Method Article

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

DOI:

10.3791/62813

⸱

July 16th, 2021

 ,  ,  , 
1Jefferson Weinberg ALS Center, Thomas Jefferson University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przed degeneracją neuronów, przyczyną deficytów motorycznych i poznawczych u pacjentów ze stwardnieniem zanikowym bocznym (ALS) i/lub otępieniem płata czołowo-skroniowego (FTLD) jest dysfunkcja komunikacji między neuronami a neuronami ruchowymi i mięśniami. Podstawowy proces transmisji synaptycznej obejmuje fuzję pęcherzyków synaptycznych zależną od depolaryzacji błony i uwalnianie neuroprzekaźników do synapsy. Proces ten zachodzi poprzez miejscowy napływ wapnia do zakończeń presynaptycznych, w których znajdują się pęcherzyki synaptyczne. W tym przypadku protokół opisuje metodologie obrazowania na żywo oparte na fluorescencji, które niezawodnie informują o egzocytozie pęcherzyków synaptycznych za pośrednictwem depolaryzacji i presynaptycznej końcowej dynamice napływu wapnia w hodowanych neuronach.

Za pomocą barwnika styrylowego, który jest wbudowany w błony pęcherzyków synaptycznych, wyjaśnia się uwalnianie pęcherzyków synaptycznych. Z drugiej strony, do badania wnikania wapnia wykorzystuje się Gcamp6m, genetycznie kodowany reporter fluorescencyjny. Stosujemy depolaryzację za pośrednictwem chlorku potasu o wysokiej zawartości chlorku potasu, aby naśladować aktywność neuronalną. Aby jednoznacznie określić ilościowo egzocytozę pęcherzyków synaptycznych, mierzymy utratę znormalizowanej fluorescencji barwnika styrylowego w funkcji czasu. W podobnych warunkach stymulacji, w przypadku napływu wapnia, fluorescencja Gcamp6m wzrasta. Normalizacja i kwantyfikacja tej zmiany fluorescencji odbywa się w podobny sposób jak protokół barwnika styrylowego. Metody te mogą być multipleksowane z nadekspresją fluorescencyjnie znakowanych zmutowanych białek opartą na transfekcji. Protokoły te były szeroko stosowane do badania dysfunkcji synaps w modelach FUS-ALS i C9ORF72-ALS, wykorzystując pierwotne neurony korowe i ruchowe gryzoni. Protokoły te z łatwością pozwalają na szybkie badania przesiewowe związków, które mogą poprawić komunikację neuronalną. W związku z tym metody te są cenne nie tylko dla badań nad ALS, ale dla wszystkich obszarów badań neurodegeneracyjnych i rozwojowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modelowanie stwardnienia zanikowego bocznego (ALS) w laboratorium jest wyjątkowo trudne ze względu na przytłaczająco sporadyczny charakter ponad 80% przypadków1, w połączeniu z ogromną liczbą mutacji genetycznych, o których wiadomo, że są chorobotwórcze2. Mimo to wszystkie przypadki ALS mają wspólną cechę, która łączy to, że przed bezpośrednim zwyrodnieniem neuronów występuje dysfunkcyjna komunikacja między presynaptycznymi neuronami ruchowymi a postsynaptycznymi komórkami mięśniowymi3,4. Klinicznie, gdy pacjenci tracą łączność między pozostałymi górnymi i dolnymi neuronami ruchowymi, wykazują cechy hiper- i hipopobudliwości neuronów przez cały czas trwania choroby5,6,7,8,9, odzwierciedlając złożone zmiany molekularne leżące u podstaw tych synaps, które my, jako badacze ALS, staramy się zrozumieć.

Wiele modeli transgenicznych zilustrowało, że pogorszenie i dezorganizacja połączenia nerwowo-mięśniowego występują wraz z ekspresją mutacji genetycznych powodujących ALS, w tym SOD110, FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 oraz TDP4317,18,19 poprzez oceny morfologiczne, w tym ocenę guzów synaptycznych, gęstości kręgosłupa i organizacji pre/postsynaptycznej. Mechanistycznie, od czasu przełomowych prac Cole'a, Hodgkina i Huxleya w latach 30. XX wieku, możliwa była również ocena odpowiedzi synaptycznych za pomocą technik elektrofizjologicznych zarówno w hodowli komórkowej in vitro, jak i preparatach warstw tkanki20. Dzięki tym strategiom wiele modeli ALS wykazało deficyty transmisji synaptycznej. Na przykład zmutowany wariant TDP43 powoduje zwiększoną częstotliwość wypalania i obniża próg potencjału czynnościowego w komórkach neuronów ruchowych NSC-34 (rdzeń kręgowy x nerwiak hybrydowy linia komórkowa 34) 21. Ten sam wariant powoduje również dysfunkcyjne przekaźnictwo synaptyczne w złączu nerwowo-mięśniowym (NMJ) przed wystąpieniem behawioralnych deficytów motorycznych w modelu myszy22. Wcześniej wykazano, że zmutowana ekspresja FUS powoduje zmniejszoną transmisję synaptyczną w NMJ w modelu FUS-ALS u drosophila przed wadami lokomotorycznymi11. Niedawny raport z wykorzystaniem indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z nośników ekspandujących C9orf72 ujawnił zmniejszenie łatwo uwalniającej się puli pęcherzyków synaptycznych23. Podsumowując, te i inne badania podkreślają znaczenie budowania bardziej wszechstronnego zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw sygnalizacji synaptycznej w modelach ALS istotnych dla choroby. Będzie to miało kluczowe znaczenie dla zrozumienia patobiologii ALS i opracowania potencjalnych celów terapeutycznych dla pacjentów.

Metody zaciskania prądu i napięcia komórek były nieocenione w określaniu właściwości błony, takich jak przewodnictwo, spoczynkowy potencjał błony i zawartość ilościowa poszczególnych synaps20,24. Jednak jednym z istotnych ograniczeń elektrofizjologii jest to, że jest ona technicznie trudna i dostarcza informacji tylko z jednego neuronu na raz. Mikroskopia konfokalna żywych komórek, w połączeniu ze specyficznymi sondami fluorescencyjnymi, daje możliwość zbadania transmisji synaptycznej neuronów w sposób czasoprzestrzenny25,26,27. Chociaż nie jest to bezpośrednia miara pobudliwości neuronów, to podejście fluorescencyjne może zapewnić względny pomiar dwóch molekularnych korelacji funkcji synaptycznej: uwalniania pęcherzyków synaptycznych i stanów przejściowych wapnia na końcach synaptycznych.

Gdy potencjał czynnościowy dociera do presynaptycznego obszaru końcowego neuronów, wyzwalane są stany przejściowe wapnia, ułatwiając przejście od sygnału elektrycznego do procesu uwalniania neuroprzekaźników28. Bramkowane napięciem kanały wapniowe zlokalizowane w tych obszarach ściśle regulują sygnalizację wapniową, aby modulować kinetykę uwalniania neuroprzekaźników29. Pierwsze zgłoszone zapisy przejściowych zaburzeń wapnia oparte na fluorescencji przeprowadzono przy użyciu wskaźnika o podwójnej długości fali Fura-2 AM lub barwnika o pojedynczej długości fali Fluo-3 AM30,31,32. Chociaż w tamtym czasie barwniki te oferowały nowe, wspaniałe spojrzenie, cierpią z powodu kilku ograniczeń, takich jak niespecyficzny podział na przedziały w komórkach, aktywna lub pasywna utrata barwnika z oznakowanych komórek, fotowybielanie i toksyczność, jeśli są obrazowane przez dłuższy czas33. W ciągu ostatniej dekady genetycznie kodowane wskaźniki wapnia stały się końmi roboczymi do obrazowania różnych form aktywności neuronalnej. Wskaźniki te łączą zmodyfikowane białko fluorescencyjne z białkiem chelatora wapnia, które szybko zmienia intensywność fluorescencji po związaniu jonówCa2+34. Zastosowanie tych nowych wskaźników jest szerokie, co pozwala na znacznie łatwiejszą wizualizację wewnątrzkomórkowych stanów przejściowych wapnia zarówno w warunkach in vitro, jak i in vivo. Jedna rodzina tych genetycznie kodowanych reporterów, znana jako GCaMP, jest obecnie szeroko stosowana. Wskaźniki te zawierają C-końcową domenę kalmoduliny, po której następuje zielone białko fluorescencyjne (GFP) i są ograniczone przez N-końcowy region wiążący kalmodulinę35,36. Wiązanie wapnia z domeną kalmoduliny wyzwala interakcję z regionem wiążącym kalmodulinę, co skutkuje zmianą konformacyjną w ogólnej strukturze białka i znacznym wzrostem fluorescencji ugrupowania GFP 35,36. Na przestrzeni lat ta rodzina reporterów przeszła kilka ewolucji, aby umożliwić odrębne odczyty dla poszczególnych stanów przejściowych wapnia o określonej kinetyce (wolny, średni i szybki), z których każdy ma nieco inne właściwości37,38. W tym miejscu zwrócono uwagę na użycie reportera GcaMP6, który, jak wykazano wcześniej, wykrywa pojedyncze potencjały czynnościowe i dendrytyczne stany przejściowe wapnia w neuronach zarówno in vivo, jak i in vitro37.

Przejściowe stany wapnia w regionie presynaptycznym wywołują fuzję pęcherzyków synaptycznych, powodując uwalnianie neuroprzekaźników do synapsy i inicjację zdarzeń sygnalizacyjnych w komórce postsynaptycznej28,39. Pęcherzyki synaptyczne są zarówno szybko uwalniane, jak i poddawane recyklingowi, ponieważ komórka homeostatycznie utrzymuje stabilną powierzchnię błony komórkowej i łatwo uwalniającą pulę pęcherzyków zdolnych do fuzji związanych z błoną40. Zastosowany tutaj barwnik styrylowy ma powinowactwo do błon lipidowych i specyficznie zmienia swoje właściwości emisyjne w zależności od uporządkowania otaczającego środowiska lipidowego41,42. Jest to zatem idealne narzędzie do oznaczania recyklingu pęcherzyków synaptycznych i późniejszego śledzenia tych pęcherzyków, gdy są one później uwalniane po stymulacji neuronalnej41,42. Protokół, który został wygenerowany i zoptymalizowany, jest adaptacją koncepcji opisanych początkowo przez Gaffielda i współpracowników, co pozwala nam na ciągłą wizualizację punkcji pęcherzyków synaptycznych znakowanych styrylem w czasie41.

Tutaj opisane są dwie powiązane metodologie oparte na fluorescencji, wiarygodnie opisujące konkretne zdarzenia komórkowe związane z transmisją synaptyczną. Protokoły zostały zdefiniowane w celu zbadania dynamiki napływu wapnia pod koniec presynaptycznym za pośrednictwem depolaryzacji i egzocytozy pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach. W tym przypadku metody i reprezentatywne wyniki koncentrują się na wykorzystaniu pierwotnych neuronów korowych lub ruchowych gryzoni jako systemu modelowego in vitro, ponieważ opublikowano badania z wykorzystaniem tych typów komórek43,44. Jednak metody te mają również zastosowanie do zróżnicowanych ludzkich neuronów korowych i3 neuronów korowych45, ponieważ odnieśliśmy sukces z obydwoma protokołami w obecnie trwających eksperymentach w naszym laboratorium. Ogólny protokół jest przedstawiony w krokowym formacie liniowym, pokazanym na Rysunek 1. Krótko mówiąc, aby zbadać dynamikę wapnia w neurytach, dojrzałe neurony są transfekowane plazmidowym DNA w celu ekspresji fluorescencyjnego reportera GCaMP6m pod promotorem wirusa cytomegalii (CMV) 37,46. Transfekowane komórki mają niski poziom podstawowej zielonej fluorescencji, który wzrasta w obecności wapnia. Obszary zainteresowania są określone w celu monitorowania zmian fluorescencji podczas naszej manipulacji. Pozwala to na pomiar wysoce przestrzennie i czasowo zlokalizowanych fluktuacji wapnia37,46. W celu oceny fuzji i uwalniania pęcherzyków synaptycznych dojrzałe neurony są ładowane barwnikiem styrylowym wbudowanym w błony pęcherzyków synaptycznych, gdy są poddawane recyklingowi, reformowane i ponownie ładowane neuroprzekaźnikami w komórkach presynaptycznych41,42,43,47,48. Obecne barwniki używane do tego celu oznaczają pęcherzyki synaptyczne wzdłuż neurytów i są używane jako wskaźnik zastępczy dla tych regionów w eksperymentach obrazowania na żywo, jak wykazano przez jednoczesne barwienie barwnika styrylowego i synaptotagminy przez Kraszewskiego i współpracowników49. Zamieszczono tutaj reprezentatywne obrazy podobnego barwienia, które również zostało wykonane (Rysunek 2A). Poprzedni badacze szeroko stosowali takie barwniki do raportowania dynamiki pęcherzyków synaptycznych w połączeniu nerwowo-mięśniowym i neuronach hipokampa48,49,50,51,52,53,54,55,56. Wybierając punktowe obszary pęcherzyków obciążonych barwnikiem i monitorując spadki intensywności fluorescencji po uwolnieniu pęcherzyków, można badać funkcjonalną zdolność transmisji synaptycznej i czasową dynamikę uwalniania po stymulacji43. W przypadku obu metod pożywka zawierająca wysokie stężenie chlorku potasu jest stosowana do depolaryzacji komórek w celu naśladowania aktywności neuronalnej. Parametry obrazowania są określone tak, aby uchwycić interwały subsekundowe obejmujące normalizację linii bazowej, po której następuje nasz okres przechwytywania stymulacji. Pomiary fluorescencji w każdym punkcie czasowym są określane, normalizowane do tła i określane ilościowo w okresie eksperymentu. Dzięki tej strategii można wykryć wzrost fluorescencji GCaMP6m za pośrednictwem napływu wapnia lub skuteczne zmniejszenie fluorescencji uwalniania barwnika styrylowego przez egzocytozę pęcherzyków synaptycznych. Szczegółowa konfiguracja metodologiczna i parametry dla tych dwóch protokołów oraz dyskusja na temat ich zalet i ograniczeń zostały opisane poniżej.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Wizualne odwzorowanie całego procesu ogólnego protokołu. (1) Wyizoluj i hoduj pierwotne neurony gryzoni in vitro do wybranego punktu czasowego dojrzewania. (2) Wprowadź GCaMP DNA lub barwnik styrylowy jako reportery aktywności synaptycznej. (3) Ustaw paradygmat obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obrazowanie na żywo i powiązanego oprogramowania. Rozpocznij podstawowy okres nagrywania. (4) Podczas gdy komórki nadal przechodzą przechwytywanie obrazu na żywo, stymuluj neurony poprzez perfuzję w kąpieli o wysokiej zawartości KCl. (5) Oceń pomiary intensywności fluorescencji w czasie, aby zmierzyć stany przejściowe wapnia lub fuzję pęcherzyków synaptycznych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach przeprowadzone w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Jeffersona.

1. Pierwotna hodowla neuronów z embrionalnej kory szczura

UWAGA: Pierwotne neurony korowe są izolowane z zarodków szczurów E17.5, jak wcześniej opisano57,58. Wydaje się, że nie ma uprzedzeń związanych ze szczepem w przypadku sukcesu tego protokołu hodowli. Ta metoda została pokrótce opisana poniżej. Aby uzyskać szczegółowe informacje, należy zapoznać się z poprzednimi wskazanymi artykułami.

  1. Poddać eutanazji ciężarne samice szczurów przez wdychanie CO2 , a następnie wtórne potwierdzenie przez zwichnięcie szyjki macicy.
  2. Zbierz zarodki i wyizoluj mózgi w lodowatym roztworze soli Hanka (HBSS) buforowanym przez HEPS o pojemności 20 mM. Od zewnętrznej powłoki kory oddziel, a następnie odrzuć prążkowie i hipokampy. Zbierz korę.
  3. Użyj cienkich kleszczy, aby usunąć opony mózgowe z kory mózgowej. Aby to zrobić, przytrzymaj korę na miejscu za pomocą jednej pary zamkniętych kleszczy, delikatnie naciskając.
    UWAGA: Z drugą parą kleszczy w drugiej ręce, uszczypnij opony mózgowe. Oderwij opony mózgowe za pomocą ruchu tocznego ze ściśniętą parą. Zmień pozycję z zamkniętymi kleszczami i powtarzaj w razie potrzeby, aż opony mózgowe zostaną całkowicie usunięte.
  4. Inkubować korę z 10 μg/ml papainy w HBSS przez 4 minuty w temperaturze 37 °C.
  5. Umyć trzykrotnie w HBSS, a następnie delikatnie rozcierać 5-10 razy za pomocą polerowanej ogniowo szklanej pipety Pasteura, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek.
    UWAGA: Unikaj bąbelków; Utrzymać pipetę w zawiesinie komórki.
  6. Płytki neuronów na 100 μg / ml pokrytych poli-D-lizyną 35-milimetrowych naczyniach ze szklanym dnem o gęstości 75 000 komórek / talerz w pożywce neuropodstawowej z suplementem B27 (2%) i penicyliną-streptomycyną.

2. Pierwotna hodowla neuronów ruchowych z embrionalnego rdzenia kręgowego szczura

UWAGA: Pierwotne neurony ruchowe są przygotowywane z zarodków szczurów E13.5, jak opisano wcześniej, z kilkoma modyfikacjami59,60. Wydaje się, że nie ma uprzedzeń związanych ze szczepem w przypadku sukcesu tego protokołu hodowli. Ta metoda została pokrótce opisana poniżej. W celu uzyskania szczegółowych informacji należy zapoznać się z poprzednimi artykułami.

  1. Poddaj eutanazji ciężarne samice szczurów, jak w kroku 1.1.
  2. Wypreparuj 10-20 rdzeni kręgowych z zarodków i rozbij je mechanicznie na małe fragmenty za pomocą dwóch par kleszczy do szczypania i ciągnięcia.
  3. Inkubować w 0,025% trypsyny przez 8 minut, a następnie dodać DNazę w stężeniu 1 mg/ml.
  4. Wirować przez poduszkę BSA o stężeniu 4% w/v przy 470 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C bez przerwy.
  5. Odwirować granulowane komórki przez 55 minut przy 830 x g w temperaturze 4 °C bez hamulca przez poduszkę o gradiencie gęstości 10,4% (v/v) (patrz tabela materiałów). Przenieś do przodu pasmo neuronu ruchowego na interfejsie wizualnym.
    UWAGA: Aby zapewnić wychwycenie wszystkich komórek, należy użyć pożywki bezfenolowej dla etapu gradientu gęstości i pożywki zawierającej fenol dla wszystkich pozostałych etapów. Interfejs gradientu gęstości i ośrodka dysocjacyjnego można łatwo zidentyfikować na podstawie różnicy kolorów.
  6. Obracaj zebrane pasma przez kolejną 4% w/v poduszkę BSA o wymiarach 470 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C bez przerwy.
  7. Ponownie zawiesić oczyszczone neurony ruchowe w kompletnym podłożu neurobazalnym z suplementem B27 (2%), glutaminą (0,25%), 2-merkaptoetanolem (0,1%), surowicą konia (2%) i penicyliną-streptomycyną.
  8. Płytki neuronów na 100 μg/ml polilizyny i 3 μg/ml szkiełek nakrywkowych pokrytych lamininą o gęstości 50 000 komórek/35 mm naczynia ze szklanym dnem.

3. Transfekcje neuronalne

UWAGA: Ten krok jest przeprowadzany dla neuronów, które zostaną poddane obrazowaniu wapnia GCaMP i/lub neuronów, do których przed oceną synaptyczną wprowadza się egzogenny plazmid DNA lub RNA. Natomiast barwnik styrylowy jest ładowany tuż przed sesją obrazowania i jest omówiony w punkcie 6. Poniższe podsumowanie jest protokołem transfekcji stosowanym dla pierwotnych neuronów gryzoni w prezentowanych przykładach, ale można go łatwo dostosować i zoptymalizować do potrzeb użytkownika.

  1. Transfekcja dla hodowanych pierwotnych neuronów korowych występuje w 12 dniu in vitro (DIV 12), podczas gdy neurony ruchowe są transfekowane w 7 dniu in vitro (DIV 7).
    UWAGA: Wszystkie poniższe kroki odbywają się w aseptycznej komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  2. Transfekcja 500 ng GCaMP6m przy użyciu odczynnika do transfekcji w stosunku 1:2 objętościowym. W przypadku jednoczesnej transfekcji dodać łącznie 1,25 μg całkowitego DNA/szalkę, zachowując ten stosunek DNA do odczynnika.
    UWAGA: W przedstawionych przykładach eksperymentalnych 750 ng plazmidu związanego z ALS/FTD, który jest przedmiotem zainteresowania, zostało transfekowane w celu ekspresji dipeptydów sprzężonych z C9orf72-ALS, zmutowanego białka FUS itp. Upewnij się, że znacznik fluorescencyjny kotransfekowanego plazmidu nie będzie kolidował z kanałem FITC obrazowania GCaMP. Podobnie, jeśli wykonujesz obrazowanie za pomocą barwnika styrylowego, upewnij się, że współtransfekowany plazmid nie będzie kolidował z kanałem obrazowania TRITC. Użycie synaptophysin-GCaMP3 jest równie skuteczne w tym protokole. Dlatego należy wykonać transfekcję tej samej ilości tego plazmidu i postępować zgodnie ze wszystkimi krokami, jak zwykle w punkcie 7.
  3. Inkubować kompleks odczynników do transfekcji DNA w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  4. Delikatnie dodaj inkubowany kompleks do neuronów kroplami za pomocą wirowania. Umieścić naczynie z powrotem w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C na 45-60 minut.
  5. Usunąć całą pożywkę hodowlaną zawierającą kompleks odczynników do transfekcji DNA i zastąpić ją preparatem 50-50 objętości wstępnie kondycjonowanych i świeżych pożywek neuronalnych. Następnie umieść komórki z powrotem w inkubatorze CO2 na 48 godzin, aż do zobrazowania.

4. Przygotowanie roztworów buforowych i roztworu podstawowego barwnika styrylowego

  1. Roztwory CSF o niskiej i wysokiej zawartości aCSF należy przygotować na świeżo przed obrazowaniem, stosując składniki wymienione w Tabeli 1. Przefiltruj oba roztwory buforowe przed użyciem.
    UWAGA: Dihydrat CaCl2 może tworzyć Ca(OH)2 podczas przechowywania. Aby uzyskać maksymalną skuteczność, zawsze używaj niedawno otwartego pojemnika. Jeżeli nie jest to możliwe, w celu usunięcia Ca(OH)2 z powierzchni zewnętrznej i zapewnienia maksymalnej rozpuszczalności, roztwory można gazować CO2 przez 5 minut przed dodaniem CaCl2. Jeśli ten krok zostanie wykonany, dostosuj pH otrzymanego roztworu, aby utrzymać wartość pH 7,4, ponieważ nadmierne nasycanie dwutlenkiem węgla spowoduje powstanie Ca(HCO3)2.
Bufor aCSF o niskim KCL (pH od 7,40 do 7,45)
Odczynnikkoncentracja
HEPESY10 mM
Zawartość NaCl140 mM
Kcl5 mM
glukoza10 mM
CaCl2 2H2O2 mM
MgCl2 4H2O1 mM
Bufor aCSF o wysokim KCL (pH od 7,40 do 7,45)
Odczynnikkoncentracja
HEPESY10 mM
Zawartość NaCl95 mM
Kcl50 mM
glukoza10 mM
CaCl2 2H2O2 mM
MgCl2 4H2O1 mM

Tabela 1: Skład sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF). Poniższa tabela zawiera składniki do przygotowania sztucznych płynu mózgowo-rdzeniowego o niskim i wysokim KCl stosowanych podczas obrazowania i stymulacji neuronów. Patrz punkt 4 w celu uzyskania instrukcji przygotowania.

  1. Przygotować roztwór podstawowy barwnika styrylowego, pobierając fiolkę ze barwnikiem o objętości 100 μg i rozpuszczając ją do stężenia podstawowego 10 mM w wodzie destylowanej lub pożywce neurobazalnej.

5. Konfiguracja mikroskopu i systemu perfuzyjnego

UWAGA: Do obrazowania szalek Petriego ze szklanym dnem, preferowany jest odwrócony konfokalny mikroskop fluorescencyjny ze względu na elastyczność perfuzji i użycie obiektywu immersyjnego z olejkiem o dużej aperturze numerycznej. Zapoznaj się z tabelą materiałów dla mikroskopu konfokalnego, kamery i obiektywów używanych do obrazowania, przykładów szczegółowo opisanych w sekcji Reprezentatywne wyniki.

  1. Wszystkie doświadczenia należy przeprowadzić w temperaturze 37 °C przy stałym poziomie 5% CO2 za pomocą mocowania stopniowego sprzężonego z systemem inkubatora.
  2. Kontroluj akwizycję obrazu za pomocą oprogramowania konfokalnego. Zoptymalizuj ustawienia akwizycji na początku sesji obrazowania, aby wybrać moc wzbudzenia i wzmocnienie, aby zapewnić optymalną wizualizację sygnałów bez fotowybielania.
    1. Utrzymuj moc wzbudzenia, czas ekspozycji, wzmocnienie detektora i liczbę klatek na sekundę na stałym poziomie we wszystkich próbkach. Wykonaj obrazowanie poklatkowe przy użyciu współczynnika proporcji 512 x 512 i liczby klatek na sekundę 2 obrazów/s, aby zminimalizować wybielanie barwnikiem.
      UWAGA: Podczas gdy puncta powinna być wyraźnie widoczna, intensywność lasera powinna być ustawiona na minimum, aby uniknąć wybielania i fototoksyczności. Ustaw przysłonę konfokalną na najwęższe ustawienie, aby uzyskać optymalną rozdzielczość punktów fluorescencyjnych w obrębie neurytów. Czas ekspozycji jest ustawiony na 200 ms lub mniej, spójny dla wszystkich próbek. Maksymalna prędkość obrazowania zastosowanej kamery wynosiła 2 obrazy/s. W przypadku korzystania z szybszego aparatu można zrobić więcej zdjęć. Jeśli to możliwe, należy wybrać ustawienia obrazowania czasowego.
  3. Wybierz następujące kombinacje filtrów wzbudzenia/dichroiczności/emisji fluorescencji do obrazowania za pomocą oprogramowania konfokalnego: odpowiednio Gcamp6m/Gcamp3 z FITC i barwnik styrylowy z TRITC.
  4. Użyj funkcji idealnego ustawiania ostrości w oprogramowaniu do akwizycji obrazowania konfokalnego podczas obrazowania poklatkowego, aby uniknąć z-drift.
    UWAGA: Ze względu na dużą szybkość obrazowania, obrazowana jest pojedyncza płaszczyzna. Zapewnienie braku dryfu z podczas eksperymentu jest bardzo ważne.
  5. Wybierz kartę Czas w panelu akwizycji obrazu, aby ustawić okresy i interwały nagrywania.
    1. Ustaw fazę #1 na interwał 500 ms, czas trwania 3 - 5 min.
    2. Ustaw fazę #2 na interwał 500 ms, czas trwania 5 min.
      UWAGA: Faza #1 odpowiada odpowiednio zapisowi wyjściowemu, faza #2 okresowi stymulacji.
  6. Zmontować aparat do perfuzji grawitacyjnej dla aCSF za pomocą systemu sterowania zaworem i kolektora kanałowego.
    1. Załadować wysoki KCl (patrz Tabela 1) do strzykawki o pojemności 50 ml umieszczonej w górnej części aparatu, z rurkami przechodzącymi przez system. Ustaw natężenie przepływu na 1 ml/min.
  7. Załaduj szklane naczynie o średnicy 35 mm zawierające neurony na stolik obrazowania konfokalnego, tak aby koniec rurki perfuzyjnej był umieszczony na krawędzi naczynia. Wybierz pole do obrazowania.

6. Obrazowanie uwalniania pęcherzyków synaptycznych za pomocą barwnika styrylowego

  1. Inkubować komórki w aCSF o niskim KCl (patrz tabela 1) przez 10 minut w temperaturze 37 °C, 48 godzin po transfekcji.
  2. Załaduj pierwotne neurony korowe lub ruchowe na szalkach Petriego ze szklanym dnem za pomocą barwnika styrylowego.
    1. Usunąć niski KCl aCSF przez aspirację.
    2. Za pomocą pipety załadować neurony w ciemności 10 μM barwnika styrylowego w CSF zawierającym 50 mM KCl przez 5 minut.
    3. Usuń roztwór ładujący i zanurz neurony w niskim KCl aCSF przez 10 minut, aby wyeliminować niespecyficzne obciążenie barwnikiem.
  3. Umieść naczynie ze szklanym dnem o średnicy 35 mm na stoliku do obrazowania, a następnie obserwuj pod obiektywem powietrznym 20x lub obiektywem zanurzeniowym z olejkiem 40x w odwróconym mikroskopie konfokalnym.
    UWAGA: Użyj fluorescencji GFP, aby zlokalizować transfekowane komórki w przypadku komórek współtransfekowanych plazmidem znakowanym GFP.
  4. Wzbudzić barwnik styrylowy za pomocą lasera o długości fali 546 nm, zebrać emisję za pomocą filtra pasmowoprzepustowego 630-730 nm (TRITC).
  5. Wybierz pole obrazowania i ustaw idealną ostrość. Następnie zrób pojedynczy nieruchomy obraz z kanałami jasnego pola, TRITC i markerów fluorescencyjnych, aby zaznaczyć granice neuronów.
  6. Zainicjuj polecenie Uruchom teraz w oprogramowaniu do pozyskiwania. Przeprowadzaj podstawowy zapis przez 3-5 minut, aby wykluczyć ewentualne zmiany w intensywności barwnika (Faza #1).
    UWAGA: Istotne jest, aby upewnić się, że każdy spadek intensywności barwnika jest spowodowany uwalnianiem pęcherzyków synaptycznych, a nie bierną dyfuzją barwnika lub fotowybielaniem. Ten 3-5-minutowy okres wstępnej stymulacji powinien skutkować stałym i utrzymanym poziomem intensywności barwnika. Ostatnie 30 s tego nagrania zostanie wykorzystane do określenia średniej podstawowej wartości fluorescencji dla każdego ROI. Przed oceną warunków eksperymentalnych można również przeprowadzić dodatkowy warunek bez stymulacji, trwający około 10 minut ciągłego zapisu przy użyciu zamierzonych ustawień akwizycji, aby zapewnić stałe wartości fluorescencji przy użyciu ustawień lasera przez dłuższy czas.
  7. Po przełączeniu do fazy #2 spust On przycisk systemu perfuzyjnego. Następnie stale perfunduj 50 mM KCl do neuronów, aby ułatwić rozładunek barwnika (Faza #2).
    1. Nagrywaj przez 300 s po dodaniu KCl. Po tym akwizycja ustaje; uruchomić wyłącznik systemu perfuzyjnego.
  8. Zapisz eksperyment i przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania konfokalnego, jak opisano w sekcji 8 poniżej.
    UWAGA: W tym momencie eksperyment może zostać przerwany, a analizę można przeprowadzić później. W przypadku, gdy komórki nie wymagają transfekcji w celu ekspresji białek będących przedmiotem zainteresowania, protokół ten może być przeprowadzony w dowolnym momencie in vitro, gdy dąży się do zbadania funkcjonalności uwalniania synaptycznego. Po przeprowadzeniu testu na komórkach kontrolnych w celu zapewnienia prawidłowego rozładowania synaptycznego, eksperymentator powinien być ślepy na warunki genetyczne lub farmakologiczne każdej testowanej potrawy, aby zminimalizować błąd systematyczny.

7. Obrazowanie fluorescencyjne stanów przejściowych wapnia Gcamp6m

  1. Transfekcyjne pierwotne neurony korowe gryzoni hodowane na 35-milimetrowych płytkach ze szklanym dnem z 500 ng Gcamp6m, jak wskazano w sekcji 3.
    UWAGA: W razie potrzeby należy współtransfekować neurony plazmidem będącym przedmiotem zainteresowania, zawierającym znacznik fluorescencyjny w zakresie czerwonym lub dalekiej czerwieni.
  2. Inkubuj neurony z niskim KCl aCSF przez 15 minut 48 godzin po transfekcji, a następnie zamontuj szalkę na platformie obrazowania.
  3. Wizualizacja fluorescencji GCaMP6m za pomocą filtra FITC (488 nm) i obiektywu 20x lub 40x.
  4. Wybierz pole obrazowania i ustaw idealną ostrość. Następnie zrób pojedynczy nieruchomy obraz z kanałami jasnego pola, FITC i markerów fluorescencyjnych, aby zaznaczyć granice neuronów.
  5. Zainicjuj polecenie Uruchom teraz w oprogramowaniu do pozyskiwania. Przeprowadzić zapis linii podstawowej przez 5 minut, a następnie przeprowadzić perfuzję z płynem CSF zawierającym 50 mM KCL w taki sam sposób, jak opisano w sekcji 6 dla eksperymentów z barwnikiem styrylowym.
    UWAGA: Celem tego obrazowania jest pomiar wywołanych stanów przejściowych wapnia. Jeśli neuron ma podstawową aktywność wypalania i strumienie wapnia w okresie przed stymulacją, nie jest on wykorzystywany w analizie danych. Zamiast tego używane są tylko komórki o stabilnej fluorescencji tła. Okresy po stymulacji można również wydłużyć do 60 minut w przypadku stanów przejściowych wapnia, z dodatkową ciągłą perfuzją o wysokim KCl lub bez niej.
  6. Zapisz eksperyment i przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania konfokalnego, jak opisano w sekcji 8 poniżej. W tym momencie eksperyment może zostać przerwany, a analizę można przeprowadzić później.
    UWAGA: Jeśli komórki nie wymagają transfekcji w celu ekspresji białek będących przedmiotem zainteresowania, protokół ten można przeprowadzić w dowolnym momencie in vitro, gdy dąży się do zbadania stanów przejściowych wapnia. Po przeprowadzeniu testu na komórkach kontrolnych w celu zapewnienia pomiaru stanów przejściowych wapnia, eksperymentator powinien być zaślepiony na warunki genetyczne lub farmakologiczne każdej badanej potrawy, aby zminimalizować błąd systematyczny.

8. Analiza obrazu

  1. Otwieranie zdjęć poklatkowych za pomocą oprogramowania konfokalnego.
  2. Wyrównywanie obrazów w seriach poklatkowych za pomocą serii poleceń : Obraz | Przetwarzanie | Wyrównaj bieżący dokument. Wybierz opcję Wyrównaj do pierwszej klatki.
  3. Wybierz obszary zainteresowania (ROI) wzdłuż neurytów za pomocą narzędzia do zaznaczania ROI, ikony w kształcie fasoli po prawej stronie ramki obrazu (Rysunek 3B). Zaznacz również ROI reprezentujący intensywność fluorescencji tła.
    UWAGA: Obszary ROI są wybierane poprzez wybór obszarów wyraźnie oddzielonych punktów wzdłuż ścieżek neuronalnych wskazanych przez nieruchomy obraz w jasnym polu. Do analizy wybiera się co najmniej pięć ROI na neuron. Tło ROI jest wybierane w regionie pola widzenia, który nie zawiera neurytów.
  4. Zmierz surową fluorescencję w czasie dla wybranych ROI za pomocą następującej serii poleceń: Pomiar | Pomiar czasu.
    1. Zainicjuj funkcję Measure (Miara) w górnej części panelu Time Measurement (Pomiar czasu). Generowana jest zarówno graficzna reprezentacja surowej fluorescencji w czasie (Rysunek 3C), jak i dane ilościowe.
      UWAGA: Każdy punkt danych reprezentuje surową fluorescencję dla tego zwrotu z inwestycji dla klatki powiązanej z tym konkretnym zmierzonym punktem czasowym.
  5. Eksportuj surowe intensywności fluorescencji do oprogramowania arkusza kalkulacyjnego.
  6. Analizuj każdy zwrot z inwestycji niezależnie. Po pierwsze, znormalizuj dane, odejmując intensywność zwrotu z inwestycji w tle od intensywności zwrotu z inwestycji w każdym punkcie czasowym.
    1. Weź surową wartość fluorescencji z tła ROI w każdym określonym punkcie czasowym i odejmij ją od ROI interesującej wartości surowej intensywności w tym punkcie czasu.
      UWAGA: Odbywa się to dla całego okresu nagrywania, zarówno fazy podstawowej, jak i stymulacji.
  7. Określ średni zwrot z inwestycji w intensywność odsetek w ciągu ostatnich 30 sekund od punktu odniesienia.
    1. Uśrednić znormalizowane surowe wartości podstawowe wygenerowane w kroku 8.6 z ostatnich 30 s 3-5 minutowego podstawowego okresu rejestracji.
      UWAGA: Do wygenerowania tej wartości można wykorzystać cały okres zapisu podstawowego. Jednakże, gdy wartość ta stabilizuje się i jest utrzymywana, 60 punktów czasowych ostatnich 30 s ma wystarczającą wielkość próby, aby reprezentować całość.
  8. Porównaj tę wartość bazową ze znormalizowaną wartością intensywności w każdym punkcie czasowym, generując zmianę wartości fluorescencji (ΔF).
    1. Weź wartość z kroku 8.7 i odejmij średnią bazową wartość fluorescencyjną. Wykonuj ten i kolejne kroki przez cały okres nagrywania, zarówno fazę podstawową, jak i stymulację.
  9. Obliczyć tę zmianę w odniesieniu do podstawowej wartości fluorescencji, generując zmianę fluorescencji/fluorescencji podstawowej (ΔF/F). Aby to zrobić, weź wartość z kroku 8.8 i podziel ją przez średnią bazową wartość fluorescencyjną.
  10. Na koniec ustaw wartość punktu początkowego na 1, aby wzrosty lub spadki można było łatwo zwizualizować graficznie w czasie.
    1. Weź wartość wygenerowaną w kroku 8.9 i dodaj 1,
      UWAGA: Jeśli zostanie to wykonane poprawnie, 30 s wartości okresu bazowego powinno oscylować w pobliżu wartości 1. W komórkach skutecznie uwalniających zawartość synaptyczną wartość ta powinna wahać się od 1 do 0 po rozpoczęciu stymulacji. Przykład kroków 6-9 przedstawiono w Rysunek 3E.

9. Analiza danych

UWAGA: Eksperymentator może zostać odślepiony na warunki eksperymentalne, aby odpowiednio zebrać dane do analizy. Użyj próbki o wielkości co najmniej 10 neuronów na warunek z każdego z trzech niezależnych eksperymentów. Rozważ neurony do włączenia tylko wtedy, gdy można wyznaczyć co najmniej pięć regionów ROI. Ten poziom replikacji eksperymentalnej był wystarczający w opublikowanych badaniach, aby wykazać głęboką utratę odciążenia synaptycznego w komórkach zawierających poli-GA związanych z ALS w porównaniu z kontrolami GFP (patrz Reprezentatywne wyniki). Jeśli jednak zaobserwuje się bardziej subtelny fenotyp, liczba biologicznych i/lub technicznych powtórzeń może wymagać optymalizacji przez użytkownika.

  1. Korzystając ze wszystkich obliczonych wartości ΔF/F w czasie na podstawie ROI danego warunku doświadczalnego, określ średnią wartość ΔF/F dla każdego punktu czasowego wraz z SEM.
  2. Wykreśl dane za pomocą programu do tworzenia wykresów i statystyk w formacie xy, gdzie x to czas, który upłynął, a y to wartość ΔF/F obliczona w kroku 9.1. Przedstaw wszystkie wartości jako średnią ± SEM.
  3. Aby określić istotność statystyczną, użyj testu t Studenta do porównania dwóch grup i jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie analizy post-hoc Tukeya do porównania trzech lub więcej grup.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po udanym wdrożeniu powyższego protokołu, pokazane są reprezentatywne wyniki dla typowego eksperymentu z uwalnianiem pęcherzyków synaptycznych barwnika styrylowego. Wyhodowane pierwotne neurony korowe szczura załadowano barwnikiem przy użyciu metody opisanej w sekcji 6. Specyficzność obciążenia barwnikiem określono poprzez jednoczesne znakowanie markerem pęcherzyków synaptycznych synaptofizyną. Większość punkcta dodatnich barwnikiem styrylowym jest współdodatnia dla tego markera (Rysunek 2A). Aby okre...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trzy kroki wspólne dla obu opisanych metod mają kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentu i wymiernych wyników. Po pierwsze, niezbędne jest przygotowanie świeżego płynu mózgowo-rdzeniowego przed każdą rundą eksperymentów, zgodnie z załączoną instrukcją. Niezastosowanie się do tego może zapobiec odpowiedniej depolaryzacji neuronów. Próbka nieleczonych neuronów kontrolnych powinna być stale testowana przed stymulacją jakichkolwiek grup eksperymentalnych, aby zapewnić prawidłową depolaryzację komórkową i stanowić punkt...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować obecnym i byłym członkom Jefferson Weinberg ALS Center za krytyczne opinie i sugestie dotyczące optymalizacji tych technik i ich analiz. Praca ta była wspierana przez fundusze NIH (RF1-AG057882-01 i R21-NS0103118 do D.T.), NINDS (R56-NS092572 i R01-NS109150 do P.P.), Muscular Dystrophy Association (D.T.), Robert Packard Center for ALS Research (D.T.), fundacji Family Strong 4 ALS oraz Fundacji Rodziny Farber (B.K.J., K.K. i P.P.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
20x obiektyw powietrznyNikonDo obrazowania
40-krotny obiektyw zanurzeniowyw oleju NikonDo obrazowania
suplement B27Thermo Scientific17504044Suplement na wzrost neuronów
Strzykawki BD bez igły, 50 mlThermo Scientific13-689-8Część zespołu perfuzji grawitacyjnej
Kapturdo hodowli komórkowej bezpieczeństwa biologicznegoBakerSterilGARD III SG403AAsceptic cell hodowla, transfekcja i ładowanie barwnika
b-MerkaptoetanolMillipore SigmaM3148Do hodowli i utrzymania kultur neuronalnych
Albumina surowicy bydlęcejMillipore SigmaA9418Do przygotowania kultur neuronalnych
Dwuwodny chlorek wapniaMillipore Sigma223506Składnik roztworów aCSF
Inkubator CO2 do hodowli komórkowychThermo Scientific13-998-123Do hodowli i utrzymania neuronów
WirówkaEppendorf5810RDo przygotowania hodowli neuronów
Mikroskop konfokalnyNikonEclipse Ti + A1R rdzeńDo obrazowania fluorescencyjnego
CoolSNAP ES2  Kamera CCDFotometriaDo akwizycji obrazu
D-GlucoseMillipore SigmaG8270Składnik roztworów aCSF
DNaseMillipore SigmaD5025Do przygotowania hodowli neuronów
Samica, ciąża w czasie Sprague Dawleyszczury Charles river400SASSDDo przygotowania embrionalnych kultur neuronów ruchowych korowych i rdzeniowych
FITC Kostka filtracyjnaNikon77032509Do obrazowania stanów przejściowych wapnia Gcamp
FM4-64 barwnik styrylowyInvitrogenT13320Do obrazowania uwalniania pęcherzyków synaptycznych
Szklane dno szalki Petriego (grubość #1,5)CellVisD35-10-1,5-NDo wzrostu neuronów na misce hodowlanej zgodnej z obrazowaniem
Szklana pipeta PasteuraGrainger52NK56Do przygotowania kultur neuronalnych
Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS)Millipore SigmaH6648Do przygotowania kultur neuronalnych
HEPESMillipore SigmaH3375Składnik roztworów aCSF
Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy o wysokim KCl (aCSF)Do obrazowania. Zobacz przepisy*
surowica dla koniMillipore SigmaH1138Do hodowli i utrzymania neuronów
Kaptur preparacyjny z przepływem laminarnymNUAIRENU-301-630Do przygotowania kultur neuronalnych
LamininThermo Scientific23017015Do przygotowania kultur neuronalnych
L-15 MediumThermo Scientific11415064 przygotowanie kultur neuronalnych
Leibovitz's L-15 Medium, bez czerwieni fenolowejThermo Scientific 21083027Do przygotowania kultur neuronalnych
L-glutamina (200 mM)Thermo Scientific25030149Suplement do hodowli neuronów
Lipofectamina 2000 Odczynnik do transfekcjiThermo Scientific11668019Do transfekcji neuronalnych
Sztuczny mózgowo-rdzeniowy o niskim KCl płyn (aCSF)Do obrazowania. Zobacz przepisy*
Chlorek magnezuMillipore Sigma208337Składnik rozwiązań CSF
Microsoft ExcelMicrosoftOprogramowanie do analizy/normalizacji danych
Nalgene  Jednostki filtrujące, 0,2 i mikro; m PESThermo Scientific565-0020Jednostka filtrująca do roztworu CSF
Pożywka neuropodstawowaThermo Scientific21103049Do hodowli i utrzymania kultur neuronalnych
NIS-Elements Advanced ResearchOprogramowanie firmy Nikondo przechwytywania i analizy obrazów
Nunc 15 mL Rurki stożkoweThermo Scientific339650Do przygotowania hodowli neuronów i bufora roztwory
Nunc 50 mL probówki stożkoweThermo Scientific339652Do przygotowania kultur neuronalnych i roztworów buforowych
OptiprepMillipore SigmaD1556Do przygotowania kultur neuronalnych
PapainaMillipore SigmaP4762Do przygotowania kultur neuronalnych
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)Thermo Scientific15140122Aby zapobiec zanieczyszczeniu bakteryjnemu kultur neuronalnych
System perfuzyjnyWarner InstrumentsSF-77BDo wymiany rurki
perfuzyjnejCole-ParmerUX-30526-14Część zespołu perfuzji grawitacyjnej
plazmid pGP-CMV-Gcamp6mAddgene40754Do obrazowania stanów przejściowych
poli-D-lizyny bromowodorekMillipore SigmaP7886Środek powlekający do szalek Petriego ze szklanym dnem
Chlorek potasuMillipore SigmaP3911Składnik roztworów aCSF
Wodorowęglan soduMillipore SigmaS5761Składnik roztworów aCSF
Chlorek soduMillipore SigmaS9888Składnik roztworów aCSF
Inkubator Stage TopTokai HitDo inkubacji żywych neuronów w okresie obrazowania
Kostka filtra TRITCNikon77032809Do obrazowania FM4-64
Inhibitor trypsynyMillipore SigmaT6414Do przygotowania kultur neuronalnych
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaThermo Scientific25200056Do przygotowania kultur neuronalnych
Tabela izolacji drgańNowy portVIP320X2430-135520Stół/statyw do mikroskopu
firmy Leibovitz aCSF

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gibson, S. B., et al. The evolving genetic risk for sporadic ALS. Neurology. 89 (3), 226-233 (2017).
  2. Kim, G., Gautier, O., Tassoni-Tsuchida, E., Ma, X. R., Gitler, A. D. ALS genetics: Gains, losses, and implications for future therapies. Neuron. 108 (5), 822-842 (2020).
  3. Nijssen, J., Comley, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
  4. Marttinen, M., Kurkinen, K. M., Soininen, H., Haapasalo, A., Hiltunen, M. Synaptic dysfunction and septin protein family members in neurodegenerative diseases. Molecular Neurodegeneration. 10, 16(2015).
  5. Bae, J. S., Simon, N. G., Menon, P., Vucic, S., Kiernan, M. C. The puzzling case of hyperexcitability in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Clinical Neurology. 9 (2), 65-74 (2013).
  6. Kiernan, M. C. Hyperexcitability, persistent Na+ conductances and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Experimental Neurology. 218 (1), 1-4 (2009).
  7. Krarup, C. Lower motor neuron involvement examined by quantitative electromyography in amyotrophic lateral sclerosis. Clinical Neurophysiology. 122 (2), 414-422 (2011).
  8. Vucic, S., Nicholson, G. A., Kiernan, M. C. Cortical hyperexcitability may precede the onset of familial amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 131, Pt 6 1540-1550 (2008).
  9. Marchand-Pauvert, V., et al. Absence of hyperexcitability of spinal motoneurons in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Physiology. 597 (22), 5445-5467 (2019).
  10. Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185 (2), 232-240 (2004).
  11. Markert, S. M., et al. Overexpression of an ALS-associated FUS mutation in C. elegans disrupts NMJ morphology and leads to defective neuromuscular transmission. Biology Open. 9 (12), (2020).
  12. Shahidullah, M., et al. Defects in synapse structure and function precede motor neuron degeneration in Drosophila models of FUS-related ALS. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19590-19598 (2013).
  13. Liu, Y., et al. C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD. Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).
  14. Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 129-133 (2015).
  15. Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 56-61 (2015).
  16. Perry, S., Han, Y., Das, A., Dickman, D. Homeostatic plasticity can be induced and expressed to restore synaptic strength at neuromuscular junctions undergoing ALS-related degeneration. Human Molecular Genetics. 26 (21), 4153-4167 (2017).
  17. Romano, G., et al. Chronological requirements of TDP-43 function in synaptic organization and locomotive control. Neurobiology of Disease. 71, 95-109 (2014).
  18. Armstrong, G. A., Drapeau, P. Calcium channel agonists protect against neuromuscular dysfunction in a genetic model of TDP-43 mutation in ALS. Journal of Neuroscience. 33 (4), 1741-1752 (2013).
  19. Diaper, D. C., et al. Loss and gain of Drosophila TDP-43 impair synaptic efficacy and motor control leading to age-related neurodegeneration by loss-of-function phenotypes. Human Molecular Genetics. 22 (8), 1539-1557 (2013).
  20. Schwiening, C. J. A brief historical perspective: Hodgkin and Huxley. Journal of Physiology. 590 (11), 2571-2575 (2012).
  21. Dong, H., et al. Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS. Neuroscience. 272, 141-153 (2014).
  22. Chand, K. K., et al. Defects in synaptic transmission at the neuromuscular junction precede motor deficits in a TDP-43(Q331K) transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32 (5), 2676-2689 (2018).
  23. Perkins, E. M., et al. Altered network properties in C9ORF72 repeat expansion cortical neurons are due to synaptic dysfunction. Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 13(2021).
  24. Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P. Vesicle hypothesis of the release of quanta of acetylcholine. Physiological Reviews. 60 (2), 396-441 (1980).
  25. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  26. Ryan, J., Gerhold, A. R., Boudreau, V., Smith, L., Maddox, P. S. Introduction to Modern Methods in Light Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1563, 1-15 (2017).
  27. Wang, L., Frei, M. S., Salim, A., Johnsson, K. Small-molecule fluorescent probes for live-cell super-resolution microscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (7), 2770-2781 (2019).
  28. Neher, E. Vesicle pools and Ca2+ microdomains: new tools for understanding their roles in neurotransmitter release. Neuron. 20 (3), 389-399 (1998).
  29. Dolphin, A. C., Lee, A. Presynaptic calcium channels: specialized control of synaptic neurotransmitter release. Nature Reviews Neuroscience. 21 (4), 213-229 (2020).
  30. Tsien, R. Y., Rink, T. J., Poenie, M. Measurement of cytosolic free Ca2+ in individual small cells using fluorescence microscopy with dual excitation wavelengths. Cell Calcium. 6 (1-2), 145-157 (1985).
  31. Takahashi, N., et al. Cytosolic Ca2+ dynamics in hamster ascending thin limb of Henle's loop. American Journal of Physiology. 268 (6), Pt 2 1148-1153 (1995).
  32. Cleemann, L., DiMassa, G., Morad, M. Ca2+ sparks within 200 nm of the sarcolemma of rat ventricular cells: evidence from total internal reflection fluorescence microscopy. Advances in Experimental Medicine and Biology. 430, 57-65 (1997).
  33. Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
  34. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  35. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  36. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  37. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  38. Horikawa, K. Recent progress in the development of genetically encoded Ca2+ indicators. Journal of Medical Investigation. 62 (1-2), 24-28 (2015).
  39. Bohme, M. A., Grasskamp, A. T., Walter, A. M. Regulation of synaptic release-site Ca(2+) channel coupling as a mechanism to control release probability and short-term plasticity. Federation of European Biochemical Society Letters. 592 (21), 3516-3531 (2018).
  40. Li, Y. C., Kavalali, E. T. Synaptic vesicle-recycling machinery components as potential therapeutic targets. Pharmacological Reviews. 69 (2), 141-160 (2017).
  41. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nature Protocols. 1 (6), 2916-2921 (2006).
  42. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods in Molecular Biology. 440, 349-369 (2008).
  43. Jensen, B. K., et al. Synaptic dysfunction induced by glycine-alanine dipeptides in C9orf72-ALS/FTD is rescued by SV2 replenishment. European Molecular Biology Organization Molecular Medicine. 12 (5), 10722(2020).
  44. Kia, A., McAvoy, K., Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P. Astrocytes expressing ALS-linked mutant FUS induce motor neuron death through release of tumor necrosis factor-alpha. Glia. 66 (5), 1016-1033 (2018).
  45. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription Factor-Mediated Differentiation of Human iPSCs into Neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51(2018).
  46. Ye, L., Haroon, M. A., Salinas, A., Paukert, M. Comparison of GCaMP3 and GCaMP6f for studying astrocyte Ca2+ dynamics in the awake mouse brain. Public Library of Science One. 12 (7), 0181113(2017).
  47. Angleson, J. K., Betz, W. J. Monitoring secretion in real time: capacitance, amperometry and fluorescence compared. Trends in Neuroscience. 20 (7), 281-287 (1997).
  48. Ryan, T. A., et al. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  49. Kraszewski, K., et al. Synaptic vesicle dynamics in living cultured hippocampal neurons visualized with CY3-conjugated antibodies directed against the lumenal domain of synaptotagmin. Journal of Neuroscience. 15 (6), 4328-4342 (1995).
  50. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 12 (2), 363-375 (1992).
  51. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
  52. Ryan, T. A., Smith, S. J. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses. Neuron. 14 (5), 983-989 (1995).
  53. Betz, W. J., Ridge, R. M., Bewick, G. S. Comparison of FM1-43 staining patterns and electrophysiological measures of transmitter release at the frog neuromuscular junction. Journal of Physiology-Paris. 87 (3), 193-202 (1993).
  54. Wu, L. G., Betz, W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction. Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).
  55. Ryan, T. A., Smith, S. J., Reuter, H. The timing of synaptic vesicle endocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (11), 5567-5571 (1996).
  56. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  57. Kayser, M. S., McClelland, A. C., Hughes, E. G., Dalva, M. B. Intracellular and trans-synaptic regulation of glutamatergic synaptogenesis by EphB receptors. Journal of Neuroscience. 26 (47), 12152-12164 (2006).
  58. Washburn, H. R., Xia, N. L., Zhou, W., Mao, Y. T., Dalva, M. B. Positive surface charge of GluN1 N-terminus mediates the direct interaction with EphB2 and NMDAR mobility. Nature Communications. 11 (1), 570(2020).
  59. Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial dynamics and bioenergetic dysfunction is associated with synaptic alterations in mutant SOD1 motor neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
  60. Casci, I., et al. Muscleblind acts as a modifier of FUS toxicity by modulating stress granule dynamics and SMN localization. Nature Communications. 10 (1), 5583(2019).
  61. Hruska, M., Henderson, N., Le Marchand, S. J., Jafri, H., Dalva, M. B. Synaptic nanomodules underlie the organization and plasticity of spine synapses. Nature Neuroscience. 21 (5), 671-682 (2018).
  62. Rein, M. L., Deussing, J. M. The optogenetic (r)evolution. Molecular Genetics and Genomics. 287 (2), 95-109 (2012).
  63. Bertucci, C., Koppes, R., Dumont, C., Koppes, A. Neural responses to electrical stimulation in 2D and 3D in vitro environments. Brain Research Bulletin. 152, 265-284 (2019).
  64. Zhang, Y., et al. jGCaMP8 Fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
  65. Guerra-Gomes, S., Sousa, N., Pinto, L., Oliveira, J. F. Functional roles of astrocyte calcium elevations: From synapses to behavior. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 427(2017).
  66. Westergard, T., et al. Cell-to-cell transmission of dipeptide repeat proteins linked to C9orf72-ALS/FTD. Cell Reports. 17 (3), 645-652 (2016).
  67. Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84 (6), 1213-1225 (2014).
  68. Daigle, J. G., et al. Pur-alpha regulates cytoplasmic stress granule dynamics and ameliorates FUS toxicity. Acta Neuropathologica. 131 (4), 605-620 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Synaptic FunctionAmyotrophic Lateral SclerosisFluorescent MeasurementSynaptic Vesicle ReleaseCalcium InfluxLive ImagingConfocal MicroscopyPrimary Neuronal CulturesGCaMP6m ReporterStyryl Dye

Related Articles