Techniki przygotowania tkanek do obrazowania mikrotomografii komputerowej ze wzmocnieniem kontrastowym modeli serca dużych ssaków z chorobami przewlekłymi

Summary

Tutaj prezentujemy protokół uzyskiwania wysokiej rozdzielczości obrazów mikrotomografii komputerowej zdrowych i patologicznych całych serc dużych ssaków z selektywnym wzmocnieniem kontrastu.

Abstract

Przebudowa strukturalna jest częstą konsekwencją przewlekłych stresów patologicznych nałożonych na serce. Zrozumienie właściwości architektonicznych i składowych chorej tkanki ma kluczowe znaczenie dla określenia ich interakcji z zachowaniem arytmicznym. Przebudowa tkanek w mikroskali, poniżej rozdzielczości klinicznej, staje się ważnym źródłem śmiertelnej arytmii, z dużą częstością występowania u młodych dorosłych. Nadal wyzwaniem jest uzyskanie wysokiego kontrastu obrazowania przy wystarczającej rozdzielczości mikroskali dla modeli przedklinicznych, takich jak całe serca dużych ssaków. Co więcej, nadal brakuje selektywnego wzmocnienia kontrastu składu tkankowego dla trójwymiarowego obrazowania w wysokiej rozdzielczości. Obrazowanie nieniszczące z wykorzystaniem mikrotomografii komputerowej daje nadzieję na obrazowanie w wysokiej rozdzielczości. Celem było złagodzenie dolegliwości związanych z nadmiernym tłumieniem promieniowania rentgenowskiego w dużych próbkach biologicznych. Serca pobrano od zdrowych świń (N = 2) i owiec (N = 2) z indukowanym przewlekłym zawałem mięśnia sercowego i powstawaniem blizn zwłóknieniowych lub indukowanym przewlekłym migotaniem przedsionków. Wycięte serca perfuzjono: roztworem soli fizjologicznej uzupełnionym środkiem gaszącym jony wapnia i środkiem rozszerzającym naczynia krwionośne, etanolem w seryjnym odwadnianiu i heksametylodicylodizyzanem w próżni. Ten ostatni wzmocnił strukturę serca podczas suszenia na powietrzu przez 1 tydzień. Tkanka z dominacją kolagenu była selektywnie wiązana przez rentgenowski środek wzmacniający kontrast, kwas fosfomolibdynowy. Konformacja tkanek była stabilna w powietrzu, co pozwoliło na długotrwałe akwizycje mikrotomografii komputerowej w celu uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości (izotropowej 20,7 μm). Optymalne ładowanie środkiem kontrastowym przez dyfuzję wykazało selektywne wzmocnienie kontrastowe warstwy nabłonkowej i podwsierdziowych włókien Purkinjego w zdrowych komorach świni. Serca z migotaniem przedsionków (AF) wykazywały zwiększoną akumulację kontrastu w tylnych ścianach i przydatkach przedsionków, co przypisuje się większej zawartości kolagenu. Serca po zawale mięśnia sercowego wykazywały selektywnie zwiększony kontrast w obszarach zwłóknienia serca, co umożliwiło identyfikację przeplatających się włókien mięśnia sercowego, które przeżyły. Preparaty tkanek suszonych powietrzem ze wzmocnieniem kontrastowym umożliwiły obrazowanie w mikroskali nienaruszonego serca dużych ssaków i selektywne wzmocnienie kontrastowe składników choroby.

Introduction

Strukturalne choroby serca odpowiadają za większość zgonów związanych z sercem na całym świecie¹. Przemodelowanie struktury serca wpływa na środowisko mięśnia sercowego i przestrzeń śródmiąższową. Ponieważ zarówno funkcja elektryczna, jak i mechaniczna serca zależy od organizacji miocytów, zakłócenia mogą prowadzić do nietolerowanej arytmii serca, upośledzenia pompowania krwi i niewydolności serca^{2,3,4,5,6,7,8,9}. Rozwój terapii leczniczych strukturalnych chorób serca jest znacznie większy niż rozpowszechnienie choroby^2,5. W związku z tym pojawia się coraz więcej przedklinicznych modeli strukturalnych chorób serca, aby lepiej zrozumieć profile anatomiczno-morfologiczne i wynikającą z nich patogenezę zaburzeń rytmu serca^{10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23}. W całym spektrum chorób strukturalnych obserwuje się regulację w górę zwłóknienia śródmiąższowego i, częściej w przypadkach związanych z niedokrwieniem, zastąpienie mięśnia sercowego przez zwłóknienie i tkankę tłuszczową¹⁸. Zrozumienie morfologiczne patologicznych komponentów zewnątrzkomórkowych może umożliwić identyfikację potencjalnych substratów arytmii. Rozmieszczenie i rozległość choroby dostarczają silnych wskaźników ryzyka arytmogennego. Nadal jednak wyzwaniem jest kompleksowe zobrazowanie profili chorób poprzez integrację makro- i mikroskali w nienaruszonym sercu.

Mikrotomografia komputerowa (mikroCT), oparta na promieniach rentgenowskich, staje się potężnym narzędziem do badania mikrostruktury miękkich tkanek biologicznych za pomocą środków kontrastowych. Uzyskano bardzo szczegółowe mapy anatomiczne dla serc małych gryzoni^24,25,26 oraz małych wypreparowanych próbek z serc dużych ssaków^27,28. Jednak obrazowanie na poziomie całych narządów sercowych dużych ssaków wykazuje nadmierne długości ścieżek, na których fotony promieniowania rentgenowskiego są tłumione przy użyciu konwencjonalnych technik przygotowania tkanek. Polega to na obciążeniu tkanki kontrastem i zanurzeniu próbki w rozpuszczalniku środka kontrastowego podczas pobierania. Zwiększenie wielkości próby i rozdzielczości powoduje wydłużenie całkowitego czasu akwizycji. Dlatego stabilność tkanek staje się kluczowa dla użytecznej rekonstrukcji obrazu, co oznacza, że należy zapobiegać deformacji tkanek wynikającej z wysuszenia. Stosowanie płynu immersyjnego ma jednak wady: (i) ogólna intensywność sygnału tła staje się niebagatelna i (ii) sprzyja rozcieńczeniu cząsteczek kontrastu związanych z tkankami. Oba te czynniki przyczyniają się do obniżenia kontrastu obrazu.

To badanie szczegółowo opisuje nowy proces przetwarzania tkanek w celu zmniejszenia tłumienia fotonów tła i optymalizacji zakresu dynamicznego zapewnianego przez środki wzmacniające kontrast. Sugeruje się stosowanie podejścia polegającego na suszeniu tkanek powietrzem z chemicznym wzmocnieniem tkanek w celu ograniczenia deformacji tkanek²⁹. W związku z tym próbki tkanek mogą pozostawać stabilne w powietrzu przez długi czas i pomijać wpływ tła z płynów zanurzeniowych. Ta metodologia zapewnia: (i) kompleksowy protokół przetwarzania i obrazowania tkanek zoptymalizowany przy użyciu całych serc świń; (ii) ocenę stężenia kontrastu i technik ładowania oraz (iii) zastosowanie tego procesu w dwóch odrębnych modelach chorób przewlekłych: migotaniu przedsionków i zawału mięśnia sercowego w sercach owiec. Rozwój modeli chorób przewlekłych został opisany w innym miejscu dla każdego modelu przewlekłej choroby serca, zawału mięśnia sercowego wywołanego przezskórną embolizacją tętnic wieńcowych¹³ i samopodtrzymującego się migotania przedsionków³⁰.

Protocol

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi z Dyrektywy Parlamentu Europejskiego 2010/63/UE w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych. Protokoły na zwierzętach zostały zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną (CEEA50) na Uniwersytecie w Bordeaux. Serca pochodziły od trzech dużych modeli ssaków, w tym (i) zdrowych dużych białych świń (N = 2, 2 miesiące); (ii) Owce (N = 1, 2 lata) z indukowanym zawałem mięśnia sercowego¹³ oraz (iii) Owce (N = 1,7 lat) z indukowanym migotaniem przedsionków³⁰.

1. Przygotowanie roztworu:

1. Roztwór kardioplegyczny: Przygotować 3 l wody destylowanej i dodać chlorek sodu (110 mM), chlorek potasu (16 mM), wodorowęglan sodu (10 mM), D-(+)-glukozę (9 mM), roztwór chlorku wapnia (1,2 mM) i roztwór chlorku magnezu (16 mM). Na koniec dodaj 500 μl/l heparyny sodu. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Sól fizjologiczna buforowana fosforanami - roztwór EDTA (PBS-EDTA).
   1. Najpierw dodać kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) do 1 l wody destylowanej do końcowego stężenia 10 mM. Zwiększyć i utrzymać pH roztworu na poziomie 12 za pomocą roztworu wodorotlenku sodu (1 M) w celu rozpuszczenia EDTA.
   2. Gdy EDTA całkowicie się rozpuści, obniż pH do 7,4 za pomocą kwasu solnego. Dodać jedną torebkę foliową z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami, aby otrzymać roztwór o stężeniu 0,01 M (chlorek sodu 0,138 M; chlorek potasu 0,0027 M) i pH 7,4. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).
3. Etanol - roztwór środka kontrastowego kwasu fosfomolibdynowego (PMA): Przygotować 1 l absolutnego etanolu i dodać PMA do uzyskania roztworu o stężeniu 1%. Zaoszczędź to rozwiązanie w RT.

2. Źródło tkanki

1. Poddaj zwierzę eutanazji i wydobądź mu serce zgodnie z lokalnymi wytycznymi etycznymi. Szybko zanurz serce w zimnym roztworze kardioplegicznym i delikatnie masuj komory w celu wstępnego spłukania.
2. Upewnij się, że przeciąłeś aortę poniżej łuku aorty i zacisnąłeś dwie strony ściany tętnicy za pomocą uchwytów na igły.
3. Zawieszając serce za uchwyty igieł, włóż kaniulę aortalną do korzenia aorty, uważając, aby nie stykać się z zastawkami aortalnymi ani przez nie nie wystawać. Owiń szew o rozmiarze 0 wokół łuku aorty na poziomie kaniuli i mocno zawiąż kaniulę na miejscu.
4. Za pomocą strzykawek o pojemności 50 ml wstrzyknąć 200 ml zimnego (4 °C) roztworu kardioplegicznego. Usuń nadmiar krwi gromadzącej się w jamach, przechylając serce na tylną stronę, aby drenować przez żyły płucne.
5. Zanurz opłukane serce i trzymaj w zimnym roztworze kardioplegicznym przechowywanym na lodzie, aż będzie gotowy do sekcji.

3. Przygotowanie tkanek:

1. Przygotuj zbiornik o pojemności 1 litra umieszczony 80 cm nad naczyniem preparacyjnym. Podłącz rurkę termoplastyczną o długości 80 cm i średnicy wewnętrznej 3.2 mm oraz średnicy zewnętrznej 4.8 mm do króćca spustowego zbiornika.
2. Przymocuj kran trójdrożny do rurki odpływowej i podłącz kolejne rurki termoplastyczne (20 cm, średnica wewnętrzna 1.6 mm i średnica zewnętrzna 3.2 mm) do każdego wolnego portu na kranie trójdrożnym. Przymocuj krany dwukierunkowe do płatnych końców rurki.
3. Napełnij zbiornik roztworem kardioplegicznym uzupełnionym heparyną (2500 jednostek). Otwórz krany, aby umożliwić odpływ roztworu kardioplegicznego i usuń wszystkie pęcherzyki powietrza, a następnie zamknij krany dwukierunkowe.
4. Przygotuj kaniule na lewą i prawą ujścia wieńca za pomocą rurki z politetrafluoroetylenu (PTFE) (średnica wewnętrzna 1 mm i średnica zewnętrzna 2 mm).
   1. Odetnij 5 cm rurki i podgrzej jeden koniec, umieszczając końcówkę obok otwartego ognia. Gdy 1 mm końcówki zacznie się topić i stanie się półprzezroczysta, dociśnij końcówkę do twardej, odpornej na ciepło powierzchni, aby uformować grzbiet na końcówce kaniuli, aby zapobiec wyślizgiwaniu się kaniul z naczyń.
   2. Włóż 1 cm nieogrzewanego końca każdej kaniuli do dwóch końców rurki drenażowej zbiornika odpływowego.
5. Usuń kaniulę aortalną. W zimnym roztworze kardioplegicznym zlokalizuj lewą i prawą ujściówkę tętnic wieńcowych.
6. Za pomocą spiczastych nożyczek ostrożnie oddziel korzeń aorty od otaczającej tkanki powyżej i poniżej ujścia wieńcowego, aby umożliwić nawlekanie jedwabnego szwu 0 G pod naczyniem wieńcowym.
7. Otwórz krany dwukierunkowe i włóż końcówki kaniul do ujścia wieńcowego. Gdy końcówki kaniul wystają 1-2 cm w głąb ujścia i poza założenie szwu, zwiąż kaniule.
8. Opłucz serce, delikatnie masując komory przez 15 minut, aż serce zostanie oczyszczone z krwi.
9. Po spłukaniu zamknij kurki dwukierunkowe i odłącz je od kranu trójdrożnego. Przenieś serce do 1 litra plastikowego, odpornego na chemikalia pojemnika zawierającego 500 ml roztworu PBS-EDTA.
10. Recyrkulacja roztworu PBS-EDTA w rurkach termoplastycznych pod wyciągiem za pomocą pompy perystaltycznej z dwoma kanałami. Zalać rurkę pompy, aż w rurce nie będzie pęcherzyków powietrza, a następnie perfundować każdą kaniulę tętnicy wieńcowej przez recyrkulację w temperaturze pokojowej przez 2 godziny przy 80 ml / min.
11. Upewnij się, że wyciąg jest sprawny. Zatrzymać pompę, spuścić roztwór z pojemnika i zastąpić go formaliną (10%) do utrwalenia przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej 80 ml/min.
12. Zastąp roztwór formaliny PBS, aby przepłukać utrwalacz trzy razy przez 15 minut każdy z prędkością 80 ml/min.

4. Odwodnienie i wysuszenie tkanek:

UWAGA: Użyj tej samej szybkości perfuzji (80 ml/min) i pozwól, aby tkanka pozostała w RT przez cały czas.

1. Zastąp roztwór PBS etanolem w stężeniu 20%, rozcieńczonym w ultraczystej wodzie i perfuzuj przez co najmniej 3 godziny.
2. Perfuzja serca za pomocą serii zwiększających się stężeń etanolu.
   1. Zacznij od zastąpienia 20% roztworu etanolu etanolem rozcieńczonym do 30% i perfuzuj przez 2 godziny.
   2. Powtórz perfuzję, zwiększając stężenie etanolu w każdej iteracji o 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 95%, 90%, 99% i 100% przez minimalny czas 1 godziny na każdym etapie (stężenie).
      UWAGA: Próbki serca mogą spoczywać bez przepływu perfuzji przez noc przy dowolnym rozcieńczeniu etanolu, jeśli dla tego stężenia miała miejsce minimalna perfuzja wynosząca 15 minut.
3. OPCJONALNIE: W przypadku stosowania środków kontrastowych metodą perfuzji należy perfekować serce 100% etanolem uzupełnionym środkiem kontrastowym PMA, 1% przez 48 godzin. Płukać środek kontrastowy przez perfuzję 100% etanolem przez 2 godziny.
4. Aby wzmocnić tkankę serca przed suszeniem powietrzem, należy recyrkulować mieszaninę etanolu i heksametylodylazanu (HMDS) w proporcji 50:50 przez 10 minut. Następnie przez 100% HMDS przez kolejne 2 godziny
   UWAGA: HMDS jest substancją wysoce toksyczną i szkodliwą. W kontakcie z powietrzem uwalnia się silny zapach amoniaku. Co więcej, płynna forma HMDS jest wysoce lotna i katalizowana przez czynniki zawierające jod.
5. Odłącz kaniule od rurki i zawieś serce na szwie aortalnym wewnątrz dygestoria.
6. Ostrożnie nasuń worek z zamkiem błyskawicznym na serce i zamknij uszczelkę worka na szwie, aby zmniejszyć narażenie serca na krążące powietrze. Pozostaw serce do wyschnięcia przez odparowanie przez 1 tydzień.
7. OPCJONALNIE: W przypadku środków kontrastowych nasycających dyfuzję myj serce w 100% etanolu przez 15 minut podczas mieszania. Zanurz serce w 100% etanolu uzupełnionym PMA, 1%, na 48 godzin w próżni. Powtórz krok 4.6.

5. Mikrotomografia komputerowa:

UWAGA: Do obrazowania serc świń użyto stacjonarnego systemu rentgenowskiego do mikrotomografii

komputerowej.

1. Zamontuj wysuszone na powietrzu serce na odpowiednim uchwycie na próbkę. Zapobiegaj wszelkim ruchom podczas pomiarów rentgenowskich mikrotomografii komputerowej za pomocą zacisku zakotwiczonego w uchwycie próbki i zabezpiecz serce za pomocą wysuszonej i sztywnej aorty.
2. Skrupulatnie wyrównaj środek próbki serca wzdłuż jej osi podłużnej ze środkiem pola widzenia obrazowania dla kątów obrotu 0° i 90°. Aby to osiągnąć we wszystkich orientacjach, zawieś serce w powietrzu za pomocą zacisku aortalnego przymocowanego do wspornika próbki.
3. Po uruchomieniu oprogramowania i uruchomieniu systemu rentgenowskiego microCT należy zastosować filtr rentgenowski aluminiowy, 1 mm, źródło promieniowania rentgenowskiego o napięciu do 60 kV i prądzie na 120 μA. Ustaw wymiary obrazu na 2016 x 1344 pikseli, a rozmiar piksela na 20 μm.
4. Wycofaj uchwyt próbki poza pole widzenia i skalibruj obraz tła oraz czas ekspozycji na promieniowanie rentgenowskie, uzyskując korekcję płaskiego pola. Upewnij się, że średnia transmisja promieniowania rentgenowskiego w tle jest większa niż 80%.
5. Zbadaj obrazy transmisji promieniowania rentgenowskiego wzdłuż długości podpory, aby określić ogólne pole obrazowania w osi podłużnej serca. Do skanowania należy użyć kroku obrotu 0,18°, uśrednienia klatek 5° i obrotu próbki 180°. Wybierz tryb skanowania offsetowego, aby zobrazować pełną szerokość podpory próbki.
   UWAGA: Parametry akwizycji wskazane w tym rozdziale zostały dobrane w celu optymalizacji jakości obrazu kompozycji zespołowej serca.
6. Po zeskanowaniu należy skorzystać z oprogramowania do tomograficznej rekonstrukcji izotropowej objętości obrazu trójwymiarowego. Do zastosowania oprogramowania NRecon należy użyć korekcji artefaktów związanych z akwizycją, w tym efektów utwardzania wiązki o 10% i redukcji artefaktów pierścieniowych o 8.
7. Aby zoptymalizować ograniczenia przechowywania danych, zastosuj minimalny prostokątny obszar zainteresowania, który obejmuje woksele obrazu specyficzne dla serca. Eksportuj obrazy w 8-bitowym formacie bitmapowym jako stos obrazów.
8. Wizualizacja zrekonstruowanego stosu danych za pomocą oprogramowania DataViewer. Cyfrowo zorientuj próbkę w granicach obrazu, aby wyrównać długą i krótką oś próbki z trzema głównymi osiami objętości obrazu.
9. Przytnij objętość obrazu we wszystkich trzech osiach, aby usunąć zewnętrzne warstwy tła obrazu, aby maksymalnie zmniejszyć całkowity rozmiar obrazu.

Results

Przygotowanie serc dużych ssaków za pomocą metody odwadniania i suszenia powietrzem usuwa całą zawartość wody z próbki. Dowody na niewystarczające zastąpienie wody etanolem można zaobserwować podczas ładowania HMDS (patrz Protokół, krok 4.4). Obecność wody pod HMDS spowoduje powstanie pęcherzyków unoszących się z tkanki. W przypadku nadmiernego poziomu wody może dojść do wzrostu temperatury płynu immersyjnego. Utrzymywanie komory zanurzeniowej w otoczeniu lodu podczas początkowego ładowania HMDS może zmniejszyć złe skutki ogrzewania tkanek. Po wysuszeniu serca na powietrzu przy braku środków kontrastowych, próbka będzie miała biały kolor (patrz Protokół, krok 4.6). Zewnętrzna powierzchnia była często wysuszona i strukturalnie stabilna przed warstwami wewnętrznymi. Płukanie w etanolu przed nałożeniem środka kontrastowego usunęło biały osad (patrz Protokół, krok 4.7). Przecięcie tkanki za pomocą ostrego ostrza odsłania makroskopowo poszczególne włókna mięśniowe z wyraźną separacją. Obciążenie kontrastowe poprzez zanurzenie próbek serca w podłożu ze środkiem kontrastowym cierpiało na artefakty graniczne dyfuzji w grubych i wysoce umięśnionych obszarach próbki. Dyfuzyjne obciążenie kontrastowe w próżni zapewniło bardziej jednorodne zabarwienie mięśni (próbka serca #1, patrz Tabela 1 dla czasów ładowania środka kontrastowego). Makroskopowo powierzchniowy rozkład środka kontrastowego wykazał niejednorodne zabarwienie między mięśniem sercowym a regionami złożonymi głównie ze składników zewnątrzkomórkowych, zwłaszcza tłuszczu i tkanki łącznej. Wysuszone na powietrzu próbki tkanek, zarówno przed, jak i po nałożeniu środka kontrastowego, zachowywały stabilną integralność strukturalną.

Czas potrzebny do zeskanowania pełnej szerokości próbki w rozdzielczości 20 μm pod mikroCT przy użyciu wyżej wymienionych parametrów skanowania i czas naświetlania 1700 ms wynosił 6 h 34 min. W zależności od wielkości próbki w osi portalowej skanera, czas ten został pomnożony przez liczbę pozycji potrzebnych do uchwycenia pełnej długości próbki. W przypadku serc świń i owiec w tym badaniu zastosowano od trzech do czterech pozycji. Oprogramowanie NRecon ułożyło skany wielopozycyjne i offsetowe w taki sposób, aby utworzyć pojedynczy obraz projekcji rentgenowskiej dla każdego kroku obrotu źródła promieniowania rentgenowskiego i detektora. W sumie 1000 projekcji jest przechowywanych jako obrazy 16-bitowe, generując 30-40 GB danych. Zrekonstruowane obrazy wolumetryczne miały 52-70 GB.

Główne anatomiczne punkty orientacyjne, w tym jamy komorowe, przegroda i wolne ściany komór, były łatwo rozpoznawalne na podstawie obrazowania rentgenowskiego suszonych na powietrzu serc świń barwionych środkiem kontrastowym przez obciążenie dyfuzją (Rysunek 1A). Co więcej, zaobserwowano również wysoce teksturowane obszary wskazujące na organizację mikrostrukturalną, takie jak orientacja włókien mięśnia sercowego, ze względu na czułe tłumienie/transmisję promieniowania rentgenowskiego (Rysunek 1B). Tomograficzne rekonstrukcje trójwymiarowych objętości obrazu wykazały wyraźną separację między tkanką a tłem zarówno na granicy nasierdzia, jak i śródbłonka (Rysunek 1D). Śródściennie zaobserwowano niski kontrast i gradient dyfuzji intensywności wokseli w grubych przezściennych obszarach tkanki. Mimo to włókna naczyniowe i mięśnia sercowego oddzielone płaszczyznami rozszczepienia były nadal łatwe do zidentyfikowania. Drugie pasmo kontrastu o większej intensywności zaobserwowano w najbardziej nasierdziowej warstwie i w punktowych obszarach podwsierdziowych. Wzmocnienie kontrastu było największe w miejscach, w których gromadziły się składniki zewnątrzkomórkowe, w szczególności tkanka łączna nasierdzia, tłuszcz nasierdziowy i osłonka tkanki łącznej sieci włókien Purkinjego. Rozkłady intensywności sygnału woksela wykazały wysoką separację od tła o zerowej intensywności (powietrze) i dwóch dominujących populacji tkanki o niskim i wysokim kontraście (Rysunek 1D).

Aby zweryfikować poprawę kontrastu rekonstrukcji obrazu mikrotomografii komputerowej i selektywność do komór kolagenowych próbek serca, zastosowano histologię, mikroskopię jasnego pola i mikroskopię fluorescencyjną (Rysunek 2). Do zatapiania i cięcia parafiny przygotowano przezścienny wycinek tkanki komorowej z wysuszonego powietrzem serca bez uprzedniego obciążenia środkiem kontrastowym. Sąsiednie wycinki tkanek zamontowane na szkiełkach mikroskopowych poddano działaniu barwienia trichromowego Massona, bez leczenia lub 48 godzin PMA (1%). Zanurzenie skrawków tkanek montowanych na szkiełku wyeliminowało efekty gradientu dyfuzji procesu barwienia, które zaobserwowano w próbkach całego serca. Barwienie trichromem Masona wykazało zabarwienie kolagenowo-dodatnie w warstwach nabłonka i śródbłonka, okołonaczyniowo w tkance podnasierdziowej oraz osłonkę tkanki łącznej otaczającą swobodnie biegnące włókno Purkinjego wystające do jamy lewej komory (Ryc. 2A). Jasne oświetlenie pola wykazało ciemniejsze zabarwienie w strukturach kolagenowych po barwieniu PMA, co potwierdza preferencyjną akumulację PMA (Ryc. 2B, C). Co więcej, wykazano wcześniej, że leczenie PMA wygasza autofluorescencję makromolekularnych kompleksów kolagenowych³¹. Fluorescencyjne obrazy skrawków tkanki komorowej wykazywały wywołaną PMA utratę fluorescencji w miejscach kolagenu (Rysunek 2D vs. 2E, Figura 2D' vs. 2E' i Figura 2D'' vs. 2E''). Zarówno w jasnym polu, jak i w obrazowaniu fluorescencyjnym, przedziały komórkowe nie uległy zmianie w wyniku leczenia PMA, a kolagen miał selektywną akumulację barwienia PMA i wygaszanie autofluorescencji.

Próbka serca #2 została zabarwiona środkiem kontrastowym poprzez perfuzję przed suszeniem na powietrzu. Rekonstrukcja obrazu ujawniła bardzo niejednolite zabarwienie w obrębie przedziału mięśnia sercowego (Ryc. 3A). Wzmocnienie kontrastu okazało się nieselektywne w stosunku do składu tkanki, bez dalszego zwiększania intensywności sygnału w obszarach nasierdziowych lub podwsierdziowych. Co więcej, tkanka o niskim kontraście wykazywała słabą separację od intensywności tła (Ryc. 3B).

Zwłóknienie komór zostało wywołane przez zawał mięśnia sercowego i przewlekłe niedokrwienie (Próbka serca #3). Blizna przednio-wierzchołkowa powstała w wyniku zastąpienia miocytów włóknisto-tłuszczowymi złogami w tkance poniżej miejsca embolizacji naczyniowej. Próbka serca #3 została przygotowana i zobrazowana z wypreparowanego klina komorowego pokrywającego przednią lewą komorę, przegrodę i wolną ścianę prawej komory. Przygotowanie tej konfiguracji klinów komorowych zostało opisane wcześniej³², a zastosowanie klinów do obrazowania serca zostało szczegółowo przeanalizowane³³. Morfologia blizny była przezścienna, ale niejednorodna (Ryc. 4). Centralna, gęsta zmiana zwłóknieniowa była otoczona luźną i niejednorodną strefą graniczną (Ryc. 4A). Preparat komorowy barwiono przez dyfuzję po wysuszeniu powietrznym i w próżni. Rysunek 4B-E pokazuje największe intensywności sygnału zrekonstruowanych objętości obrazów mikrotomografii komputerowej na granicach tkanek i obszarach blizn. Środki kontrastowe słabo zabarwiły zdrowy mięsień sercowy, ale kontrast mikrostrukturalny został zachowany (Rysunek 4C'). W strefie granicznej tkanka bliznowata była przeplatana ocalałym mięśniem sercowym (Ryc. 4D'). Gęste zwłóknienie wyglądało na przezścienne, ale teksturowane, co wskazuje na różnice w składzie (Ryc. 4E'). Skrawki tkanki przezściennego obszaru lewej komory wysuszonego na powietrzu i wybarwionego PMA preparatu tkankowego wykorzystano do walidacji selektywności PMA dla kolagenu w tkance patologicznej poprzez porównanie z barwieniem trichromowym Massona (Figura 4F). Barwienie PMA było selektywne dla kolagenu (podnasierdziowe i podwsierdziowe) i nieobecne w regionach mięśnia sercowego, które przeżyły (Ryc. 4G).

Próbka serca #4 z indukowanym uporczywym migotaniem przedsionków została wysuszona powietrzem z zachowaniem naturalnego kształtu jamy przedsionkowej. Nie zaobserwowano zapadania się uszka przedsionkowego. Główne anatomiczne punkty orientacyjne można było zidentyfikować morfologicznie na podstawie zrekonstruowanych obrazów (przegroda przedsionkowa, mięśnie pektynowate, zatoka wieńcowa, ujście żyły płucnej, żyła główna i cristae terminalis). Barwienie dyfuzyjne w próżni spowodowało wzmocnienie kontrastu w korzeniu aorty i zastawkach przedsionkowo-komorowych oraz dyskretnych obszarach pracującego mięśnia sercowego. Wzmocnienie barwienia mięśni było ograniczone do przydatków przedsionków i tylnych ścian zarówno lewego, jak i prawego przedsionka (Ryc. 5).

Rysunek 1: Obrazowanie mikrotomografią serca świni suszonego na powietrzu potraktowanego środkiem kontrastowym PMA przez dyfuzję w próżni. (A) Obraz projekcji rentgenowskiej. (B) Profil transmisyjny wyodrębniony z czerwonej linii w A. (C) Wycinek komór o krótkiej osi z tomograficznie zrekonstruowanej objętości trójwymiarowej. Żółte strzałki wskazują punktowe obszary kontrastu przypisywane sub-wsierdziowym włóknom Purkinjego. Niebieskie strzałki wskazują unaczynienie. (D) Rozkład intensywności sygnału zrekonstruowanego wycinka obrazu pokazanego w C. LV: lewa komora i RV: prawa komora. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Walidacja selektywności PMA dla kolagenu. (A) Barwienie trichromem przez Massona przezściennego odcinka tkanki z komór wysuszonego powietrzem serca. Mięsień sercowy jest zabarwiony na czerwono, a kolagen jest pokazany na zielono. Sąsiednie odcinki tkanek (B) bez barwienia lub (C) wybarwione PMA (1%) obrazowano przy jasnym oświetleniu pola w celu oceny jednorodności zabarwienia. (D) Skrawki tkanek bez barwienia lub (E) wybarwione PMA obrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Panele D' (solidna czerwona ramka) i E' (przerywana czerwona ramka) to powiększone widoki podnasierdzia dla sekcji niebarwionych i barwionych PMA. Panele D'' (jednolita niebieska ramka) i E'' (przerywana niebieska ramka) to odpowiadające im powiększone widoki podwsierdzia i swobodnie biegnącego włókna Purkinjego. Strzałki wskazują miejsca zawartości kolagenu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Ładowanie perfuzyjne PMA przed suszeniem powietrzem i obrazowaniem MicroCT. (A) Krótki wycinek zrekonstruowanego obrazu objętości komór z serca świni. Niebieskie strzałki wskazują unaczynienie. (B) Rozkład intensywności sygnału wycinka obrazu z panelu A. LV: lewa komora i RV: prawa komora. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Obrazowanie mikrotomografią serca owcy cierpiącej na przewlekły zawał mięśnia sercowego. (A) W okolicy wierzchołkowej powstała gęsta blizna (patrz zdjęcie we wstawce). Renderowanie objętościowe obszaru wierzchołkowego z perspektywy wsierdzia zostało zabarwione na podstawie intensywności obrazu (kolor czerwony odpowiadający tkance bliznowatej i mięśniowi sercowemu na zielono). Ortogonalne warstwy intensywności skali szarości pokazują gęsty rozkład blizn i graniczące z ocalałym mięśniem sercowym. Oddzielenie tkanki zwłóknieniowej od mięśnia sercowego odpowiada obszarom tkanki tłuszczowej. (B) Fotografia wysuszonego na powietrzu preparatu klina komorowego od owcy z bliznami wierzchołkowymi po zawale mięśnia sercowego. Ukośne wycinki objętości zrekonstruowanego obrazu mikrotomografii komputerowej przechodzą przez komory na środkowym poziomie między podstawą a wierzchołkiem i proksymalnie do miejsca (C) niedrożności naczyń (C - czerwona linia w panelu B), (D) obszaru okołozawałowego graniczącego z gęstą blizną i zdrowym mięśniem sercowym (D - niebieska linia w panelu B) i (E) obszaru gęstego zwłóknienia (E - zielona linia w panelu B). (C') Rozszerzony widok obszaru przegrody zaznaczony czerwoną przerywaną ramką w C. (D') Rozszerzony widok obszaru zawału w wierzchołku prawej komory (niebieska przerywana ramka w panelu D). (E') Rozszerzony widok obszaru zawału w wierzchołku lewej komory (zielona przerywana ramka w panelu E). LV: Jama lewej komory; RV: jama prawej komory; MB: zespół moderatorów; Pap: mięsień brodawkowaty. Żółta strzałka wskazuje lewą przednią tętnicę zstępującą. (F) Barwienie trichromowe przez Massona przekroju histologicznego wyciętego z wysuszonej powietrzem lewej komory barwionej PMA. Kolagen jest zabarwiony na niebiesko, a mięsień sercowy jest zabarwiony na różowo/fioletowo. (G) Odpowiedni wycinek tkanki rozkładu barwienia PMA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Obraz serca owcy wykonany za pomocą mikrotomografii komputerowej po przewlekłym indukowanym migotaniu przedsionków. (A) Odwzorowanie objętości przedsionków z przypisanym zabarwieniem jak w Rysunek 4A. (B) Dwuprzedsionkowy wycinek obrazu mikrotomografii komputerowej w długiej osi serca. Plastry o krótkiej osi pobrano na poziomie (C) zastawek przedsionkowo-komorowych (C - czerwona linia w panelu B), (D) korzenia aorty (D - niebieska linia w panelu B) i (E) lewego dachu przedsionka (E - zielona linia w panelu B). LA: lewe przedsionki; RA: prawy przedsionek; LAA: uszek lewego przedsionka; RAA: uszek prawego przedsionka; LV: lewa komora; RV: prawa komora; LVOT: droga odpływu lewej komory; RVOT: droga odpływu prawej komory i PA: tętnica płucna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.

Próbka #	1	cyfra arabska	3	4
gatunek	świnia	świnia	owca	owca
Masa ciała (kg)	32,4	Dnia 31,2	47,2	53,4
Masa serca (g)	191,2	186,2	202,4	207,6
Patologia	-	-	Przewlekłe zawałie mięśnia sercowego	Przewlekłe migotanie przedsionków
Przygotowanie próbki	Całe serce	Całe serce	Klin przedniego serca	Całe serce
Sposób ładowania kontrastowego	dyfuzja	Perfuzji	dyfuzja	dyfuzja
Ekspozycja na środek kontrastowy (h)	Rozdział 48	24	Rozdział 48	Rozdział 48

Tabela 1: Próbki serca i leczenie środkiem kontrastowym.

Discussion

Opracowano szczegółowy protokół dla preparatów dużych tkanek, w którym wykorzystuje się całe serca dużych ssaków do późniejszego obrazowania strukturalnego w wysokiej rozdzielczości. Podejście polegające na suszeniu powietrzem usunęło wpływ tłumienia promieniowania rentgenowskiego tła i maksymalnie optymalizowało tkankę: kontrast tła²⁹. Dzięki temu podejściu uzyskano rozdzielczość izotropową w zakresie 20 μm do obrazowania wolumetrycznego w próbkach o średnicy do 7,2 cm. Mikrotomografia komputerowa tkanek miękkich zazwyczaj opiera się jednak na zastosowaniu niespecyficznych środków kontrastowych w celu poprawy absorpcji promieniowania rentgenowskiego i czułości systemów mikrotomografii komputerowej³⁴. Chociaż rentgenowskie środki kontrastowe poprawiają ogólne tłumienie promieniowania rentgenowskiego i poprawiają obrazowanie tkanek miękkich, oddzielenie składników tkanek na podstawie składu biochemicznego pozostaje wyzwaniem. Zaobserwowano jednak, że przy użyciu suszonych na powietrzu serc w połączeniu z popularnym rentgenowskim środkiem kontrastowym w warunkach laboratoryjnych, PMA, selektywnie barwiono składniki zewnątrzkomórkowe. Wzmocniono tkankę łączną związaną ze zdrowym mięśniem sercowym i patologiczną przebudową strukturalną w chorobach przewlekłych.

Proces suszenia tkanki biologicznej na powietrzu wymaga interwencji, aby zapobiec deformacji próbki. Przygotowanie próbek do mikroskopii elektronowej wiąże się z podobnymi wymaganiami. Zazwyczaj stosuje się metodę suszenia w punkcie krytycznym, która wykorzystuje równowagę medium zanurzeniowego w tkance, temperatury i ciśnienia w celu wyeliminowania napięcia powierzchniowego płynnej zawartości tkanki, co powoduje deformację na poziomie molekularnym po odparowaniu³⁵. Takie podejście wymaga równomiernego zastąpienia zawartości wody w próbce ciekłym dwutlenkiem węgla, który jest bardziej niezawodny w małych i łatwo dyfuzyjnych próbkach. Alternatywnie, integralność strukturalna tkanki może zostać poprawiona, a suszenie powietrzem, tj. faza parowania może być stosowana przez dłuższy czas w celu zmniejszenia ogólnej deformacji. Cząsteczka HMDS ulega sililowaniu w celu utworzenia rusztowania na bazie silikonu w celu wzmocnienia i ustabilizowania organizacji molekularnej próbki tkanki³⁶. Parowanie jest dodatkowo wydłużane poprzez ograniczanie krążących prądów powietrza z otoczenia, również w celu uniknięcia niejednorodnego parowania, szczególnie między powierzchnią próbki a warstwami wewnętrznymi.

Liczne środki kontrastowe były już wcześniej stosowane w obrazowaniu mikrotomografii komputerowej tkanek miękkich. Najczęściej spotykane są jod, kwas fosfowolframowy (PTA) i PMA. Jod został szczególnie zastosowany ze względu na wyższą szybkość dyfuzji 34,37,38. Niemniej jednak jod działa jako katalizator sililowania odczynnika HMDS³⁶. Katalizowana reakcja jest agresywna i egzotermiczna, co wiąże się z wysokim ryzykiem zniszczenia próbki i ryzykiem bezpieczeństwa, jeśli resztki HMDS pozostaną z powodu niepełnego wysuszenia próbki. Zarówno PTA, jak i PMA rozpuszczone w etanolu mogą być bezpiecznie stosowane w połączeniu z HMDS. Wykazano, że PTA i PMA zapewniają większą zdolność rozdzielczą drobnych struktur w niezmineralizowanych krążkach międzykręgowych w porównaniu z barwieniem jodem³⁸. W obrazowaniu mikrotomograficznym próbek ssaków, PTA i PMA zastosowano do barwienia zarodków myszy³⁹, układu sercowo-naczyniowego myszy³⁷, mięśni i mózgu królika⁴⁰ oraz żył świń⁴¹. PTA ma większą masę cząsteczkową i gęstość w roztworze niż PMA. Wynika to częściowo z większej masy atomowej wolframu (liczba atomowa wynosi 74 g/mol), głównego pierwiastka tłumiącego w PTA. Dla porównania, najcięższy pierwiastek w PMA, molibden, ma liczbę atomową 42 g/mol. Zarówno masa atomowa, jak i gęstość próbki leżą u podstaw tłumienia promieniowania rentgenowskiego, oprócz grubości próbki⁴². Zwiększając długość ścieżki promieniowania rentgenowskiego poprzez zwiększanie rozmiarów próbek, tłumienie promieniowania rentgenowskiego staje się bardziej wrażliwe na zwiększoną gęstość próbki. W związku z tym wybrano środek kontrastowy PMA o mniejszej gęstości, aby zmniejszyć ryzyko nadmiernego tłumienia i zoptymalizować zakres dynamiczny kontrastu obrazu dla serc o skali zbliżonej do ludzkiej. Dalsze dowody wykazały, że obciążenie dyfuzyjne PMA daje bardziej jednorodne barwienie niż w przypadku większej cząsteczki PTA w tkance serca⁴³.

Sposób dostarczania środka kontrastowego wpływa na równomierność dystrybucji środka kontrastowego w tkance serca (ryc. 3). Perfuzja środków kontrastowych w sercu odwodnionym etanolem wykazała niejednolite poziomy barwienia tła PMA z powodu zmiennego oporu naczyniowego. W wysuszonym na powietrzu sercu struktura laminarna mięśni jest podkreślona przez proces wysuszania próbki, zwiększając separację mięśni laminarnych. To ostatecznie poprawiło ogólną przepuszczalność tkanki dla obciążenia środkiem kontrastowym na podstawie dyfuzji. W związku z tym suszenie powietrzem ułatwiało tkankom: kontrast powietrza na poziomie laminarnym i wewnątrzlaminarnym (ryc. 4). Co więcej, ładowanie dyfuzyjne może być dodatkowo ułatwione przez aplikację w próżni. Wykazano ponadto, że kurczenie się tkanek w próbkach niewysuszonych zależy od stężenia środka kontrastowego⁴⁰. Jednak wcześniejsza stabilizacja morfologiczna próbki poprzez suszenie powietrzem hamuje efekt kurczenia się tkanek²⁹.

Obrazy mikrotomografii komputerowej całych narządów o wysokiej rozdzielczości z natury rzeczy generują duże ilości danych. Charakter technik obrazowania tomograficznego umożliwia wizualizację i przetwarzanie obrazu na zasadzie slice po slice, co zmniejsza obciążenie przetwarzania komputerowego i pamięci. Jednak, aby zwizualizować trójwymiarowe stosy obrazów, na przykład w celu renderowania objętości próbek w reprezentacjach trójwymiarowych, zalecane minimalne specyfikacje komputera to 128 GB pamięci RAM i szybkość procesora 3 GHz. Półprzewodnikowe dyski twarde również znacznie poprawiły transfer danych.

Pojawienie się obrazowania mikrotomografii komputerowej w dziedzinie serca zapewnia wiele korzyści w badaniach translacyjnych i walidacji klinicznej. Zalety obrazowania trójwymiarowego i mikrometrycznego wykazały już zastosowanie w określaniu obciążenia zakrzepowego u pacjentów z niedokrwieniem mięśnia sercowego z uniesieniem odcinka ST^44,45. Mapowanie potencjalnych źródeł arytmii u pacjentów ze strukturalnymi chorobami serca jest w dużej mierze zależne od określenia rozmieszczenia zwłóknieniowej tkanki bliznowatej i zlokalizowania przeplatających się ścieżek mięśnia sercowego, który przeżył. Podejścia drugiego rzutu do diagnostyki komorowych zaburzeń rytmu serca wykorzystują obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego⁴⁶. Może solidnie lokalizować gęste zwłóknienie, ale ogranicza się do charakterystyki morfologicznej o niskiej rozdzielczości i oferuje ograniczony wgląd w przebudowę mikrostrukturalną i rozproszone rozkłady zmian zwłóknieniowych⁴⁷. Badanie rozkładu i charakterystyki blizn w wysokiej rozdzielczości ma ogromny potencjał w zakresie poprawy naszej wiedzy na temat przebudowy strukturalnej serca i ryzyka rozwoju niewydolności serca. W szczególności badania podstawowe lub badania pośmiertne skorzystają z potwierdzających obrazów strukturalnych do mapowania elektrycznego arytmii serca.

Podsumowując, serca wzmocnione leczeniem HMDS i suszeniem powietrzem mogą być następnie barwione rentgenowskim środkiem kontrastowym, aby zwiększyć tłumienie promieniowania rentgenowskiego składników zewnątrzkomórkowych. W szczególności w zdrowym mięśniu sercowym akumulacja PMA występuje w nabłonku, tkance zastawkowej i przedziałach układu przewodnictwa komorowego osłoniętych tkanką łączną, co spowodowało zwiększone tłumienie promieniowania rentgenowskiego. Co więcej, w strukturalnie chorym mięśniu sercowym zwiększony kontrast był dodatkowo selektywny w kierunku zwłóknienia.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% neutralna buforowana formalina	Diapath	F0043
Roztwór chlorku wapnia	Honeywell	21114
Rurka kaulacyjna PTFE	VWR	DENE3400102
Zbiornik o stałej wysokości podnoszenia 1L Aparat	Harvard	50-0496
D-(+)-Glukoza	Sigma	G5767
Etanol absolutny	VWR	20821.330
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Sigma	796881
Heparyna sodowa (5000 U/ml)	Panpharma	3400891287301.
Hexamethyldisilazan (HMDS)	Sigma	440191-1L
Kwas solny, odczynnik ACS, 37%	Sigma	258148
roztwór chlorku magnezu	Honeywell	63020
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Sigma	P5368
Hydrat kwasu fosfomolibdynowego	Fisher Scientific	417895000
Przewody pompy chlorku potasu	Sigma	P5405
, 3-stopniowe	Ismatec	FV-96328-48
SkyScan, 1276	Bruker		micro CT
Wodorowęglan sodu	Sigma	S5761
Chlorek sodu	Sigma	S3014
Roztwór wodorotlenku sodu 50% w H2O	Sigma
Zestawy łączników rurowych	Harvard Apparatus	72-1407
Pompa do węży	Ismatec	ISM 1089
Rurka Tygon R-3603 1,6 mm 3,2 mm 0,8 mm	VWR	228-1279
Przewody Tygon R-3603 3,2 mm 4,8 mm 0,8 mm	VWR	228-1283
Strzykawki jednorazowe dwuczęściowe 50 ml	Norm-Ject	4850001000	Nie zawiera pirogenów, nie zawiera PCW