Artykuł metodologiczny

Multipleksowane fluorescencyjne barwienie immunohistochemiczne czterech typów komórek odpornościowych endometrium w nawracających poronieniach

DOI:

10.3791/62931

⸱

4 sierpnia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, Prince of Wales Hospital, 2Department of Orthopaedics and Traumatology, The Chinese University of Hong Kong, Prince of Wales Hospital, 3Department of Obstetrics and Gynaecology, Shenzhen Baoan Women’s and Children’s Hospital, Shenzhen University, 4School of Medicine, Faculty of Medicine and Health Sciences, Keele University, 5Li Ka Shing Institute of Health Sciences; School of Biomedical Sciences, The Chinese University of Hong Kong

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomimo postępów w immunohistochemii multipleksowej i obrazowaniu wielospektralnym, scharakteryzowanie gęstości i grupowania głównych komórek odpornościowych jednocześnie w endometrium pozostaje wyzwaniem. W artykule opisano szczegółowy protokół barwienia multipleksowego i obrazowania dla jednoczesnej lokalizacji czterech typów komórek odpornościowych w endometrium.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunohistochemia jest najczęściej używaną metodą identyfikacji i wizualizacji antygenów tkankowych w badaniach biologicznych i diagnostyce klinicznej. Może być stosowany do charakteryzowania różnych procesów biologicznych lub patologii, takich jak gojenie się ran, odpowiedź immunologiczna, odrzucanie tkanek i interakcje tkanka-biomateriał. Jednak wizualizacja i kwantyfikacja wielu antygenów (zwłaszcza komórek odpornościowych) w pojedynczym wycinku tkanki przy użyciu konwencjonalnego barwienia immunohistochemicznego (IHC) pozostaje niezadowalająca. W związku z tym w ostatnich latach wprowadzono technologie multipleksowania w celu identyfikacji wielu markerów biologicznych w pojedynczej próbce tkanki lub zestawie różnych próbek tkanki.

Te technologie mogą być szczególnie przydatne w różnicowaniu zmian w interakcjach immunologicznych między komórkami w obrębie endometrium między płodnymi kobietami a kobietami z nawracającymi poronieniami podczas implantacji. W artykule opisano szczegółowy protokół multipleksowanego barwienia fluorescencyjnego IHC w celu zbadania gęstości i grupowania czterech głównych typów komórek odpornościowych jednocześnie w precyzyjnie dobranych próbkach endometrium podczas implantacji zarodka. Metoda obejmuje przygotowanie próbki, optymalizację multipleksu z markerami dla podtypów komórek odpornościowych oraz skanowanie szkiełek, a następnie analizę danych, ze szczególnym odniesieniem do wykrywania komórek odpornościowych endometrium.

Korzystając z tej metody, gęstość i grupowanie czterech głównych typów komórek odpornościowych w endometrium może być jednocześnie analizowane w jednym wycinku tkanki. Ponadto w tym artykule omówione zostaną czynniki krytyczne i rozwiązywanie problemów w celu przezwyciężenia możliwych zakłóceń fluoroforowych między stosowanymi sondami fluorescencyjnymi. Co ważne, wyniki tej techniki barwienia multipleksowego mogą pomóc w dogłębnym zrozumieniu interakcji i regulacji immunologicznej podczas implantacji zarodka.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nawracające poronienia (RM) można zdefiniować jako utratę dwóch lub więcej ciąż przed 24 tygodniem ciąży1. Ten częsty stan rozrodczy dotyka do 1% par na całym świecie2,3. Patofizjologia jest wieloczynnikowa i można ją podzielić na przyczyny embriologiczne (głównie z powodu nieprawidłowego kariotypu zarodka) oraz przyczyny macierzyńskie, które wpływają na rozwój endometrium i/lub łożyska. Ta manifestacja może wynikać z nieprawidłowości genetycznych rodziców, anomalii macicy, stanów prozakrzepowych, czynników endokrynologicznych i zaburzeń immunologicznych4.

W ostatnich latach dysfunkcja komórek efektorowych układu odpornościowego była związana z patogenezą wczesnej utraty ciąży5. Zainspirowało to wiele badań nad wyjaśnieniem określonych populacji komórek odpornościowych w endometrium podczas cyklu miesiączkowego, implantacji i wczesnej ciąży, z określonymi rolami we wczesnej ciąży. Wśród tych komórek odpornościowych komórki naturalnych zabójców macicy (uNK) odgrywają kluczową rolę podczas implantacji zarodka i ciąży, szczególnie w procesach inwazji trofoblastów i angiogenezy6. Badania wykazały zwiększoną gęstość komórek uNK w błonie śluzowej macicy u kobiet z RM7,8, chociaż to odkrycie nie było związane ze zwiększonym ryzykiem poronienia9. Jednak to pobudziło badania oceniające gęstość innych typów komórek odpornościowych (takich jak makrofagi, komórki dendrytyczne macicy) w endometrium u kobiet z RM10, 11. Niemniej jednak nie ma pewności, czy u kobiet z RM występuje znacząca zmiana gęstości komórek odpornościowych w endometrium okołoimplantacyjnym.

Jednym z możliwych wyjaśnień niepewności jest to, że ocena gęstości komórek odpornościowych endometrium może być trudna ze względu na szybkie zmiany w endometrium podczas okna implantacji. W ciągu 24 godzin znaczące zmiany w endometrium zmieniają gęstość komórek odpornościowych i wydzielanie cytokin, wprowadzając źródło zmienności w tych wynikach12. Ponadto większość doniesień opiera się głównie na zastosowaniu barwienia pojedynczych komórek (np. tradycyjne metody IHC), które nie były w stanie zbadać wielu markerów na tym samym fragmencie tkanki. Chociaż cytometria przepływowa może być stosowana do wykrywania wielu populacji komórek w jednej próbce, wymagana duża liczba komórek i czasochłonna optymalizacja utrudniają popularność i skuteczność tej metody. W związku z tym niedawny postęp w barwieniu multipleksowym IHC może rozwiązać ten problem poprzez barwienie immunologiczne wielu markerów na tym samym szkiełku w celu oceny wielu parametrów, w tym linii komórkowej i lokalizacji histologicznej poszczególnych subpopulacji immunologicznych. Co więcej, technologia ta może zmaksymalizować uzyskane informacje w przypadku ograniczonej dostępności tkanek. Ostatecznie technika ta może pomóc w wyjaśnieniu różnic w interakcjach komórek odpornościowych w błonie śluzowej macicy między kobietami płodnymi a kobietami z RM.

Dwie grupy kobiet zostały zrekrutowane ze Szpitala Księcia Walii, w tym kobiety z kontrolą płodności (FC) i kobiety z niewyjaśnionymi nawracającymi poronieniami (RM). Kontrolę płodności zdefiniowano jako kobiety, które miały co najmniej jedno żywe poród bez historii samoistnego poronienia, a kobiety z RM zdefiniowano jako te, które miały historię ≥2 kolejnych poronień przed 20 tygodniem ciąży. Osoby z obu grup spełniały następujące kryteria włączenia: (a) wiek od 20 do 42 lat, (b) osoba niepaląca, (c) regularny cykl miesiączkowy (25-35 dni) i prawidłowa budowa macicy, (d) brak stosowania jakiegokolwiek schematu hormonalnego przez co najmniej 3 miesiące przed biopsją endometrium, (e) brak hydrosalpinx według histero-salpingogramu. Ponadto wszyscy zrekrutowani pacjenci mieli prawidłowe kariotypowanie, prawidłowy 3-wymiarowy histerosalpingogram ultrasonograficzny, hormon folikulotropowy dnia 2 < 10 IU / L, progesteron w środkowej części lutealu > 30 nmol / L, normalną czynność tarczycy i wynik negatywny na obecność przeciwciał przeciwzakrzepowych tocznia i przeciwciał IgG i IgM przeciwko kardiolipiny.

Aby lepiej zrozumieć immunologiczne podstawy RM, najbardziej pożądane byłoby jednoczesne określenie ilościowe i zlokalizowanie głównych typów komórek odpornościowych obecnych w endometrium w momencie implantacji. W artykule opisano cały protokół od przygotowania próbki, optymalizacji multipleksu z markerami dla podtypów komórek odpornościowych i skanowania szkiełek, po którym następuje analiza danych ze szczególnym odniesieniem do wykrywania komórek odpornościowych endometrium. Ponadto w artykule opisano, w jaki sposób można określić gęstość i grupowanie typów komórek odpornościowych jednocześnie w błonie śluzowej macicy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie zostało zatwierdzone przez Joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee. Uzyskano świadomą zgodę uczestniczek przed pobraniem biopsji endometrium. Zapoznaj się z sekcją wprowadzającą, aby zapoznać się z kryteriami włączenia grup kontrolnych i RM.

1. Przygotowanie próbki

  1. Upewnij się, że wszystkie kobiety biorące udział w tym badaniu przechodzą codzienny test paskowy moczu od 9 dnia cyklu miesiączkowego w celu zidentyfikowania wyrzutu hormonu luteinizującego (LH) w celu wykrycia owulacji i dokładnie zmierzenia czasu biopsji endometrium w 7dniu po wyrzucie LH (LH+7).
  2. Pobrać 0,5cm2 fragment biopsji endometrium za pomocą próbnika Pipelle lub Pipet Curet od kobiet płodnych i kobiet z niewyjaśnionym RM. Oznaczyć pojemnik i natychmiast umieścić próbkę w 10% neutralnie buforowanej formalinie (pH 7) w celu utrwalenia przez noc w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Objętość utrwalacza powinna być 5-10 razy większa niż tkanki.
  3. Umieść tkankę we wkładzie w celu odwodnienia w maszynie do przetwarzania tkanek przed zatopieniem jej w stopionym wosku parafinowym. Zanurzyć tkanki w parafinie w temperaturze 58-60 °C.
  4. Pozostaw blok parafiny do ostygnięcia przez noc w temperaturze pokojowej. Za pomocą mikrotomu przyciąć bloki parafiny do grubości 3 μm.
    UWAGA: Stosowanie wody destylowanej pomaga w prawidłowym montażu tkanek i przyleganiu podczas barwienia multipleksowego.
  5. Umieść wstęgę parafinową w łaźni wodnej o temperaturze 40-45 °C na 30 s.
  6. Zamontuj sekcje na szkiełkach mikroskopowych pokrytych poli-L-lizyną (0.1% w/v). Umieścić szkiełka chusteczką do góry i pozostawić do wyschnięcia w temperaturze 37 °C na noc. Przechowuj szkiełka w pudełku na szkiełka z dala od ekstremalnych temperatur do czasu dalszego użycia.

2. Określ idealne stężenie przeciwciał dla multipleksowego IHC przy użyciu konwencjonalnego IHC.

UWAGA: Jest to ważne dla identyfikacji poziomu ekspresji i wzorca każdego markera immunologicznego w próbce endometrium, a także określenia sekwencji barwienia każdego markera, jak również powiązanych par fluoroforów wzmacniających sygnał tyramidu (TSA).

  1. Przetestuj przeciwciała pod kątem ich przydatności dla multipleksowego IHC, używając ręcznego konwencjonalnego IHC13.
  2. Użyj tkanek endometrium do badania pojedynczych przeciwciał.
  3. Uwzględnij kontrolę pozytywną (np. śledziona) i kontrolę ujemną (kontrola izotypowa) w celu optymalizacji warunków barwienia każdego przeciwciała.
  4. Barwienie należy przeprowadzić przy użyciu rozcieńczenia zalecanego w karcie katalogowej przeciwciała.
  5. Przeprowadzić dodatkowe barwienie, stosując stężenia powyżej i poniżej zalecanego rozcieńczenia użytego w kroku 2.3.
    UWAGA: Patolog kliniczny powinien ślepo ocenić wybarwione szkiełka, aby potwierdzić lokalizację sondowania przeciwciał i integralność komórkową.

3. Metoda barwienia multipleksowego

  1. Przygotowanie i mocowanie szkiełek
    1. Ułożyć szkiełka (z kroku 1.6) płasko chusteczką skierowaną do góry w piekarniku i piec w temperaturze 60 °C przez co najmniej 1 godzinę.
    2. Wyjmij szkiełka z piekarnika i pozwól im ostygnąć przez co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej przed umieszczeniem ich w pionowym stojaku na prowadnice.
    3. Odparafinuj i ponownie nawodnij szkiełka utrwalone w formalinie, zatopione w parafinie, mając 10 minut przeznaczonych na każdy z następujących etapów: ksylen (2x), 100% etanol (2x), 95% etanol (1x), 70% etanol (2x) i woda destylowana (2x).
    4. Umieść stojak ze szkiełkami w plastikowym pudełku na szkiełka i zanurz je w soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS, pH 7,6).
      UWAGA: Szkiełka muszą pozostać wilgotne, począwszy od tego etapu nawadniania, aż do montażu w ostatnim etapie.
    5. Utrwalić próbki, zanurzając szkiełka w plastikowym pudełku na szkiełka wypełnionym mieszaniną formaldehydu rozcieńczonego w metanolu (1:9) na 30 minut w ciemności.
    6. Umyj szkiełka dwukrotnie w wodzie dejonizowanej przez 2 minuty, a następnie przystąp do pobierania antygenu.
  2. Pobieranie epitopów
    1. Umieść stojak ze szkiełkami w żaroodpornym pudełku i napełnij go buforem kwasu cytrynowego (pH 6,0), aby przykryć szkiełka.
    2. Umieść pudełko w kuchence mikrofalowej i podgrzewaj szkiełka przez 50 sekund przy 100% mocy, a następnie 20 minut przy 20% mocy, aby utrzymać tę samą temperaturę.
    3. Pozostaw szkiełka do ostygnięcia przez około 15 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Opłucz szkiełka w wodzie przez 2 minuty, a następnie TBS-Tween 20 (TBST) przez 2 minuty
      UWAGA: TBST składa się z 25 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl i 0,05% Tween 20 (v/v).
  3. Blokowanie
    1. Zablokować endogenną aktywność peroksydazy w tkance, zanurzając szkiełko w słoiku zawierającym roztwór blokujący peroksydazę (patrz tabela materiałów) na 10 minut.
    2. Myć szkiełka TBST przez 5 minut.
    3. Użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby zaznaczyć granicę wokół sekcji tkanki na szkiełku.
    4. Przykryć skrawki tkanek buforem blokującym (patrz tabela materiałów) lub albuminą surowicy bydlęcej (5%, w/v) i inkubować szkiełka w wilgotnej komorze przez 15 minut.
  4. Zastosowanie przeciwciał i sygnałów
    1. Usuń odczynniki blokujące.
    2. Inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem będącym przedmiotem zainteresowania (np. CD3, rozcieńczenie 1:100 w rozcieńczalniku przeciwciał, patrz Tabela 1) w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    3. Usuń przeciwciało pierwszorzędowe. Myć 3x z TBST przez 5 min za każdym razem.
    4. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym znakowanym polimerową peroksydazą chrzanową (HRP) (Tabela 1) przez 15 minut w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej. Myć 3x z TBST przez 5 min za każdym razem.
    5. Zastosować roztwór roboczy TSA z fluoroforu Opal (1:100 w rozcieńczalniku do amplifikacji) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby umożliwić koniugację fluoroforu z próbką tkanki w pierwotnych miejscach wiązania przeciwciał. Myć TBST trzykrotnie przez 5 minut za każdym razem.
  5. Usuwanie izolacji na bazie mikrofal
    1. Przepłukać buforem do odzyskiwania antygenu (roztwór buforowy cytrynianu, pH 6,0).
    2. Wykonaj odpędzanie oparte na mikrofalach w celu usunięcia pierwszorzędowo-drugorzędowego kompleksu HRP w celu wprowadzenia następnego przeciwciała pierwszorzędowego (np. CD20).
    3. Umieść szkiełka w buforze do odzyskiwania antygenu, podgrzewaj je w kuchence mikrofalowej ze 100% mocą przez 50 sekund, a następnie z 20% mocą przez 20 minut w pojemnikach nadających się do kuchenki mikrofalowej i schładzaj w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    4. Powtarzać kroki 3.2.4-3.5.2, aż próbki tkanek zostaną zbadane pod kątem wszystkich pierwszorzędowych przeciwciał.
  6. Przeciwbejc i montaż
    1. Po usunięciu i schłodzeniu buforu do odzyskiwania antygenu w mikrofalach, przepłukać szkiełka w wodzie destylowanej i TBST.
    2. Inkubować w roztworze 4', 6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) (1,0 μg/ml) przez 5 minut w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej.
    3. Myć 3x z TBST przez 5 min za każdym razem. Umyć wodą raz przez 5 min.
    4. Wysuszyć prowadnicę na powietrzu i zamontować za pomocą odpowiedniego medium montażowego (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Barwienie przeciwstawne nie będzie wymagane w przypadku slajdów monopleksowych, które mają być używane do tworzenia biblioteki spektralnej.

4. Obraz i analiza

  1. Przygotowanie preparatów z biblioteki spektralnej
    1. Utwórz slajdy biblioteczne (obrazy referencyjne z pojedynczym barwieniem) dla każdego fluoroforu, DAPI i autofluorescencji z tą samą tkanką kontrolną do analizy obrazu wielospektralnego.
    2. Korzystając ze szkiełek z próbkami biopsji endometrium od kobiet z RM i kobiet płodnych, wykonaj kroki od 1.1 do 3.6.4 w celu wykrycia pojedynczego przeciwciała dla każdego szkiełka (bez dalszego dodawania przeciwciał lub fluoroforów).
    3. Dla każdego wykrycia przeciwciał wybarwić jedno ze szkiełek DAPI (jak w kroku 3.6.2) i pozostawić jedno szkiełko niewybarwione w celu wykrycia ewentualnej autofluorescencji tkanek w widmie.
    4. Użyj odpowiednich filtrów na stacji roboczej, aby uzyskać obraz dla tego zestawu preparatów dla każdego przeciwciała i prześlij je do biblioteki analizy obrazów (zgodnie z opisem w kroku 4.2).
    5. Po przechwyceniu obrazu wybierz inForm jako źródło biblioteki spektralnej i zbuduj bibliotekę spektralną.
    6. Ponieważ używane są fluorofory, wybierz z menu Plamy/Fluory.
    7. Wybierając plamy lub fluorofory, zawęź wybór, wybierając jedną lub więcej grup. Wybierz opcję Wszystkie, aby wyświetlić wszystkie widma zgodne z obrazami.
  2. Obrazowanie spektralne
    UWAGA: Obrazy zostały zarejestrowane za pomocą stacji roboczej Mantra z biblioteką spektralną utworzoną za pomocą oprogramowania do analizy obrazu w formie.
    1. Uchwycić obraz szkiełek barwionych pojedynczym przeciwciałem za pomocą odpowiednich filtrów epi-fluorescencji, jak zaproponowano w Tabeli 2 (np. DAPI, izotiocyjanian fluoresceiny [FITC], CY3, Texas Red i CY5) za pomocą stacji roboczej.
      UWAGA: Zalecane filtry dla konkretnych fluoroforów stosowanych w tym protokole przedstawiono w Tabeli 2.
    2. Zidentyfikuj odpowiedni czas ekspozycji dla optymalnego sygnału, badając każdy marker w odpowiadającym mu kanale fluorescencyjnym.
      UWAGA: Optymalny sygnał określa się zgodnie z odniesieniem do dodatniości i lokalizacji uzyskanej w barwieniu pojedynczym przeciwciałem.
    3. Określ stały czas ekspozycji dla każdego analitu (kombinacji przeciwciała i fluoroforu), aby ustandaryzować porównanie między próbkami.
      UWAGA: Określenie stałej ekspozycji jest uzależnione od intensywności w próbie interesów.
    4. Skanuj poplamione multipleksem slajdy w odpowiednim trybie skanowania za pomocą wbudowanego algorytmu autofokusa.
      UWAGA: Ustalona biblioteka spektralna zostanie wykorzystana do rozróżnienia wielospektralnego sześcianu obrazu na pojedyncze pojedyncze składniki (demiksowanie spektralne). Pozwoliłoby to na przetworzenie identyfikacji opartej na kolorach dla wszystkich markerów zainteresowania przy użyciu następujących dwóch głównych kroków: sesji szkoleniowej i sesji analizy obrazu.
  3. Analiza obrazu
    1. Zliczanie wybranych typów komórek odpornościowych w błonie śluzowej macicy
    2. Przechwyć co najmniej 10 pól do analizy w powiększeniu 200x.
      UWAGA: Pola zostały przechwycone poprzez zeskanowanie całej sekcji bez żadnego wyboru. Może to zapewnić jednoczesne wychwycenie wszystkich składników komórkowych błony śluzowej macicy, np. granicy nabłonka światła, zrębu i gruczołów.
    3. Aby policzyć komórki, kliknij przycisk Policz obiekty na pasku kroków, aby wyświetlić panel Ustawienia zliczania obiektów.
    4. Zaznacz pole Odrzuć obiekt, jeśli dotykasz krawędzi, aby wykluczyć wszystkie obiekty dotykające krawędzi obrazu, obszaru procesu lub obszaru tkanki.
    5. Jeśli tkanka została podzielona na segmenty, wybierz Kategorię tkanki, w której mają znajdować się obiekty. Nie licz obiektów spoza wybranej kategorii tkanek.
    6. Wybierz żądane podejście do identyfikacji obiektów: Oparte na obiektach lub Oparte na pikselach (próg).
      UWAGA: Podejście oparte na pikselach (próg) powinno być wybrane w przypadku wiarygodnego lub spójnego zabarwienia, dla którego zastosowanie prostego progu pozwoli uzyskać piksele obiektu. Podejście obiektowe jest zalecane, gdy wymagane są bardziej zaawansowane podejścia oparte na morfometrii w przypadku braku spójności i swoistości barwienia obiektów.
    7. Wybierz żądane skalowanie sygnału: Skala automatyczna lub Skala stała.
      UWAGA: Wybranie opcji Automatyczne skalowanie spowoduje automatyczne skalowanie każdej płaszczyzny komponentu przed wykonaniem segmentacji obiektu. Opcja Stała skala jest zalecana, gdy wymagana jest lepsza wydajność segmentacji, a sygnały barwienia są spójne i niezawodne.
    8. Z listy rozwijanej wybierz Podstawowy komponent do segmentacji obiektów.
    9. Dostosuj wartość minimalnego sygnału dla komponentu podstawowego do żądanej wartości progowej.
    10. Aby automatycznie wypełniać otwory w obiektach, wybierz opcję Wypełnij otwory.
    11. Aby wykrywać obiekty, które stykają się z innymi obiektami, jako pojedyncze obiekty, a nie jako jeden obiekt, zaznacz pole wyboru Popraw podział po zaznaczeniu pola wyboru Maksymalny rozmiar (piksele).
    12. Aby wykluczyć obiekty na podstawie zaokrąglenia obiektu, zaznacz pole Zaokrąglenie i określ żądaną minimalną okrągłość.
    13. Policz wszystkie komórki zrębu (CD3−/CD20−/CD68−/CD56− i DAPI+), w tym komórki otaczające naczynia krwionośne.
    14. Policz osobno komórki odpornościowe, w tym limfocyty T (CD3+ i DAPI+), limfocyty B (CD20+ i DAPI+), makrofagi (CD68+ i DAPI+) oraz komórki uNK (CD56+ i DAPI+).
    15. Wyraź dane jako procentową liczbę komórek odpornościowych w stosunku do całkowitej liczby komórek zrębu dla każdego przechwyconego obrazu i podaj końcową liczbę komórek jako średnią ze wszystkich pól.
    16. Użyj Edytora widoków, aby wyświetlić wynikowe tabele danych po przetworzeniu. Wyeksportuj tabelę danych zliczania.
    17. Kwantyfikacja rozmieszczenia przestrzennego komórek odpornościowych endometrium
    18. Przy 200-krotnym powiększeniu oszacuj funkcję L za pomocą programu R dla zakresu 0-20 μm uważanego za maksymalną odległość kontaktu komórka-komórka14.
      UWAGA: Zestaw narzędzi języka R "spatstat" został użyty do pomiaru funkcji L.
      1. Oznacz poziom grupowania różnych par komórek odpornościowych na podstawie obszaru pod krzywą (AUC) ich funkcji L.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólny schematyczny proces przeprowadzania 4-kolorowego testu multipleksowego w celu wykrycia 4 typów komórek odpornościowych endometrium jest pokazany w Rysunek 1. Krótko mówiąc, protokół tego multipleksowego barwienia immunofluorescencyjnego wymagał 8 kluczowych kroków: 1. Przygotowanie szkiełek, 2. Pobranie epitopu, 3. Blokowanie, 4. Podanie przeciwciał pierwotnych, 5. Wtórne zastosowanie przeciwciał, 6. Wzmocnienie sygnału, 7. Usunięcie przeciwciała i 8. Przeciwbarwienie i montaż. Renderowanie i a...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krytyczne kroki w ramach protokołu
Ważne jest, aby pamiętać, że barwienie multipleksowe wymaga starannej optymalizacji. Pobieranie antygenu przy użyciu buforu cytrynianowego i technologii mikrofalowej wymaga optymalizacji, aby zapewnić całkowite usunięcie przeciwciał i utrzymanie żywotności tkanek. Ponieważ odczynniki TSA kowalencyjnie wiążą się z miejscami otaczającymi antygen, mogą potencjalnie hamować wiązanie kolejnego przeciwciała pierwszorzędowego poprzez przeszkodę steryczną (znaną również ja...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Hong Kong Obstetrical and Gynecological Trust Fund w 2018 roku oraz Hong Kong Health and Medical Research Fund (06170186, 07180226).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rozcieńczalnik do amplifikacjiPerkinElmer FP1498Bufor rozcieńczalnika fluoroforowego
Rozcieńczalnik przeciwciałPerkin ElmerARD1001EARozcieńczanie przeciwciała
CD3Spring BioscienceM3072Przeciwciało pierwotne
CD20Biocare MedicalCM004BPrzeciwciało pierwotne
CD56LeicaNCL-CD56-504Pierwotne przeciwciało
CD68Spring BioscienceM5510Pierwszorzędny roztwór
buforowy cytrynianu, pH 6,0 (10x)AbcamAB64214Roztwór do odzyskiwania antygenu
EMSURE Ksylen (mieszanina izomeryczna)Merck108297Deparafiing
Absolutetanolu Merck107017Alkohol etylowy do nawodnienia
HistoCore BIOCUT Ręczny obrotowy Leica MikrotomLeicaRM2125RTSSekcja tkanek osadzonych w parafinie
inForm Zaawansowane oprogramowanie do analizy obrazuPerkin ElmerinForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (wersja 14.0)Oprogramowanie do analizy danych
Mantra® Stacja roboczaAkoya BiosciencesCLS140089Obrazowanie spektralne
MikrofalowyfalownikPanasonicMikrofalowe usuwanie
Opal 520Perkin ElmerFP1487AOdpowiedni odczynnik fluorescencyjny na bazie tyramidu
Opal 620Perkin ElmerFP1495AOdpowiedni odczynnik fluorescencyjny na bazie tyramidu
Opal 650Perkin ElmerFP1496AOdpowiedni odczynnik fluorescencyjny na bazie tyramidu
Opal 690Perkin ElmerFP1497AOdpowiedni odczynnik fluorescencyjny na bazie tyramidu
PiekarnikMemmertU10Deparafian
Roztwór blokujący peroksydazęDAKOS2023Usuwanie aktywności peroksydazy tkankowej
Szkiełko pokryte poli-L-lizynąFISHER SCIENTIFIC120-550-15Szkiełko do rutynowego stosowania histologicznego
PolyHRP Broad SpectrumPerkin ElmerARH1001EAPrzeciwciało drugorzędowe
ProLong™ Złoty uchwyt zapobiegający blaknięciuThemoFisher ScientificP36930Montaż
Spatstat/Wersja 2.1-0Przestrzenna analiza wzorca punktowego
Spectral DAPIPerkin ElmerFP1490ABarwienie kwasami nukleinowymi
Procesor tkanekThermo FischerExcelsior ESPrzetwarzanie tkanek do odwodnienia i parafiny
Tris Buffer Saline (TBS), 10xCell Signaling Technology12498SRoztwór myjący
Tween 20Sigma-AldrichP1370-1LNiejonowy detergent

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. ESHRE Guideline Group on RPL et al. ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss. Human Reproduction Open. 2018 (2), 004(2018).
  2. Stirrat, G. M. Recurrent miscarriage. Lancet. 336 (8716), 673-675 (1990).
  3. Rai, R., Regan, L. Recurrent miscarriage. Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).
  4. Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. The investigation and treatment of couples with recurrent first-trimester and second-trimester miscarriage. Green-top Guideline No. 17. Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. , (2011).
  5. King, A. Uterine leukocytes and decidualization. Human Reproduction Update. 6 (1), 28-36 (2000).
  6. Le Bouteiller, P., Piccinni, M. P. Human NK cells in pregnant uterus: why there. American Journal of Reproductive Immunology. 59 (5), 401-406 (2008).
  7. Lash, G. E., et al. Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure. Journal of Reproductive Immunology. 116, 50-59 (2016).
  8. Yang, Y., et al. HOXA-10 and E-cadherin expression in the endometrium of women with recurrent implantation failure and recurrent miscarriage. Fertility and Sterility. 107 (1), 136-143 (2017).
  9. Tuckerman, E., Laird, S. M., Prakash, A., Li, T. C. Prognostic value of the measurement of uterine natural killer cells in the endometrium of women with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 22 (8), 2208-2213 (2007).
  10. Jasper, M. J., et al. Macrophage-derived LIF and IL1B regulate alpha(1,2)fucosyltransferase 2 (Fut2) expression in mouse uterine epithelial cells during early pregnancy. Biology of Reproduction. 84 (1), 179-188 (2011).
  11. Kopcow, H. D., et al. T cell apoptosis at the maternal-fetal interface in early human pregnancy, involvement of galectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18472-18477 (2008).
  12. Johnson, P. M., Christmas, S. E., Vince, G. S. Immunological aspects of implantation and implantation failure. Human Reproduction. 14, Suppl 2 26-36 (1999).
  13. Hong, G., et al. Multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58711(2019).
  14. Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095(2017).
  15. Zhao, Y., et al. The use of multiplex staining to measure the density and clustering of four endometrial immune cells around the implantation period in women with recurrent miscarriage: comparison with fertile controls. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 593-603 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Multiplexowa immunohistochemiabarwienie fluorescencyjnekom rki odporno ciowe endometriumklastrowanie kom rek odporno ciowychsegmentacja tkanekods anianie epitop wznakowanie przeciwcia amiliczenie kom rekimplantacja zarodka

Powiązane artykuły