Optogenetyczne przejście fazowe TDP-43 w rdzeniowych neuronach ruchowych larw danio pręgowanego

Kazuhide Asakawa; Hiroshi Handa; Koichi Kawakami

doi:10.3791/62932

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Optogenetyczne przejście fazowe TDP-43 w rdzeniowych neuronach ruchowych larw danio pręgowanego

5.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62932

⸱

25 lutego 2022

Kazuhide Asakawa¹ , Hiroshi Handa¹ , Koichi Kawakami²^,³

¹Department of Chemical Biology, Tokyo Medical University, ²Division of Molecular and Developmental Biology, National Institute of Genetics, ³Department of Genetics, Graduate University for Advanced Studies (SOKENDAI)

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy protokół indukowania przejścia fazowego białka wiążącego DNA 43 (TDP-43) TAR przez światło w neuronach ruchowych rdzenia, używając danio pręgowanego jako modelu.

Streszczenie

Nieprawidłowa agregacja białek i selektywna podatność neuronów to dwie główne cechy charakterystyczne chorób neurodegeneracyjnych. Związki przyczynowo-skutkowe między tymi cechami można badać poprzez kontrolowanie przejścia fazowego białka związanego z chorobą w wrażliwym typie komórki, chociaż to eksperymentalne podejście było do tej pory ograniczone. W tym miejscu opisujemy protokół indukowania przejścia fazowego białka wiążącego RNA / DNA TDP-43 w rdzeniowych neuronach ruchowych larw danio pręgowanego do modelowania cytoplazmatycznej agregacji TDP-43 występującej w degenerujących się neuronach ruchowych w stwardnieniu zanikowym bocznym (ALS). Opisujemy metodę genetyczną opartą na sztucznym chromosomie bakteryjnym (BAC) w celu selektywnego dostarczania optogenetycznego wariantu TDP-43 do rdzeniowych neuronów ruchowych danio pręgowanego. Wysoka przezierność larw danio pręgowanego pozwala na przejście fazowe optogenetycznego TDP-43 w neuronach ruchowych rdzenia poprzez proste oświetlenie zewnętrzne za pomocą diody elektroluminescencyjnej (LED) przeciwko nieskrępowanym rybom. Przedstawiamy również podstawowy przebieg obrazowania na żywo neuronów ruchowych rdzenia danio pręgowanego oraz analizę obrazu za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania Fiji/ImageJ w celu scharakteryzowania reakcji optogenetycznego TDP-43 na oświetlenie światłem. Protokół ten umożliwia scharakteryzowanie przejścia fazowego TDP-43 i tworzenia agregatów w środowisku komórkowym wrażliwym na ALS, co powinno ułatwić badanie jego konsekwencji komórkowych i behawioralnych.

Wprowadzenie

Granulki rybonukleoproteiny (RNP) kontrolują niezliczone aktywności komórkowe w jądrze i cytoplazmie, tworząc bezbłonowe przegrody poprzez separację faz ciecz-ciecz (LLPS), zjawisko, w którym jednorodny płyn rozpada się na dwie odrębne fazy ciekłe1^,². Rozregulowane LLPS białek wiążących RNA, które normalnie działają jako składniki granulek RNP, sprzyjają nieprawidłowemu przejściu fazowemu, prowadząc do agregacji białek. Proces ten jest związany z chorobami neurorozwojowymi i neurodegeneracyjnymi³^,⁴^,⁵. Precyzyjna ocena....