Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Eksperymenty NMR pod wysokim ciśnieniem do wykrywania nisko położonych stanów konformacyjnych białek

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62701

⸱

29 czerwca 2021

 ,  , 
1Department of Chemistry, Iowa State University, 2Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University

W tym artykule

Podsumowanie

Dostarczamy szczegółowy opis kroków wymaganych do złożenia ogniwa wysokociśnieniowego, ustawienia i nagrania eksperymentów NMR pod wysokim ciśnieniem, a na koniec analizujemy zarówno intensywność szczytu, jak i zmiany chemiczne pod ciśnieniem. Eksperymenty te mogą dostarczyć cennych informacji na temat szlaków fałdowania i stabilności strukturalnej białek.

Streszczenie

Wysokie ciśnienie to dobrze znana metoda perturbacji, która może być użyta do destabilizacji białek globularnych i dysocjacji kompleksów białkowych w odwracalny sposób. Ciśnienie hydrostatyczne napędza równowagę termodynamiczną w kierunku stanu (stanów) o dolnej objętości molowej. Rosnące ciśnienie stwarza zatem możliwości precyzyjnego dostrojenia stabilności białek globularnych i równowagi oligomeryzacji kompleksów białkowych. Eksperymenty NMR pod wysokim ciśnieniem pozwalają na szczegółową charakterystykę czynników rządzących stabilnością białek globularnych, ich mechanizmów fałdowania i mechanizmów oligomeryzacji poprzez połączenie precyzyjnej zdolności dostrajania stabilności zaburzeń ciśnienia i rozdzielczości miejsca oferowanej przez spektroskopię NMR roztworu. W tym miejscu przedstawiamy protokół badania lokalnej stabilności fałdowania białka za pomocą zestawu eksperymentów 2D 1H-15N zarejestrowanych od 1 bara do 2,5 kbar. Kroki wymagane do akwizycji i analizy takich eksperymentów są zilustrowane danymi uzyskanymi w domenie RRM2 hnRNPA1.

Wprowadzenie

Od dawna wiadomo, że wysokoenergetyczne, słabo zaludnione stany konformacyjne białek i kompleksów białkowych odgrywają kluczową rolę w wielu szlakach biologicznych1,2,3. Dzięki eksperymentom opartym między innymi na sekwencjach impulsów Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)4, Chemical Exchange Saturation Transfer (CEST)5 oraz transferze nasycenia wymiany ciemnego (DEST)6 (między innymi), spektroskopia NMR roztworu stała się metodą z wyboru do charakteryzowania przejściowych stanów konformacyjnych7. Wraz z tymi eksperymentami można wprowadzić perturbacje, takie jak temperatura, pH lub chemiczne denaturanty, aby zwiększyć względną populację podstanów konformacyjnych o wyższej energii. Podobnie, równowaga białkowa może być również zaburzona przez zastosowanie wysokiego ciśnienia hydrostatycznego. W zależności od wielkości zmiany objętości związanej z odpowiednimi zmianami konformacyjnymi, wzrost ciśnienia o kilkaset do kilku tysięcy prętów może znacznie ustabilizować wyższy stan energetyczny lub spowodować całkowite rozwinięcie białka8,9,10. Widma NMR białek zazwyczaj wykazują dwa rodzaje zmian ciśnienia hydrostatycznego: (i) zmiany przesunięć chemicznych i (ii) zmiany intensywności pików. Zmiany przesunięcia chemicznego odzwierciedlają zmiany na granicy faz białko-woda powierzchniowa i/lub lokalna kompresja struktury białka w szybkiej skali czasowej (względem skali czasowej NMR)11. Crosspeak wykazujący dużą nieliniową zależność od ciśnienia przesunięć chemicznych może wskazywać na obecność stanów konformacyjnych o wyższej energii12,13. Z drugiej strony, szczytowe zmiany intensywności wskazują na główne przejścia konformacyjne w powolnej skali czasu, takie jak zmiany w populacjach stanów złożonych/rozłożonych. Obecność fałdowanych produktów pośrednich lub wyższych stanów energetycznych można wykryć na podstawie dużych zmian wielkości zmiany objętości po rozwinięciu, mierzonych dla różnych reszt danego białka14,15,16,17. Opierając się na naszym doświadczeniu, nawet małe białka, które są zwykle klasyfikowane jako foldery dwustanowe, wykazują niejednorodne reakcje na nacisk, co dostarcza przydatnych informacji na temat ich lokalnej stabilności fałdowania. Opisano tutaj protokół pozyskiwania i analizy intensywności piku amidu i zależności od ciśnienia 1H zmian chemicznych, wykorzystując jako białko modelowe izolowany motyw rozpoznawania RNA 2 (RRM2) heterogenicznej jądrowej rybonukleoproteiny A1 (hnRNPA1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Opisany tutaj protokół wymaga (i) pompy wysokociśnieniowej oraz komory z rurką z cyrkonii wzmocnionej glinem o znamionowej wytrzymałości 2.5 kbar18, (ii) oprogramowania SPARKY19 do analizy widm NMR oraz (iii) oprogramowania do dopasowywania krzywych.

1. Przygotowanie próbek, montaż komory wysokociśnieniowej i konfiguracja eksperymentów.

  1. Wybór buforu: Należy zastosować równą mieszankę buforów anionowych i kationowych, takich jak fosforanowy i Tris20,21.
    UWAGA: pKa buforów anionowych, takich jak fosforanowy i MES, wiąże się z istotną objętością reakcji (tj. różnicą w cząstkowych objętościach molowych kwasu i produktów zjonizowanych). pH takich buforów może być zatem znacząco zmienione przez zmianę ciśnienia (~0,25-0,5 jednostki pH/kbar).
  2. Należy upewnić się, że wymagana objętość próbki jest zbliżona do objętości standardowej probówki NMR o średnicy 3 mm (~300μL).
  3. Wprowadzić próbkę znakowaną 15N do probówki z cyrkonu za pomocą pipety szklanej. Należy upewnić się, że próbka spoczywa na dnie probówki. Uzupełnić 200 μL oleju mineralnego, aby zapobiec mieszaniu się próbki z cieczą transmisyjną (np. wodą). Resztę probówki wypełnić cieczą transmisyjną.
  4. Nałożyć jednorazowy pierścień O-ring na górną część probówki z cyrkonu i wsunąć probówkę do podstawy (Rysunek 1A,B). Następnie podłączyć probówkę do przewodu wysokociśnieniowego i dokręcić podstawę do ogniwa, początkowo ręcznie. Następnie przyłożyć moment obrotowy 14,7 Nm, aby zapobiec wyciekom przy niższym ciśnieniu (Rysunek 1C,D).
  5. Aby sprawdzić szczelność zestawu ogniwa ciśnieniowego, należy napompować probówkę do ciśnienia 300 bar poza spektrometrem, korzystając z podpory ogniwa i naczynia zabezpieczającego. Odczekać 15 min, zredukować ciśnienie do 1 bar i sprawdzić szczelność za pomocą czystej ściereczki niepozostawiającej włókien.
  6. Wsunąć niepodciśnieniową probówkę do spektrometru, ostrożnie prowadząc przewód łączący. Przesuwać probówkę w spektrometrze, aż osiągnie ona pozycję roboczą próbki (Rysunek 1E).
  7. Zablokować, zshimmować, dopasować i nastroić kanały 1H i 15N w sposób rutynowy.
    UWAGA: Parametry shimmingu dla probówek z cyrkonu przystosowanych do wysokiego ciśnienia różnią się znacznie od standardowych probówek NMR. Zaleca się zapisanie zoptymalizowanych ustawień shimmingu do przyszłego użytku.
  8. Skonfigurować eksperyment 1H-15N-HSQC lub TROSY-HSQC i zarejestrować eksperyment referencyjny w warunkach atmosferycznych (1bar).

2. Rejestracja eksperymentów NMR wysokociśnieniowych

  1. Stopniowo zwiększać ciśnienie od 1 bar do 2.5 kbar w przyrostach 500 bar, aby przetestować ogólną stabilność białka. Prędkość pompy ciśnieniowej ustawić domyślnie na ~18 bar/s. Jeśli dokładne szybkości zwijania/rozwijania nie są znane, pozwolić próbce na równowagowanie przez 15-20 min po każdym przyroście 500 bar. Zarejestrować widmo przy ciśnieniu 2.5 kbar.
  2. Stopniowo zmniejszać ciśnienie z powrotem do 1 bar w krokach 500 bar, aby przetestować odwracalność perturbacji ciśnieniowej. Zarejestrować kolejne widmo w warunkach atmosferycznych i porównać przesunięcia chemiczne oraz intensywności pików z widmem referencyjnym zarejestrowanym wcześniej w tych samych warunkach.
    UWAGA: Jeśli piki korelacyjne stanu natywnego są bardziej intensywne po cyklu ciśnieniowym, może to wskazywać, że niewielkie agregaty obecne w roztworze przy ciśnieniu atmosferycznym uległy dysocjacji i prawidłowo się zwiniły. Z drugiej strony, spadek intensywności lub znaczące zmiany przesunięć chemicznych sugerują, że białko mogło ulec nieodwracalnemu błędnemu zwinięciu w warunkach wysokiego ciśnienia.
  3. Zarejestrować serię eksperymentów 2D od 1 bar do 2.5 kbar co 500 bar. Zaleca się przeprowadzenie dodatkowych eksperymentów w pobliżu punktu przegięcia przejścia zwijania/rozwijania, aby zwiększyć precyzję dopasowania.

3. Analiza zmian intensywności piku

  1. Przetworzyć wszystkie widma i przenieść przypisania szkieletu z widma referencyjnego przy ciśnieniu 1 bar do widma zarejestrowanego przy 500 bar, a następnie przenieść przypisania z 500 bar do 1 kbar i tak dalej.
    UWAGA: Ponieważ ciśnienie wywołuje nierównomierne przesunięcie 1H i 15W przypadku przesunięć chemicznych nie należy po prostu kopiować przyporządkowania szkieletu z jednego widma do drugiego. Należy skorygować je ręcznie.
  2. W menu Sparky kliknij Szczyt > Lista pików (lt)W Lista pików okno, kliknij w Opcje i wybierz opcję wyświetlania obu Częstotliwości (ppm) i Wysokość danychZapisz listę uzyskaną dla każdego widma.
  3. W oprogramowaniu do dopasowywania krzywych skopiuj tożsamość sygnałów krosowych oraz wartości intensywności piku tak, aby wartości ciśnienia (w barach) stanowiły zmienną na osi X, a intensywność zmienną na osi Y.
  4. Jeśli całkowity lub niemal całkowity (>obserwuje rozfałdowanie (80%), dopasuj profile intensywności poszczególnych pików, aby wyznaczyć odpowiednio zmianę energii swobodnej i zmianę objętości podczas rozfałdowania, stosując prosty model dwustanowy:
    Wzór na równowagę zwijania białek \(I = \frac{I_F}{1+e^{-\frac{\Delta G_U^0 + \Delta V_U(p-p_0)}{RT}}}\).                                     Równ. 1
    gdzie „I” to obserwowana intensywność sygnału krosowego przy danym ciśnieniu p i IF jest intensywnością tego samego sygnału korelacyjnego w stanie w pełni sfałdowanym. R to stała gazowa, T to temperatura bezwzględna, ΔGU0 standardowa różnica energii swobдной Gibbsa między stanem rozfałdowanym a pofałdowanym przy ciśnieniu atmosferycznym p0 (1 bar) oraz ΔVu zmiana objętości podczas rozwijania. Przy ciśnieniu p w barach i temperaturze T w kelwinach, R = 1,987 cal/K, ΔGU0 jest w cal/mol, a ΔVU jest w cal/mol/bar. Pomnóż ΔVU wartości uzyskane z dopasowania przez 41,84 w celu konwersji na mL/mol. ΔVU wartości te zazwyczaj mieszczą się w zakresie od -50 do -150 mL/mol dla białek globularnych22Wszystkie parametry są tutaj przedstawione w odniesieniu do reakcji rozwijania, lecz mogą zostać łatwo przeliczone na parametry reakcji zwijania (ΔGU0 = -ΔGF0 oraz ΔVU = -ΔVF).

4. Analiza zmian przesunięcia chemicznego

  1. Zorganizuj kolumny w oprogramowaniu w taki sposób, aby punkty ciśnienia były zmienną, a przesunięcia chemiczne 1H wyekstrahowane z list Sparky stanowiły oś Y.
  2. Dopasuj zależność przesunięć chemicznych 1H od ciśnienia do prostego równania kwadratowego:
    δ(p) = δ0(p0) + B1(p-p0) + B2 (p-p0)2                    Równanie 2
    Gdzie δ(p) to zmierzone przesunięcie chemiczne 1H sygnału korelacyjnego przy danym ciśnieniu p, a δ0(p0) to przesunięcia chemiczne 1H tego samego sygnału w widmie referencyjnym zarejestrowanym przy 1 bar. B1 i B2 reprezentują parametry pierwszego i drugiego rzędu wyrażone odpowiednio w ppm/bar i ppm/bar2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisany tutaj protokół został zastosowany do zbadania zależności od ciśnienia RRM2, drugiego motywu rozpoznawania RNA białka hnRNPA1 (pozostałości 95-106), który jest niemal całkowicie rozfałdowany w zakresie 2,5 kbar (>90%). Widma 1H-15N zarejestrowano przy ciśnieniach 1 bar, 500 bar, 750 bar, 1 kbar, 1,5 kbar, 2 kbar i 2,5 kbar (Rysunek 2). Ponieważ przy 2,5 kbar żaden z natywnych pików korelacyjnych nie był widoczny powyżej poziomu szumu, wszystkim odpowiadającym ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badanie to szczegółowo opisuje protokół zaimplementowany do badania strukturalnych i termodynamicznych reakcji białek na zaburzenia ciśnienia. Eksperymenty wysokociśnieniowe zarejestrowane tutaj na RRM2 pokazują, że duże różnice w wartościach ΔVU , wskazujące na nie w pełni kooperatywne rozwijanie, można znaleźć w stosunkowo małym białku jednodomenowym. Podobny obraz wyłania się z analizy zmian przesunięcia chemicznego 1H pod wpływem ciśnienia. Należy zauważyć, że Kalbitzer i współpracownicy wykazal...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy przeczytali i zatwierdzili manuskrypt. Deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez fundusze z Roy J. Carver Charitable Trust dla Juliena Roche'a. Dziękujemy J. D. Levengoodowi i B. S. Tolbertowi za uprzejme udostępnienie próbki RRM2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bruker Nmr Cell 2.5 KbarDaedalus Innovations LLCNMRCELL-B
Sparky3Uniwersytet Kalifornijski San Francisco, KaliforniaNie dotyczy
Xtreme-60 Pompa strzykawkowaDaedalus Innovations LLCXTREME-60

Bibliografia

  1. Alderson, R. T., Kay, L. E. Unveiling invisible protein states with NMR spectroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 60, 39-49 (2020).
  2. Korzhnev, D. M., Kay, L. E. probing invisible, low-populated states of protein molecules by relaxation dispersion NMR spectroscopy: An application to protein folding. Accounts of Chemical Research. 41, 442-451 (2008).
  3. Loria, P. J., Berlow, R. B., Watt, E. D. Characterization of enzyme motions by solution NMR relaxation dispersion. Accounts of Chemical Research. 41, 214-221 (2008).
  4. Ishima, R. CPMG relaxation dispersion. Methods in Molecular Biology. 1084, 29-49 (2014).
  5. Longo, D. L., et al. Chemical exchange saturation transfer (CEST): an efficient tool for detecting molecular information on proteins' behaviour. Analyst. 39, 2687-2690 (2014).
  6. Fawzi, N. L., Ying, J., Torchia, D. A., Clore, M. G. Probing exchange kinetics and atomic resolution dynamics in high-molecular-weight complexes using dark-state exchange saturation transfer NMR spectroscopy. Nature Protocols. 7, 1523-1533 (2012).
  7. Anthis, N. J., Clore, M. G. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48, 35-116 (2015).
  8. Roche, J., et al. Cavities determine the pressure unfolding of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6945-6950 (2012).
  9. Chen, C. R., Makhatadze, G. I. Molecular determinant of the effects of hydrostatic pressure on protein folding stability. Nature Communications. 8, 14561(2017).
  10. Roche, J., Royer, C. A. Lessons from pressure denaturation of proteins. Journal of the Royal Society Interface. 15, 20180244(2018).
  11. Xu, X., Gagné, D., Aramini, J. M., Gardner, K. H. Volume and compressibility differences between protein conformations revealed by high-pressure NMR. Biophysical Journal. 120, 924-935 (2021).
  12. Akasaka, K., Li, H. Low-lying excited states of proteins revealed from non-linear pressure shifts in 1H and 15N NMR. Biochemistry. 40, 8665-8671 (2001).
  13. Akasaka, K. Probing conformational fluctuation of proteins by pressure perturbation. Chemical Reviews. 106, 1814-1835 (2006).
  14. Kitahara, R., Yokoyama, S., Akasaka, K. NMR snapshots of a fluctuating protein structure: ubiquitin at 30 bar-3 kbar. Journal of Molecular Biology. 347, 277-285 (2005).
  15. Roche, J., et al. remodeling of the folding free energy landscape of Staphylococcal nuclease by cavity-creating mutations. Biochemistry. 51, 9535-9546 (2012).
  16. Nucci, N. V., Fuglestad, B., Athanasoula, E. A., Wand, J. A. Role of cavities and hydration in the pressure unfolding of T4 lysozyme. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13846-13851 (2014).
  17. Maeno, A., et al. Cavity as a source of conformational fluctuation and high-energy state: High-pressure NMR study of a cavity-enlarged mutant of T4 lysozyme. Biophysical Journal. 108, 133-145 (2015).
  18. Peterson, R. W., Wand, J. A. Self-contained high-pressure cell, apparatus, and procedure for the preparation of encapsulated proteins dissolved in low viscosity fluids for nuclear magnetic resonance spectroscopy. Review of Scientific Instruments. 76, 094101(2005).
  19. Goddard, T. D., Kneller, D. G. Sparky 3. , University of California San Francisco. San Francisco, CA. (2010).
  20. Caro, J. A., Wand, J. A. Practical aspects of high-pressure NMR spectroscopy and its applications in protein biophysics and structural biology. Methods. 148, 67-80 (2018).
  21. Kitamura, T., Itoh, J. Reaction volume of protonic ionization for buffering agents. Prediction of pressure dependence of pH and pOH. Journal of Solution Chemistry. 16, 715-725 (1987).
  22. Royer, C. A. Revisiting volume changes in pressure-induced protein unfolding. Biochimica et Biophysica Acta. 1595, 201-209 (2002).
  23. Erlach, M. B., et al. Relationship between nonliner pressure-induced chemical shift changes and thermodynamic parameters. Journal of Physical Chemistry B. 118, 5681-5690 (2014).
  24. de Oliveira, G. A. P., Silva, J. L. A hypothesis to reconcile the physical and chemical unfolding of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 112, 2775-2784 (2015).
  25. Nguyen, L. M., Roche, J. High-pressure NMR techniques for the study of protein dynamics, folding and aggregation. Journal of Magnetic Resonance. 277, 179-185 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

stany konformacyjne białekperturbacja ciśnieniemzwijanie białekmechanizmy oligomeryzacjiznakowanie azotem-15spektroskopia relaksacji poprzecznejeksperymenty 2D NMRstabilność białekenergia swobodna Gibbsa
Eksperymenty NMR pod wysokim ciśnieniem do wykrywania nisko położonych stanów konformacyjnych białek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.