Method Article

Analityczne oznaczanie funkcji mitochondrialnej wyciętych homogenatów guzów litych

DOI:

10.3791/62875

⸱

August 6th, 2021

 ,  ,  , 
1Integrated Physiology and Molecular Medicine Laboratory, Pennington Biomedical Research Center, 2Clinical Oncology and Metabolism, Pennington Biomedical Research Center, 3Department of Nutrition, Case Western Reserve University, 4Department of Clinical Nutrition, University of Texas Southwestern Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy praktyczny protokół i analityczne podejście do oceny mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej i zdolności przenoszenia elektronów w świeżych homogenatach guza. Protokół ten można łatwo dostosować do badania różnych funkcji mitochondriów, które przyczyniają się do inicjacji, progresji i odpowiedzi na leczenie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria są niezbędne do powstania i rozwoju raka poprzez produkcję energii, reaktywną regulację form tlenu i syntezę makromolekuł. Genetyczne i funkcjonalne adaptacje mitochondriów do środowiska guza napędzają potencjał proliferacyjny i przerzutowy. Pojawienie się sekwencjonowania DNA i RNA usunęło krytyczne bariery w ocenie genetycznych mediatorów nowotworzenia. Jednak do tej pory podejścia metodologiczne do oceny funkcji mitochondriów guza pozostają nieuchwytne i wymagają biegłości technicznej ograniczającej wykonalność, ostatecznie zmniejszając wartość diagnostyczną i prognostyczną, zarówno w warunkach eksperymentalnych, jak i klinicznych. W tym miejscu przedstawiamy prostą i szybką metodę ilościowego określania szybkości fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) i zdolności przenoszenia elektronów (ET) w świeżo wyciętych homogenatach guzów litych przy użyciu respirometrii o wysokiej rozdzielczości. Protokół może być powtarzalnie stosowany u różnych gatunków i typów nowotworów, a także dostosowywany do oceny różnorodności mitochondrialnych szlaków ET. Korzystając z tego protokołu, wykazaliśmy, że myszy z luminalnym rakiem sutka B wykazują wadliwe oddychanie związane z dinukleotydem nikotynamidoadeninowym i zależność od bursztynianu w celu wytworzenia trifosforanu adenozyny za pośrednictwem OXPHOS.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie komórki są ściśle powiązane potrzebą produkcji i konsumpcji trifosforanu adenozyny (ATP), waluty energii molekularnej. Ponieważ mutacje komórkowe prowadzą do powstawania nowotworów, mitochondria zapewniają przetrwanie poprzez dywersyfikację produkcji energii, która często jest fenotypowo odróżnialna od tkanki nienowotworowej1,2,3. W związku z tym istnieje pilna potrzeba szybkiego i głębokiego profilowania funkcji mitochondrialnej układu oddechowego w celu ułatwienia klasyfikacji typu nowotworu, inicjacji nowotworu, progresji i odpowiedzi na leczenie.

Funkcje oddechowe wyciętych próbek tkanek nie mogą być oceniane w stanie nienaruszonym, ponieważ podstawowe substraty dla OXPHOS nie są przepuszczalne dla komórek. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, mitochondria można przygotować przez izolację, przenikanie chemiczne lub homogenizację mechaniczną. Izolacja mitochondrialna jest od dawna uważana za złoty standard oceny funkcji oddechowych. Wymaga jednak dużych ilości tkanki, jest czasochłonny i mało wydajny, co może powodować błąd selekcji dla niektórych frakcji mitochondriów4. Permeabilizacja polega na mechanicznym oddzieleniu i wystawieniu skrawków tkanek lub wiązek włókien na działanie łagodnego detergentu, który selektywnie degraduje błonę plazmatyczną5. Permeabilizacja jest często stosowana w tkankach prążkowanych, takich jak mięsień szkieletowy i mięsień sercowy, ponieważ poszczególne wiązki włókien mogą być rozdzielane. W porównaniu z izolacją, przepuszczalność daje więcej mitochondriów w ich naturalnym środowisku komórkowym i formie fizycznej5. Przepuszczalność została z powodzeniem zastosowana w innych tkankach, takich jak tumor6,7 i placenta8; Jednak odtwarzalność preparatów z włókien przepuszczalnych może być trudna ze względu na spójność preparacji i wymagania tlenowe w celu pokonania ograniczeń dyfuzji9. Ponadto przepuszczalne włókna mogą być nieodpowiednie w niektórych typach nowotworów, które są gęsto komórkowe i silnie zwłókniałe. Homogenaty tkankowe są generowane w wyniku mechanicznego rozerwania błony plazmatycznej i są podobne do włókien przepuszczalnych pod względem wydajności i integralności mitochondriów10. Homogenaty tkankowe minimalizują również ograniczenia dyfuzji tlenu i mogą być łatwo stosowane w różnych typach tkanek poprzez optymalizację siły mechanicznej11,12.

Tutaj przedstawiamy prostą i szybką metodę ilościowego określania szybkości fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) i zdolności do przenoszenia elektronów (ET) w świeżo wyciętych homogenatach guzów litych. Protokół jest optymalnie zaprojektowany do oceny świeżych tkanek za pomocą respirometru o wysokiej rozdzielczości Oxygraph-2k (O2k), który wymaga wcześniejszej wiedzy na temat konfiguracji i kalibracji instrumentu, ale może być podobnie dostosowany za pomocą dowolnej elektrody typu Clark, analizatora Seahorse lub czytnika płytek. Protokół może być powtarzalnie stosowany u różnych gatunków i typów nowotworów, a także dostosowywany do oceny różnorodności mitochondrialnych szlaków ET.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty i procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Pennington Biomedical Research Center, Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Przygotowanie odczynnika.

  1. Przygotuj pożywkę do wzrostu komórek EO771 z 10 mM HEPES, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% penicyliny-streptomycyny (100 U/ml) i 0,2% amfoterycyny B.
  2. Przygotować 1 l roztworu do konserwacji biopsji (BIOPS) w szklanej zlewce o pojemności 1000 ml.
    1. Dodać 3,180 g Na2ATP (5,77 mM stężenie końcowe).
    2. Dodać 1,334 g MgCL2·6H2O (6,56 mM stężenie końcowe).
    3. Dodać 2,502 g tauryny (20 mM stężenie końcowe).
    4. Dodać 3,827 g fosfokreatyny Na2(15 mM stężenie końcowe).
    5. Dodać 1,362 g imidazolu (20 mM stężenie końcowe).
    6. Dodać 0,077 g ditiotreitolu (0,5 mM stężenie końcowe).
    7. Dodać 9,76 g hydratu MES (50 mM stężenie końcowe).
    8. Dodać 800 mlH2Oi wymieszać składniki za pomocą mieszadła magnetycznego w temperaturze 30 °C.
    9. Dodać 72,3 ml 100 mM K2EGTA (7,23 mM stężenie końcowe).
      1. Rozpuścić 7,608 g EGTA i 2,3 g KOH w 100 mlH2O.
      2. Doprowadzić pH do 7,0 za pomocą 5 M KOH i zwiększyć objętość do 200 ml za pomocą H2O.
    10. Dodać 27,7 ml 100 mM CaK2EGTA (2,77 mM stężenie końcowe).
      1. Rozpuścić 7,608 g EGTA w 200 mlH2Oi podgrzać do 80 °C (100 mM stężenie końcowe).
      2. Rozpuścić 2,002 g CaCO3 w 200 ml gorącego 100 mM roztworu EGTA.
      3. Ciągle mieszając, dodaj 2,3 g KOH i dostosuj pH do 7,0.
    11. Doprowadzić pH do 6,75 w temperaturze 23 °C (pH 7,1 w temperaturze 0 °C) za pomocą 5 M KOH. Doprowadzić objętość do 980 ml za pomocąH2Oi wymieszać roztwór. Sprawdź pH jeszcze raz, wyreguluj w razie potrzeby i dodaj końcową objętość do 1000 ml wodą.
    12. Podzielić BIOPS na stożkowe probówki (15 ml lub 50 ml) i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Rozmrozić tylko raz, tuż przed użyciem.
  3. Przygotować 1 l mitochondrialnej pożywki oddechowej (MiR05) w szklanej zlewce o pojemności 1000 ml.
    1. Dodać 0,190 g EGTA (0,5 mM stężenie końcowe).
    2. Dodać 0,610 g MgCL2·6H2O (3 mM stężenie końcowe).
    3. Dodać 2,502 g tauryny (20 mM stężenie końcowe).
    4. Dodać 1,361 g KH2PO4 (10 mM stężenie końcowe).
    5. Dodać 4,77 g HEPES (20 mM stężenie końcowe).
    6. Dodać 37,65 g D-sacharozy (110 mM stężenie końcowe).
    7. Dodać 800 mlH2Oi wymieszać składniki za pomocą mieszadła magnetycznego w temperaturze 30 °C.
    8. Dodać 120 ml 0,5 M kwasu laktobionowego (60 mM stężenie końcowe).
      1. Rozpuścić 35,83 g kwasu laktobionowego w 100 mlH2O.
      2. Dostosuj pH do 7,0 za pomocą 5 M KOH i zwiększ objętość do 200 ml za pomocąH2O.
    9. Wymieszać roztwór i dostosować pH do 7,1 za pomocą 5 M KOH.
    10. Odważyć 1 g BSA, zasadniczo wolnego od kwasów tłuszczowych (1 g/l stężenia końcowego), w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Dodaj 40 ml roztworu o pH 7,1 z kroku 9 do probówki, delikatnie odwróć do wymieszania i unikaj pienienia. Przenieść rozpuszczony BSA do pozostałego roztworu o pH 7,1 z kroku 9 i delikatnie i ciągle mieszać. Sprawdzić pH jeszcze raz, wyregulować w razie potrzeby i doprowadzić końcową objętość do 1000 ml za pomocąH2O.
    11. Podwielokrotną pożywkę MiR05 rozmieścić w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Rozmrozić tylko raz, tuż przed użyciem.
  4. Przygotować podłoża, rozprzęgacze i inhibitory.
    1. Przygotować 0,8 M jabłczanu: Rozpuścić 536,4 mg kwasu L-jabłkowego w 4 mlH2O. Zneutralizować za pomocą 5 M KOH do pH 7 i zwiększyć objętość do 5 ml za pomocąH2O. Podzielić na porcje, a następnie przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Przygotować 1 M pirogronian: Rozpuścić 550 mg soli sodowej kwasu pirogronowego w 4 mlH2O. Zneutralizować za pomocą 5 M KOH do pH 7 i zwiększyć objętość do 5 ml za pomocąH2O. Podzielić na porcje, a następnie przechowywać w temperaturze -20 °C.
    3. Przygotować 0,5 M ADP (5′-difosforan adenozyny): Rozpuścić 1,068 g soli sodowej ADP w 4 mlH2O. Zneutralizować 5 M KOH do pH 7 i zwiększyć objętość do 5 ml za pomocąH2O. Podzielić na porcje, a następnie przechowywać w temperaturze -20 °C.
    4. Przygotować 2 M glutaminianu: Rozpuścić 3,7426 g monohydratu kwasu L-glutaminowego w 8 mlH2O. Zneutralizować za pomocą 5 M KOH do pH 7 i zwiększyć objętość do 10 ml za pomocąH2O. Podzielić na porcje, a następnie przechowywać w temperaturze -20 °C.
    5. Przygotować 4 mM cytochromu c: Rozpuścić 50 mg cytochromu c w 1 mlH2O. Podzielić na podwielokrotności, a następnie przechowywać w temperaturze -20 °C.
    6. Przygotować 1 M bursztynian: Rozpuścić 2,701 g sześciowodnego soli disodowej bursztynianu w 8 mlH2O. Zneutralizować 1 N HCl do pH 7 i zwiększyć objętość do 10 ml za pomocąH2O. Podzielić na porcje, a następnie przechowywać w temperaturze -20 °C.
    7. Przygotować 1 mM FCCP (cyjanek karbonylu-4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon): Rozpuść 2,54 mg FCCP w 10 ml czystego etanolu. Podzielić na porcje, a następnie przechowywać w temperaturze -20 °C.
    8. Przygotować 150 μM rotenonu: Rozpuść 3,94 mg rotenonu w 10 ml czystego etanolu, aby przygotować 1 mM bulionu, wirować aż do całkowitego rozpuszczenia. Rozcieńczyć 225 μl 1 mM stężenia rotenonu w 1,275 ml czystego etanolu, aby uzyskać 1,5 ml 150 μM rotenonu. Chronić przed światłem, podzielić na porcje, a następnie przechowywać w temperaturze -20 °C.
    9. Przygotować 125 μM antymycyny A: Rozpuścić 11 mg antymycyny A w 4 ml czystego etanolu, aby przygotować 5 mM stężenia podstawowego antymycyny A. Rozcieńczyć 25 μl 5 mM antymycyny A o stężeniu podstawowym 975 μl czystego etanolu, aby uzyskać 1 ml 0,125 mM antymycyny A. Podzielić na podwielokrotności, a następnie przechowywać w temperaturze -20 °C.
    10. Przygotować 0,8 M askorbinianu: Rozpuścić 1,584 g soli sodowej askorbinianu w 8 mlH2O. Dostosować pH kwasem askorbinowym do pH 6 i zwiększyć objętość do 10 ml za pomocąH2O. Chronić przed światłem, podzielić na porcje, a następnie przechowywać w temperaturze -20 °C.
    11. Przygotować 0,2 M TMPD (tetrametylo-p-fenylenodiamina): Rozpuść 32,85 mg TMPD w 987,5 μl DMSO. Dodać 12,5 μl 0,8 M askorbinianu (10 mM końcowe stężenie askorbinianu). Chronić przed światłem, podzielić na porcje, a następnie przechowywać w temperaturze -20 °C.
    12. Przygotować 4 M azydek sodu: Rozpuścić 2,6 g azydku sodu w 10 mlH2O. Podzielić na porcje i przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Wzrost guza

  1. Hoduj komórki EO771 w pożywce wzrostowej RPMI 1640 i utrzymuj komórki w inkubatorze z wilgotnością 37 °C z 5% CO2 .
  2. Jednorodzinne czterotygodniowe samice myszy C57BL/6J, utrzymuj je w temperaturze 21-22 °C w 12-godzinnym cyklu światło: ciemność. Zapewnij myszom ad libitum dostęp do pożywienia i wody.
  3. Gdy myszy osiągną wiek 10 tygodni, przygotuj komórki i myszy do implantacji komórek rakowych.
    1. Trypsynizować komórki, dezaktywować trypsynę za pomocą pożywki wzrostowej i odwirowywać komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić i połączyć granulki komórek (w razie potrzeby) w pożywce. Policz żywe komórki za pomocą błękitu trypanowego i przygotuj rozcieńczenie komórek 1 x 106 komórek w całkowitej objętości 60 μl z roztworem 1:1:1 pożywki/macierzy błony podstawnej/PBS. Po dodaniu macierzy błony podstawnej dobrze wymieszaj i utrzymuj zawiesinę komórkową na lodzie. Napełnić strzykawki 60 μl zawiesiny komórek i umieścić je na lodzie. Pracuj wydajnie i wstrzyknij komórki myszom w ciągu 1,5 godziny od przygotowania.
    2. Znieczulenie myszy przez inhalację izofluranu (3%-5% w przypadku indukcji i 1%-3% w przypadku leczenia podtrzymującego). Ogolić się między prawymi4 i 5 pachwinowymi gruczołami sutkowymi. Ortotopowo wstrzyknąć znieczulonym myszom zawiesinę komórek EO771.
  4. Używaj suwmiarki elektronicznej do monitorowania i mierzenia wzrostu guza dwa razy w tygodniu przez 4 tygodnie. Podczas sekcji zwłok należy wyciąć, zważyć, a następnie natychmiast umieścić guz (lub co najmniej 60 mg wycinka guza) w 10 ml lodowatego biopsu. Trzymaj rurkę na mokrym lodzie.

3. Konfiguracja i kalibracja przyrządu

  1. Ogrzać pożywkę MiR05 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  2. Włącz system Oroboros O2k, otwórz oprogramowanie DATLAB, wprowadź lub wybierz Użytkownik. Kliknij Połącz z O2k. Sprawdź konfigurację O2k i upewnij się, że właściwy przyrząd jest oznaczony jako Power-O2k, a każda komora odpowiada właściwemu czujnikowi tlenu; kliknij przycisk OK. Po otwarciu okna sterowania O2k, w zakładce Systemy ustaw temperaturę bloku na 37 °C, prędkość mieszadła na 750 obr./min dla obu komór, a interwał zapisu danych na 2.0 s. Sprawdź zarówno moc mieszadła, jak i oświetlenie w skrzynkach komory. W zakładce Tlen, O2 ustaw wzmocnienie czujnika na 1 V/μA (wzmocnienie może wymagać regulacji w przypadku starszych modeli instrumentów), napięcie polaryzacji na 800 mV, a następnie kliknij Połącz z O2k. Po otwarciu nowego pliku eksperymentu nazwij plik i kliknij Zapisz. Gdy eksperyment jest aktywny, otworzy się okno wyboru protokołu; kliknij Anuluj, aby uruchomić niestandardowy SUIT (miareczkowanie inhibitora rozłączania substratu).
  3. Po wybraniu protokołu otworzy się okno próbki, w którym należy wypełnić kod eksperymentalny, typ próby, kohortę, kod próbki, numer próby i numer podpróby, jeśli ma to zastosowanie. Przypisz jednostkę do mg i wprowadź stężenie homogenatu guza na ml (ilość na komorę zostanie automatycznie wypełniona). Upewnij się, że wskazane medium to MiR05, a objętość komory wynosi 2.00 ml. Dodaj komentarze w razie potrzeby w dolnym polu i kliknij OK.
  4. Usuń korki i odessaj 70% etanolu z komór. Nigdy nie zasysaj blisko membrany, która jest odsłonięta po wewnętrznej stronie komory. Spłucz cztery razy czystą wodą i napełnij komorę 2,25 ml MiR05.
  5. Test czujnika: Kliknij F9, aby wyłączyć mieszadła na 30 sekund. Po ponownym włączeniu mieszadła upewnij się, że nachylenie O2 szybko rośnie monowykładniczo w każdej komorze. Jeśli komora nie przejdzie testu czujnika, sprawdź połączenia elektryczne i wyczyść, czy nie nagromadziły się sole; Powtórz test. Jeśli czujnik nadal nie przejdzie testu, odłącz złącze polarograficznego czujnika tlenu (POS), aby sprawdzić membranę. W przypadku widocznego uszkodzenia membrany, silnego utlenienia lub znacznego nagromadzenia pęcherzyków, należy przerwać procedury eksperymentalne i przystąpić do serwisowania instrumentu.
  6. Kalibracja tlenu: Wykonaj kalibrację tlenu, aby uzyskać dokładne pomiary oddechu.
    1. Ruchem obrotowym powoli włóż korki do ich pozycji skalibrowanej objętościowo. Odsysić nadmiar pożywki wyrzuconej przez kapilarnę iniekcyjną, która gromadzi się w studzience korka. Ruchem obrotowym podnieś korki na tyle, aby ściśle przylegały do narzędzia do przekładki blokującej, pozostawiając objętość gazu powyżej fazy ciekłej w celu ostatecznego wyrównania powietrza (30-45 min.).
    2. Użyj stanu ustalonego osiągniętego w tym okresie, aby skalibrować czujnik tlenu w celu uzyskania dokładnych pomiarów oddychania. Nachylenie O2 neg. (ujemne nachylenie tlenu) wynosi 0 ± 2 pmol/s·mL. Jeśli wartość jest wyższa niż 2 pmol/s·mL, wyczyść komorę i uzupełnij ją świeżo rozmrożonym MiR05. Jeśli nachylenie jest niestabilne, przystąp do serwisowania przyrządów.
    3. Po osiągnięciu stanu ustalonego wybierz krzywą stężeniaO2 i podświetl stały obszar krzywej, przytrzymując Shift i lewy przycisk myszy. Po wybraniu regionu kliknij F5, wybierz znacznik kalibracji powietrza za pomocą strzałki rozwijanej i kliknij Kalibruj i skopiuj do schowka.
  7. Kalibracja tła instrumentalnego (opcjonalnie)
    1. Po kalibracji powietrza upewnij się, że nad fazą ciekłą nie ma objętości gazu dla zrównoważenia tła strumienia (~15 min) i całkowicie zamknij komory.
      UWAGA: Wskaźnik stanu ustalonego osiągnięty w tym okresie stanowi tło instrumentalne i można go odjąć od danych wynikowych w celu zwiększenia precyzji analitycznej. Nachylenie O2 neg. początkowo nieznacznie wzrośnie i ustabilizuje się między ± 2 do 4 pmol/s·mL.
    2. Jeśli wartość jest wysoka (>6 pmol/s·ml), istnieje potencjalne zanieczyszczenie biologiczne. W takim przypadku wyczyść komorę i uzupełnij ją świeżo rozmrożonym MiR05. Po osiągnięciu stanu ustalonego wybierz krzywą negacji nachylenia O2 i podświetl stały obszar krzywej, przytrzymując Shift i klikając lewym przyciskiem myszy.
    3. Po wybraniu regionu kliknij F5, zaznacz pole Korekcja linii bazowej i znacznik linii bazowej ze strzałką listy rozwijanej, a następnie kliknij przycisk OK.

4. Preparat homogenatu nowotworu

  1. Umieść szklany homogenizator zawierający 1 ml MiR05 i ciasno przylegający szklany tłuczek na mokrym lodzie.
  2. W czasie badania umieść tkankę w 1 ml BIOPS na lodowatej szalce Petriego.
  3. Oczyść i wypreparuj tkankę, aby zmaksymalizować rozpuszczalny materiał, uniknąć martwiczych obszarów i usunąć brzeżną tkankę nowotworową. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego, skalpela i pęsety chirurgicznej usuń włosy, tkankę martwiczą, obwodową tkankę łączną i naczyniową oraz przyległy tłuszcz, jeśli dotyczy. Zadbaj o to, aby guz pozostał w lodowatym BIOPS podczas sekcji.
  4. Pokrój guz na małe kawałki (~ 5-10 mg każdy) i umieść pozostałe kawałki guza z powrotem w 10 ml BIOPS trzymanym na lodzie. W razie potrzeby należy użyć tej chusteczki później do dodatkowych przygotowań.
    UWAGA: Wykonaj szybko następujące kroki, aby zminimalizować czas, w którym próbka nie jest całkowicie zanurzona w BIOPS. Po umieszczeniu próbki w MiR05 czas ma kluczowe znaczenie. Przygotowany homogenat należy jak najszybciej przenieść do skalibrowanej komory.
  5. Ostrożnie osusz skrawki tkanek na bibule filtracyjnej, umieść je na małej plastikowej tarowanej łódce do ważenia i zapisz początkową mokrą masę. Umieść niewykorzystane kawałki z powrotem w stożkowej probówce BIOPS o pojemności 10 ml w celu dalszej konserwacji.
  6. Zanurzyć skrawki tkanek w lodowatym homogenizatorze zawierającym MiR05 i w razie potrzeby zapisać pozostałą masę na łodzi wagowej.
  7. Za pomocą szklanego tłuczka (zakres prześwitu 0,09-0,16 mm) delikatnie rozerwij tkankę nowotworową, wykonując 5-7 ruchów w dół i w górę. Przy każdym pociągnięciu obróć tłuczek ruchem zgodnie z ruchem wskazówek zegara i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara 3 razy, popychając tłuczek w dół i dodatkowe 3 razy, ciągnąc tłuczek z powrotem do góry. Upewnij się, że chusteczka osiądzie na dnie homogenizatora między pociągnięciami, ale unikaj przesuwania tłuczka całkowicie powyżej objętości płynu, aby zapobiec pienieniu się.
    UWAGA: Otrzymany homogenat powinien wydawać się mętny z minimalnymi resztkami tkanek stałych.
  8. Wlej homogenat do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i umieść go na lodzie.
  9. Odpipetować 1-3 ml świeżego MiR05 przez tłuczek i umieścić w homogenizatorze, aby zmyć pozostały homogenat tkankowy. Wlać płukanie MiR05 do stożkowej probówki zawierającej homogenat. Powtórz mycie tłuczka i homogenizatora 2-3 razy, aby zapewnić całkowite przeniesienie homogenatu. Należy pamiętać o docelowym stężeniu i wymaganej objętości, aby nie rozcieńczyć nadmiernie próbki podczas etapów mycia.
  10. Aby dokładnie obliczyć stężenie homogenatu tkankowego, należy dokładnie sprawdzić homogenizator i homogenat pod kątem pozostałego niehomogenizowanego materiału (tj. tkanki łącznej).
    1. Aby usunąć niehomogenizowany materiał z homogenizatora, do którego nie można dotrzeć pęsetą, należy dodać MiR05 do homogenizatora, odessać objętość (wraz z tkanką) za pomocą pipety i przenieść zawartość na szalkę Petriego.
    2. Aby usunąć niehomogenizowany materiał z homogenatu (osadzony w dużych kawałkach na dnie stożkowej probówki), należy zassać duże kawałki pipetą i umieścić je na nasadce tkankowej stożkowej probówki.
    3. Usuń tkankę z szalki Petriego lub stożkowej nasadki probówki za pomocą pęsety i osusz ją na bibule filtracyjnej. Dodaj pozostały homogenat ze stożkowej nakrętki probówki z powrotem do stożkowej probówki, zakryj ją, a następnie odwróć, aby wymieszać.
    4. Ponownie sprawdzić homogenizatory i homogenizować pod kątem dodatkowego materiału niehomogenizowanego i powtórzyć kroki 4.10.1-4.10.3, aby usunąć materiał w razie potrzeby.
  11. Zważyć i zapisać masę niehomogenizowanego materiału odzyskanego z homogenizatora. Sprawdzić, czy w preparacie homogenatu nie ma przeniesionych tkanek w rażąco nienaruszonych śladach. Usuń niehomogenizowane kawałki i zważ w razie potrzeby.
  12. Odjąć masę tkanki odzyskanej z łodzi wagowej, homogenizatora i homogenatu (jeśli to konieczne) od początkowej mokrej masy, aby obliczyć końcową masę próbki.
  13. Korzystając z końcowej masy próbki, dodaj dodatkowy MiR05, aby doprowadzić homogenat do pożądanego stężenia (patrz krok 5, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat eksperymentów optymalizacyjnych).
  14. Po zważeniu i przygotowaniu homogenatu należy jak najszybciej przystąpić do oznaczania. Próbkę należy przechowywać na mokrym lodzie do czasu jej przeniesienia do przyrządu.

5. Substrat, rozprzęgacz, protokół miareczkowania inhibitora (SUIT)

  1. Po skalibrowaniu przyrządu i przygotowaniu próbki należy usunąć korki ruchem obrotowym i zassać MiR05 z komór (unikając membrany odsłoniętej wewnątrz komory). Dobrze wymieszaj homogenat i dodaj 2,25 ml homogenatu do komory. W przypadku dodawania jednego homogenatu do wielu komór, pipetuj po 1 ml na raz do każdej komory, mieszając homogenat, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie w tkankach. Kliknij F4, aby nazwać i oznaczyć czas zdarzenia, a następnie kliknij OK.
  2. Napełnij strzykawkę o pojemności 50 ml tlenem ze zbiornika tlenu z regulatorem i rurką gazową za pomocą igły 18 G. Hiperdotlenić komory do ~500 μM tlenu. W tym celu wstrzyknij tlen bezpośrednio do komór. Luźno włóż korki i poczekaj na zamknięcie, aż tlen osiągnie ~480 μM. Ruchem obrotowym powoli zamknij komorę i pozwól, aby oddech się zrównoważył (~15-20 min). W razie potrzeby napełnić centralną kapilarnę korka MiR05.
  3. Analityczne oznaczanie zdolności OXPHOS i ET (stan przeniesienia elektronów) aktywności sprzężonej z N i NS oraz CIV (kompleksu IV): Użyj dedykowanych mikrostrzykawek do wstrzykiwania substratów, rozłączników i inhibitorów do całkowicie zamkniętych komór. Kliknij F4 przy każdym wstrzyknięciu, aby nazwać i oznaczyć czasowo zdarzenia dla każdej komory w czasie rzeczywistym. W trakcie badania należy wybrać F6, aby w razie potrzeby dostosować skale ujemne stężenia O2 i nachyleniaO2. Po każdym wstrzyknięciu należy umyć strzykawki 3 razy w wodzie (w przypadku związków rozpuszczalnych w wodzie) lub 70% etanolu (w przypadku związków rozpuszczonych w etanolu lub DMSO).
    UWAGA: Sprzężony z N: strumień O2 wspierany przez zdefiniowane kombinacje substratów generujących NADH, sprzężony z NS: strumień O2 wspierany przez zbieżność zdefiniowanych kombinacji substratów generowanych przez NADH i bursztynian.
    1. Dodać 5 μl 0,8 M jabłczanu (2 mM stężenie końcowe) i natychmiast przejść do następnego wstrzyknięcia. Umyć strzykawkę do wstrzykiwań 3 razy w wodzie.
    2. Natychmiast dodać 5 μl 1 M pirogronianu (2,5 mM stężenie końcowe) i poczekać, aż oddech się ustabilizuje. Umyć strzykawkę do wstrzykiwań 3 razy w wodzie.
    3. Dodać 10 μl 0,5 M ADP (2,5 mM stężenie końcowe) i poczekać, aż odpowiedź ADP się ustabilizuje. Umyć strzykawkę do wstrzykiwań 3 razy w wodzie.
      UWAGA: Może być wymagane dodatkowe ADP (2,5-10 mM), aby zapewnić, że stężenia adenylanu nie ograniczają się do strumieni oddechowych.
    4. Dodać 5 μl 2 M glutaminianu (5 mM stężenie końcowe) i poczekać, aż oddech się ustabilizuje. Umyć strzykawkę do wstrzykiwań 3 razy w wodzie.
    5. Dodać 5 μl 4 mM cytochromu c (10 μM stężenie końcowe) i poczekać, aż oddychanie się ustabilizuje. Umyć strzykawkę do wstrzykiwań 3 razy w wodzie.
    6. Dodać 20 μl 1 M bursztynianu (10 mM stężenie końcowe) i poczekać, aż oddech się ustabilizuje. Umyć strzykawkę do wstrzykiwań 3 razy w wodzie.
    7. Miareczkować z dokładnością do 0,5-1 μl FCCP 1 mM (stężenie końcowe 2-20 μM) i czekać, aż oddech się ustabilizuje po każdym wstrzyknięciu, kontynuować, aż nie nastąpi dodatkowe zwiększenie oddychania. Umyć strzykawkę do wstrzykiwań 3 razy w 70% etanolu.
    8. Dodać 2 μl 150 μM rotenonu (150 nM-2 μM stężenie końcowe) i poczekać, aż oddychanie się ustabilizuje. Dodaj kolejny 1 μl rotenonu, aby upewnić się, że nie ma dalszego hamowania. W przypadku zmniejszenia oddechu należy kontynuować dodatkowe wstrzyknięcia, aż do momentu, gdy nie nastąpi zmniejszenie oddychania. Umyć strzykawkę do wstrzykiwań 3 razy w 70% etanolu.
    9. Dodać 2 μl 125 μM antymycyny A (125 nM-5 μM stężenie końcowe) i poczekać, aż oddech się ustabilizuje. Dodaj kolejny 1 μl antymycyny A, aby upewnić się, że nie ma dalszego hamowania. W przypadku zmniejszenia oddechu należy kontynuować dodatkowe wstrzyknięcia, aż do momentu, gdy nie nastąpi zmniejszenie oddychania. Umyć strzykawkę do wstrzykiwań 3 razy w 70% etanolu.
    10. Sprawdzić stężenie tlenu w komorze; jeśli stężenie jest niższe niż 125 μM, należy ponownie natlenić do powietrza w pomieszczeniu lub lekko przetlenić, aby upewnić się, że tlen nie ogranicza przepływu tlenu. Dodać 5 μl 0,8 M askorbinianu (2 mM stężenie końcowe). Umyć strzykawkę do wstrzykiwań 3 razy w 70% etanolu.
    11. Natychmiast dodać 10 μl 0,2 M TMPD (1 mM stężenie końcowe), poczekać na powolny wzrost oddechu. Umyć strzykawkę do wstrzykiwań 3 razy w 70% etanolu.
    12. Dodać 25 μl 4 M azydku sodu (50 mM stężenie końcowe) natychmiast po ustabilizowaniu się strumienia oddechowego askorbinianu/TMPD. Umyć strzykawkę do wstrzykiwań 3 razy w 70% etanolu.
    13. Zakończ badanie - kliknij Plik, Zapisz i odłącz. Kontynuować mycie komory i strzykawki, wykonując czynności 9.2-9.3.

6. Protokół czułości ADP

  1. Po skalibrowaniu przyrządu i przygotowaniu próbki, należy usunąć korki ruchem obrotowym i zassać MiR05 z komór (unikając membrany odsłoniętej po wewnętrznej stronie komory). Dobrze wymieszaj homogenat i dodaj 2,25 ml homogenatu do komory. Załóżmy, że dodajemy jeden homogenat do wielu komór, pipetujemy po 1 ml na raz do każdej komory, mieszając homogenat, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie w tkankach. Kliknij F4, aby nazwać i oznaczyć czasowo zdarzenie, a następnie kliknij OK.
  2. Włóż korki i ruchem obrotowym powoli zamknij komorę i pozwól, aby oddech się wyrównał (~15-20 min). W razie potrzeby napełnić centralną kapilarnę korka MiR05.
  3. Analityczne oznaczanie wrażliwości ADP mitochondriów sprzężonych z bursztynianem: Kliknij F4 przy każdym wstrzyknięciu, aby nazwać i oznaczyć czasowo zdarzenia dla każdej komory w czasie rzeczywistym. W trakcie badania należy wybrać F6, aby w razie potrzeby dostosować skale ujemne stężenia O2 i nachyleniaO2.
    1. Dodać 2 μl 150 μM rotenonu (stężenie końcowe 150 nM).
    2. Natychmiast dodać 20 μl 1 M bursztynianu (10 mM stężenie końcowe) i poczekać, aż oddech się ustabilizuje.
    3. Miareczkować ADP poprzez stopniowe dodawanie stężeń podnasyconych, aż do osiągnięcia maksymalnej szybkości odpowiedzi (VMAX; stężenie końcowe 2,5-10 mM).
      UWAGA: Szybkość może ustabilizować się po wstrzyknięciu z powodu niewielkiej zmiany stężenia ADP, zwiększając w ten sposób stężenie we wstrzyknięciu po każdym plateau i kontynuując miareczkowanie, aż nie nastąpi dalszy wzrost oddychania, nawet przy krotnym wzroście stężenia ADP we wstrzyknięciu.

7. Zalecane eksperymenty optymalizacyjne

  1. Określ optymalny homogenat i stężenie tlenu dla protokołu.
    1. Wykonaj protokół SUIT (kroki 5.1-5.3) przy wielu stężeniach tkankowych (np. 30 mg/ml, 20 mg/ml, 10 mg/mL, 5 mg/mL, 2,5 mg/mL, 1 mg/ml i/lub 0,5 mg/ml).
    2. Wybierz stężenie, które maksymalizuje strumień oddechowy, jednocześnie ograniczając częstotliwość reoksygenacji (nie więcej niż 1-2). Jeśli wymagane jest częstsze ponowne natlenianie, należy zmniejszyć stężenie homogenatu.
  2. Określ optymalną liczbę uderzeń za pomocą homogenizatora.
    1. Wykonaj protokół SUIT (kroki 5.1-5.3) na wielu poziomach homogenizacji (np. 5 uderzeń, 10 uderzeń, 15 uderzeń, 20 uderzeń).
    2. Ponieważ w literaturze nie ma wystarczających danych, aby określić próg procentowego wzrostu cytochromu c z preparatem homogenatu nowotworu, należy wybrać preparat o ograniczonej odpowiedzi cytochromu c, ale odpowiednim oddychaniu energetyzowanym przez interesujący substrat (substraty).
  3. Określ optymalne stężenia substratu, ADP, rozprzęgacza i inhibitora wymagane dla ilościowych i powtarzalnych strumieni oddechowych.
    1. Wykonaj protokół SUIT (kroki 5.1-5.3.9) przy wybranym stężeniu tkanki (krok 7.1). Miareczkować każdy substrat, rozłączacz, inhibitor i ADP, aż do momentu, gdy nie zaobserwuje się dalszej reakcji. Miareczkować inhibicję za pomocą azydku sodu w oddzielnych eksperymentach.
      1. Dodać 5 μl 0,8 M jabłczanu (2 mM stężenie końcowe) i natychmiast przejść do następnego wstrzyknięcia.
      2. Miareczkować z dokładnością do 1 μl 1 M pirogronianu i poczekać, aż oddech się ustabilizuje po każdym wstrzyknięciu, kontynuować do momentu, gdy nie nastąpi dodatkowe zwiększenie oddechu.
      3. Miareczkować z dokładnością co 2 μl do 0,5 M ADP i czekać, aż oddech się ustabilizuje po każdym wstrzyknięciu, kontynuować do momentu, gdy nie nastąpi dodatkowe zwiększenie oddychania.
      4. Miareczkować z dokładnością do 1 μl 2 M glutaminianu i czekać, aż oddech się ustabilizuje po każdym wstrzyknięciu, kontynuować, aż nie nastąpi dodatkowe zwiększenie oddychania.
      5. Dodać 5 μl 4 mM cytochromu c (10 μM stężenie końcowe) i poczekać, aż oddychanie się ustabilizuje.
      6. Miareczkować z dokładnością do 5 μl 1 M bursztynianu i poczekać, aż oddech się ustabilizuje po każdym wstrzyknięciu, kontynuować do momentu, gdy nie nastąpi dodatkowe zwiększenie oddychania.
      7. Miareczkować z dokładnością co 5 μl do 0,5 M ADP i czekać, aż oddech się ustabilizuje po każdym wstrzyknięciu, kontynuować do momentu, gdy nie nastąpi dodatkowe zwiększenie oddechu.
      8. Miareczkować z dokładnością do 0,5 μl FCCP wynoszącą 1 mM i poczekać, aż oddech się ustabilizuje po każdym wstrzyknięciu, kontynuować do momentu, gdy nie nastąpi dodatkowe zwiększenie oddychania.
      9. Miareczkować z dokładnością co 1 μl 150 μM rotenonu i poczekać, aż oddech się ustabilizuje po każdym wstrzyknięciu, kontynuować do momentu, gdy nie nastąpi zmniejszenie oddechu.
      10. Miareczkować z dokładnością co 1 μl 125 μM antymycyny A i poczekać, aż oddech się ustabilizuje po każdym wstrzyknięciu, kontynuować tak długo, aż nie nastąpi dodatkowe spowolnienie oddychania.
      11. Dodać 5 μl 0,8 M askorbinianu (2 mM stężenie końcowe).
      12. Natychmiast dodaj 5 μL 0,2 M TMPD (0,5 mM stężenia końcowego), poczekaj, aż oddech będzie powoli przyspieszał. W osobnym eksperymencie dodaj 10 μl 0,2 M TMPD (1 mM stężenie końcowe).
      13. W oddzielnych eksperymentach dodaj 10 μl, 25 μl, 50 μl i 100 μl 4 M azydku sodu (odpowiednio 20 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM stężenie końcowe) natychmiast po ustabilizowaniu się strumienia oddechowego askorbinianu / TMPD.
    2. Wybierz substrat i stężenia inhibitorów, które są nasycone w pierwszym wstrzyknięciu, aby poprawić czas eksperymentu. Użyj ADP w stężeniach nasycających lub niedostatecznie nasyconych, aby połączyć oceny czułości ADP z tradycyjnymi protokołami SUIT.
    3. Stosować submaksymalne stężenia rozprzęgacza, aby wykazać reakcję na dawkę bez hamowania strumienia oddechowego.

8. Analiza danych

  1. Analiza SUIT
    1. Wybierz prędkości w stanie ustalonym lub szczytowym z każdego miareczkowania i wyeksportuj je do redukcji analitycznej.
    2. Wyrazić dane jako pmol O2 na sekundę na mg tkanki (pmol/s/mg).
    3. Osiągnij analityczną redukcję PM-L, PM-P, PMG-P, PMGS-P i PMGS-E poprzez odjęcie wskaźnika niewrażliwości na antymycynę A od odpowiedniego współczynnika (tj. wskaźnika w stanie ustalonym uzyskanego po dodaniu ADP).
      UWAGA: PM: pirogronian + jabłczan; PMG: pirogronian + jabłczan + glutaminian; PMGS: pirogronian + jabłczan + glutaminian + bursztynian; -L: Stan wycieku; -P: Stopień fosforylacji oksydacyjnej, -E: Stan przeniesienia elektronów.
    4. Osiągnąć analityczną redukcję CIV-E poprzez odjęcie wskaźnika niewrażliwości na azydek sodu od wskaźnika szczytowego askorbinianu/TMPD.
    5. Osiągnij analityczną redukcję PMG-E poprzez odjęcie wskaźnika niewrażliwości na rotenon od wskaźnika PMGS-E.
    6. Osiągnij analityczną redukcję S-E poprzez odjęcie wskaźnika niewrażliwości na antymycynę A od wskaźnika niewrażliwości na rotenon.
    7. Osiągnąć analityczne zmniejszenie skuteczności kontroli cytochromu c, markera nienaruszalności błony zewnętrznej, za pomocą następującego równania:
      jc = ((JCHNOc - JCHNO)/JCHNO) x 100
      W równaniu jc to % wzrost po dodaniu cytochromu c, JCHNOc to strumień tlenu po dodaniu cytochromu c, a JCHNO to strumień tlenu przed dodaniem cytochromu c.
  2. Analiza wrażliwości ADP
    1. Analitycznie określ kinetykę czułości ADP w odniesieniu do szybkości przeciekania bursztynianu + rotenonu (a nie szybkości homogenatu tkankowego).
    2. Wykreślić strumieńO2 (oś Y) w stosunku do względnego stężenia ADP (oś X). Określić maksymalną prędkość oddechową (Vmax) jako szybkość szczytową osiągniętą podczas miareczkowania ADP.
    3. Określ kinetykę Michaelisa-Mentena za pomocą oprogramowania do dopasowywania krzywych (PRISM, wersja 10.1), aby ujawnić stężenie ADP, przy którym osiąga się 1/2 VMAX (pozorne KM).

9. Instrumentalna kontrola jakości

  1. Wykonaj instrumentalne tło O2 w żądanym zakresie stężenia tlenu (0-600 μM) i kalibrację zera.
    1. Wykonaj kroki 3.1 i 3.2
    2. Usuń korki i odessaj 70% etanolu z komór (unikając membrany odsłoniętej po wewnętrznej stronie komory). Przepłukać 4 razy podwójnie destylowanymH2Oi napełnić komorę 2,25 ml MiR05
    3. Hiperdotlenić komory do ~600 μM tlenu.
    4. Powoli włóż korki do pozycji całkowicie zamkniętej. Odsysać nadmiar pożywki wyrzuconej przez kapilę iniekcyjną i zebranej w studzience korka i pozwolić na ustabilizowanie się sygnału tlenowego (30-45 min).
    5. Aby przeprowadzić kalibrację tlenu, wybierz obszar, w którym zarówno stężenie tlenu, jak i nachylenie są stabilne, otwórz okno kalibracji dla odpowiedniej komory i wybierz znak R1.
    6. Przygotować roztwór ditionitu, rozpuszczając 20 mg wodorosiarczynu sodu w 0,5 ml wody. Ogranicz ekspozycję na powietrze, ponieważ ditionit utlenia się z czasem pod wpływem tlenu.
    7. Po ustabilizowaniu się sygnału tlenowego wstrzyknąć 1 μl i obserwować spadek stężenia tlenu. W razie potrzeby dostosować moc roztworu ditionitu.
    8. Wstrzyknąć wystarczającą ilość roztworu ditionitu, aby obniżyć stężenie tlenu odpowiednio do 450 μM, 300 μM, 225 μM, 150 μM, 75 μM i 0 μM. Przy każdym wstrzyknięciu należy pozwolić, aby tlen się ustabilizował i wybrać znacznik nachylenia w stanie ustalonym. Gdy stężenie tlenu wyniesie ~0 μM, zaznacz stężenie tlenu.
    9. Aby wykonać instrumentalną korekcję tła O2, wybierz okno strumienia/nachylenia dla odpowiedniej komory, wybierz Kalibracja tła O2 i kliknij Kalibruj dla interesujących Cię znaczników.
    10. Aby przeprowadzić kalibrację zera, otwórz okno kalibracji dla odpowiedniej komory i wybierz znak R0 uzyskany po miareczkowaniu ditionitu.
  2. Czyszczenie narzędzi
    1. Szybko spłucz każdą komorę czystą wodą trzy razy. Do pierwszego prania odessać homogenat, całkowicie napełnić komorę wodą, a następnie zassać wodę. Do drugiego płukania napełnij komorę w 3/4 wodą, włóż korki, aby przepchnąć wodę przez kapilar iniekcyjny, zaessaj część wody przez kapilar iniekcyjne, a następnie wyjmij korki, aby całkowicie odessać popłucz.
    2. Myć komory 70% etanolem przez 5 min.
    3. Nad zlewem lub zlewką wyczyść korki czystą wodą, 70% etanolem i 100% etanolem, przetłaczając płyn przez naczynia włosowate do wstrzykiwań za pomocą butelki do mycia.
    4. Szybko spłucz każdą komorę czystą wodą dwa razy.
    5. Inkubować komory z 2 ml PBS zawierającego ~ 2 mg zamrożonych mitochondriów, lizatu komórkowego lub żywych fibroblastów przez 15 minut.
    6. Umyj komory czystą wodą przez 5 minut dwa razy.
    7. Umyj komory 70% etanolem przez 5 minut dwa razy.
    8. Myć komory 100% etanolem przez 10 min.
    9. Napełnij komory 70% etanolem.
      1. Jeśli przeprowadzasz kolejny eksperyment, pozostaw komory w 70% etanolu na 5 minut, a następnie przejdź do kroku 3.3.
      2. Jeśli eksperymenty zostaną zakończone, załóż pokrywki na korki i wyłącz instrument.
  3. Po każdym użyciu należy odpowiednio oczyścić strzykawki do wstrzykiwań i przechowywać je przeznaczone do określonego stosowania w związku chemicznym, aby zapobiec ich przeniesieniu.
    1. Włożyć strzykawkę do płynu myjącego i całkowicie zanurzyć igłę do wstrzykiwań.
    2. Pobrać płyn myjący do strzykawki do maksymalnej objętości.
    3. Wyjąć strzykawkę z pojemnika do mycia, wylać płyn do płukania do zlewki, a następnie osuszyć strzykawkę na ręczniku papierowym.
    4. Kroki 9.3.1-9.3.3 powtórzyć trzy razy tak szybko, jak to możliwe po każdym użyciu.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wstępne badania wykazały, że guzy EO771 były słabo oksydacyjne i dlatego wymagały wysokich stężeń homogenatu dla odpowiedniej oceny strumieniaO2. Przeprowadzono eksperymenty optymalizacyjne w celu określenia optymalnego zakresu stężeń homogenatu tkankowego dla badania. Homogenaty guza początkowo przygotowywano w dawce 40 mg/ml, a następnie rozcieńczano liniowo. StrumieńO2 znormalizowany do masy tkankowej był spójny we wszystkich stężeniach (Rysunki 1A-D). Zaobserwowano, że dawka 40 mg/ml powodowała szybkie wyczerpanie tlenu i nie nadawała się do eksperymentów (Rysunek 1A). Zużycie tlenu znacznie spadło przy 30 mg/ml i 20 mg/ml, ale nadal gwałtownie spadało w krótkim czasie przy braku substratów lub ADP (Rysunek 1B, C). Stężenie 10 mg/ml skutkowało optymalnym wskaźnikiem zużycia tlenu (Rysunek 1D), który wspierałby dłuższy, 90-minutowy protokół SUIT.

Protokół SUIT został użyty do oceny OXPHOS i ET związanych z NADH- i bursztynianem, a także aktywności CIV (Rysunek 2A). Pirogronian i jabłczan dodawano do homogenatu tkankowego pod nieobecność ADP w celu przeprowadzenia przecieku (L) przez NADH. Następnie dodano nasycający ADP w celu wysterowania maksymalnego OXPHOS (P) sprzężonego z NADH, a następnie dodano glutaminian. Następnie dodano cytochrom c, aby zapewnić integralność błony zewnętrznej; wzrost częstości oddechów był mniejszy niż 20% we wszystkich próbkach (Rysunek 2B). Biorąc pod uwagę bardzo niską odpowiedź na substraty sprzężone z NADH, oceniano również uwalnianie cytochromu c w obecności bursztynianu i rotenonu oraz obserwowano minimalną stymulację cytochromem c (Figura 2B). Co ciekawe, OXPHOS związany z NADH był znikomy w guzach EO771 (Figura 2C). Następnie dodano bursztynian w obecności pirogronianu, jabłczanu i glutaminianu w celu stymulowania przepływu elektronów przez dehydrogenazę bursztynianową. FCCP został następnie miareczkowany w celu wysterowania maksymalnego przepływu elektronów (E), co ujawniło, że w guzach EO771 fosforylacja, a nie utlenianie, ograniczała się do oddychania (Rysunek 2C). Rotenon i antymycyna A były następnie miareczkowane w celu zahamowania odpowiednio kompleksu I i kompleksu III. Następnie dodano askorbinian i TMPD, aby napędzać maksymalny przepływ elektronów przez CIV, który jest następnie hamowany przez azydek sodu. Tabela 1 ilustruje analityczne równania redukcji surowych danych (Tabela 2) w celu ilościowego określenia parametrów oddechowych wykreślonych w Rysunek 2C. Ogólnie rzecz biorąc, profile oddechowe homogenacji guza (Ryc. 2C) są podobne do tych z niewszczepionych komórek EO771 przepuszczalnych digitoniną (Ryc. 2D), z wyjątkiem zmniejszonego maksymalnego transferu elektronów wspieranego przez substraty sprzężone z N i S w guzie.

Ponieważ oddychanie związane z NADH było znikome, kinetyka oddechowa bursztynianu była dalej oceniana przez stopniowe miareczkowanie nienasyconego ADP, aż do osiągnięcia maksymalnej szybkości (VMAX) (Rysunek 3A,3B). Półmaksymalne stężenie (KM) ADP w obecności bursztynianu + rotenonu wynosiło 37,5 μM, podczas gdy VMAX wynosiło ~10,5 pmol/s/mg (Rysunek 3C). Tak więc, pomimo stosunkowo słabych szybkości utleniania, guzy EO771 były bardzo wrażliwe na ADP i utrzymywały syntezę ATP przy stosunkowo niskich stężeniach ADP.

Wybór odpowiednich regionów surowych danych do ekstrakcji jest kluczowy dla powtarzalności eksperymentów i dokładnej kwantyfikacji. W przypadku cytochromu c należy wybrać znacznik w stanie ustalonym bezpośrednio przed wstrzyknięciem (Rysunek 4A, znak 1). Często występuje początkowy artefakt wstrzyknięcia, po którym może nastąpić okres czasu (około 5-10 minut), w którym strumieńO2 nie jest stały. Ocena wydajności cytochromu c jest dokonywana poprzez dokonanie dodatkowej selekcji po ustabilizowaniu się strumieniaO2 (Rysunek 4A, znak 2). Selekcje po dodaniu substratów, ADP lub większości inhibitorów są również dokonywane po artefakcie iniekcji i po ustabilizowaniu się strumieniaO2 (Rysunek 4B). Selekcja stosowana do określenia maksymalnego oddychania niesprzężonego jest dokonywana przy szczytowym wzroście osiągniętym podczas miareczkowania FCCP, które często nie jest ostatnim wykonanym wstrzyknięciem (Rysunek 4C). Selekcji TMPD dokonuje się po dodaniu zarówno askorbinianu, jak i TMPD oraz przy szczytowym wzroście oddychania (Rysunek 4D, znak 1). Tuż po tym szczycie dodawany jest inhibitor, azydek sodu, który gwałtownie zmniejsza oddychanie, ale często ma artefakt iniekcji niższy niż zahamowana częstość oddychania (Rysunek 4D). Znak inhibitora jest wykonywany natychmiast po wstrzyknięciu artefaktu (Rysunek 4D, znak 2). StrumieńO2 zazwyczaj nie stabilizuje się i nadal maleje.

Tabela 1: Notacja oddechowa i wyprowadzenie analityczne. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Charakterystyka próbki i układu oddechowego homogenatów luminalnego guza sutka B. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

figure-results-1
Rysunek 1: Optymalizacja stężenia homogenatu guza. O2 Strumień (czerwony) i O2 Stężenie (niebieski) w homogenatach guza sutka przygotowanych w (A) 40 mg/mL, (B) 30 mg/mL, (C) 20 mg/ml i (D) 10 mg/mL. Thom: Oddychanie jednorodne tkankowo. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Ocena zdolności OXPHOS i ET za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości w świeżo wyciętych homogenatach guza. (A) Reprezentatywny wykres zużycia tlenu (czerwony) i stężeń (niebieski) w trakcie protokołu substratu, inhibitora i rozprzęgacza. PM: pirogronian + jabłczan, D: ADP, G: glutaminian, c: cytochrom c, S: bursztynian, F: FCCP, zgnilizna: rotenon, Ama: antymycyna A, Asc/TMPD: askorbinian/tetrametylo-p-fenylenodiamina. (B) Procentowy wzrost strumieniaO2 po dodaniu cytochromu c. (C-D) Oddychanie wspomagane jabłczanem, pirogronianem, glutaminianem i bursztynianem w obecności ADP, FCCP i askorbinianu/TMPD w (C) homogenatach guza pochodzących z EO771 i (D) niezagnieżdżonych komórkach permeabilizowanych digitoniną EO771. Thom: Oddychanie jednorodne tkankowo; PM: pirogronian + jabłczan; PMG: pirogronian + jabłczan + glutaminian; PMGS: pirogronian + jabłczan + glutaminian + bursztynian; CIV: Kompleks IV; -L: Stan wycieku; -P: Stopień fosforylacji oksydacyjnej, -E: Stan przeniesienia elektronów; Sprzężony z N: strumieńO2 wspierany przez zdefiniowane kombinacje substratów generujących NADH; Sprzężony z NS: strumień O2 wspierany przez zbieżność zdefiniowanych kombinacji substratów generowanych przez NADH i bursztynianu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Guzy sutka EO771 wykazywały wysoką wrażliwość ADP (adenozyno-5′-difosforanu). (A) Reprezentatywny wykres zużycia tlenu (kolor czerwony) i stężeń tlenu (kolor niebieski) w całym protokole miareczkowania ADP sprzężonego z S. Thom: Oddychanie jednorodne tkankowo; S/Rot: bursztynian/rotenon; D: ADP. (B) Oddychanie wspomagane bursztynianem w obecności rotenonu i zwiększające się stężenia ADP (0 μM ADP = S/Rot-L). (C) Maksymalna szybkość (VMAX) i połowa maksymalnego stężenia(KM) ADP w obecności bursztynianu + rotenonu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Reprezentatywny rysunek ilustrujący wybór znaczników surowych strumieni O2 do ekstrakcji danych. (A) Wybór cytochromu c: wybór numer 1 przed wstrzyknięciem cytochromu c i wybór numer 2 po wstrzyknięciu, gdy strumień O2 się ustabilizował. c Cytochrom c. (B) Wybór substratu, ADP i inhibitora: wybór numer 1 po wstrzyknięciu (bursztynian na tym reprezentatywnym poletku), w którym strumieńO2 ustabilizował się. S: Bursztynian. (C) Wybór rozprzęgacza: wybór numer 1 przy szczytowym wzroście oddychania podczas miareczkowania rozprzęgacza. Na tym reprezentatywnym wykresie miareczkowania FCCP trzecie wstrzyknięcie nieznacznie zmniejsza oddychanie i dlatego nie jest wykorzystywane do selekcji. F: ACCP. (D) Selekcja TMPD: selekcja numer 1 przy szczytowym wzroście oddychania po wstrzyknięciach askorbinianu i TMPD. Selekcja azydku sodu: wybór numer 2 po artefakcie ostrego wstrzyknięcia, gdy oddychanie początkowo się zmniejsza. As/Tm: Askorbinian/TMPD; Azd: Azide. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podejścia do oceny oddychania mitochondrialnego w nowotworach były w dużej mierze ograniczone do modeli in vitro 13,14,15,16. Osiągnięto pewne sukcesy w pomiarze oddychania mitochondrialnego w nowotworach za pomocą przepuszczalności chemicznej 6,7,17, ale nie ma jednolitego, złotego standardu podejścia, które można by uniwersalnie zastosować i porównać między typami nowotworów. Ponadto brak spójnej analizy danych i raportowania ma ograniczoną możliwość uogólnienia i odtwarzalność danych. Opisana tutaj metoda zapewnia proste, stosunkowo szybkie podejście do pomiaru oddychania mitochondrialnego18 w preparatach mitochondrialnych ze świeżo wyciętych próbek guzów litych. Guzy wyrosły z ortotopowo wszczepionych mysich komórek raka sutka Luminal B, ERα-ujemnych EO77119.

Staranność i ostrożność w obchodzeniu się z tkankami znacznie poprawi dokładność i normalizację wskaźników zużycia tlenu. Tkanka i mitochondria mogą zostać łatwo uszkodzone, jeśli próbka nie jest utrzymywana w niskiej temperaturze, nie jest stale zanurzana w pożywkach konserwujących lub jest nadmiernie traktowana, co skutkuje nieoptymalnymi wskaźnikami rutynowymi i OXPHOS. Ponadto kluczowe znaczenie ma dokładna mokra masa homogenizowanej tkanki, ponieważ jest to podstawowa metoda normalizacji. Można rozważyć inne metody normalizacji, takie jak białko całkowite lub markery specyficzne dla mitochondriów, takie jak aktywność syntazy cytrynianu20. Ponadto konieczne będzie zajęcie się kwestią niejednorodności tkanek, a decyzje dotyczące regionów nowotworu, które należy uwzględnić w eksperymentach, będą podejmowane a priori. Martwicza, zwłóknieniowa i łączna tkanka łączna może nie homogenizować i/lub dobrze oddychać i należy ich unikać, chyba że celowo bada się te obszary guza. Warto zauważyć, że guz może być bardzo lepki w zależności od rodzaju i obszaru wycięcia, co sprawia, że dokładne ważenie i przenoszenie jest trudniejsze. Liczba pociągnięć stosowanych do homogenizacji powinna być zoptymalizowana, aby zapewnić pełne przygotowanie mitochondriów, jednocześnie łagodząc uszkodzenia zewnętrznych błon mitochondrialnych.

W celu poprawy dokładności i odtwarzalności zalecamy przeprowadzanie eksperymentów optymalizacyjnych dla liczby ruchów preparatu homogenatu, stężenia tkanki oraz stężeń substratu, rozprzęgacza i inhibitora. W badaniach można porównać różną liczbę udarów i sposób, w jaki odpowiadają one odpowiedzi na dodanie cytochromu c w badaniu, a także maksymalną mitochondrialną wydolność oddechową 21. Chociaż istnieje ogólna zgoda co do tego, że mniejsza odpowiedź cytochromu c jest lepsza, ponieważ wzrost zużycia tlenu po dodaniu cytochromu c może wskazywać na uszkodzenie zewnętrznej błony mitochondrialnej, nie ma złotego standardu co do tego, jaki jest ten próg dla każdej tkanki i powinien być badany eksperymentalnie, aby upewnić się, że tkanka nie jest przepracowana lub nieprzygotowana. W tej tkance nowotworowej stwierdzono, że odpowiedź cytochromu c poniżej ~30% nie upośledzała funkcji oddechowych. Stosowanie cytochromu c staje się kluczowe dla dokładnej oceny ilościowej wydolności oddechowej, jeśli test jest pozytywny. W takim przypadku dodatek uzupełnia endogenny cytochrom c, którego wyczerpanie spowoduje niedoszacowanie częstości oddechów.

Eksperymenty z miareczkowaniem stężenia w tkankach mogą być przeprowadzane w zakresie możliwych stężeń i, w idealnym przypadku, powinny być przeprowadzane przy użyciu SUITs, które będą badane podczas badania. Pojemność oddechowa będzie się różnić w zależności od rodzaju i składu guza. Tak więc guzy gęste z mitochondriami lub dużą pojemnością oddechową będą wymagały niższych stężeń (0,5-5 mg / ml). Guzy z niewielką liczbą mitochondriów lub niską wydolnością oddechową będą wymagały wyższych stężeń (7-12 mg/ml). Dodatkowo, SUITy, które są długie lub mają mocno zużyte podłoża, mogą potrzebować mniej tkanki, aby zapobiec retlenkacji komory lub ograniczeniu ADP. Niektóre tkanki będą miały liniową zależność w zużyciu tlenu, podczas gdy inne będą wykazywać lepszą wrażliwość i maksymalne utlenianie w określonych zakresach stężeń. Wybrane stężenie w tkankach powinno być zoptymalizowane, aby zmaksymalizować strumień tlenu przy jednoczesnym ograniczeniu liczby zdarzeń reoksygenacji. Ponadto często lepiej jest przecenić potrzebę lub dążyć do wyższej granicy zakresu stężeń. Inhibitory, które są niezbędne do ilościowego określania strumieni oddechowych, są bardziej precyzyjne, gdy są stosowane w większych pulach mitochondriów.

Kolejną istotną kwestią jest stężenie leków, które są stosowane podczas protokołów. Zmiany stężenia homogenatu mogą wpływać na stężenia substratów, rozprzęgaczy i inhibitorów wymaganych do uzyskania maksymalnej odpowiedzi. W związku z tym, po wybraniu optymalnego zakresu stężeń, należy przeprowadzić eksperyment testujący dawki wymagane dla protokołu SUIT. Można dodać dodatkowy ADP, aby zapewnić, że stężenia adenylanu nie ograniczają się do strumieni oddechowych. Rozłączniki chemiczne, takie jak FCCP lub CCCP, hamują oddychanie przy wyższych stężeniach22. W związku z tym konieczne jest miareczkowanie w małych ilościach, aby ujawnić maksymalną osiągniętą szybkość. Inhibitory, takie jak rotenon i antymycyna A, najlepiej stosować po nasyceniu w pierwszym wstrzyknięciu. Podczas gdy optymalne stężenia zostały określone we wstępnych eksperymentach, zaobserwowaliśmy również związane z leczeniem różnice w odpowiedzi na inhibitory, a zatem często dodajemy jedno dodatkowe wstrzyknięcie inhibitorów, aby wykazać maksymalne hamowanie, ponieważ wynikowe wskaźniki służą jako podstawa do kwantyfikacji. Chemiczne hamowanie askorbinianu/TPMD jest niezbędne do dokładnej redukcji analitycznej, ponieważ TMPD ulega autooksydacji23. Kontrolowaliśmy autooksydację askorbinianu / TMPD / cytochromu c poprzez dodanie azydku sodu, uznanego inhibitora CIV. W przypadku badań Km dodanie rotenonu w obecności samego bursztynianu zapobiega akumulacji szczawiooctanu, który może hamować aktywność dehydrogenazy bursztynianowej w niskich stężeniach24. Objętość i stężenie ADP są w dużym stopniu zależne od wrażliwości mitochondriów na dominującą kombinację substratów. Preparaty mitochondrialne, które są bardzo wrażliwe na ADP, będą wymagały niższych stężeń początkowych. Dodatkowo, zatwierdzone chemikalia i właściwe przygotowanie leku z dbałością o pH, wrażliwość na światło, jeśli ma to zastosowanie, i temperaturę przechowywania są niezbędne do udanych eksperymentów.

Konfiguracja przyrządów i rutynowa pielęgnacja mają kluczowe znaczenie dla powodzenia tych eksperymentów. Odpowiednie i właściwe czyszczenie komór ma zasadnicze znaczenie dla powtarzalności i zapobiegania zanieczyszczeniom biologicznym, białkowym, inhibitorom lub rozprzęgaczom. Elektrody typu Clark i systemy O2k wykorzystują szklane komory reakcyjne, co stanowi znaczną przewagę kosztową w porównaniu z systemami opartymi na płytkach, które opierają się na materiałach eksploatacyjnych. Szklane komory muszą być jednak energicznie czyszczone i mogą być źródłem zanieczyszczenia inhibitorami w kolejnych badaniach. Inkubacja z próbkami bogatymi w mitochondria podczas procesu mycia (na przykład izolowane mitochondria serca lub wątroby) może zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia eksperymentalnego i jest zalecana jako uzupełnienie procedur rozcieńczania i mycia na bazie alkoholu. Jeśli prowadzone są kolejne badania, czyszczenie etanolem i mitochondriami minimalizuje możliwość zanieczyszczenia inhibitorami. Przed każdym eksperymentem zaleca się kalibrację czujnika tlenu w celu uzyskania dokładnych pomiarów oddychania w stosunku do panującego ciśnienia parcjalnego tlenu. Jeżeli wielokrotne kalibracje nie są możliwe, jedna kalibracja dziennie może być wystarczająca, jeśli stężenie tlenu pozostaje stabilne i stałe po procedurze prania.

Opisane powyżej procedury wykorzystują instrument Oroboros O2k do pomiaru zużycia tlenu w tkance nowotworowej w ciągu 4 godzin od wycięcia guza przy użyciu wcześniej zaprojektowanego i zoptymalizowanego roztworu konserwującego i pożywek oddechowych 25,26,27. Wiele parametrów w tym protokole może być modyfikowanych dla kolejnych aplikacji. Konfiguracja i kalibracja urządzenia, homogenizatory używane do przygotowania tkanek oraz optymalne stężenie tlenu w homogenacji i komorze mogą być dostosowane do stosowania w innych urządzeniach o potencjale monitorowania tlenu. Dla przykładu, komory były lekko przepełnione podczas dodawania homogenatu, a stąd kiedy komora jest całkowicie zamknięta, kapilara komory pozostaje pełna. Spowoduje to zużycie pewnej ilości tlenu w komorze, ale dzięki optymalizacji stężenia próbki możemy uwzględnić to zużycie przy określaniu, od jakiego poziomu tlenu zacząć. Alternatywnie, próbkę można pozostawić do zrównoważenia z tlenem w otoczeniu przed zamknięciem komory, ale często wydłuża to czas do rozpoczęcia eksperymentu i opóźnia dodawanie substratów. Chociaż homogenizatory stosowane w tym protokole są powszechnie dostępne, można zastosować inne komercyjne techniki homogenizacji, takie jak rozdrabniacz tkanek lub automatyczny homogenizator28.

Dodatkowo, procedury przygotowania tkanek i instrumentów mogą być wykorzystywane z wieloma różnymi SUIT do badania kontroli oddechu poprzez różnorodność stanów sprzężenia i kontroli szlaku29. Te protokoły SUIT zostały opracowane w celu pomiaru zdolności funkcjonalnej, a zatem udział potencjalnych substratów endogennych nie ma wpływu na pomiar pojemności. Analitycznie uwzględniamy niemitochondrialne zużycie tlenu i / lub resztkowe zużycie homogenatu poprzez odjęcie antymycyny A-rotenonu lub wskaźników niewrażliwych na azydek sodu, w zależności od potrzeb. Mitochondria mogą pozostać żywotne w BIOPS lub podobnie skonstruowanych roztworach konserwujących przez dłuższy czas (>24 h), w zależności od rodzaju tkanki i jej nienaruszalności30,31. Badania można przeprowadzić z wyprzedzeniem w celu określenia czasowych limitów przechowywania, ponieważ OXPHOS niektórych substratów może mieć różne ograniczenia. Jest to niezbędne, jeśli eksperymentu nie można przeprowadzić w ciągu kilku godzin od wycięcia tkanki/biopsji. 37°C to optymalna i fizjologiczna temperatura do oceny funkcji oddechowych w większości układów ssaków. Jeżeli jednak temperatura testu wydaje się zakłócać ocenę32, można przeprowadzić badania porównawcze w szerokim zakresie temperatur (25–40 °C), aby zapewnić odpowiednią reakcję. Ograniczenia instrumentalne mogą ograniczać możliwość prowadzenia takich badań.

Głównymi ograniczeniami wyżej opisanej metody są: 1) możliwość uszkodzenia mitochondriów przez homogenizację mechaniczną, 2) obecność ATPaz lub innych subkomórkowych substancji biochemicznych w preparatach homogenacyjnych, które mogą zakłócać jednoczesne oznaczanie ATP lub innych zmiennych będących przedmiotem zainteresowania i mogą wymagać dodatkowych metod korekcji lub zastosowania inhibitorów33oraz 3) ocena wielu próbek i/lub wielu SUIT na próbkę jest czasochłonna, ponieważ jeden instrument może pomieścić dwa eksperymenty jednocześnie i wymaga czyszczenia i ustawiania pomiędzy kolejnymi eksperymentami. Eksperymenty optymalizacyjne i konsekwentne przygotowywanie próbek mogą zminimalizować znaczne uszkodzenia mitochondriów, które przyczyniłyby się do niespójnych danych.

Znaczenie tej metody w stosunku do istniejących/alternatywnych metod polega na zwiększeniu wykonalności w porównaniu z ilością materiału wyjściowego, wyzwaniem wyizolowania mitochondriów lub wyzwaniem technicznym w przepuszczalności tkanki. Przygotowanie homogenatów jest szybsze, tlen nie jest tak ograniczony i jest mniej podatny na zmienność między personelem w porównaniu z tkanką przepuszczalną. Co ważne, prawie wszystkie typy próbek nadają się do przygotowania homogenatu, co pozwala na analizę porównawczą między tkankami. Respirometria o wysokiej rozdzielczości jest złotym standardem pomiaru mitochondriów OXPHOS i ET. Zastosowanie tej metody w przedklinicznych i klinicznych badaniach nad rakiem może rozszerzyć obecne badania in vitro na badania ex vivo . Ponadto oferuje potencjalne zastosowania w warunkach klinicznych i diagnostycznych.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konfliktu interesów związanego z tą pracą.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy personelowi Pennington Biomedical Research Center Comparative Biology za opiekę nad zwierzętami. Badania te były częściowo wspierane przez granty Narodowego Instytutu Zdrowia U54GM104940 (JPK) i KL2TR003097 (LGD). Wszystkie eksperymenty i procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt w Pennington Biomedical Research Center.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Hydrat kwasu 2-(N-Morfolino)etanosulfonowegoSigma-AldrichM8250
Sól sodowa adenozyno5′-difosforanuSigma-AldrichA2754
Hydrat soli disodowej adenozyno-5'-trifosforanuSigma-AldrichA2383
Amfoterycyna BGibco15290018
Antymycyna ASigma-AldrichA8674
AskorbinianSigma-AldrichA4544
Albumina surowicy bydlęcej, frakcja V, szok cieplny, bez kwasów tłuszczowychSigma-Aldrich3117057001Roche
BD 50 mL Luer-Lok Strzykawka FisherScientific13-689-8
BD  Vacutainer Ogólnego zastosowania Igły strzykawkoweFisher Scientific23-021-020
Węglan wapniaSigma-AldrichC4830
Cyjanek karbonylu 4-(trifluorometoksy)fenylohydrazonSigma-AldrichC2920
Cytochrom c z serca koniaSigma-AldrichC2506
Oprogramowanie Datlab 7.4Oroboros Instruments
DimetylosulfotlenekAmrescoN182
DithiothreitolSigma-AldrichD0632
D-SacharozaSigma-AldrichS7903
Dumont # 5 KleszczeFine Science Tools11251-30Dumoxel, autoklawowalne
Dumont # 7 KleszczeFine Science Tools11271-30Dumoxel, autoklawowalne
Suwmiarka cyfrowa 150 mm/6 caliWorld Precision Instruments501601
ogniwa EO771CH3 BioSystemsSKU:  94APV1-fiolka-premPatogen testowany
glikol etylenowy-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N′,N′ Kwas -tetraoctowySigma-AldrichE4378
Samica myszy C57BL/6J  Zapas Jackson Laboratory#000664
HEPESSigma-AldrichH4034
ImidazolSigma-Aldrich56750
KimwipesFisher Scientific34120
L-(−)-Kwas jabłkowySigma-AldrichG1626
Kwas laktobionowySigma-AldrichL2398
JabłczanSigma-AldrichM6413
Matrigel MatrixCorning354248
MgCl· 6H2OSigma-AldrichM2670
MikrostrzykawkiHamilton87919, 80383, 80521, 80665, 80765, 80865, 87943
N,N,N′,N′-Tetrametylo-p-fenylenodiaminaSigma-AldrichT7394
Oxygraph-2kOroboros Instruments10023-03
Oxygraph-2k FluoRespirometerOroboros Instrumenty10003-01
PBSGibco10010023
Penicylina-StreptomycynaGibco15140122
Sól disodowa fosfokreatyny hydratSigma-AldrichP7936
Wodorotlenek potasuSigma-AldrichP1767
Fosforan potasu jednozasadowySigma-AldrichP5655
RotenonSigma-AldrichR8875
RPMI 1640Gibco21875034
Azydek soduSigma-AldrichS2002
Pirogronian soduSigma-AldrichP5280
Bursztynian (disód)Sigma-AldrichW327700
TaurynaSigma-AldrichT0625
Bibuła filtracyjna Whatman, klasa 5Sigma-Aldrich1005-090
Młynek do tkanek Wheaton Tenbroeck, 7 mlDuran Wheaton Kimble357424
Mikronożyczki do mikro preparacji z prostą końcówkąRobozRS-5914SC
Skalpel niebezpieczny nr 11Igła do1029065
BD 27 G x 1/2Becton, Dickinson i spółka
Igła do precyzyjnego ślizgu BD 18 G x 1Becton, Dickinson and Company305195
Strzykawka BD 1 mlTacke Beckton, Dickinson and Company309659
Pyrex Wielorazowa szalka Petriego, 60 mmThermo Fisher Scientific316060
Gryzoń Dieta o bardzo wysokiej zawartości tłuszczu,   60% kcal z tłuszczu, 20% kcal z białka i 20% kcal z węglowodanówDieta badawczaD12492
Szkiełko do zegarka Pyrex, 100 mmThermo Fisher ScientificS34819
precyzyjnego ślizgu McKesson 305109

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fundamentals of cancer metabolism. Science Advances. 2 (5), 1600200(2016).">DeBerardinis, R. J., Chandel, N. S. Fundamentals of cancer metabolism. Science Advances. 2 (5), 1600200(2016).
  2. Reactivation of dihydroorotate dehydrogenase-driven pyrimidine biosynthesis restores tumor growth of respiration-deficient cancer cells. Cell Metabolism. 29 (2), 399-416 (2019).">Bajzikova, M., et al. Reactivation of dihydroorotate dehydrogenase-driven pyrimidine biosynthesis restores tumor growth of respiration-deficient cancer cells. Cell Metabolism. 29 (2), 399-416 (2019).
  3. Mitochondrial ubiquinol oxidation is necessary for tumour growth. Nature. 585 (7824), 288-292 (2020).">Martínez-Reyes, I., et al. Mitochondrial ubiquinol oxidation is necessary for tumour growth. Nature. 585 (7824), 288-292 (2020).
  4. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PloS One. 6 (3), 18317(2011).">Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PloS One. 6 (3), 18317(2011).
  5. Bioenergetics of the Cell: Quantitative Aspects. Saks, V. A., et al. , Springer US. 81-100 (1998).">Saks, V. A., et al. Bioenergetics of the Cell: Quantitative Aspects. Saks, V. A., et al. , Springer US. 81-100 (1998).
  6. Metabolic control analysis of cellular respiration in situ in intraoperational samples of human breast cancer. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (5), 539-558 (2012).">Kaambre, T., et al. Metabolic control analysis of cellular respiration in situ in intraoperational samples of human breast cancer. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (5), 539-558 (2012).
  7. Mitochondrial respiration in human colorectal and breast cancer clinical material is regulated differently. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 1372640(2017).">Koit, A., et al. Mitochondrial respiration in human colorectal and breast cancer clinical material is regulated differently. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 1372640(2017).
  8. Changes in mitochondrial respiration in the human placenta over gestation. Placenta. 57, 102-112 (2017).">Holland, O. J., et al. Changes in mitochondrial respiration in the human placenta over gestation. Placenta. 57, 102-112 (2017).
  9. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).">Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
  10. High-resolution respirometry for simultaneous measurement of oxygen and hydrogen peroxide fluxes in permeabilized cells, tissue homogenate and isolated mitochondria. Biomolecules. 5 (3), 1319-1338 (2015).">Makrecka-Kuka, M., Krumschnabel, G., Gnaiger, E. High-resolution respirometry for simultaneous measurement of oxygen and hydrogen peroxide fluxes in permeabilized cells, tissue homogenate and isolated mitochondria. Biomolecules. 5 (3), 1319-1338 (2015).
  11. Preservation of native properties of mitochondria in rat liver homogenate. Mitochondrion. 1 (3), 249-267 (2001).">Kondrashova, M. N., et al. Preservation of native properties of mitochondria in rat liver homogenate. Mitochondrion. 1 (3), 249-267 (2001).
  12. Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates. Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).">Pecinová, A., Drahota, Z., Nůsková, H., Pecina, P., Houštěk, J. Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates. Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).
  13. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292 (1), 125-136 (2007).">Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292 (1), 125-136 (2007).
  14. Assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (141), e58426(2018).">Hlozková, K., Starková, J. Assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (141), e58426(2018).
  15. Cancer Metabolism: Methods and Protocols. Haznadar, M. , Springer. New York. 353-363 (2019).">Zhang, J., Zhang, Q. Cancer Metabolism: Methods and Protocols. Haznadar, M. , Springer. New York. 353-363 (2019).
  16. Doxorubicin-transferrin conjugate alters mitochondrial homeostasis and energy metabolism in human breast cancer cells. Scientific Reports. 11 (1), 4544(2021).">Wigner, P., Zielinski, K., Labieniec-Watala, M., Marczak, A., Szwed, M. Doxorubicin-transferrin conjugate alters mitochondrial homeostasis and energy metabolism in human breast cancer cells. Scientific Reports. 11 (1), 4544(2021).
  17. Oxidative phosphorylation and mitochondrial function differ between human prostate tissue and cultured cells. The FEBS Journal. 283 (11), 2181-2196 (2016).">Schöpf, B., et al. Oxidative phosphorylation and mitochondrial function differ between human prostate tissue and cultured cells. The FEBS Journal. 283 (11), 2181-2196 (2016).
  18. Measuring oxidative phosphorylation in human skin fibroblasts. Analytical Biochemistry. 437 (1), 52-58 (2013).">Ye, F., Hoppel, C. L. Measuring oxidative phosphorylation in human skin fibroblasts. Analytical Biochemistry. 437 (1), 52-58 (2013).
  19. EO771, the first luminal B mammary cancer cell line from C57BL/6 mice. Cancer Cell International. 20, 328(2020).">Le Naour, A., et al. EO771, the first luminal B mammary cancer cell line from C57BL/6 mice. Cancer Cell International. 20, 328(2020).
  20. Mitochondrial physiology. Bioenergetics Communications. 1, 44(2020).">Gnaiger, E., et al. Mitochondrial physiology. Bioenergetics Communications. 1, 44(2020).
  21. Respirometric oxidative phosphorylation assessment in saponin-permeabilized cardiac fibers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2431(2011).">Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Respirometric oxidative phosphorylation assessment in saponin-permeabilized cardiac fibers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2431(2011).
  22. Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling. Free Radical Biology and Medicine. 51 (9), 1621-1635 (2011).">Dranka, B. P., et al. Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling. Free Radical Biology and Medicine. 51 (9), 1621-1635 (2011).
  23. Generation of superoxide radical, hydrogen peroxide and hydroxyl radical during the autoxidation of N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine. Chemico-Biological Interactions. 65 (2), 133-143 (1988).">Munday, R. Generation of superoxide radical, hydrogen peroxide and hydroxyl radical during the autoxidation of N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine. Chemico-Biological Interactions. 65 (2), 133-143 (1988).
  24. Inhibition of succinate-linked respiration and complex II activity by hydrogen peroxide. Archives of Biochemistry and Biophysics. 488 (1), 69-75 (2009).">Moser, M. D., Matsuzaki, S., Humphries, K. M. Inhibition of succinate-linked respiration and complex II activity by hydrogen peroxide. Archives of Biochemistry and Biophysics. 488 (1), 69-75 (2009).
  25. Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers. Biochimica et Biophysica Acta. 892 (2), 191-196 (1987).">Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G., Kapelko, V. I., Saks, V. A. Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers. Biochimica et Biophysica Acta. 892 (2), 191-196 (1987).
  26. Life in the Cold. Heldmaier, G., Klingenspor, M. , Springer. Berlin, Heidelberg. 431-442 (2000).">Gnaiger, E., et al. Mitochondria in the Cold. Life in the Cold. Heldmaier, G., Klingenspor, M. , Springer. Berlin, Heidelberg. 431-442 (2000).
  27. High-resolution fluorespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria. Methods in Molecular Biology. 1782, 31-70 (2018).">Doerrier, C., et al. High-resolution fluorespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria. Methods in Molecular Biology. 1782, 31-70 (2018).
  28. Selective disruption of respiratory supercomplexes as a new strategy to suppress Her2(high) breast cancer. Antioxidants & Redox Signaling. 26 (2), 84-103 (2017).">Rohlenova, K., et al. Selective disruption of respiratory supercomplexes as a new strategy to suppress Her2(high) breast cancer. Antioxidants & Redox Signaling. 26 (2), 84-103 (2017).
  29. Bioenergetics Communications. 5th ed. , (2020).">Gnaiger, E. Mitochondrial pathways and respiratory control. Bioenergetics Communications. 5th ed. , (2020).
  30. Mitochondrial viability in mouse and human postmortem brain. FASEB Journal. 24 (9), 3590-3599 (2010).">Barksdale, K. A., et al. Mitochondrial viability in mouse and human postmortem brain. FASEB Journal. 24 (9), 3590-3599 (2010).
  31. A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions. Scientific Reportys. 10 (1), 13179(2020).">Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions. Scientific Reportys. 10 (1), 13179(2020).
  32. Dramatic changes in mitochondrial substrate use at critically high temperatures: a comparative study using Drosophila. Journal of Experimental Biology. 224, Pt 6 (2021).">Jorgensen, L. B., Overgaard, J., Hunter-Manseau, F., Pichaud, N. Dramatic changes in mitochondrial substrate use at critically high temperatures: a comparative study using Drosophila. Journal of Experimental Biology. 224, Pt 6 (2021).
  33. Simultaneous measurement of mitochondrial respiration and ATP production in tissue homogenates and calculation of effective P/O ratios. Physiological Reports. 4 (20), 13007(2016).">Salin, K., et al. Simultaneous measurement of mitochondrial respiration and ATP production in tissue homogenates and calculation of effective P/O ratios. Physiological Reports. 4 (20), 13007(2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial FunctionTumor HomogenatesOxidative PhosphorylationElectron TransferHigh Resolution RespirometryTissue HomogenizationOxygen ConsumptionNADH Oxidative PhosphorylationSuccinate RespirationComplex IV Activity

Related Articles