Method Article

Badanie właściwości strukturalnych i dynamicznych transportujących nanostruktur subkomórkowych za pomocą spektroskopii fluktuacji czasoprzestrzennej

DOI:

10.3791/62790

⸱

August 16th, 2021

 ,  ,  , 
1NEST Laboratory, Scuola Normale Superiore, 2Center for Nanotechnology Innovation@NEST CNI@NEST

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza średniego kwadratu (iMSD) wyprowadzona z obrazowania jest stosowana do makropinosomów, aby podkreślić ich wewnętrzną, ewoluującą w czasie naturę pod względem właściwości strukturalnych i dynamicznych. Makropinosomy są następnie porównywane z granulkami wydzielniczymi insuliny (ISG) jako odniesienie dla struktur subkomórkowych o niezmiennych w czasie średnich właściwościach strukturalnych/dynamicznych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie wywodzące się ze średniego kwadratu przemieszczenia (iMSD) jest używane do zajmowania się strukturalnymi i dynamicznymi właściwościami subkomórkowych nanostruktur, takich jak pęcherzyki biorące udział w endo/egzocytotycznym transporcie substancji rozpuszczonych i biomolekuł. iMSD opiera się na standardowym obrazowaniu poklatkowym, jest kompatybilne z dowolnym układem optycznym i nie musi skupiać się na pojedynczych obiektach, aby wyodrębnić trajektorie. Z każdego śladu iMSD oblicza się unikalny tryplet średnich parametrów strukturalnych i dynamicznych (tj. rozmiar, lokalna dyfuzyjność, współczynnik anomalny) i łączy się go w celu zbudowania "sygnatury iMSD" badanej nanostruktury.

Siła tego podejścia jest tutaj udowodniona na przykładzie makropinosomów. Pęcherzyki te ewoluują w czasie, zmieniając swoją średnią wielkość, liczbę i właściwości dynamiczne, przechodząc od wczesnych do późnych etapów transportu wewnątrzkomórkowego. Jako kontrola, granulki wydzielania insuliny (ISG) są używane jako odniesienie dla struktur subkomórkowych, które żyją w stanie stacjonarnym, w którym średnie właściwości strukturalne i dynamiczne całej populacji obiektów są niezmienne w czasie. Analiza iMSD uwypukla te szczególne cechy ilościowo i toruje drogę do podobnych zastosowań na poziomie subkomórkowym, zarówno w stanach fizjologicznych, jak i patologicznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanostruktury subkomórkowe (np. pęcherzyki endocytarne/wydzielnicze, organelle) odgrywają kluczową rolę w regulacji sygnalizacji komórkowej1. Właściwe dostrojenie ich cech strukturalnych (np. rozmiar) i/lub dynamicznych (np. dyfuzyjności) określa, jak komórka reaguje na bodźce wewnętrzne lub zewnętrzne2,3,4. Opierając się na tych dowodach, nie jest zaskakujące, że zmiany tych cech występują w wielu stanach patologicznych. Przykłady obejmują rolę nieprawidłowo regulowanej endocytozy w nowotworach2,3, strukturalne i dynamiczne zmiany stwierdzone na poziomie ISG w komórkach β narażonych na cukrzycę typu 2 5, nieprawidłowa regulacja lizosomalnych właściwości strukturalnych i transportowych w leukodystrofii globoidalnej lub lipidozie galaktozyloceramidowej6oraz dysfunkcje w szlaku endo-lizosomalnym w chorobach neurodegeneracyjnych (np. choroba Alzheimera)7.

W tym kontekście, badacze udowodnili niedawno, że wydajność standardowych metod mikroskopii optycznej może być zwiększona poprzez odpowiednie dostrojenie rozdzielczości próbkowania przestrzennego i czasowego8. To z kolei może dostarczyć dalszych informacji na temat istotnych procesów biologicznych. W praktyce jest to możliwe dzięki algorytmowi analizy fluktuacji czasoprzestrzennych, który jednocześnie wyodrębnia średnie właściwości strukturalne i dynamiczne obiektów dyfuzyjnych bezpośrednio ze standardowego stosu obrazów mikroskopii optycznej bez konieczności wstępnej wiedzy na temat interesującego nas obiektu biologicznego i ekstrakcji trajektorii pojedynczych obiektów. Wszystkie te informacje są zawarte w jednym wyjściu metody: iMSD trace9 (szczegóły dotyczące wyprowadzania i analizy śladu iMSD znajdują się w pliku uzupełniającym 1).

Wynikowy protokół eksperymentalny składa się z kilku kroków. Po pierwsze, obrazowanie obszaru zainteresowania jest wykonywane w wysokiej rozdzielczości czasowej. Następnie ze stosu obrazów obliczane są średnie funkcje korelacji przestrzenno-czasowej. Wreszcie, dzięki dopasowaniu gaussowskiemu szeregu funkcji korelacji, średnie "prawo dyfuzji" uzyskuje się bezpośrednio z obrazowania i analizuje w celu rozpoznania trybu dyfuzji obiektu. Potencjał tej metody został już udowodniony dla różnych obiektów biologicznych, począwszy od molekuł, a skończywszy na nanocząstkach, a nawet całych organellach/strukturach subkomórkowych9,10,11,12,13,14,15.

Ten artykuł opisuje zastosowanie iMSD do makropinosomów, aby podkreślić ich wewnętrzną, nieodwracalną naturę ewolucji w czasie pod względem ich średnich (tj. na poziomie całej populacji) właściwości strukturalnych i dynamicznych. Co więcej, te pęcherzyki endocytarne są porównywane z ISG jako odniesienie dla struktur subkomórkowych w "stanie stacjonarnym", tj. stanie, w którym średnie właściwości strukturalne/dynamiczne całej populacji granulek pozostają stałe w dowolnym punkcie czasowym. Makropinocytoza definiuje serię zdarzeń zainicjowanych przez rozległą reorganizację (lub potarganie) błony plazmatycznej w celu utworzenia zewnętrznej struktury makropinocytycznej, która jest następnie internalizowana16. Powstałe makropinosomy we wczesnym stadium są bardzo podobne do fagosomów. Jednocześnie można je odróżnić od innych form pęcherzyków endocytarnych ze względu na charakterystyczne duże rozmiary, niejednorodność morfologiczną i brak struktur białkowo-płaszczowych.

Testy biochemiczne wykazały, że po internalizacji, makropinosomy stopniowo wzbogacają się o markery białkowe innych szlaków endocytarnych, co z kolei sugeruje, że ich tożsamość ciągle się zmienia podczas transportu17. Wykorzystując przeciwciała przeciwko znanym markerom szlaku endosomalnego, wykazano, że makropinosomy stopniowo przyjmują klasyczne cechy endosomalne: zmniejszają się, przekształcają się w późne struktury endocytarne (np. lizosomy) lub ostatecznie tracą swoją tożsamość poprzez pobieranie określonych markerów molekularnych za pośrednictwem błony (np. sortowanie neksyn)18,19. Ogólny scenariusz jest taki, że każdy pojedynczy makropinosom w komórce nieodwracalnie zmienia swoją strukturalną i dynamiczną (a także molekularną) tożsamość podczas transportu z błony plazmatycznej do ostatecznego losu wewnątrzkomórkowego. W rezultacie właściwości strukturalne/dynamiczne/molekularne całej populacji makropinosomów również zmieniają się wzdłuż tej samej ścieżki czasowej. Będąc wewnętrznie wrażliwą na średnie właściwości całej populacji obserwowanych obiektów, metoda iMSD ilościowo obrazuje "ewoluującą naturę" poprzez kwantyfikację kluczowych parametrów średnich, tj. lokalnej dyfuzyjności i współczynnika anomalnego (właściwości dynamiczne) oraz średniej wielkości makropinosomów (właściwości strukturalne) na dowolnym etapie ich transportu wewnątrzkomórkowego.

Dla porównania, podobne pomiary przeprowadzono na dobrze znanej strukturze zamkniętej w błonie wewnątrzkomórkowej, ISG, w modelu komórek β. Podobnie jak w przypadku makropinosomów, regulacja właściwości strukturalnych i dynamicznych ISG, od ich powstania w sieci Trans Golgiego (TGN) do egzocytozy w błonie komórkowej, ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego wykonania funkcji ISG20. Jednak w przeciwieństwie do makropinosomów, ISG żyją w "stanie stacjonarnym", w którym w dowolnym momencie wszystkie funkcjonalne/strukturalne/molekularne etapy długości życia ISG są jednocześnie obecne w komórce, a każdy z nich jest reprezentowany przez określoną subpopulację ISG. Oznacza to, że chociaż każda pojedyncza granulka nieodwracalnie ewoluuje od biogenezy do wydzielania, oczekuje się, że średnie właściwości strukturalne/dynamiczne całej populacji granulek pozostaną stałe w dowolnym punkcie czasowym (chyba że warunki stanu stacjonarnego zostaną zmienione, na przykład, przez bodźce zewnętrzne, takie jak glukoza, cholesterol i cytokiny13). Potwierdza to analiza iMSD.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie próbki

  1. Przed eksperymentem mikroskopowym subkulturuj komórki w naczyniach nadających się do zastosowań mikroskopowych.
    1. Umyj 10-centymetrowe naczynie poddane kulturze tkankowej z konfluentnymi komórkami HeLa lub INS 1E (insulinoma β-cell-like) dwukrotnie 0,01 M 1x PBS, dodaj 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA (1x) i umieść w 37 °C, wilgotnym, 5% inkubatorze CO2 2 na 5 minut.
    2. Ponownie zawiesić oderwane komórki, dodając 9 ml kompletnego podłoża DMEM (dla komórek HeLa) lub RPMI 1640 (dla komórek INS-1E) i zebrać ostatnie 10 ml w probówkach wirówkowych.
    3. Wysiewać około 2 × 105 komórek w każdym naczyniu o wymiarach 35 mm x 10 mm w końcowej objętości 1 ml pożywki. Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. Do fluorescencyjnego znakowania lizosomów użyj LysoTracker Red DND-99.
    1. Rozcieńczyć roztwór podstawowy w 1 ml podgrzanego podłoża do końcowego stężenia barwnika 70 nM.
    2. Zastąp pożywkę z naczynia świeżą pożywką zawierającą LysoTracker. Inkubować komórki w pożywce zawierającej LysoTracker przez 20 minut w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2 i przemyć je dwukrotnie świeżą pożywką przed eksperymentem.
    3. Do fluorescencyjnego znakowania makropinosomów należy użyć izotiocyjanianu fluoresceiny o masie 70 kDa. Przemyć subkultury komórkowe trzykrotnie 0,01 M 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), zastąpić pożywką zawierającą dekstran (1 mg/ml) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Przed przystąpieniem do eksperymentu mikroskopowego należy trzykrotnie umyć komórki świeżą pożywką.
    4. Aby fluorescencyjnie znakować ISG w komórkach INS-1E, należy transfekować komórki za pomocą odczynnika do transfekcji (patrz tabela materiałów) i plazmidu z zielonym białkiem fluorescencyjnym (EGFP) wzmocnionego peptydem C (EGFP) class<="xref">13 zgodnie z protokołem producenta i inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny w atmosferze 5% CO2 przed eksperymentem.

2. Akwizycja danych

  1. Aby mikroskop osiągnął równowagę w żądanej temperaturze i atmosferze, należy włączyć układ sterowania inkubatorem mikroskopu co najmniej 2 godziny przed eksperymentem.
    UWAGA: Każda akwizycja to seria poklatkowa.
  2. Obrazy można uzyskać za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw zanurzeniowy z aperturą numeryczną (NA) 60x, 1,2x.
  3. Użyj lasera argonowego o długości fali 488 nm do wzbudzenia EGFP (transfekowanych komórek) i makropinosomów znakowanych fluoresceiną. Zebrać emisję fluorescencji w zakresie od 500 do 600 nm za pomocą standardowego detektora fotopowielacza.
  4. Użyj lasera HeNe o długości fali 543 nm, aby wzbudzić Lysotracker i zebrać jego emisję fluorescencji w zakresie od 555 do 655 nm.
  5. Ustaw średnicę otworu detekcyjnego na rozmiar 1 Airy. Dla każdej akwizycji zbierz serię 1000 sekwencyjnych klatek. Ustaw czas zatrzymania piksela na 2 μs/piksel, aby uzyskać czas klatki 129 ms.
    UWAGA: Każda klatka składała się z 256 x 256 pikseli (16 bitów/piksel) o fizycznym wymiarze 69 nm/piksel, co odpowiada w przybliżeniu obszarowi 17 μm x 17 μm.

3. iObliczanie MSD

UWAGA: Aby poprawnie wykonać obliczenia, użyj oprogramowania zdolnego do obliczeń numerycznych i programowania skryptów. Konkretny skrypt (np. plik skryptu 'iMSD.m', patrz Plik pomocniczy 1) musi znajdować się w tym samym katalogu zawierającym serię obrazów, która ma być przetworzona. Każdy obraz z serii musi być zapisany jako osobny plik ".tif".

  1. Aby poprawnie zainicjować parametry instrumentalne używane do akwizycji, otwórz iMSD.m za pomocą programowego edytora tekstu i zmodyfikuj jego pierwszą sekcję w następujący sposób.
    1. Ustaw N jako liczbę ramek w szeregu czasowym (np. 1000 w tym protokole).
    2. Ustaw px_size: rozmiar piksela, wyrażony w μm (np. 0,069 w tym protokole).
    3. Zestaw f: rozdzielczość czasowa każdej klatki, wyrażona w sekundach (np. 0,129 w tym protokole).
    4. Ustaw Filtr: wejście binarne do korekcji tła, ustaw wartość na "0", aby przetwarzać obrazy RAW lub ustaw wartość na "1", aby wykonać odejmowanie tła na podstawie progu.
    5. Ustaw av_toll: próg korekcji tła; każdy piksel o intensywności mniejszej niż ta wartość zostanie ustawiony na 0, jeśli Filter=1.
    6. Ustaw bit jako liczbę całkowitą określającą intensywność próbkowania (np. 8 bitów, 16 bitów).
  2. Zapisz i uruchom edytowany plik skryptu iMSD.m.
  3. Sprawdź wykonanie skryptu.
    UWAGA: Stan przetwarzania obliczeń można sprawdzić w oknie poleceń; Jeśli wystąpi jakikolwiek problem krytyczny, proces zostanie przerwany i zostanie wyświetlony komunikat ostrzegawczy pokazujący typ błędu i powiązany kod wiersza. W przeciwnym razie wykonaj kroki 3.3.1-3.3.3.
    1. Zaimportuj stos obrazów i odejmij tło (jeśli jest to wymagane).
    2. Oblicz funkcję korelacji czasoprzestrzennej G(ξ,η,τ) przy użyciu metody Fouriera.
    3. Dopasuj funkcję korelacji czasoprzestrzennej do funkcji Gaussa 2D.
      UWAGA: Na końcu procesu w oknie poleceń zostaną wyświetlone wartości wyjściowe procedur dopasowaniaσ 2(τ): raportowane są średnie, błąd i odpowiadająca im dobroć (R2) dopasowania.
  4. Sprawdź wyjście graficzne.
    UWAGA: Krzywa iMSD i odpowiadające jej krzywe dopasowania są pokazane w trzech oddzielnych panelach, z których każdy odpowiada innemu typowi stosowanego równania dopasowania: dyfuzji Browna, dyfuzji anomalnej lub dyfuzji ograniczonej. Dla każdej krzywej wartość R2 jest podawana w legendzie wykresu.
  5. Sprawdź tekst output.
    UWAGA: Na końcu procesu tworzony jest plik ".xls" o tej samej nazwie, co oryginalny plik poklatkowy ".tif". Pierwszy arkusz zawiera wartości ξ, η, τ i σ2 obliczone dla każdego opóźnienia czasowego. Parametry wejściowe i główne obliczone wartości wyjściowe są podane w drugim arkuszu, tj. współczynnik dyfuzji, współczynnik anomalny i punkt przecięcia osi y σ2:0.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólny przebieg metody jest przedstawiony w Rysunek 1. Podsumowuje on główne kroki przedstawione w sekcji protokołu, od przygotowania próbki (Rysunek 1A) do obrazowania poklatkowego wewnątrzkomórkowych nanostruktur (Rysunek 1B), analizy fluktuacji w celu obliczenia szeregu funkcji korelacji czasoprzestrzennej (Rysunek 1C) i dopasowania do wyprowadzenia średnich właściwości strukturalnych/dynamicznych badanego obiektu (Rysunek 1D).

Krytycznym parametrem jest rozdzielczość czasowa przyjęta do obrazowania subkomórkowego obiektu zainteresowania. Ta wartość eksperymentalna wyznaczy próg czasowy, przy którym będzie mierzone minimalne średnie przemieszczenie obiektów będących przedmiotem zainteresowania. Preferowanym warunkiem jest jednak ustawienie rozdzielczości czasowej obrazowania, przy której obiekt zainteresowania wydaje się "nieruchomy" w uchwyconej klatce, tj. wykazuje charakterystyczny rozmiar, który średnio nie ulega deformacji pod wpływem prędkości obrazowania. Jest to technicznie możliwe, jeśli przedmiotem zainteresowania jest zamknięta błoną struktura subkomórkowa lub organella (jak w tym przypadku). Zazwyczaj struktury subkomórkowe wykazują lokalne współczynniki dyfuzji (D, μm2 / s, patrz tabela 1), które są o kilka rzędów wielkości niższe niż w przypadku izolowanych pojedynczych cząsteczek w cytoplazmie (np. GFP21). Walidację można przeprowadzić poprzez sztuczne unieruchomienie organelli będącej przedmiotem zainteresowania (np. przez utrwalenie chemiczne). Rzeczywiście, warunek ten może służyć jako odniesienie do określenia rzeczywistej wielkości organelli w zastosowanych warunkach eksperymentalnych (np. długość fali wzbudzenia, rozmiar piksela, obiektyw).

Tutaj, mimo że lizosomy zostały użyte jako organelle testowe do tej procedury, wyniki są ważne niezależnie od struktury docelowej. Rysunek 2A pokazuje obraz stałego (tj. nieruchomego) lizosomu wraz z akwizycją przeprowadzoną na żywych komórkach w odpowiedniej rozdzielczości czasowej (tj. zazwyczaj poniżej 100 ms/klatkę; np. 65 ms/klatkę w przykładzie w Rysunek 2B) oraz akwizycję wykonaną celowo w bardzo niskiej rozdzielczości czasowej (np. 10 s/klatkę w przykładzie w Rysunek 2C). Dla każdego warunku rozmiar obiektu rozpraszającego jest wyodrębniany w następujący sposób: i) profil intensywności plamki jest uzyskiwany za pomocą narzędzia linii w oprogramowaniu ImageJ; ii) profil intensywności jest wykreślany i interpolowany przez funkcję Gaussa w celu obliczenia pełnej szerokości przy połowie wartości maksimum (FWHM), która z kolei jest używana jako oszacowanie średnicy plamki (Rysunek 2D). Zgodnie z oczekiwaniami i wykresem Rysunek 2E, akwizycja w bardzo wysokiej rozdzielczości czasowej (tj. 65 ms/klatkę) daje średni rozmiar struktury zbliżony do uzyskanego w ustalonej próbce, albo przy użyciu standardowego narzędzia opisanego powyżej, albo przez wyodrębnienie punktu przecięcia osi y iMSD. Zamiast tego, akwizycja przy niskiej prędkości powoduje wzrost pozornego rozmiaru struktury, ze względu na naturalną dynamikę struktury podczas obrazowania. W nieoptymalnych warunkach eksperymentalnych uzyskane informacje strukturalne/dynamiczne nie odzwierciedlają wiernie wewnętrznych właściwości badanego obiektu.

Po wybraniu głównych parametrów eksperymentalnych, można utworzyć zestawy danych dla docelowych struktur wewnątrzkomórkowych. W przypadku makropinosomów, po 20 minutach inkubacji komórek z dektransem o stężeniu 70 kDa, uzyskano szeregi czasowe znakowanych struktur wewnątrzkomórkowych w różnych punktach czasowych po traktowaniu, od 30 minut do około 180 minut. Co ciekawe, stopniowa zmiana właściwości strukturalnych i dynamicznych makropinosomów jest wykrywana podczas transportu (Rysunek 3; rozkłady σ0 2, D, m, α i N dla makropinosomów są przedstawione na wykresach po lewej stronie). Chociaż podczas transportu nie wykrywa się żadnych oczywistych zmian w lokalnej dyfuzyjności (Dm) makropinosomów, zarówno charakterystyczny rozmiar (σ02), jak i ogólny tryb ruchu (α) ewoluują w czasie.

Na szczególną uwagę zasługuje fakt, że podczas transportu obserwuje się zmniejszenie średniej wielkości makropinosomów (Rysunek 3A, po lewej), wraz z jednoczesnym wzrostem subdyfuzyjnego charakteru ich ruchu (tj. oznaczonym jako spadek wartości α, Rysunek 3C, lewy panel). Dodatkowo, liczba makropinosomów została wyodrębniona z każdego przejęcia: wyniki, przedstawione w Rysunek 3D, lewy panel, wyraźnie ujawniają wzrost liczby makropinosomów w czasie. Wszystkie te wyniki są dobrze zgodne z oczekiwaniami, ponieważ makropinosomy znakowane dekstranem mają powstawać jako izolowane, duże pęcherzyki otoczone błoną na błonie plazmatycznej (które są również odpowiedzialne za ruch wzdłuż składników cytoszkieletu), ale mają stopniowo komunikować się ze szlakiem endo-lizosomalnym składającym się z dużej populacji mniejszych i losowo dyfuzyjnych struktur.

Jak przewidywano powyżej, wyniki dla makropinosomów kontrastują z podobnymi pomiarami wykonanymi na ISG (Rysunek 3, prawa kolumna). Granulki insuliny nie wykazują zmieniającego się w czasie trendu parametrów strukturalnych/dynamicznych pochodzących z iMSD (i ich średniej liczby w komórce) w tym samym oknie czasowym obserwowanym dla makropinosomów. Co więcej, wartości charakterystyczne σ02, Dm i α są zupełnie inne niż w przypadku lizosomów, ponownie użytych jako odniesienie. Wynik ten potwierdza przewidywaną powyżej ideę, że granulki są badane w "stanie stacjonarnym", w którym w dowolnym momencie średnie właściwości strukturalne/dynamiczne całej populacji ISG pozostają niezmienione (tj. pozostają stałe, chyba że warunki stanu stacjonarnego zmienią się, na przykład z powodu bodźców zewnętrznych).

figure-results-1
Rysunek 1: Eksperymentalny przebieg pracy. (A) Komórki były platerowane przez 24 godziny (48 godzin dla eksperymentów transfekcyjnych) przed eksperymentami konfokalnymi na szalkach komórkowych nadających się do zastosowań mikroskopowych. Komórki zostały następnie odpowiednio potraktowane zgodnie z metodą znakowania (patrz protokół) w celu wybarwienia interesujących organelli cytoplazmatycznych. (B) Typowa akwizycja konfokalna składa się ze stosu obrazów (poklatkowych) cytoplazmatycznej części żywej komórki, opisujących ewolucję w czasie dynamiki znakowanych organelli. (C) Film poklatkowy jest analizowany za pomocą niestandardowego skryptu Matlab, najpierw obliczając funkcję korelacji obrazu czasoprzestrzennego i dopasowanie Gaussa w celu wykreślenia krzywych iMSD (D) i powiązanych wyodrębnionych parametrów dopasowania opisujących parametry dynamiki strukturalnej obrazowanych organelli. Skróty: iMSD = średnie przemieszczenie kwadratowe wyprowadzone z obrazowania; STICS = spektroskopia korelacji obrazów czasoprzestrzennych; α = anomalny współczynnik dyfuzji; Dm = dyfuzyjność lokalna; σ2(τ) = wariancja. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Prawidłowe parametry eksperymentalne. (A) Przykładowy obraz barwionych lizosomów w ustalonej próbce. Podziałka = 2 μm. (B) Pierwsza klatka stosu obrazów barwionych lizosomów w żywej komórce, uzyskanych z odpowiednimi parametrami. Rozdzielczość czasowa: 65 ms/klatkę. Podziałka liniowa = 2 μm. (C) Pierwsza klatka stosu obrazów barwionych lizosomów w żywej komórce, uzyskanych z małą prędkością: widoczna jest sztuczna deformacja pozornego rozmiaru lizosomu spowodowana ruchem organelli podczas obrazowania. Rozdzielczość czasowa: 10 s/klatkę. Pasek skali = 2 μm. (D) Przykład obliczenia rozmiaru dla obrazowanych lizosomów w niebieskim ROI (A), (B) i (C). Profil intensywności wzdłuż niebieskiej linii został wyposażony w funkcję Gaussa w celu uzyskania FWHM, tj. oszacowania wielkości plamki. Wartości FWHM są podawane dla każdej złączki. (E) Graficzne przedstawienie wartości wielkości uzyskanych w wyniku analizy obrazu opisanej w panelu (D) dla wszystkich obrazowanych lizosomów (kwadrat, wartość średnia i odchylenie standardowe), dla lizosomów zamkniętych w niebieskim ROI (niebieski trójkąt) i pobranych przez analizę iMSD (czerwone kółko). Ten rysunek pochodzi z 22. Skróty: ROI = region zainteresowania; FWHM = pełna szerokość w połowie maksimum; iMSD = średnie przemieszczenie kwadratowe pochodzące z obrazowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Czasowa ewolucja oznakowanych organelli. (A) Wykresy wartości wielkości wyodrębnionych przez iMSD w porównaniu z postępem czasowym kolejnych przejęć przedstawionych jako średnia zmierzonych wartości w akwizycjach przeprowadzonych w 10-minutowym oknie czasowym. Po lewej stronie postępujące zmniejszanie średniej wielkości makropinosomów (czarne kółka), a po prawej niezmienna w czasie wielkość granulek wydzielania insuliny (czarne kwadraty) w porównaniu z lizosomami, reprezentowane jako średnia wartość wielkości (grubsza czerwona linia) ± odchylenie standardowe (przerywane czerwone linie). (B) i (C) Progresja w czasie współczynników Dm i α dla makropinosomów (po lewej) i granulek insuliny (po prawej) ekstrahowanych za pomocą analizy iMSD. (D) Ewolucja w czasie liczby znakowanych makropinosomów i granulek insuliny mierzona w pierwszej klatce każdego pozyskanego filmu poklatkowego. Skróty: iMSD = średnie przemieszczenie kwadratowe wyprowadzone z obrazowania; α = anomalny współczynnik dyfuzji; Dm = dyfuzyjność lokalna, N = liczba. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

OrganelleEtykietowanieLinia komórkowaRozmiar (nm)Dm ( × 10-3 μm2/s)αNRef.
Wczesny endosom (EE)CellLight Wczesny endosom GFPHela395±743,0±2,41.02±0.20Rozdział 4010
Późny endosom (LE)CellLight Późny endosom GFPHela693±10215,4±10,60,57±0,16Rozdział 5810
Lizosom (LY)LysoTracker DND-99HelaNumer katalogowy: 471±7615,3±9,00,49±0,13143 Rozdział 14310, 14
Kaweola (CAV)Caveolin-EGFPHelaNumer telefonu 405±493,1±1,81,00±0,221510
pęcherzyk pokryty klatryną (CCV)Transferrin-Alexa 488Hela513±6216,2±9,90,48±0,1733 Rozdział 3310
Granulka insuliny (IG)C-peptyd-EGFPINS-1E335±563,0±1,70,70±0,14Rozdział 10711
Wczesny makropinosom (EMCR)Fluoresceina-dekstran 70 kDaHelaNumer katalogowy: 979±4238,3±90,79±0,273610
Makropinosom pośredni (IMCR)Fluoresceina-dekstran 70 kDaHela702±18013,7±19,90,60±0,382910
Późny makropinosom (LMCR)Fluoresceina-dekstran 70 kDaHela592±1275,8±4,70,39±0,212110

Tabela 1: Parametry strukturalne i dynamiczne wyodrębnionez MSD. Tabela przedstawia wartości wielkości, Dm i α współczynnik zmierzony dla różnych organelli, określając strategie znakowania, użytą linię komórkową i liczbę analizowanych akwizycji. Wartości są podawane jako średnia ± odchylenie standardowe. Skróty: iMSD = średnie przemieszczenie kwadratowe wyprowadzone z obrazowania; α = anomalny współczynnik dyfuzji; Dm = dyfuzyjność lokalna, N = liczba; GFP = białko zielonej fluorescencji; EGFP = wzmocnione białko zielonej fluorescencji.

Plik uzupełniający 1: Szczegóły dotyczące wyprowadzania i analizy śladów iMSD. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik pomocniczy 1: Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Właściwości i zalety iMSD są oczywiste w porównaniu z dostępnymi technikami pozyskiwania analogicznych informacji. W przypadku informacji strukturalnych preferowanym wyborem jest analiza za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Dzięki tej metodzie można uzyskać szczegóły ultrastrukturalne w rozdzielczości molekularnej, a nawet poza nią, nawet w przypadku nanostruktur subkomórkowych. Niemniej jednak swoista rozdzielczość przestrzenna TEM osiągana jest kosztem informacji w wymiarze czasowym, który jest tu interesujący. Aby to zrekompensować, szczególne zainteresowanie wzbudzają najnowsze postępy w technologiach obrazowania żywych komórek. Należą do nich nowe markery fluorescencyjne o zwiększonych parametrach (np. jasności i fotostabilności), zoptymalizowane procedury znakowania i bardziej czułe detektory. Ponadto dostępne są narzędzia analityczne do rozwiązywania problemów zarówno strukturalnych (np. "rozmiar" za pomocą analizy lokalnej spektroskopii korelacji obrazu opartej na fazorze, PLICS23, agregacja/oligomeryzacja za pomocą analizy liczbowej i jasności24), jak i dynamicznych (np. prawo dyfuzji przez śledzenie pojedynczych cząstek, tj. (SPT)25,26,27,28) parametrów w skali subkomórkowej. Metoda SPT zapewnia bezpośredni dostęp do trajektorii obiektu i jego MSD. Wadą jest jednak konieczność pomiaru niskiej gęstości sondy i bardzo jasnych etykiet oraz wielu trajektorii pojedynczych obiektów, aby spełnić kryteria statystyczne. Jeśli chodzi o rozdzielczość czasową pomiaru, nieorganiczne, fotostabilne sondy (np. kropki kwantowe lub nanocząstki metali) mogą zwiększyć wydajność SPT, ale kosztem złożonych procedur produkcyjnych i etykietowania.

W porównaniu z tymi standardami, opisana tutaj metoda iMSD wykazuje kilka kluczowych zalet. Po pierwsze, podejście to może być stosowane w połączeniu ze stosunkowo słabymi znacznikami fluorescencyjnymi, takimi jak genetycznie kodowane białka fluorescencyjne (np. zastosowanie do ISG). W ten sposób w porównaniu z SPT uzyskuje się wyższą rozdzielczość czasową (przy użyciu tej samej etykiety) ze względu na mniejszą wymaganą ilość fotonów8. Po drugie, metoda iMSD jest ograniczona jedynie rozdzielczością czasową, ale nie dyfrakcją. W rzeczywistości, pomimo zastosowanej konfiguracji optycznej ograniczonej dyfrakcją, można zmierzyć średnie przemieszczenia molekularne nawet poniżej granicy dyfrakcji, co wykazano już dla przepływów molekularnych za pomocą STICS29. Rzeczywista rozdzielczość w pomiarze przemieszczeń zależy od tego, jak dokładnie (pod względem sygnału do szumu) można zmierzyć funkcję korelacji, co wyjaśnia, dlaczego nie jest ona ograniczona dyfrakcją. Wydaje się zatem jasne, że minimalne przemieszczenie, które można zmierzyć, zależy od dyfuzyjności obiektu zainteresowania i rozdzielczości czasowej układu obrazowania.

W związku z tym ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że zastosowanie do nanostruktur subkomórkowych, takich jak makropinosomy lub granulki insuliny, za pomocą laserowego mikroskopu skaningowego jest optymalne: dostępna prędkość skanowania jest znacznie wyższa niż dynamika obiektu zainteresowania. W takim przypadku ruch obiektów podczas akwizycji jest znikomy, a funkcję korelacji można przybliżyć za pomocą funkcji Gaussa. Wreszcie, podejście oparte na technologii iMSD można łatwo zastosować do szerokiej gamy komercyjnych konfiguracji mikroskopii optycznej opartych na skanowaniu rastrowym lub obrazowaniu szerokokątnym za pomocą kamery, bez konieczności kalibracji systemu (wymaganej tylko wtedy, gdy konieczne jest dokładne oszacowanie wielkości cząstek). Ważnym parametrem, aby metoda działała, jest odpowiednie pobieranie próbek przestrzennych. Zgodnie z ogólną zasadą, aby osiągnąć zadowalającą zbieżność algorytmu dopasowania, minimalny rozmiar obszaru zainteresowania do obrazowania powinien być co najmniej 3 razy większy niż maksymalne przemieszczenie przedmiotu zainteresowania.

Podsumowując, metoda iMSD wymaga jedynie mikroskopu wyposażonego w szybki sposób akwizycji. Struktura, która jest przedmiotem zainteresowania, może być przypisana do dowolnego genetycznie kodowanego lub organicznego fluoroforu, umożliwiając w ten sposób obrazowanie wielokanałowe. Przewiduje się, że analiza krzyżowa iMSD zostanie wykorzystana w najbliższej przyszłości do selekcji subpopulacji subkomórkowych nanostruktur i ujawnienia ich interakcji i kodyfuzji w komórce, co jest gorącym tematem w biofizyce komórkowej. Jeśli jakikolwiek szczegół zostanie utracony przez analizę iMSD, jest to z pewnością związane z dużą ilością informacji molekularnej w dynamicznych nanostrukturach subkomórkowych. Takie informacje są nieuchronnie uśredniane podczas pomiaru ze względu na słabą rozdzielczość czasową. Teoretycznie jednak nie ma ograniczeń technicznych ze względu na możliwość pobierania informacji molekularnych, pod warunkiem, że uda się osiągnąć wystarczające prędkości akwizycji8. Ze względu na ciągłe ulepszenia w zakresie szybkości/czułości detektora i technologii obrazowania, przewiduje się, że informacje o całym przedziale subkomórkowym i jego składnikach molekularnych zostaną wyodrębnione z jednego zestawu danych.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca otrzymała finansowanie od Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC) w ramach Programu Badań i Innowacji Unii Europejskiej Horyzont 2020 (umowa o grant nr 866127, projekt CAPTUR3D).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100x Penicylina-Streptomycyna-GlutaminaGibco10378-016Pożywka komórkowa suplement
C-peptyd-EGFPPlazmid
DMEM o wysokiej zawartości glukozyGibco31053028Pożywka komórkowa (HeLa)
FBSGibco10082147Suplement pożywki komórkowej
Izotiocyjanian fluoresceiny-dekstran 70 kDaSigma Aldrich46945-100MG-FOdczynnik
HeLaATCCCCL-61Linia komórkowa
Lipofectamina 2000Odczynnik TermoFisher11668019Trasfection
Lysotracker Red DND-99GibcoL7528Oprogramowanie
MatlabMathWork
Naczynia komórkowe odpowiednie do mikroskopuWillcoGWSt-3522Szalki Petriego
Olympus FV1000Olympus JapanMikroskop konfokalny
RPMI 1640Gibco11835063Podłoże komórkowe (INS-1E)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Murphy, J. E., Padilla, B. E., Hasdemir, B., Cottrell, G. S., Bunnett, N. W. Endosomes: a legitimate platform for the signaling train. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17615-17622 (2009).
  2. Mosesson, Y., Mills, G. B., Yarden, Y. Derailed endocytosis: an emerging feature of cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (11), 835-850 (2008).
  3. Mellman, I., Yarden, Y. Endocytosis and cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (12), 016949(2013).
  4. Di Fiore, P. P. Endocytosis, signaling and cancer, much more than meets the eye. Preface. Molecular Oncology. 3 (4), 273-279 (2009).
  5. Bogan, J. S., Xu, Y., Hao, M. Cholesterol accumulation increases insulin granule size and impairs membrane trafficking. Traffic. 13 (11), 1466-1480 (2012).
  6. Ballabio, A., Gieselmann, V. Lysosomal disorders: From storage to cellular damage. Biochimica et Biophysica Acta. 1793 (4), 684-696 (2009).
  7. Hu, Y. -B., Dammer, E. B., Ren, R. -J., Wang, G. The endosomal-lysosomal system: from acidification and cargo sorting to neurodegeneration. Translational Neurodegeneration. 4, 18(2015).
  8. Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. Spatiotemporal fluctuation analysis: a powerful tool for the future nanoscopy of molecular processes. Biophysical Journal. 111 (4), 679-685 (2016).
  9. Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. Fast spatiotemporal correlation spectroscopy to determine protein lateral diffusion laws in live cell membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12307-12312 (2013).
  10. Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. From fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51994(2014).
  11. Digiacomo, L., et al. Dynamic fingerprinting of sub-cellular nanostructures by image mean square displacement analysis. Scientific Reports. 7 (1), 14836(2017).
  12. Durso, W., et al. Lysosome dynamic properties during neuronal stem cell differentiation studied by spatiotemporal fluctuation spectroscopy and organelle tracking. International Journal of Molecular Sciences. 21 (9), 3397(2020).
  13. Ferri, G., et al. Insulin secretory granules labelled with phogrin-fluorescent proteins show alterations in size, mobility and responsiveness to glucose stimulation in living β-cells. Scientific Reports. 9 (1), 2890(2019).
  14. Durso, W., D'Autilia, F., Amodeo, R., Marchetti, L., Cardarelli, F. Probing labeling-induced lysosome alterations in living cells by imaging-derived mean squared displacement analysis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (4), 2704-2709 (2018).
  15. Digiacomo, L., Digman, M. A., Gratton, E., Caracciolo, G. Development of an image Mean Square Displacement (iMSD)-based method as a novel approach to study the intracellular trafficking of nanoparticles. Acta Biomaterialia. 42, 189-198 (2016).
  16. Swanson, J. A., Watts, C. Macropinocytosis. Trends in Cell Biology. 5 (11), 424-428 (1995).
  17. Jones, A. T. Macropinocytosis: searching for an endocytic identity and role in the uptake of cell penetrating peptides. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11 (4), 670-684 (2007).
  18. Falcone, S., et al. Macropinocytosis: regulated coordination of endocytic and exocytic membrane traffic events. Journal of Cell Science. 119, Pt 22 4758-4769 (2006).
  19. Kerr, M. C., et al. Visualisation of macropinosome maturation by the recruitment of sorting nexins. Journal of Cell Science. 119, Pt 19 3967-3980 (2006).
  20. Rorsman, P., Renstrom, E. Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells. Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).
  21. Di Rienzo, C., Piazza, V., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. Probing short-range protein Brownian motion in the cytoplasm of living cells. Nature Communications. 5 (1), 5891(2014).
  22. Ferri, G., et al. Time-lapse confocal imaging datasets to assess structural and dynamic properties of subcellular nanostructures. Scientific Data. 5 (1), 180191(2018).
  23. Scipioni, L., Gratton, E., Diaspro, A., Lanzanò, L. Phasor analysis of local ICS detects heterogeneity in size and number of intracellular vesicles. Biophysical Journal. 111 (3), 619-629 (2016).
  24. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  25. Li, C. H., Bai, L., Li, D. D., Xia, S., Xu, T. Dynamic tracking and mobility analysis of single GLUT4 storage vesicle in live 3T3-L1 cells. Cell Research. 14 (6), 480-486 (2004).
  26. Donovan, K. W., Bretscher, A. Tracking individual secretory vesicles during exocytosis reveals an ordered and regulated process. Journal of Cell Biology. 210 (2), 181-189 (2015).
  27. Westphal, V., et al. Video-rate far-field optical nanoscopy dissects synaptic vesicle movement. Science. 320 (5873), 246-249 (2008).
  28. Tabei, S. M. A., et al. Intracellular transport of insulin granules is a subordinated random walk. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 4911-4916 (2013).
  29. Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophysical Journal. 88 (5), 3601-3614 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Spatiotemporal Fluctuation SpectroscopyMean Square DisplacementSubcellular NanostructuresMacropinosome TraffickingInsulin Secretory GranulesTime Lapse ImagingDynamic PropertiesStructural PropertiesFluorescence MicroscopyCross Correlation Analysis

Related Articles