Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Optogenetyczne przejście fazowe TDP-43 w rdzeniowych neuronach ruchowych larw danio pręgowanego

5.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62932

⸱

25 lutego 2022

 ,  , 
1Department of Chemical Biology, Tokyo Medical University, 2Division of Molecular and Developmental Biology, National Institute of Genetics, 3Department of Genetics, Graduate University for Advanced Studies (SOKENDAI)

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy protokół indukowania przejścia fazowego białka wiążącego DNA 43 (TDP-43) TAR przez światło w neuronach ruchowych rdzenia, używając danio pręgowanego jako modelu.

Streszczenie

Nieprawidłowa agregacja białek i selektywna podatność neuronów to dwie główne cechy charakterystyczne chorób neurodegeneracyjnych. Związki przyczynowo-skutkowe między tymi cechami można badać poprzez kontrolowanie przejścia fazowego białka związanego z chorobą w wrażliwym typie komórki, chociaż to eksperymentalne podejście było do tej pory ograniczone. W tym miejscu opisujemy protokół indukowania przejścia fazowego białka wiążącego RNA / DNA TDP-43 w rdzeniowych neuronach ruchowych larw danio pręgowanego do modelowania cytoplazmatycznej agregacji TDP-43 występującej w degenerujących się neuronach ruchowych w stwardnieniu zanikowym bocznym (ALS). Opisujemy metodę genetyczną opartą na sztucznym chromosomie bakteryjnym (BAC) w celu selektywnego dostarczania optogenetycznego wariantu TDP-43 do rdzeniowych neuronów ruchowych danio pręgowanego. Wysoka przezierność larw danio pręgowanego pozwala na przejście fazowe optogenetycznego TDP-43 w neuronach ruchowych rdzenia poprzez proste oświetlenie zewnętrzne za pomocą diody elektroluminescencyjnej (LED) przeciwko nieskrępowanym rybom. Przedstawiamy również podstawowy przebieg obrazowania na żywo neuronów ruchowych rdzenia danio pręgowanego oraz analizę obrazu za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania Fiji/ImageJ w celu scharakteryzowania reakcji optogenetycznego TDP-43 na oświetlenie światłem. Protokół ten umożliwia scharakteryzowanie przejścia fazowego TDP-43 i tworzenia agregatów w środowisku komórkowym wrażliwym na ALS, co powinno ułatwić badanie jego konsekwencji komórkowych i behawioralnych.

Wprowadzenie

Granulki rybonukleoproteiny (RNP) kontrolują niezliczone aktywności komórkowe w jądrze i cytoplazmie, tworząc bezbłonowe przegrody poprzez separację faz ciecz-ciecz (LLPS), zjawisko, w którym jednorodny płyn rozpada się na dwie odrębne fazy ciekłe1,2. Rozregulowane LLPS białek wiążących RNA, które normalnie działają jako składniki granulek RNP, sprzyjają nieprawidłowemu przejściu fazowemu, prowadząc do agregacji białek. Proces ten jest związany z chorobami neurorozwojowymi i neurodegeneracyjnymi3,4,5. Precyzyjna ocena związku przyczynowo-skutkowego między nieprawidłowymi LLPS białek wiążących RNA a patogenezą choroby ma kluczowe znaczenie dla określenia, czy i w jaki sposób LLPS może być wykorzystany jako skuteczny cel terapeutyczny. LLPS białek wiążących RNA jest stosunkowo łatwy do zbadania in vitro i w modelach jednokomórkowych, ale jest trudny w organizmach wielokomórkowych, zwłaszcza u kręgowców. Krytycznym wymogiem do analizy takich LLPS w poszczególnych komórkach w środowisku tkankowym jest stabilna ekspresja sondy do obrazowania i manipulacji LLPS w typie komórki podatnej na chorobę.

Stwardnienie zanikowe boczne (ALS) jest ostatecznie śmiertelnym zaburzeniem neurologicznym, w którym neurony ruchowe mózgu i rdzenia kręgowego są selektywnie i stopniowo tracone z powodu zwyrodnienia. Do tej pory mutacje w ponad 25 genach były związane z dziedziczną (lub rodzinną) postacią ALS, która stanowi 5%-10% wszystkich przypadków ALS, a niektóre z tych genów powodujących ALS kodują białka wiążące RNA składające się z RNP, takie jak hnRNPA1, TDP-43 i FUS6,7. Co więcej, sporadyczna postać ALS, która stanowi 90%-95% wszystkich przypadków ALS, charakteryzuje się cytoplazmatyczną agregacją TDP-43 zdeponowaną w degenerujących się neuronach ruchowych. Główną cechą tych białek wiążących RNA związanych z ALS są ich wewnętrznie nieuporządkowane regiony (IDR) lub domeny o niskiej złożoności, które nie mają uporządkowanych trójwymiarowych struktur i pośredniczą w słabych interakcjach białko-białko z wieloma różnymi białkami, które napędzają LLPS7,8. Fakt, że mutacje powodujące ALS często występują w IDR, doprowadził do pomysłu, że nieprawidłowy LLPS i przemiana fazowa tych białek związanych z ALS mogą leżeć u podstaw patogenezy ALS9,10.

Niedawno, metoda optoDroplet, technika optogenetyczna oparta na Cryptochrome 2, która pozwala na modulację interakcji białko-białko za pomocą światła, została opracowana w celu wywołania przejścia fazowego białek za pomocą IDRs11. Ponieważ technika ta została z powodzeniem rozszerzona na TDP-43, zaczęła odkrywać mechanizmy leżące u podstaw patologicznej przemiany fazowej TDP-43 i związanej z nią cytotoksyczności12,13,14,15. W tym protokole przedstawiamy metodę genetyczną dostarczania optogenetycznego TDP-43 do typów komórek wrażliwych na ALS, a mianowicie rdzeniowych neuronów ruchowych u danio pręgowanego przy użyciu BAC dla genu mnr2b / mnx2b kodującego białko homeodomenowe dla specyfikacji neuronów ruchowych16,17. Wysoka przezierność larw danio pręgowanego pozwala na prostą, nieinwazyjną stymulację światłem optogenetycznego TDP-43, która wyzwala jego przejście fazowe w rdzeniowych neuronach ruchowych. Przedstawiamy również podstawowy przebieg pracy do obrazowania na żywo neuronów ruchowych rdzenia danio pręgowanego oraz analizę obrazu przy użyciu ogólnodostępnego oprogramowania Fiji/ImageJ w celu scharakteryzowania reakcji optogenetycznego TDP-43 na stymulację światłem. Metody te pozwalają na badanie przejścia fazowego TDP-43 w środowisku komórkowym wrażliwym na ALS i powinny pomóc w zbadaniu jego patologicznych konsekwencji na poziomie komórkowym i behawioralnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie prace nad rybami zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (numer identyfikacyjny zatwierdzenia 24-2) Narodowego Instytutu Genetyki (Japonia), który posiada Gwarancję Dobrostanu Zwierząt Zwierząt Naukowych (numer gwarancji A5561-01) w Biurze Dobrostanu Zwierząt Laboratoryjnych Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH, Stany Zjednoczone).

1. Budowa BAC do ekspresji optogenetycznego genu TDP-43 z promotora mnr2b

  1. Przygotowanie BAC
    1. Zakup klonu BAC danio pręgowanego zawierającego locus mnr2b zebry (CH211-172N16, BACPAC Genomics). Oczyść DNA BAC z 5 ml nocnej kultury LB DH10B Escherichia coli (E. coli) zawierającej CH211-172N16, jak opisano w Warming et al.18.
    2. Przekształć CH211-172N16 w komórki SW102 E. coli za pomocą elektroporacji, jak opisano w Warming et al.18.
      UWAGA: Oczyszczanie DNA BAC z E. coli w tym samym dniu elektroporacji zwykle daje wyższy wskaźnik powodzenia transformacji BAC18. W przeciwnym razie oczyszczone DNA BAC utrzymuje się w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
    3. Wprowadzić kasetę iTol2-amp do transgenezy BAC za pośrednictwem transpozonu Tol219 do szkieletu CH211-172N16 za pomocą elektroporacji, zgodnie z opisem w Asakawa et al.20.
      1. Wykonać zapas glicerolu klonów komórek E. coli przenoszących CH211-172N16 z integracją kasety iTol2-amp (CH211-172N16-iTol2A) po potwierdzeniu integracji za pośrednictwem homologicznej integracji za pośrednictwem rekombinacji w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) (Ex Taq) przy użyciu pary starterów Tol2-L-out (5'-AAA GTA TCT GGC TAG AAT CTT ACT TGA-3') i pTARBAC-13371r (5'-TAG CGG CCG CAA ATT TAT TA-3') i spełnione są następujące warunki: etap denaturacji w temperaturze 98 °C przez 1 minutę, po którym następuje 25 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 10 s, wyżarzanie startera w temperaturze 55 °C przez 15 s i przedłużanie startera w temperaturze 72 °C przez 1 minutę, wzmacniając produkt PCR składający się z 354 par zasad (bp).
  2. Mnr2B-HS: Konstrukcja opTDP-43h
    1. Skonstruuj plazmid przenoszący kasetę ekspresyjną dla ludzkiego dzikiego typu TDP-43/TARDBP (TDP-43h), który jest oznaczony mRFP1 i CRY2olig odpowiednio na końcach N i C (dalej opTDP-43h)14.
      UWAGA: Fragment opTDP-43h powinien być otoczony sekwencją promotora genu zebry hsp70l (650 bp) i sekwencją sygnałową poliadenylacji (poliA), a następnie genem oporności na kanamycynę (hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan)14.
    2. Amplifikuj kasetę hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan starterami, które wyżarzają hsp70l i Kan i zawierają 45 sekwencji pz kodonów inicjujących gen mnr2b metodą PCR (polimeraza GXL DNA) przy użyciu pary starterów mnr2b-hspGFF-Forward (5'-tat cag cgc aat tac ctg caa ctc taa aca caa caa caa aag tgt tgc aGA ATT CAC TGG AGG CTT CCA GAA C-3') i Km-r (5'-ggt tct tca gct aaa agg gcg tcg atc ctg aag ttc ttt gac ttt tcc atC AAT TCA GAA GAA CTC GTC AAG AA-3') z następującymi warunkami: etap denaturacji w temperaturze 98 °C przez 1 minutę, po którym następuje 30 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 10 s, wyżarzanie podkładu w temperaturze 55 °C przez 15 s, i wydłużenie startera w temperaturze 68 °C przez 30 s, wzmacniając produkt PCR o ~5,7 pz.
    3. Oddzielić produkty PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (100 V) i oczyścić prążek DNA hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan za pomocą kolumny DNA. Dostosuj stężenie oczyszczonej kasety hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan do 50 ng/μL w buforze Tris-EDTA (TE) zawierającym 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) i 1 mM EDTA.
    4. Wprowadzić kasetę hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan do CH211-172N16-iTol2A za pomocą elektroporacji, jak opisano w Warming et al.18 i wybrać transformanty odporne na ampicylinę i kanamycynę na płytkach agarowych LB. CH211-172N16-iTol2A przenoszący kasetę hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan jest oznaczony jako mnr2b-hs:opTDP-43h.
    5. Oczyść mnr2b-hs:opTDP-43h za pomocą zestawu do oczyszczania BAC i rozpuść go w 250 ng / μL w TE po ekstrakcji fenolem / chloroformem.
  3. mnr2b-hs:Konstrukcja EGFP-TDP-43z
    1. Skonstruuj inny plazmid przenoszący tardbp danio pręgowanego typu dzikiego, który jest oznaczony wzmocnionym białkiem zielonej fluorescencji (EGFP) na jego N-końcu (EGFP-TDP-43z) zamiast opTDP-43h, ale poza tym jest identyczny z konstruktem hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan (hsp70l-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan)14. Użyj EGFP-TDP-43z jako wewnętrznej kontroli stymulacji świetlnej opTDP-43h.
    2. Skonstruuj CH211-172N16-iTol2A zawierającą kasetę hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan w locus mnr2b, jak opisano w 1.2.1-1.2.5. CH211-172N16-iTol2A przenoszący kasetę hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan jest oznaczony jako mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z.

2. Transgeneza BAC za pośrednictwem transpozonu Tol2 u danio pręgowanego

  1. Przygotować roztwór do wstrzykiwań zawierający 40 mM KCl, czerwień fenolową (10% v/v), 25 ng/μL DNA mnr2b-hs:opTDP-43h i 25 ng/μL transpozazy Tol2 mRNA19.
  2. Wstrzyknąć 1 nl roztworu do wstrzykiwań (kropla o średnicy około 123 μm skalibrowana w oleju mineralnym) do cytozolu zarodków danio pręgowanego typu dzikiego w stadium jednokomórkowym. Przebadaj wstrzyknięte ryby pod kątem tworzenia agregatów dodatnich dla czerwonego białka fluorescencyjnego (RFP) w różnych tkankach embrionalnych, w tym neuronach ruchowych rdzenia, pod stereomikroskopem fluorescencyjnym 2-3 dni po zapłodnieniu (dpf). Wychowaj rybę z pozytywnym wynikiem RFP do dorosłości.
  3. Wstrzyknąć DNA mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z zgodnie z opisem w 2.1 i 2.2. Wychowuj ryby z dodatnim EGFP do dorosłości.
  4. Po kilku miesiącach umieść dojrzałe płciowo wstrzyknięte ryby i ryby typu dzikiego w parach w standardowych klatkach godowych o pojemności 2 litrów, aby uzyskać potomstwo F1. Przesiewaj ryby F1 przy 3 dpf pod kątem fluorescencji RFP (opTDP-43h) lub EGFP (EGFP-TDP-43z) w kręgosłupie ruchowym za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w soczewkę obiektywową Plan-Neofluar 5x/0,15. Zazwyczaj jedna ryba założycielska jest identyfikowana z 10-20 wstrzykniętych ryb (szybkość transmisji linii zarodkowej wynosi 5%-10%).
  5. Wyizoluj i porównaj wiele wkładów Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] i Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] od różnych ryb założycielskich, ponieważ intensywność, ale nie wzór, ekspresji opTDP-43h lub EGFP-TDP-43z może się różnić między rybami założycielami ze względu na efekty pozycji chromosomów.
  6. Skrzyżowanie linii rybnych Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] i Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] w celu uzyskania potomstwa zawierającego podwójnie transgeniczne ryby Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] w stosunku mendlowskim.
  7. Hoduj ryby w plastikowym naczyniu zawierającym 30 ml buforu E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mMMgSO4, 10-5% błękitu metylenowego) i dodaj 0,003% (w/v) N-fenylotiomocznika po 8-10 godzinach od zapłodnienia (hpf), aby zahamować melanogenezę.
  8. Przykryj plastikowe naczynie folią aluminiową po 30 hpf.

3. Przygotowanie LED do oświetlenia światłem niebieskim

  1. Włącz panel LED za pomocą powiązanej aplikacji zainstalowanej na tablecie/telefonie. Umieść sondę spektrometru w pustej studzience 6-dołkowej i dostosuj światło LED do długości fali, osiągając szczyt przy ~ 456 nm za pomocą aplikacji. Umieść czujnik optyczny miernika mocy optycznej w pustej studzience i wyreguluj moc światła LED (~0.61 mW/cm2). Ustawienie oświetlenia LED można zapisać i można je odzyskać w aplikacji.
  2. Wprowadzić ustawienie naczynia/panelu LED do inkubatora w temperaturze 28 °C. Zakończ ten krok, zanim rozpocznie się obrazowanie ryb przy 48 hpf.

4. Obrazowanie larw danio pręgowanego wyrażających optogenetyczne TDP-43

  1. Wybierz podwójnie transgeniczne ryby Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] podwójnie transgeniczne ryby co najmniej przed 47 hpf, na podstawie fluorescencji RFP (opTDP-43h) lub EGFP (EGFP-TDP-43z) w kręgosłupie ruchowym przy użyciu zestawu mikroskopu epifluorescencyjnego opisanego powyżej.
  2. Dechorionacja podwójnie transgenicznych ryb Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z].
  3. Rozgrzej 1% agarozę o niskiej temperaturze topnienia zawierającą 250 μg/ml soli metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu w temperaturze 42 °C.
  4. Krótko znieczulić podwójnie transgeniczne ryby Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] podwójnie transgeniczne ryby w temperaturze 48 hpf w buforze E3 zawierającym to samo stężenie trikanu.
  5. Umieść kroplę podgrzanej 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia na szklanym naczyniu w temperaturze pokojowej. Średnica kropli agarozy w kształcie kopuły na szklanym naczyniu wynosi 8-10 mm.
  6. Za pomocą pipety Pasteura dodaj znieczuloną rybę do agarozy o niskiej temperaturze topnienia na szklanym naczyniu, a następnie wymieszaj, pipetując kilka razy. Zminimalizuj ilość buforu E3 dodawanego do agarozy wraz z rybą.
  7. Utrzymuj rybę na boku, używając igły strzykawkowej podczas krzepnięcia agarozy (zwykle ~1 min), aby upewnić się, że rdzeń kręgowy znajduje się w odpowiedniej pozycji poziomej. Po zestaleniu się umieść kilka kropli buforu E3 na rybę w kształcie kopuły zamontowaną na agarozie.
  8. Uzyskaj szeregowe konfokalne przekroje z rdzenia kręgowego, skanując za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w soczewkę obiektywową z 20-krotnym zanurzeniem w wodzie o aperturze numerycznej 1,00, przy użyciu prędkości skanowania 4,0 μs na piksel (12 bitów na piksel), wielkości kroku 1,0 μm na wycinek dla obiektywu oraz kombinacji długości fal wzbudzenia/emisji: Kanał 1) 473/510 nm dla EGFP i kanał 2) 559/583 nm dla mRFP1.
    UWAGA: Kloaka po brzusznej stronie ryby jest zawarta w obszarach zainteresowania (ROI) jako odniesienie, co pomaga zidentyfikować i porównać segmenty kręgosłupa (poziomy 16-17) w punktach czasowych.
  9. Usuń rybę z agarozy, ostrożnie rozbijając agarozę igłą strzykawki, jak tylko obrazowanie zostanie zakończone. Utrzymuj jak najkrótszy czas, w którym ryba jest osadzona w agarozie, chociaż osadzanie agarozy przez <30 minut nie wpływa na żywotność ryby.

5. Stymulacja świetlna ryb wyrażających opTDP-43h poprzez oświetlenie polowe niebieskiej diody elektroluminescencyjnej (LED)

  1. Dodaj 7,5 ml buforu E3 do studzienki i umieść w studzience podwójnie transgeniczne ryby Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]. Umieść sześciodołkowe naczynie na panelu LED, trzymając naczynie i panel LED w odległości 5 mm od siebie za pomocą przekładki (na przykład z pięcioma przesuwanymi szklankami ułożonymi jeden na drugim).
  2. Włącz niebieską diodę LED. Trzymaj część podwójnie transgenicznych ryb Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] podwójnie transgenicznych ryb w oddzielnym sześciodołkowym naczyniu przykrytym folią aluminiową, gdy konieczne jest nieoświetlone ryby kontrolne (tj. w ciemnych warunkach)14.
  3. Po naświetleniu (np. przez 24 godziny przy 72 hpf w Rysunek 3), zobrazuj rdzeń kręgowy oświetlonej ryby, powtarzając kroki 4.3 - 4.9.

6. Wizualizacja cytoplazmatycznego przemieszczania optogenetycznego TDP-43 w rdzeniowych neuronach ruchowych

  1. Otwórz plik obrazu w ImageJ/Fiji21 (Wersja: 2.1.0/1.53c), programie do przetwarzania obrazów Java o otwartym kodzie źródłowym opracowanym przez NIH Image, który można pobrać z https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. Użyj paska przewijania Z, aby poruszać się po płaszczyznach ogniskowych. Utwórz projekcję maksymalnej intensywności wielu plasterków, klikając Obraz | Stosy | Projekt Z | Maksymalna intensywność i ustawienie Plaster początkowy i plasterek końcowy, które obejmują półsegmenty kolumny motorycznej kręgosłupa.
  3. Podziel obraz wielokanałowy na dwa obrazy jednokanałowe, klikając Obraz | Kolor | Podziel kanały.
  4. Wzmocnij sygnał EGFP-TDP-43z, aby upewnić się, że cytoplazmatyczny EGFP-TDP-43z jest wyraźnie widoczny, klikając Obraz | Dostosuj | Jasność/Kontrast i regulacja Minimum
  5. Otwórz menedżera ROI, klikając pozycję Analizuj | Narzędzia | Menedżer zwrotu z inwestycji. Znajdź komórki, które można zidentyfikować na obu obrazach przy 48 hpf i 72 hpf, na podstawie względnych pozycji ciał komórek. Ustaw ROI, obrysowując kontury ciał komórkowych pojedynczych rdzeniowych neuronów ruchowych wizualizowanych przez sygnał EGFP-TDP-43z za pomocą wyborów odręcznych, a następnie klikając przycisk Dodaj [t] w menedżerze ROI.
  6. Ustaw główną oś somy, rysując linię prostą za pomocą opcji Prosta i klikając Analizuj | Profil wykresu dla obrazów EGFP-TDP-43z (C1) i opTDP-43h (C2) przy 48 i 72 hpf.
  7. Znormalizuj profil wykresu, dzieląc wartości przez największą wartość dla każdego sygnału EGFP-TDP-43z i opTDP-43h. Wykreśl znormalizowane wartości za pomocą współrzędnych x-y, gdzie x i y reprezentują odpowiednio główną oś somy i względne natężenia fluorescencji, używając wykresu XY w oprogramowaniu statystycznym.

7. Porównanie ratiometryczne między sygnałami opTDP-43h i EGFP-TDP-43z przy użyciu ImageJ/Fiji

  1. Otwórz plik obrazu w ImageJ/Fiji i ustaw ROI dla pojedynczych komórek mnr2b-dodatnich, używając obrazu projekcji o maksymalnej intensywności EGFP-TDP-43z, jak w 6.1-6.5. Dodaj ROI poza brzusznym rdzeniem kręgowym (np. struna grzbietowa), aby reprezentować sygnał tła (ROI tła).
  2. Dla każdego obrazu EGFP-TDP-43z i opTDP-43 utwórz projekcję wielu plasterków, klikając Obraz | Stosy | Projekt Z | Sumuj wycinki i ustaw wycinek początkowy i plasterek stop, które obejmują kolumnę motoryczną połowiczą.
  3. Otwórz menedżera ROI utworzonego z obrazem projekcji o maksymalnej intensywności. Wyświetl ROI na obrazie Sum Slices, wybierając okno obrazu dla EGFP-TDP-43z, a następnie klikając przycisk Pokaż wszystko w menedżerze ROI. Kliknij opcję Zmierz w menedżerze zwrotu z inwestycji, aby uzyskać średnie wartości dla każdego zwrotu z inwestycji.
  4. Uzyskać średnie wartości dla opTDP-43h zgodnie z tą samą procedurą, która została opisana w ppkt 7.3.
  5. Dla każdego ROI, po odjęciu średniej dla tła ROI, podziel odjętą średnią dla opTDP-43h przez odjętą średnią dla EGFP-TDP-43z, aby uzyskać wartość ratiometryczną. Wartości ratiometryczne można porównywać między różnymi punktami czasowymi i prezentować za pomocą wykresu kolumnowego w oprogramowaniu Prism.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Obrazowanie na żywo białek TDP-43 optogenetycznych i nieoptogenetycznych w mnr2b+ neuronach ruchowych rdzenia kręgowego larw ryb zebrafish
Aby wywołać przejście fazowe TDP-43 w neuronach ruchowych rdzenia kręgowego ryb zebrafish, skonstruowano ludzkie białko TDP-43h, znakowane mRFP1 i CRY2olig22 odpowiednio na N- i C-końcu, i określono je jako opTDP-43h14 (Ryc. 1A). Fragment genu o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ekspresja opTDP-43h i EGFP-TDP-43z za pośrednictwem mnr2b-BAC u danio pręgowanego zapewnia wyjątkową możliwość obrazowania na żywo przejścia fazowego TDP-43 w neuronach ruchowych rdzenia. Przezroczystość optyczna tkanek ciała larw danio pręgowanego pozwala na prostą i nieinwazyjną stymulację optogenetyczną opTDP-43h. Porównania między pojedynczymi neuronami ruchowymi rdzenia kręgowego w czasie wykazały, że zależna od światła oligomeryzacja opTDP-43h powoduje jego cytoplazmatyczne grupowanie, co przypomina patolo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

KA i KK są wynalazcami własności intelektualnej opisanej w tym manuskrypcie, a tymczasowe patenty zostały złożone przez National Institute of Genetics.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant numery JP19K06933 (KA) i JP20H05345 (KA).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskop konfokalnyOlympusFV1200
Mikroskop epifluorescencyjnyZEISSAxioimager Z1
Stereoskop fluorescencyjnyLeicaMZ16FA
Szklana podstawaIWAKI3910-035
PanelMEECN-25C
Nanoleaf LimitedZestaw Nanoleaf AURORA smarter
Mupid-2plusTAKARAAD110
NucleoBond BAC100MACHEREY-NAGEL740579
NuSieve GTG AgarozaLONZA50181
Soczewka obiektywowaOlympusXLUMPlanFL N 20×/1.00
Soczewka obiektywowaZEISSPlan-Neofluar 5x/0.15
Miernik mocy optycznejHIOKI3664
Czujnik optycznyHIOKI9742-10
Roztwór czerwieni fenolowej 0,5%MerckP0290-100ML
Polimeraza DNA PrimeSTAR GXLTAKARAR050A
żeluQiagen28704
Naczynie sześciodołkoweFALCON353046
Sonda spektrometryczna BLUE-WaveStellerNet Inc.VIS-50
Igła strzykawkowaTERUMONN-2725R
TaKaRa Ex TaqTAKARARR001A
TricaneSigma-AldrichA5040
Danio pręgowany klon BAC CH211-172N16BACPAC GenomicsCH211-172N16
Inkubator LED QIAquick Zestaw do ekstrakcji

Bibliografia

  1. Brangwynne, C. P. Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles. Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).
  2. Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 39-58 (2014).
  3. Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair rna metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106 (3), 404-420 (2020).
  4. Nedelsky, N. B., Taylor, J. P. Bridging biophysics and neurology: aberrant phase transitions in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 15 (5), 272-286 (2019).
  5. Ramaswami, M., Taylor, J. P., Parker, R. Altered ribostasis: RNA-protein granules in degenerative disorders. Cell. 154 (4), 727-736 (2013).
  6. Nguyen, H. P., Van Broeckhoven, C., vander Zee, J. ALS genes in the genomic era and their implications for FTD. Trends in Genetics. 34 (6), 404-423 (2018).
  7. Pakravan, D., Orlando, G., Bercier, V., Van Den Bosch, L. Role and therapeutic potential of liquid-liquid phase separation in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Molecular Cell Biology. 13 (1), 15-28 (2021).
  8. Santamaria, N., Alhothali, M., Alfonso, M. H., Breydo, L., Uversky, V. N. Intrinsic disorder in proteins involved in amyotrophic lateral sclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (7), 1297-1318 (2017).
  9. Lagier-Tourenne, C., Cleveland, D. W. Rethinking ALS: the FUS about TDP-43. Cell. 136 (6), 1001-1004 (2009).
  10. Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Multi-phaseted problems of TDP-43 in selective neuronal vulnerability in ALS. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (10), 4453-4465 (2021).
  11. Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optodroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
  12. Zhang, P., et al. Chronic optogenetic induction of stress granules is cytotoxic and reveals the evolution of ALS-FTD pathology. Elife. 8, 39578(2019).
  13. Mann, J. R., et al. RNA Binding Antagonizes Neurotoxic Phase Transitions of TDP-43. Neuron. 102 (2), 321-338 (2019).
  14. Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Optogenetic modulation of TDP-43 oligomerization accelerates ALS-related pathologies in the spinal motor neurons. Nature Communications. 11 (1), 1004(2020).
  15. Otte, C. G., et al. Optogenetic TDP-43 nucleation induces persistent insoluble species and progressive motor dysfunction in vivo. Neurobiology of Disease. 146, 105078(2020).
  16. Wendik, B., Maier, E., Meyer, D. Zebrafish mnx genes in endocrine and exocrine pancreas formation. Developmental Biology. 268 (2), 372-383 (2004).
  17. Seredick, S. D., Van Ryswyk, L., Hutchinson, S. A., Eisen, J. S. Zebrafish Mnx proteins specify one motoneuron subtype and suppress acquisition of interneuron characteristics. Neural Development. 7, 35(2012).
  18. Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Research. 33 (4), 36(2005).
  19. Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6 (12), 1998-2021 (2011).
  20. Asakawa, K., Abe, G., Kawakami, K. Cellular dissection of the spinal cord motor column by BAC transgenesis and gene trapping in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, 100(2013).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nature Communications. 5, 4925(2014).
  23. Asakawa, K., Kawakami, K. Protocadherin-mediated cell repulsion controls the central topography and efferent projections of the abducens nucleus. Cell Reports. 24 (6), 1562-1572 (2018).
  24. Redchuk, T. A., et al. Optogenetic regulation of endogenous proteins. Nature Communications. 11 (1), 605(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przej cie fazowe TDP 43optogenetyczne TDP 43agregacja bia ektransgeneza BACmikroskopia konfokalnastymulacja wiat em niebieskimagregacja cytoplazmatycznastwardnienie zanikowe boczne
Optogenetyczne przejście fazowe TDP-43 w rdzeniowych neuronach ruchowych larw danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.