Artykuł metodologiczny

In vivo (in vivo) Funkcja zróżnicowanych podzbiorów skórnych komórek dendrytycznych w celu indukowania odporności Th17 w śródskórnym zakażeniu Candida albicans

DOI:

10.3791/62731

⸱

20 lipca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Dermatology, Severance Hospital, Cutaneous Biology Research Institute, Yonsei University College of Medicine, 2Brain Korea 21 FOUR Project for Medical Science, Yonsei University College of Medicine, 3Institute for Immunology and Immunological Diseases, Yonsei University College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj pokazujemy in vivo funkcję podzbiorów skórnych komórek dendrytycznych w odporności Th17 na głębokie zakażenie skórne Candida albicans.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skóra jest najbardziej zewnętrznym organem barierowym w ciele, który zawiera kilka typów komórek dendrytycznych (DC), grupę profesjonalnych komórek prezentujących antygen. Kiedy skóra napotyka atakujące patogeny, różne skórne DC inicjują wyraźną odpowiedź immunologiczną limfocytów T w celu ochrony organizmu. Wśród atakujących patogenów infekcja grzybicza specyficznie napędza ochronną odpowiedź immunologiczną Th17 wytwarzającą interleukinę-17. Opracowano protokół skutecznego różnicowania komórek Th17 przez śródskórne zakażenie Candida albicans w celu zbadania podzbioru skórnych DC odpowiedzialnych za indukowanie odporności Th17. Cytometria przepływowa i analizy ekspresji genów wykazały wyraźną indukcję odpowiedzi immunologicznej Th17 w węzłach chłonnych drenujących skórę i zakażonej skórze. Wykorzystując indukowane przez toksynę błoniczą szczepy myszy zubożające podzbiór DC, stwierdzono, że skórne DC CD301b + są odpowiedzialne za optymalne różnicowanie Th17 w tym modelu. W związku z tym protokół ten stanowi cenną metodę badania funkcji in vivo zróżnicowanych podzbiorów skórnych DC w celu określenia odporności Th17 na głęboką infekcję grzybiczą skóry.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skóra jest najbardziej zewnętrznym organem barierowym, który chroni ciało przed inwazją zewnętrznych patogenów i bodźców1. Skóra składa się z dwóch odrębnych warstw, w tym naskórka - warstwowego nabłonka keratynocytów - i leżącej poniżej skóry właściwej - gęstej sieci kolagenu i innych składników strukturalnych. Jako pierwotna tkanka bariery nabłonkowej, skóra zapewnia głównie bariery fizyczne i przyczynia się do dodatkowych barier immunologicznych, ponieważ zawiera liczne rezydujące komórki odpornościowe2,3. Wśród skórnych komórek odpornościowych, komórki dendrytyczne (DC) są rodzajem profesjonalnych komórek prezentujących antygen, które aktywnie pobierają własne i nie-własne antygeny i migrują do regionalnych węzłów chłonnych (LN) w celu zainicjowania odpowiedzi i tolerancji limfocytów T specyficznych dla antygenu zgodnie z naturą antygenów4.

Skóra zawiera komórki prezentujące antygen naskórka, a mianowicie komórki Langerhansa (LCs) i co najmniej dwa typy DCs, w tym konwencjonalne DC typu 1 (cDC1) i konwencjonalne DC typu 2 (cDC2)5. Naskórkowe LC są embrionalne pochodzenia monocytowego i utrzymują swoją liczbę komórek poprzez samoutrwalanie w warunkach homeostatycznych6. W przeciwieństwie do tego, skórne cDC1 i cDC2 pochodzą z hematopoetycznych komórek macierzystych i są stale uzupełniane przez genetorów zaangażowanych w DC5. Skórne DC charakteryzują się markerami powierzchniowymi, z grubsza podzielonymi na populacje Langerin+ (w tym LC i cDC1) i CD11b+Langerin- (głównie cDC2). Ponadto grupa ta ujawniła, że populacja CD11b+Langerin-DC jest dalej klasyfikowana do dwóch podzbiorów zgodnie z wyrażeniem CD301b7.

Ważne cechy funkcjonalne skórnych DC są skoncentrowane na podziale pracy, determinowanym głównie przez wewnętrzną naturę każdego podzbioru DC, lokalizacje in situ DC, mikrośrodowisko tkanek i miejscowe sygnały zapalne8. Te cechy funkcjonalne skórnych DC wymagają zbadania roli określonych podzbiorów DC podczas niektórych typów odpowiedzi immunologicznej skóry. Po stymulacji antygenowej przez skórne DC w drenujących LN, naiwne limfocyty T CD4 + różnicują się w określone podzbiory pomocniczych limfocytów T, które wytwarzają zestaw zdefiniowanych cytokin do wywierania swojej funkcji efektorowej9. Wśród podzbiorów limfocytów T pomocniczych CD4 +, komórki Th17 wytwarzające interleukinę-17 (IL-17) odgrywają kluczową rolę w chorobach autoimmunologicznych i odporności przeciwgrzybiczej10. Pod tym względem infekcja grzybicza skóry jest solidnym modelem do badania odporności Th17 in vivo11,12,13. Kiedy skórki pozbawione taśmy są naskórkowo wystawione na działanie drożdży Candida albicans (C. albicans), naskórkowe LC odgrywają kluczową rolę w napędzaniu specyficznego dla antygenu różnicowania Th1714.

Odporność ochronna przed śródskórnym zakażeniem C. albicans wymaga odporności wrodzonej, takiej jak aktywność fibrynolityczną fibroblastów i fagocytów15. Jednak niewiele wiadomo na temat roli skórnych podzbiorów DC w ustanawianiu odporności Th17 w głębokim zakażeniu skórnym C. albicans. W pracy opisano metodę śródskórnego zakażenia skóry C. albicans, która wywołuje lokalną i regionalną odpowiedź immunologiczną Th17. Zastosowanie indukowanych toksyną błoniczą (DT) szczepów myszy zubożających podzbiór DC ujawniło, że skórne DC CD301b + mają kluczowe znaczenie dla odporności na Th17 w tym modelu. Opisane tutaj podejście pozwala na badanie odpowiedzi Th17 na głębokie inwazyjne zakażenie grzybicze skóry.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt (IACUC, ID zatwierdzenia: 2019-0056, 2019-0055). Do tego badania wykorzystano siedmio- do 9-tygodniowe samice myszy typu dzikiego (WT) C57BL/6 o wadze 18-24 g. Niektóre badania przeprowadzono na samicach myszy z receptorem toksyny błoniczej Langeryny (DTR) i CD301b-DTR w tym samym wieku i o tej samej masie ciała. Do eksperymentu wykorzystano od czterech do sześciu myszy w każdej grupie, a dane są reprezentatywne dla trzech niezależnych eksperymentów. Prace te prowadzono w warunkach 3 poziomu bezpieczeństwa biologicznego, które można było również przeprowadzić w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi (temperatura pokojowa 23 °C ± 3 °C, wilgotność 50% ± 10%).

1. Przygotowanie Candida albicans

UWAGA: Eksperymenty w tej sekcji były przeprowadzane w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Smuga C. albicans przecedzić SC5314 na płytkę agarową z drożdży, peptonem, dekstrozą, adeniną (YPDA) za pomocą pętli do zaszczepiania i igły.
  2. Inkubować płytkę do góry nogami przez 2 dni w temperaturze 30 °C.
    UWAGA: Płytka agarowa YPDA z C. albicans może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
  3. Wyizolować pojedynczą kolonię z płytki w celu zaszczepienia do 10 ml pożywki YPDA w probówce o pojemności 50 ml za pomocą sterylnej końcówki pipety.
  4. Inkubować w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 230-250 obr./min przez ~17 godzin.
  5. Umieść zawiesinę drożdży w kuwecie i mierz gęstość optyczną (OD) przy 600 nm co 30 minut za pomocą spektrofotometru UV-VIS, aż OD600 osiągnie 1,5-2,0,
    UWAGA: Ten krok może potrwać 16-18 godzin.
  6. Wirować zawiesinę drożdżową o masie 1000 × g przez 5 minut.
  7. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki drożdży w odpowiedniej ilości sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  8. Policz komórki C. albicans za pomocą hemocytometru i wiruj zawiesinę z stężeniem 1000 × g przez 5 minut.
  9. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki C. albicans w PBS do stężenia 1 × 10-7 komórek w 40 μl PBS na opuszkę stopy.
  10. W celu przygotowania zabitych termicznie (HK) C. albicans, po ustaleniu liczby komórek, należy zabić komórki drożdży przez ogrzewanie w temperaturze 65 °C przez 60 minut przy użyciu mieszadła grzewczego.

2. Zakażenie opuszki myszy C. albicans

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schemat ideowy śródskórnego modelu infekcji Candida albicans. (A) Tylnym opuszkom stóp myszy wstrzyknięto śródskórnie 1 × 107 C. albicans. Po 7 dniach opuszki stóp myszy ponownie wystawiono na działanie 1 × 107 HK C. albicans we wstrzyknięciu śródskórnym, a odpowiedź nadwrażliwości typu opóźnionego mierzono 24 godziny po prowokacji antygenem. Miejscową odpowiedź immunologiczną podczas uczulenia na C. albicans analizowano po 7 dniach w drenujących skórę LN. (B, C) Obrazy opuszków stóp przed śródskórnym wstrzyknięciem opuszki stopy z C. albicans. (D, E) Wstrzyknięcie C. albicans do głębokiej skóry właściwej opuszki stopy. (F, G) Kliniczne objawy zaczerwienienia i obrzęku po wstrzyknięciu opuszki stopy do prawej opuszki stopy. (H) Szkic przedstawiający drogi limfatyczne od opuszki stopy do LN podkolanowych po wstrzyknięciu C. albicans. (I) Odsłonięte LN podkolanowe zlokalizowane za kolanem 7 dni po wstrzyknięciu C. albicans i (J) bez wstrzyknięcia. Skróty: HK = zabity na gorąco; LN = węzły chłonne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Znieczulaj myszy izofluranem w komorze indukcyjnej, aż myszy będą miały powolną częstość oddechów i nie będą wykazywać reakcji wycofania na szczypanie palców u nóg lub ogonów.
    UWAGA: Podczas znieczulenia zaleca się stosowanie maści do oczu, aby zapobiec suchości oczu, szczególnie w przypadku znieczulenia trwającego dłużej niż 5 minut.
  2. Zdjąć nasadkę z igły 31 G i po wymieszaniu komórek załadować strzykawkę insulinową o pojemności 0,3 ml przygotowanym C. albicans z kroku 1.9.
  3. Wyjmij znieczuloną mysz z komory indukcyjnej i delikatnie wstrzyknij 40 μl komórek drożdży (1 × 107 komórek) do głębokiej skóry właściwej opuszki stopy w celu uczulenia C. albicans.
    UWAGA: Maksymalna objętość, jaką można wstrzyknąć do podnóżka, wynosi 50 μl.
  4. Powoli wyjąć igłę strzykawki z miejsca wstrzyknięcia.
  5. Umieść każdą mysz samodzielnie w klatce, aż w pełni wyzdrowieje ze znieczulenia, a następnie bezpiecznie włóż ją z powrotem do klatki domowej.
  6. Aby rozwinąć specyficzną dla antygenu odpowiedź na C. albicans, należy zmobilizować prawą opuszkę stopy myszy za pomocą przygotowanego HK C. albicans poprzez wstrzyknięcie śródskórne 7 dni po uczuleniu, jak opisano wcześniej (1 × 107 komórek; 40 μl na opuszkę stopy; powtórz kroki 2.1-2.5).
  7. Zebrać drenujące skórę LN 7 dni po uczuleniu na C. albicans lub uszkodzeniu tkankowym opuszki stopy 24 godziny po prowokacji antygenem po eutanazji w komorze CO2 .

3. Zubożenie komórek dendrytycznych in vivo wywołane toksyną błoniczą

UWAGA: W tym badaniu, zarówno myszy Langerin-DTR, jak i CD301b-DTR były leczone DT 1 dzień przed i po śródskórnym uczuleniu na C. albicans.

  1. Przygotować 10 μg/ml roztworu DT w PBS.
  2. Zdjąć nakrętkę z igły strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml, wymieszać DT i napełnić strzykawkę DT.
  3. Prawidłowo unieruchamiaj myszy w pozycji głową w dół.
  4. Zdezynfekuj brzuszną stronę myszy za pomocą 70% etanolu.
  5. Powoli wstrzyknij każdej myszy 100 μl 1 μg DT dootrzewnowo do lewego dolnego kwadrantu jamy brzusznej, aby zubożyć określone podzbiory komórek dendrytycznych.
    UWAGA: Należy uważać, aby nie uszkodzić narządów podczas wstrzyknięcia.
  6. Odczekaj 5 sekund, a następnie powoli wyjmij igłę.

4. Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym

  1. Umieść mysz w komorze CO2 do momentu, aż nie zaobserwuje się ruchu oddechowego.
  2. Zdezynfekuj mysz 70% etanolem i pokrój zmianę na skórze tylnej poduszki stopy na małe kawałki za pomocą kleszczy i nożyczek.
  3. Całkowicie zanurz pokrojone tkanki w odczynniku do izolacji RNA.
  4. Homogenizować próbki za pomocą homogenizatora tkankowego zgodnie z instrukcjami producenta (2 cykle po 3 minuty przy 30 Hz).
    UWAGA: W tym badaniu do lizy tkanek użyto kulek ze stali nierdzewnej.
  5. Wirować z prędkością 10 000 × g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C.
  6. Ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki.
  7. Wyizoluj całkowite RNA ze skóry zmienionej chorobowo za pomocą zestawu do izolacji całkowitego RNA.
  8. Oznaczyć stężenie RNA za pomocą spektrofotometru UV-Vis.
  9. Zsyntetyzuj cDNA za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji do ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR).
  10. Wykonuj qPCR w czasie rzeczywistym za pomocą systemu PCR w czasie rzeczywistym, monitorując syntezę dwuniciowego DNA podczas cykli PCR przy użyciu zielonego barwnika fluorescencyjnego.
    UWAGA: W tym badaniu wyniki zostały znormalizowane do poziomu fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-guaninowej (Hprt). Sekwencje starterów są wymienione w tabeli 1, a protokół PCR jest następujący: początkowa denaturacja w temperaturze 95 °C przez 30 s, amplifikacja przez 42 cykle (95 °C przez 5 s, 60 °C przez 30 s).

5. Izolacja komórek i analiza metodą cytometrii przepływowej

  1. Po eutanazji CO2 należy przeprowadzić sekcję myszy za pomocą kleszczy i nożyczek, ostrożnie odsłaniając i zbierając drenujące opuszki stopy LN zwane LN podkolanowe, znajdujące się za kolanem.
  2. Przygotować zawiesiny jednokomórkowe z LN drenujących opuszki stóp każdej myszy, filtrując tkanki przez sitko o średnicy 70 μm po homogenizacji za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 3 ml.
  3. Przemyć komórki PBS i wirować w temperaturze 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Odrzucić supernatant i ponownie przemyć komórki PBS.
  5. Wirować z prędkością 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w kompletnym pożywce RPMI-10 zawierającej 55 μM β-merkaptoetanolu, 50 ng/ml 12-mirystynianu 13-octanu forbolu (PMA) i 500 ng/ml jonomycyny w 24-dołkowej płytce do stymulacji limfocytów T.
  7. Po 1 godzinie dodać 10 μg/ml brefeldyny A i 1000x monenzyny do zawiesiny komórkowej i hodować przez dodatkowe 5 godzin.
  8. Zbierz komórki i umyj je buforem do sortowania komórek aktywowanym fluorescencją (FACS).
  9. Wirować z prędkością 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
  10. Zabarwić martwe komórki barwnikiem barwiącym martwe komórki i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  11. Przemyć próbki buforem FACS i wirować je z prędkością 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  12. Odrzucić supernatant i wybarwić komórki przeciwciałami markerowymi powierzchniowymi sprzężonymi z fluorochromem i blokerem receptora Fc przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  13. Przemyć próbki buforem FACS i wirować je z prędkością 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  14. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulowane komórki w roztworze utrwalającym i przepuszczalnym przez 15-20 minut w temperaturze 4 °C w celu barwienia wewnątrzkomórkowego.
  15. Przemyć próbki 1x buforem płuczącym i wirować w temperaturze 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  16. Odrzucić supernatant i wykonywać wewnątrzkomórkowe barwienie cytokinami przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  17. Przemyć próbki 1x buforem płuczącym i wirować w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  18. Ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości (200-300 μl) buforu FACS.
  19. Analizuj ekspresję białek za pomocą cytometrii przepływowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj zademonstrowaliśmy śródskórny model infekcji C. albicans, aby zbadać rolę skórnej odpowiedzi immunologicznej Th17 in vivo. Po początkowym śródskórnym wstrzyknięciu C. albicans do opuszki stopy, drenujące skórę LN zostały powiększone (Ryc. 2A). W okresie uczulenia stosunek limfocytów T efektorowych CD4 + do CD8 + znacznie wzrósł (Rysunek 2B, C). Dodatkowo, efektorowe limfocyty T CD4 + obficie wytwarza...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W pracy opisano metodę śródskórnego zakażenia C. albicans , która pozwala na badanie roli skórnych DC w odpowiedzi immunologicznej Th17 in vivo. Stosując wieloparametryczną analizę cytometryczną przepływową ze szczepami myszy indukowanymi przez DT, stwierdziliśmy, że skórne DC CD301b + są kluczowym podzbiorem DC skóry do inicjowania odporności Th17 na głębokie zakażenie skórne C. albicans . Co więcej, wyniki wykazały, że odpowiedź limfocytów T wytwarzających IL-17 była wytwarzana głó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez grant badawczy Wydziału Samjung-Dalim Yonsei University College of Medicine (6-2019-0125), przez Program Badań Podstawowych za pośrednictwem Narodowej Fundacji Badawczej Republiki Korei finansowany przez Ministerstwo Edukacji (2019R1A6A1A03032869) oraz Ministerstwo Nauki i Technologii Informacyjnych i Komunikacyjnych (2018R1A5A2025079, 2019M3A9E8022135 i 2020R1C1C1014513), oraz przez Koreańskie Centra Kontroli i Prewencji Chorób (KCDC, 2020-ER6714-00).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka insulinowa 0,3 ml (31 G)  BD328822
1x  Bufor do trwałej ondulacji/płukaniaBD554723
1 ml (30 G) strzykawka insulinowa strzykawka  BD328818
24-dołkowa Falcon353047
50 ml probówka stożkowaFalcon50050
70 μ m sitkoFalcon352350
70% etanol
ABI StepOnePlus system PCR w czasie rzeczywistymApplied Biosystems
Komora anestezjologicznaAparat
Brefeldin ABDBD
β-MerkaptoetanolGibco21985023
Candida Szczep albicans SC5314dostarczony przez Daniela Kaplana z Uniwersytetu w Pittsburghu
CD3BioLegend100216Klon 17A2
Myszydostarczone przez Akiko Iwasaki na Uniwersytecie Yale
CD4BioLegend100408Klon GK1.5
CD44eBioscience47-0441-80Klon IM7
CD8aBD Biosciences553031Clone 53.6.7
Wirówka
Licznik
KuwetaKartellKA.1938
Roztwór Cytofix/CytopermBD554722
Toksyna błonicza (DT)Sól fizjologiczna buforowana
Dulbecco (DPBS)WelgeneLB001-02
Bufor FACS (sortowanie komórek aktywowane fluorescencją)Wewnętrzny
bloker receptora FcBD553142
Surowica bydlęca płodu (FBS)WelgeneS101-07
KleszczeRobozdo pobierania próbki
HemocytometrFisher Scientific267110
Zestaw całkowitego RNA Hybrid-RGeneAll Biotechnology305-101
hydroksyetylopiperazyna, kwas etanosulfonowy (HEPES)Gibco15630-080
IL-17A (cytokina wewnątrzkomórkowa)BioLegend506912klon TC11-18H10.1
JonomycynaSigmaI0634
Izofluran
Langerin-DTRdostarczone przez Heung Kyu Lee w Koreańskim Zaawansowanym Instytucie Nauki i Technologii
LIVE/DEAD Zestaw do barwienia Aqua Dead CellInvitrogenL34957
Pętla i igłaSPL90010
MonenzynaBDBD554724
NanoDrop 2000Thermo Scientific
Penicylina  Gibco15140-122
szalka PetriegoSPL10090
Phorbol 12-mirystynian 13-octan (PMA)SigmaP8139
PrimeScript RT Master MixTakara BioRR360A
RPMI 1640Gibco11875-093
NożyczkiRobozdo pobierania próbek
Koraliki ze stali nierdzewnej, 5 mmQIAGEN69989
Sterylna końcówka
SYBR Green Premix Ex Taq IITakara BioRR820A
TCRβTermomikser BioLegend109228Clone H57-597
  CEppendorf
TissueLyserQIAGEN
UV-VIS spektrofotometrPerkinElmer
Wild-type C57BL/6  myszy Użyto myszy Orient Biow wieku od 7 do 9 tygodni
Pożywka drożdżowo-peptonowo-dekstrozo-adeninowa (YPDA), płynna, sterylna (1% ekstrakt drożdżowy, 2% pepton bakto, 2% dekstroza)
Płytka agarowa YPDA, sterylna (1% ekstrakt drożdżowy, 2% pepton bakto, 2% dekstroza, 2% agar bakto)
Harvarda 555029 CD301b-DTR klików fosforanami Sigma do pipet Myszy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nature Reviews Immunology. 9 (10), 679-691 (2009).
  2. Bouwstra, J. A., Ponec, M. The skin barrier in healthy and diseased state. Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (12), 2080-2095 (2006).
  3. Kabashima, K., Honda, T., Ginhoux, F., Egawa, G. The immunological anatomy of the skin. Nature Reviews Immunology. 19 (1), 19-30 (2019).
  4. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
  5. Kashem, S. W., Haniffa, M., Kaplan, D. H. Antigen-presenting cells in the skin. Annual Review of Immunology. 35, 469-499 (2017).
  6. Kaplan, D. H. Ontogeny and function of murine epidermal Langerhans cells. Nature Immunology. 18 (10), 1068-1075 (2017).
  7. Kim, T. G., et al. Skin-specific CD301b(+) dermal dendritic cells drive IL-17-mediated psoriasis-like immune response in mice. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 844-853 (2018).
  8. Durai, V., Murphy, K. M. Functions of murine dendritic cells. Immunity. 45 (4), 719-736 (2016).
  9. O'Shea, J. J., Paul, W. E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4+ T cells. Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).
  10. Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 cells. Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).
  11. Hernandez-Santos, N., Gaffen, S. L. Th17 cells in immunity to Candida albicans. Cell Host & Microbe. 11 (5), 425-435 (2012).
  12. Burstein, V. L., et al. IL-17-mediated immunity controls skin infection and T helper 1 response during experimental Microsporum canis dermatophytosis. Journal of Investivative Dermatology. 138 (8), 1744-1753 (2018).
  13. Sparber, F., et al. The skin commensal yeast Malassezia triggers a type 17 response that coordinates anti-fungal immunity and exacerbates skin inflammation. Cell Host & Microbe. 25 (3), 389-403 (2019).
  14. Igyarto, B. Z., et al. Skin-resident murine dendritic cell subsets promote distinct and opposing antigen-specific T helper cell responses. Immunity. 35 (2), 260-272 (2011).
  15. Santus, W., et al. Skin infections are eliminated by cooperation of the fibrinolytic and innate immune systems. Science Immunology. 2 (15), (2017).
  16. Kashem, S. W., et al. Candida albicans morphology and dendritic cell subsets determine T helper cell differentiation. Immunity. 42 (2), 356-366 (2015).
  17. Chen, H., Zhou, X., Ren, B., Cheng, L. The regulation of hyphae growth in Candida albicans. Virulence. 11 (1), 337-348 (2020).
  18. Santus, W., Mingozzi, F., Vai, M., Granucci, F., Zanoni, I. Deep dermal injection as a model of Candida albicans skin infection for histological analyses. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57574(2018).
  19. Villablanca, E. J., Mora, J. R. A two-step model for Langerhans cell migration to skin-draining LN. European Journal of Immunology. 38 (11), 2975-2980 (2008).
  20. Persson, E. K., et al. IRF4 transcription-factor-dependent CD103(+)CD11b(+) dendritic cells drive mucosal T helper 17 cell differentiation. Immunity. 38 (5), 958-969 (2013).
  21. Marcoux, D., et al. Deep cutaneous fungal infections in immunocompromised children. Journal of the American Academy of Dermatology. 61 (5), 857-864 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

zaka enie r dsk rnebariera sk rnakom rki prezentuj ce antygencytometria przep ywowaekspresja gen wsubpopulacje kom rek dendrytycznych sk ry w a ciwejgrzybiczna infekcja sk ry
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły