Artykuł metodologiczny

Eksperymenty NMR pod wysokim ciśnieniem do wykrywania nisko położonych stanów konformacyjnych białek

DOI:

10.3791/62701

⸱

29 czerwca 2021

 ,  , 
1Department of Chemistry, Iowa State University, 2Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostarczamy szczegółowy opis kroków wymaganych do złożenia ogniwa wysokociśnieniowego, ustawienia i nagrania eksperymentów NMR pod wysokim ciśnieniem, a na koniec analizujemy zarówno intensywność szczytu, jak i zmiany chemiczne pod ciśnieniem. Eksperymenty te mogą dostarczyć cennych informacji na temat szlaków fałdowania i stabilności strukturalnej białek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wysokie ciśnienie to dobrze znana metoda perturbacji, która może być użyta do destabilizacji białek globularnych i dysocjacji kompleksów białkowych w odwracalny sposób. Ciśnienie hydrostatyczne napędza równowagę termodynamiczną w kierunku stanu (stanów) o dolnej objętości molowej. Rosnące ciśnienie stwarza zatem możliwości precyzyjnego dostrojenia stabilności białek globularnych i równowagi oligomeryzacji kompleksów białkowych. Eksperymenty NMR pod wysokim ciśnieniem pozwalają na szczegółową charakterystykę czynników rządzących stabilnością białek globularnych, ich mechanizmów fałdowania i mechanizmów oligomeryzacji poprzez połączenie precyzyjnej zdolności dostrajania stabilności zaburzeń ciśnienia i rozdzielczości miejsca oferowanej przez spektroskopię NMR roztworu. W tym miejscu przedstawiamy protokół badania lokalnej stabilności fałdowania białka za pomocą zestawu eksperymentów 2D 1H-15N zarejestrowanych od 1 bara do 2,5 kbar. Kroki wymagane do akwizycji i analizy takich eksperymentów są zilustrowane danymi uzyskanymi w domenie RRM2 hnRNPA1.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Od dawna wiadomo, że wysokoenergetyczne, słabo zaludnione stany konformacyjne białek i kompleksów białkowych odgrywają kluczową rolę w wielu szlakach biologicznych1,2,3. Dzięki eksperymentom opartym między innymi na sekwencjach impulsów Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)4, Chemical Exchange Saturation Transfer (CEST)5 oraz transferze nasycenia wymiany ciemnego (DEST)6 (między innymi), spektroskopia NMR roztworu stała się metodą z wyboru do charakteryzowania przejściowych stanów konformacyjnych7. Wraz z tymi eksperymentami można wprowadzić perturbacje, takie jak temperatura, pH lub chemiczne denaturanty, aby zwiększyć względną populację podstanów konformacyjnych o wyższej energii. Podobnie, równowaga białkowa może być również zaburzona przez zastosowanie wysokiego ciśnienia hydrostatycznego. W zależności od wielkości zmiany objętości związanej z odpowiednimi zmianami konformacyjnymi, wzrost ciśnienia o kilkaset do kilku tysięcy prętów może znacznie ustabilizować wyższy stan energetyczny lub spowodować całkowite rozwinięcie białka8,9,10. Widma NMR białek zazwyczaj wykazują dwa rodzaje zmian ciśnienia hydrostatycznego: (i) zmiany przesunięć chemicznych i (ii) zmiany intensywności pików. Zmiany przesunięcia chemicznego odzwierciedlają zmiany na granicy faz białko-woda powierzchniowa i/lub lokalna kompresja struktury białka w szybkiej skali czasowej (względem skali czasowej NMR)11. Crosspeak wykazujący dużą nieliniową zależność od ciśnienia przesunięć chemicznych może wskazywać na obecność stanów konformacyjnych o wyższej energii12,13. Z drugiej strony, szczytowe zmiany intensywności wskazują na główne przejścia konformacyjne w powolnej skali czasu, takie jak zmiany w populacjach stanów złożonych/rozłożonych. Obecność fałdowanych produktów pośrednich lub wyższych stanów energetycznych można wykryć na podstawie dużych zmian wielkości zmiany objętości po rozwinięciu, mierzonych dla różnych reszt danego białka14,15,16,17. Opierając się na naszym doświadczeniu, nawet małe białka, które są zwykle klasyfikowane jako foldery dwustanowe, wykazują niejednorodne reakcje na nacisk, co dostarcza przydatnych informacji na temat ich lokalnej stabilności fałdowania. Opisano tutaj protokół pozyskiwania i analizy intensywności piku amidu i zależności od ciśnienia 1H zmian chemicznych, wykorzystując jako białko modelowe izolowany motyw rozpoznawania RNA 2 (RRM2) heterogenicznej jądrowej rybonukleoproteiny A1 (hnRNPA1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Opisany tutaj protokół wymaga (i) wysokociśnieniowej pompy i ogniwa z aluminiową rurką cyrkonową o mocy 2,5 kbar18, (ii) oprogramowania SPARKY19 do analizy widm NMR, oraz (iii) oprogramowania do dopasowywania krzywych.

1. Przygotowanie próbki, montaż komory wysokociśnieniowej i przygotowanie eksperymentów.

  1. Wybór bufora: Użyj równej mieszaniny anionowych i kationowych, takich jak fosforan i Tris20,21.
    UWAGA: pKa anionowych, takich jak fosforan i MES, jest związane ze znaczną objętością reakcji (tj. różnicą w częściowych objętościach molowych kwasu i produktów zjonizowanych). Na pH takich może zatem znacząco wpływać zmiana ciśnienia (~0,25-0,5 jednostki pH/kbar).
  2. Upewnij się, że wymagana objętość próbki jest podobna do standardowej probówki NMR o średnicy 3 mm (~300 μl).
  3. Wprowadzić próbkę znakowaną 15N za pomocą szklanej pipety do probówki z tlenkiem cyrkonu. Upewnij się, że sample są osadzone na dnie probówki. W komplecie 200 μl oleju mineralnego, aby zapobiec mieszaniu się próbki z cieczą przekładniową (np. wodą). Napełnij pozostałą część rurki płynem przekładniowym.
  4. Umieść jednorazowy O-ring na rurce z tlenku cyrkonu i wsuń rurkę do podstawy (Rysunek 1A,B). Następnie podłącz rurkę do wysokociśnieniowej linki mocującej i najpierw ręcznie dokręć podstawę do ogniwa. Następnie należy zastosować moment obrotowy 14,7 Nm, aby zapobiec wyciekom przy niższym ciśnieniu (Rysunek 1C,D).
  5. Aby sprawdzić integralność zespołu komory ciśnieniowej, należy zwiększyć ciśnienie w rurze do 300 barów na zewnątrz spektrometru za pomocą wspornika ogniwa i naczynia zabezpieczającego. Odczekaj 15 minut, zresetuj ciśnienie do 1 bara i sprawdź, czy nie ma wycieków czystą, niestrzępiącą się chusteczką.
  6. Włóż rurkę bezciśnieniową do spektrometru, ostrożnie prowadząc linkę mocującą. Wsuń probówkę w spektrometrze, aż osiągniesz pozycję siedzącą próbki (Rysunek 1E).
  7. Zablokuj, podkładkuj, dopasuj i dostrój kanały 1H i 15N jak zwykle.
    UWAGA: Podkładki regulacyjne do wysokociśnieniowych probówek cyrkonowych bardzo różnią się od standardowych probówek NMR. Zaleca się zachowanie zoptymalizowanych podkładek regulacyjnych do wykorzystania w przyszłości.
  8. Ustaw 1 H-15N-HSQC lub TROSY-HSQC i nagraj eksperyment referencyjny w warunkach atmosferycznych (1bar).

2. Nagrywanie eksperymentów NMR pod wysokim ciśnieniem

  1. Stopniowo zwiększaj ciśnienie od 1 bara do 2,5 kbar z krokami co 500 barów, aby przetestować ogólną stabilność białka. Ustaw prędkość pompy ciśnieniowej domyślnie na ~18 bar/s. Jeśli dokładne tempo składania/rozwijania nie jest znane, pozwól, aby próbka zrównoważyła się 15-20 minut po każdym wzroście o 500 barów. Nagrywaj widmo przy 2,5 kbar.
  2. Stopniowo zmniejszaj ciśnienie z powrotem do 1 bara w krokach co 500 barów, aby przetestować odwracalność zaburzeń ciśnienia. Zarejestrować inne widmo w warunkach atmosferycznych i porównać przesunięcia chemiczne i natężenia pików z widmem odniesienia zarejestrowanym poprzednio w tych samych warunkach.
    UWAGA: Jeśli natywne szczyty krzyżowe są bardziej intensywne po przebiegu ciśnienia, może to oznaczać, że małe agregaty obecne w roztworze pod ciśnieniem atmosferycznym mogły się zdysocjować i prawidłowo ponownie zagiąć. Z drugiej strony, utrata intensywności lub znaczące zmiany przesunięcia chemicznego sugerują, że białko może doświadczyć nieodwracalnego nieprawidłowego fałdowania w warunkach wysokiego ciśnienia.
  3. Nagraj serię eksperymentów 2D od 1 bara do 2,5 kbar co 500 barów. Zaleca się rejestrowanie dodatkowych eksperymentów w pobliżu punktu przegięcia przejścia składania/rozkładania, aby poprawić precyzję dopasowania.

3. Analiza zmian intensywności szczytowej

  1. Przetwarzaj wszystkie widma i przenieś przypisanie szkieletu z widma odniesienia przy 1 barze do widma zarejestrowanego przy 500 barach, a następnie przenieś przypisanie z 500 bar na 1 kbar i tak dalej.
    UWAGA: Ponieważ ciśnienie indukuje nierównomierne przesunięcie chemiczne o 1H i 15N, nie należy po prostu kopiować przypisania szkieletu z jednego widma do drugiego. Dostosuj go ręcznie.
  2. W menu Sparky kliknij na Peak > Peak List (lt). W oknie Peak List (Lista szczytów) kliknij Opcje i wybierz opcję, aby wyświetlić zarówno częstotliwości (ppm), jak i wysokość danych. Zapisz listę uzyskaną dla każdego spektrum.
  3. W oprogramowaniu do dopasowywania krzywych skopiuj tożsamość piku krzyżowego i wartości intensywności szczytu, aby wartości ciśnienia (w barach) były zmienną osi X, a intensywność była zmienną osi Y.
  4. Jeśli zaobserwuje się całkowite lub prawie całkowite (>80%) rozwinięcie, dopasuj indywidualne profile intensywności szczytowej, aby wyodrębnić odpowiednio energię swobodną i zmianę objętości po rozwinięciu, używając prostego modelu dwustanowego:
    figure-protocol-1 Równanie 1
    Gdzie "I" jest obserwowaną intensywnością piku poprzecznego przy danym ciśnieniu p, a IF jest intensywnością tego samego piku poprzecznego w stanie całkowicie złożonym. R jest stałą gazową, T jest temperaturą bezwzględną, ΔGU0 jest standardową różnicą energii swobodnej Gibbsa między stanami rozłożenia i zagięcia przy ciśnieniu atmosferycznym p0 (1 bar), a ΔVu jest zmianą objętości po rozwinięciu. Przy ciśnieniu p w barach i temperaturze T w kelwinach, R = 1,987 cal/K, ΔGU0 jest w cal/mol, a ΔVU jest w cal/mol/bar. Pomnóż wartości ΔVU uzyskane z dopasowania przez 41,84, aby przeliczyć na ml/mol. Wartości ΔVU są zwykle w zakresie od -50 do -150 mL/mol dla białek globularnych22. W tym przypadku wszystkie parametry są wyrażone w odniesieniu do reakcji rozwijania, ale można je łatwo przekształcić w parametry reakcji fałdowania (ΔGU0 = -ΔGF0 i ΔVU = -ΔVF).

4. Analiza zmian chemicznych

  1. Ułóż kolumny w oprogramowaniu tak, aby punkty nacisku były zmienne, a przesunięcia chemiczne 1H wyodrębnione z list Sparky'ego jako oś Y.
  2. Dopasuj zależność ciśnienia przesunięć chemicznych 1H do prostego równania kwadratowego:
    δ(p) = δ0(p0) + B1(p-p0) + B2 (p-p0)2 Równanie 2
    Gdzie δ (p) jest zmierzonym przesunięciem chemicznym piku poprzecznego o 1H przy danym ciśnieniu p, a δ0 (p0) o 1H przesunięciem chemicznym tego samego piku poprzecznego w widmie odniesienia zarejestrowanym przy ciśnieniu 1 bar. B1 i B2 reprezentują parametry pierwszego i drugiego rzędu wyrażone odpowiednio w ppm/bar i ppm/bar2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół został wykorzystany do zbadania zależności od ciśnienia RRM2, drugiego motywu rozpoznawania RNA hnRNPA1 (reszty 95-106), który jest prawie całkowicie rozwinięty w zakresie 2,5 kbar (>90%). >1Widma H-15N zebrano przy ciśnieniach 1 bar, 500 bar, 750 bar, 1 kbar, 1,5 kbar, 2 kbar i 2,5 kbar (Rysunek 2). Ponieważ żaden z rodzimych szczytów poprzecznych nie był widoczny powyżej poziomu hałasu przy 2,5 kbar, wszystkim odpowiadającym pozostałościom przypisan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to szczegółowo opisuje protokół zaimplementowany do badania strukturalnych i termodynamicznych reakcji białek na zaburzenia ciśnienia. Eksperymenty wysokociśnieniowe zarejestrowane tutaj na RRM2 pokazują, że duże różnice w wartościach ΔVU , wskazujące na nie w pełni kooperatywne rozwijanie, można znaleźć w stosunkowo małym białku jednodomenowym. Podobny obraz wyłania się z analizy zmian przesunięcia chemicznego 1H pod wpływem ciśnienia. Należy zauważyć, że Kalbitzer i współpracownicy wykazal...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy przeczytali i zatwierdzili manuskrypt. Deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez fundusze z Roy J. Carver Charitable Trust dla Juliena Roche'a. Dziękujemy J. D. Levengoodowi i B. S. Tolbertowi za uprzejme udostępnienie próbki RRM2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bruker Nmr Cell 2.5 KbarDaedalus Innovations LLCNMRCELL-B
Sparky3Uniwersytet Kalifornijski San Francisco, KaliforniaNie dotyczy
Xtreme-60 Pompa strzykawkowaDaedalus Innovations LLCXTREME-60

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alderson, R. T., Kay, L. E. Unveiling invisible protein states with NMR spectroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 60, 39-49 (2020).
  2. Korzhnev, D. M., Kay, L. E. probing invisible, low-populated states of protein molecules by relaxation dispersion NMR spectroscopy: An application to protein folding. Accounts of Chemical Research. 41, 442-451 (2008).
  3. Loria, P. J., Berlow, R. B., Watt, E. D. Characterization of enzyme motions by solution NMR relaxation dispersion. Accounts of Chemical Research. 41, 214-221 (2008).
  4. Ishima, R. CPMG relaxation dispersion. Methods in Molecular Biology. 1084, 29-49 (2014).
  5. Longo, D. L., et al. Chemical exchange saturation transfer (CEST): an efficient tool for detecting molecular information on proteins' behaviour. Analyst. 39, 2687-2690 (2014).
  6. Fawzi, N. L., Ying, J., Torchia, D. A., Clore, M. G. Probing exchange kinetics and atomic resolution dynamics in high-molecular-weight complexes using dark-state exchange saturation transfer NMR spectroscopy. Nature Protocols. 7, 1523-1533 (2012).
  7. Anthis, N. J., Clore, M. G. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48, 35-116 (2015).
  8. Roche, J., et al. Cavities determine the pressure unfolding of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6945-6950 (2012).
  9. Chen, C. R., Makhatadze, G. I. Molecular determinant of the effects of hydrostatic pressure on protein folding stability. Nature Communications. 8, 14561(2017).
  10. Roche, J., Royer, C. A. Lessons from pressure denaturation of proteins. Journal of the Royal Society Interface. 15, 20180244(2018).
  11. Xu, X., Gagné, D., Aramini, J. M., Gardner, K. H. Volume and compressibility differences between protein conformations revealed by high-pressure NMR. Biophysical Journal. 120, 924-935 (2021).
  12. Akasaka, K., Li, H. Low-lying excited states of proteins revealed from non-linear pressure shifts in 1H and 15N NMR. Biochemistry. 40, 8665-8671 (2001).
  13. Akasaka, K. Probing conformational fluctuation of proteins by pressure perturbation. Chemical Reviews. 106, 1814-1835 (2006).
  14. Kitahara, R., Yokoyama, S., Akasaka, K. NMR snapshots of a fluctuating protein structure: ubiquitin at 30 bar-3 kbar. Journal of Molecular Biology. 347, 277-285 (2005).
  15. Roche, J., et al. remodeling of the folding free energy landscape of Staphylococcal nuclease by cavity-creating mutations. Biochemistry. 51, 9535-9546 (2012).
  16. Nucci, N. V., Fuglestad, B., Athanasoula, E. A., Wand, J. A. Role of cavities and hydration in the pressure unfolding of T4 lysozyme. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13846-13851 (2014).
  17. Maeno, A., et al. Cavity as a source of conformational fluctuation and high-energy state: High-pressure NMR study of a cavity-enlarged mutant of T4 lysozyme. Biophysical Journal. 108, 133-145 (2015).
  18. Peterson, R. W., Wand, J. A. Self-contained high-pressure cell, apparatus, and procedure for the preparation of encapsulated proteins dissolved in low viscosity fluids for nuclear magnetic resonance spectroscopy. Review of Scientific Instruments. 76, 094101(2005).
  19. Goddard, T. D., Kneller, D. G. Sparky 3. , University of California San Francisco. San Francisco, CA. (2010).
  20. Caro, J. A., Wand, J. A. Practical aspects of high-pressure NMR spectroscopy and its applications in protein biophysics and structural biology. Methods. 148, 67-80 (2018).
  21. Kitamura, T., Itoh, J. Reaction volume of protonic ionization for buffering agents. Prediction of pressure dependence of pH and pOH. Journal of Solution Chemistry. 16, 715-725 (1987).
  22. Royer, C. A. Revisiting volume changes in pressure-induced protein unfolding. Biochimica et Biophysica Acta. 1595, 201-209 (2002).
  23. Erlach, M. B., et al. Relationship between nonliner pressure-induced chemical shift changes and thermodynamic parameters. Journal of Physical Chemistry B. 118, 5681-5690 (2014).
  24. de Oliveira, G. A. P., Silva, J. L. A hypothesis to reconcile the physical and chemical unfolding of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 112, 2775-2784 (2015).
  25. Nguyen, L. M., Roche, J. High-pressure NMR techniques for the study of protein dynamics, folding and aggregation. Journal of Magnetic Resonance. 277, 179-185 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

stany konformacyjne bia ekperturbacja ci nieniemzwijanie bia ekmechanizmy oligomeryzacjiznakowanie azotem 15spektroskopia relaksacji poprzecznejeksperymenty 2D NMRstabilno bia ekenergia swobodna Gibbsa

Powiązane artykuły