Artykuł metodologiczny

Kinetx: Połączone oprogramowanie do oznaczania i analizy cytometrii przepływowej do ilościowego pomiaru i kategoryzacji aktywacji płytek krwi w czasie rzeczywistym.

3.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62947

⸱

7 października 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1ICMR, School of Biological Sciences, University of Reading, 2Institute of Cardiovascular Sciences, University of Birmingham

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Płytki krwi reagują szybko na różne bodźce. W artykule opisano test funkcji płytek krwi oparty na cytometrii przepływowej w czasie rzeczywistym oraz nowo opracowane oprogramowanie typu open source (Kinetx), które umożliwia ilościowe pomiary kinetyczne uwalniania granulek płytek krwi, wiązania fibrynogenu i wewnątrzkomórkowego przepływu wapnia.

Streszczenie

Płytki krwi reagują szybko na uszkodzenie naczyń krwionośnych i ulegają aktywacji w odpowiedzi na szereg bodźców, aby ograniczyć utratę krwi. Wiele testów czynnościowych płytek krwi mierzy odpowiedź punktu końcowego po określonym czasie, a nie szybkość aktywacji płytek krwi. Jednak szybkość, z jaką płytki krwi przekształcają bodźce zewnątrzkomórkowe w odpowiedź funkcjonalną, jest istotnym czynnikiem określającym, jak skutecznie mogą reagować na uraz, wiązać się z tworzącą się skrzepliną i sygnalizować rekrutację innych płytek krwi. W tym artykule opisano test funkcji płytek krwi oparty na cytometrii przepływowej, który umożliwia jednoczesne pozyskiwanie danych i stymulację próbki oraz wykorzystuje nowo opracowane oprogramowanie typu open source (Kinetx) w celu umożliwienia ilościowych pomiarów kinetycznych uwalniania granulek płytek krwi, wiązania fibrynogenu i wewnątrzkomórkowego strumienia wapnia. Kinetix został opracowany w celu umożliwienia użytkownikom zmiany parametrów, takich jak stopień wygładzenia, identyfikacja odległych punktów danych czy skale czasowe. Aby pomóc użytkownikom niezaznajomionym ze środowiskiem R, analizę danych Kinetix można wykonać za pomocą jednego polecenia. Razem pozwala to na dokładny i powtarzalny pomiar i kategoryzację wskaźników aktywacji płytek krwi w czasie rzeczywistym, takich jak szybkość, przyspieszenie, czas do osiągnięcia szczytu stężenia wapnia oraz jakościowe zmiany kształtu. Pomiary kinetyczne aktywacji płytek krwi dają unikalny wgląd w zachowanie płytek krwi podczas pierwszych etapów aktywacji i mogą dostarczyć metody przewidywania rekrutacji płytek krwi do tworzącej się skrzepliny.

Wprowadzenie

Płytki krwi odgrywają kluczową rolę w hemostazie i generują szybką i wieloaspektową odpowiedź na uszkodzenie naczyniowe1,2. Obecne testy czynnościowe płytek krwi mierzą różne aspekty reaktywności płytek krwi, reprezentatywne dla ich działania hemostatycznego in vivo. Tradycyjnie, czynność płytek krwi była oceniana za pomocą testów końcowych, które mierzą wiązanie fibrynogenu, uwalnianie granulek lub agregację płytek krwi w płytkach krwi stymulowanych wystarczająco długo, aby osiągnąć maksymalną aktywację3,4. Testy te nie uwzględniają czasu potrzebnego płytkom krwi na przekształcenie bodźców zewnątrzkomórkowych w sygnały wewnątrzkomórkowe i strumień wapnia, a następnie degranulację i związanie się z rosnącą skrzepliną. Krew przepływa z szybkością ścinania do 20 dyn/cm3 w żyłach i 80 dyn/cm3 w dużych tętnicach5, podkreślając potrzebę przeciwdziałania temu szybkiemu przepływowi przez płytki krwi poprzez wykrywanie, przetwarzanie i szybkie reagowanie na bodźce zewnątrzkomórkowe, aby związać się w tworzącą się skrzeplinę i wspierać jej ciągły wzrost.

Szybkość aktywacji płytek krwi może się różnić niezależnie od maksymalnego zakresu aktywacji płytek krwi. Kinaza związana z integrynami (ILK) jest białkiem zaangażowanym w regulację integryn β1 i β3 w płytkach krwi6,7. Hamowanie lub swoista delecja ILK in vivo wykazała, że szybkość, ale nie maksymalny zakres aktywacji płytek krwi, była zaburzona przy braku funkcjonalnego ILK8. Różnice między szybkością agregacji a maksymalnym poziomem agregacji zidentyfikowano również u myszy z niedoborem CALDAG GEFI9,10, cząsteczki sygnałowej zaangażowanej w regulację sygnalizacji inside-out za pośrednictwem RAP111.

Te wyniki pokazują, że częstość płytek krwi i maksymalne poziomy aktywacji mogą być autonomiczne, a pomiary maksymalnej aktywacji mogą nie opisywać zachowania płytek krwi do tego momentu. Te różnice w czasie potrzebnym do aktywacji płytek krwi mogą głęboko wpływać na ich początkowe wiązanie z rosnącym skrzepliną, wpływając na architekturę i ogólny rozmiar skrzepliny. Te różnice między częstością płytek krwi a maksymalną aktywacją podkreślają potrzebę przeprowadzenia testu w celu dokładnego pomiaru szybkości aktywacji płytek krwi i mogą być wykorzystane do wykrywania wariancji w populacji.

Ten artykuł opisuje metodę, która dokładnie mierzy aktywację płytek krwi i strumień wapnia w czasie rzeczywistym oraz oblicza szereg wskaźników, w tym szybkość, przy której płytki krwi stają się aktywowane i czas potrzebny płytkom krwi do osiągnięcia maksymalnej szybkości aktywacji i maksymalnego strumienia wapnia. Te kinetyczne pomiary aktywacji płytek krwi dają lepszy wgląd w zachowanie płytek krwi podczas pierwszych etapów tworzenia skrzepliny i zapewniają metodę przewidywania, jak szybko płytki krwi mogą zostać zrekrutowane do tworzącej się skrzepliny.

Protokół

Ten protokół wykorzystywał ludzką krew pełną i płytki krwi od zdrowych dawców, którzy nie mieli żadnych podstawowych schorzeń i nie przyjmowali żadnych leków, o których wiadomo, że zakłócają funkcję płytek krwi, po pisemnej świadomej zgodzie i został zatwierdzony przez Komitet Etyki Badań Uniwersytetu w Reading.

1. Pobieranie krwi i przygotowanie osocza bogatopłytkowego

  1. Zebrać krew obwodową w urządzeniu próżniowym zawierającym 3,2% cytrynian sodu
  2. Wyrzuć pierwsze 3 ml.
  3. Pozostawić krew w temperaturze 30 °C na 30 minut przed odwirowaniem.
  4. Przygotować osocze bogatopłytkowe (PRP) przez odwirowanie przy 140 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej przed inkubacją w temperaturze 37 °C przez czas trwania testu, który zakończył się w ciągu 60 minut od odwirowania.

2. Przygotowanie instrumentu

UWAGA: Bezciśnieniowy system fluidyki jest niezbędny do cytometrii przepływowej w czasie rzeczywistym, ponieważ płytki krwi są stymulowane jednocześnie, gdy cytometr przepływowy rejestruje zdarzenia.

  1. Użyj bezciśnieniowego cytometru przepływowego, aby przeprowadzić cytometrię przepływową w czasie rzeczywistym.
  2. Aby przeprowadzić test w temperaturze 37 °C, należy przymocować do stolika matę do preparowania myszy, aby umieścić na niej 96-dołkową płytkę. Podgrzewać matę do temperatury 37 °C na czas trwania próby.
  3. Umieścić 96-dołkową płytkę na wierzchu podgrzewanej maty, aby umożliwić ciągłą inkubację w temperaturze 37 °C (Rysunek 1)

3. Przygotowanie testu

  1. Wiązanie fibrynogenu i ekspresja selektyny P
    1. Polipropylenową, 96-dołkową, okrągłodenną, niepoddawaną obróbce płytkę do mikromiareczkowania pokryć 5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w buforowanym roztworze soli fizjologicznej Hepes (HBS; 10 mM Hepes pH 7,4; 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO4·7H20) przez noc w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotować mieszaninę przeciwciał w HBS zawierającą 5 mM glukozy (HBS-G). Dodać przeciwciało antyfibrynogenowe znakowane izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) (FITC-FGN; rozcieńczenie 1:37,5 (v/v)) i anty-selektynę P znakowaną allofikocyjaniną (APC) (APC-CD62P; rozcieńczenie 1:37,5 (v/v)) do HBS-G (końcowa objętość: 225 μl) i inkubować na 96-dołkowej płytce w temperaturze 37 °C.
    3. Bezpośrednio przed zebraniem zdarzeń dodać PRP do mieszaniny przeciwciał HBS-G w rozcieńczeniu 1:600 (v/v).
      UWAGA: Wymagana jest niewielka objętość PRP, aby zapewnić, że limit zdarzenia nie zostanie przekroczony i zmniejszyć agregację płytek krwi w próbce. Rozcieńczenie płytek krwi badano w badaniach pilotażowych i nie wpływa ono na szybkość aktywacji.
    4. Inkubować mieszaninę aktywacyjną zawierającą FITC-FGN (rozcieńczenie 1:37,5 (v/v)) i APC-CD62P (rozcieńczenie 1:37,5 (v/v)) i agonistę w temperaturze 37 °C. Do agonistów należą: trombina (thr; 0,0012-1 U/ml) w obecności peptydu Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP; 1,18 mM), peptyd kolagenu usieciowanego (CRP-XL; 0,004-10 μg/ml), difosforan adenozyny (ADP; 0,04-4 μM), epinefryna (epi; 20-200 μM), 9,11-Dideoksy-11α,9α-epoksymetaprostaglandyna F2α (U46619; 0,02-5 μM) oraz peptyd aktywujący receptor trombiny 6 (TRAP-6; 0,04-10 μM).
  2. Strumień wapnia
    UWAGA: Ten test został przeprowadzony przy użyciu komercyjnego zestawu do oznaczania wapnia (tabela materiałów)
    1. Pokryć polipropylenową, 96-dołkową, okrągłodenną, niepoddaną obróbce płytkę do mikromiareczkowania 5% BSA w buforowanym roztworze soli fizjologicznej Hepes przez noc w temperaturze 4 °C.
    2. Aby przygotować barwnik do oznaczania wapnia, dodaj 100 ml buforu do oznaczania wapnia i 2 ml roztworu podstawowego probenecydu (250 mM) do jednej butelki odczynnika wapniowego, aby uzyskać 2x roztwór ładujący odczynnik wapniowy.
    3. Aby przygotować Fluo-4/HBS-G, rozcieńczyć barwnik wapniowy HBS-G w stosunku 1:1, przefiltrować przez filtr 0,22 μM. Dodać 225 μl Fluo-4/HBS-G do odpowiednich studzienek 96-dołkowej płytki w temperaturze 37 °C.
    4. Inkubować PRP w temperaturze 37 °C przez 30 minut w rozcieńczeniu 1:1 z Fluo-4/HBS-G.
    5. Przygotować mieszaninę aktywacyjną w Fluo-4/HBS-G i inkubować w temperaturze 37 °C. Do agonistów należą: trombina (1 U/ml) w obecności GPRP, CRP-XL (0,5 μg/ml), ADP (1 μM), epinefryna (20 μM), U46619 (1 μM) i TRAP-6 (1 μM).
    6. Bezpośrednio przed pobraniem roztworów dodać PRP/Fluo-4/HBS-G do 225 μl mieszaniny Fluo-4/HBS-G w końcowym rozcieńczeniu PRP (po dodaniu agonisty) 1: 600 (v/v; 0,5 ml w 300 ml końcowej objętości).

4. Procedura testowa i zbieranie danych

  1. Ustaw cytometr przepływowy na natężenie przepływu na "wolne" ze średnią liczbą 1000 zdarzeń na sekundę (eps) i maksimum 3000 eps. Ustaw próg na 20000, aby uniknąć rejestrowania zanieczyszczeń komórek.
  2. Bramka populacji płytek krwi za pomocą wykresów rozproszenia do przodu (FSC) i rozproszenia bocznego (SSC). W celu zebrania danych należy wykreślić FSC-A w stosunku do SSC-A, aby dokładnie zabramować populację płytek krwi oraz FL1 lub FL4 w funkcji czasu, aby zarejestrować zdarzenia fluorescencyjne w czasie.
  3. Cytometr przepływowy potrzebuje 14 s, aby rozpocząć rejestrowanie zdarzeń; po tym pozwól instrumentowi rejestrować zdarzenia w każdym dołku przez kolejne 5 sekund, zanim szybko dodasz 75 μl mieszanki aktywacyjnej za pomocą końcówki ładującej żel, aby zapewnić spontaniczne mieszanie (Rysunek 1).
  4. Zbieraj zdarzenia przez 5 minut i ustaw wykresy tak, aby rejestrować kanał 488 (FL1; filtr 533/30 - FITC-fibrynogen/FLUO-4) w funkcji czasu i kanał 633 (filtr FL4; 675/25 - wybór APC-P) w funkcji czasu.
  5. Zapisz dane wykresu dla kanałów 488 i 633 z każdej studni jako pliki CSV.

5. Analiza danych

  1. Pobierz najnowszą wersję Kinetx12.
    UWAGA: Plik do pobrania zawiera cały kod wymagany do analizy danych wygenerowanych z testu i towarzyszy mu zestaw testowy danych eksperymentalnych od dziesięciu dawców i wyników wygenerowanych w wyniku ich analizy (wyniki te można ponownie wygenerować i zwalidować za pomocą następujących procedur) (Rysunek 2).
  2. Konfigurowanie środowiska języka R
    1. Użyj języka programowania R za pośrednictwem środowiska RStudio. Zainstaluj R13, RStudio14 oraz następujące pakiety: ggplot2, dplyr, plotrix, minpack.lm, tidyverse, psych. Upewnij się, że wszystkie pakiety wymagań wstępnych zostały pomyślnie zainstalowane.
    2. Utwórz metadane: Umieść plik tekstowy (o nazwie wellData.txt) w tym samym katalogu co dane. Opisuje agonistów, ich stężenia, wszelkie przeciwciała oraz test (funkcję lub wapń) używany do generowania każdego pliku CSV.
    3. Umieść drugi plik tekstowy ("IsotypeData.txt") w tym samym katalogu i zdefiniuj izotypy. Pliki udostępnione w pliku do pobrania ("data/wellData.txt" i "data/IsotypeData.txt") mogą pełnić rolę szablonu, który można łatwo dostosować do alternatywnych agonistów, inhibitorów i stężeń.
    4. Analizuj dane: Kinetx składa się z trzech funkcji zdefiniowanych w krokach 5.2.5-5.2.7.
    5. kinetxProcess.R: Ta funkcja przetwarza surowe dane z funkcjonalnej cytometrii przepływowej. Aby uruchomić, wpisz kinetxProcess('lokalizacja danych','gdzie umieścić wyjścia','FL1' (dla FITC-anty-fibrynogenu lub 'FL4' (dla APC-CD62P)
    6. kinetxProcessCalcium.R: Ta funkcja analizuje i oznacza dane dotyczące strumienia wapnia. Aby uruchomić, wpisz kinetxProcessCalcium('lokalizacja danych','gdzie umieścić wyjścia','FL1')
    7. kinetxSummary.R: Ta funkcja podsumowuje dane. Aby uruchomić, wpisz kinetxSummary('lokalizacja danych','gdzie umieścić wyjścia','FL1').
    8. Aby uruchomić wszystkie powyższe funkcje (5.2.5-5.2.7) na danych testowych, użyj skryptu (test. R).
      UWAGA: Pierwsze dwie funkcje generują liczby dla każdego dawcy, które pokazują surowe dane oraz dopasowane krzywe. Wszystkie dane wyjściowe i arkusz kalkulacyjny, który podsumowuje dane, są umieszczane w lokalizacji wyjściowej.

Wyniki

Analiza funkcjonalnej cytometrii przepływowej w czasie rzeczywistym ujawnia różnice w kształcie krzywych aktywacji pomiędzy agonistami oraz pomiędzy dawcami
Analiza danych funkcjonalnych (ekspresja P-selektyny i wiązanie fibrynogenu) przy użyciu oprogramowania Kinetx usuwa punkty danych wykraczające poza rozsądne zakresy (>200000 lub <1) oraz punkty <2,80 s (punkt ten zostaje ustawiony jako czas zero), normalizuje dane do mediany izotypów i dopasowuje wygładzoną krzywą średniej ruchomej (za pomocą funkcji loess). Kinetx przypisuje również metryki i kategorie na podstawie kształtu dopasowanej wygładzonej linii, wartości bezwzględnych oraz tempa zmian w następujący sposób: (1) RoC – średni wzrost wygładzonej linii w ciągu pierwszych 120 s; (2) etykieta – kategoryzuje odpowiedzi jako szybkie, średnie lub wolne, zgodnie z wartościami odcięcia 40 i 80 dla FL1 oraz 5 i 10 dla FL4; (3) EarlyRoC – średni wzrost wygładzonej linii w ciągu pierwszych 20 s; (4) kształt – niski poziom odpowiedzi, wzrostowy, liniowy lub spadkowy (Rysunek 3A) – niski poziom odpowiedzi określany jest jako FL1 < 4000 lub FL4 < 1000, natomiast etykiety wzrostowy, liniowy i spadkowy są określane na podstawie: shapeMetric – RoC(120 sekund)/EarlyRoC, gdzie kształt wzrostowy to shapeMetric >2, liniowy to shapeMetric między 0,9-2, a spadkowy to shapeMetric <0,9; (5) generuje arkusz kalkulacyjny podsumowujący dane, podając poziom i tempo zmian w 0 s, 10 s, 20 s, 30 s, 40 s, 60 s, 90 s, 120 s, 180 s, medianę izotypu, maksymalne i minimalne tempo zmian oraz przyspieszenie, a także wszystkie etykiety i kategorie.

Wiązanie fibrynogenu przez płytki krwi oraz ekspozycja P-selektyny w ciągu 5 min po aktywacji w odpowiedzi na pojedyncze stężenie agonistów takich jak ADP, TRAP-6, CRP-XL, epinefryna i U46617, zostały przeanalizowane u 30 dawców. Wskaźniki wiązania fibrynogenu i ekspozycji P-selektyny w odpowiedzi na różne agoniści wykazują znaczne zróżnicowanie w kształcie odpowiedzi (Rycina 3). Płytki krwi stymulowane TRAP-6 i ADP wykazały szybsze przyspieszenie wiązania fibrynogenu, które u wielu dawców spowolniło w późniejszych punktach czasowych (Rycina 3B). Wiązanie fibrynogenu w odpowiedzi na CRP-XL, trombinę i epinefrynę częściej wykazywało rosnące lub liniowe tempo odpowiedzi. U wielu dawców zaobserwowano stosunkowo długi czas opóźnienia dla CRP-XL, zanim tempo wiązania fibrynogenu gwałtownie przyspieszyło. Odpowiedź na U46619 była często klasyfikowana jako niska. W przeciwieństwie do tego, ekspozycja P-selektyny częściej wykazywała liniowe lub rosnące tempo odpowiedzi na wszystkie agoniści, z wyjątkiem U46619, który ponownie wykazał niski poziom odpowiedzi (Rycina 3C).

Wewnątrzkomórkowy przepływ wapnia podczas aktywacji płytek krwi można dokładnie zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej w czasie rzeczywistym
Analiza danych w teście przepływu wapnia polega na usunięciu punktów danych wykraczających poza rozsądne zakresy (< 2,80 s, przy czym ten punkt zostaje ustawiony jako czas zero), a następnie dopasowaniu wygładzonej krzywej średniej ruchomej (za pomocą funkcji loess). Oprogramowanie Kinetx przypisuje metryki, a kategorie są określane na podstawie kształtu dopasowanych linii wygładzonych, wartości bezwzględnych oraz szybkości zmian w następujący sposób: (1) kategoria – opisująca kształt odpowiedzi wapniowej na podstawie wczesnego wzrostu, maksimum oraz końcowego spadku z maksimum, określana jako liniowa, szczytowa lub utrzymująca się (Rycina 4A); (2) szybkość – opisująca tempo zmian w początkowych 30 s, definiowana jako brak zmian, wolna, średnia lub szybka (z wartościami granicznymi 10, 40 i 80). Kinetx generuje również arkusz kalkulacyjny podsumowujący dane, podając poziom i szybkość zmian w 0 s, 10 s, 20 s, 30 s, 40 s, 60 s, 90 s, 120 s, 180 s, maksymalną i minimalną szybkość zmian oraz przyspieszenie, a także wszystkie etykiety i kategorie, a ponadto tworzy wykres danych dla każdego dawcy. Przykłady przepływu wapnia zmierzonego tą metodą u 30 osób ponownie wykazały różne wzorce aktywacji w zależności od osobników i agonistów (Rycina 4B). CRP-XL wywołał głównie utrzymującą się odpowiedź wapniową, podczas gdy odpowiedź na TRAP-6 najczęściej miała charakter szczytowy. Wszystkie pozostałe agoniści wygenerowali głównie odpowiedź liniową.

Cytometria przepływowa w czasie rzeczywistym pozwala zidentyfikować różnice w maksymalnych poziomach aktywacji w odpowiedzi na różne agonisty i stężenia
Wyniki wykazują, że test cytometrii przepływowej w czasie rzeczywistym posiada zdolność do wykrywania różnic w maksymalnych poziomach wiązania fibrynogenu (Rysunek 5A) oraz ekspozycji P-selektyny (Rysunek 5D) w odpowiedzi na stymulację za pośrednictwem różnych receptorów (10 µg/mL CRP-XL vs. 3 U/mL trombiny P < 0,001; 10 µg/mL CRP-XL vs. 1 U/mL trombiny P < 0,001). Wykazują one również, że test jest czuły na różnice w stężeniu agonisty, przy czym poziomy maksymalnego wiązania fibrynogenu i ekspozycji P-selektyny wzrastają w odpowiedzi na większe stężenia agonistów (wiązanie fibrynogenu – CRP-XL – 0,004 µg/mL vs. 0,4, 5, 10 µg/mL, P < 0,01; trombina – 0,0012 U/mL vs. 1 i 3 U/mL, P < 0,01; ADP – 0,04 µg/mL vs. 1 i 4 µM, P < 0,05).

Analiza cytometryczna w czasie rzeczywistym jest wystarczająco czuła, aby wykryć zmienność w tempie aktywacji płytek między różnymi dawcami
Maksymalne tempo aktywacji płytek określono poprzez dopasowanie wygładzonej średniej ruchomej (loess) do danych fluorescencji, a następnie wykorzystanie tej metody do obliczenia maksymalnego tempa wiązania fibrynogenu i ekspozycji P-selektyny (Rycina 5B,E). Dane wykazują znaczną zmienność między poszczególnymi dawcami, a analiza cytometryczna jest wystarczająco czuła, aby wykryć tę zmienność. Wyniki wskazują, że zwiększenie stężenia agonisty ma niewielki wpływ na maksymalne tempo wiązania fibrynogenu (Rycina 5B). W przeciwieństwie do tego, maksymalne tempo ekspozycji P-selektyny wzrasta wraz z wyższym stężeniem trombiny i CRP-XL, ale nie wraz ze wzrostem stężeń ADP (Rycina 5E).

Zróżnicowanie czasu opóźnienia aktywacji płytek krwi można wykryć za pomocą cytometrii przepływowej w czasie rzeczywistym
Czas do osiągnięcia maksymalnej szybkości aktywacji płytek określono poprzez obliczenie punktów czasowych, w których osiągnięto maksymalną szybkość wiązania fibrynogenu i ekspozycji P-selektyny (Ryc. 5C,F). Maksymalna szybkość wiązania fibrynogenu i ekspozycji P-selektyny różni się w zależności od dawcy, szczególnie przy niższych stężeniach agonistów. Stymulacja płytek rosnącymi stężeniami CRP-XL wykazuje, że przy wyższych stężeniach agonistów czas osiągnięcia maksymalnej szybkości wiązania fibrynogenu jest krótszy, a zmienność między dawcami mniejsza; jednak tendencja ta nie jest obserwowana w przypadku stymulacji trombiną ani ADP (Ryc. 5C). Analiza ta wykazuje, że w niektórych okolicznościach zwiększenie stężenia agonisty skraca czas rozpoczęcia aktywacji płytek (czas opóźnienia) bez zmiany maksymalnej szybkości aktywacji płytek oraz że oba te parametry można ocenić za pomocą tej metody.

Etapy przeprowadzania cytometrii przepływowej w laboratorium: wirowanie krwi, przygotowanie testu cytometrycznego, przechowywanie danych za pomocą kodowania w języku R.
Rysunek 1: Cytometria przepływowa w czasie rzeczywistym w warunkach laboratoryjnych. (A) pełna krew z antykoagulantem została (B) odwirowana w celu uzyskania osocza bogatopłytkowego (PRP). (C) Rozcieńczone PRP zawierające odpowiednie przeciwciała lub barwniki wskaźnikowe wapnia umieszczono na płytce 96-dołkowej, wczytano do nieciśnieniowego cytometru przepływowego i utrzymywano w temperaturze 37 °C za pomocą maty sekcyjnej. Próbki stymulowano podczas akwizycji mieszanką aktywującą zawierającą przeciwciała lub barwnik wapniowy oraz agonistę, którą szybko dodawano do dołka za pomocą końcówki do nakładania żelu, aby zapewnić samoistne wymieszanie. (D) Zdarzenia zbierano przez 5 min, a następnie zapisano pliki CSV z danymi dla każdego dołka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Kodowanie cytometrii przepływowej w czasie rzeczywistym; CSV do R, analiza danych, typ odpowiedzi, kształt, diagram metryki Kintex.
Rysunek 2: Schemat analizy danych. (A) Konfigurowano środowisko R i tworzono metadane. (B) Usunięto dane odstające i dopasowano wygładzoną krzywą średniej kroczącej (loess). (C) Zdefiniowano typ odpowiedzi oraz (D) kształt odpowiedzi. (E) Obliczono metryki, wyeksportowano je i wygenerowano wykresy dla każdego dawcy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy przedstawiające wiązanie fibrynogenu i stopnie ekspozycji P-selektyny; liniowy, malejący, rosnący, niski.
Rycina 3: Reprezentatywne wyniki analizy Kinetx wiązania fibrynogenu przez płytki krwi oraz ekspresji P-selektyny w czasie rzeczywistym. (A) Oprócz dostarczania parametrów, takich jak maksymalna szybkość zmian (RoC) oraz RoC w różnych punktach czasowych, Kinetx kategoryzuje kształt krzywej, aby dostarczyć dodatkowych informacji o aktywacji płytek krwi, których trudno uchwycić za pomocą pojedynczego parametru. Reprezentatywne dane dla 30 osób pokazują typową zmienność obserwowaną w czasie rzeczywistym dla (B) wiązania fibrynogenu przez płytki krwi oraz (C) ekspresji P-selektyny w odpowiedzi na agoniści: ADP, TRAP-6, CRL-XL, epinefrynę i U46617. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wzorce przepływu wapnia; wykresy pokazujące odpowiedzi liniowe, szczytowe i trwałe; dane intensywności fluorescencji.
Rysunek 4: Reprezentatywny wynik analizy Kinetx w czasie rzeczywistym przepływu wapnia w płytkach krwi. (A) Poza dostarczaniem parametrów, takich jak maksymalna szybkość zmian (RoC) oraz RoC w różnych punktach czasowych, oprogramowanie Kinetx kategoryzuje kształt krzywej przepływu wapnia, aby dostarczyć dodatkowych informacji o aktywacji płytek, których trudno uchwycić za pomocą pojedynczego parametru. Reprezentatywne dane dla 30 osób pokazują typową zmienność obserwowaną w czasie rzeczywistym podczas (B) przepływu wapnia w płytkach krwi w odpowiedzi na agonisty ADP, TRAP-6, CRL-XL, epinefrynę i U46617. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy maksymalnej ekspozycji fibrynogenu i P-selektyny; analiza danych z testów aktywacji płytek krwi.
Rycina 5: Stężenie agonisty determinuje maksymalną aktywację płytek krwi, ale nie szybkość ich aktywacji. Maksymalna aktywacja płytek krwi – wiązanie fibrynogenu (A) lub ekspozycja P-selektyny (D) – uległa istotnej pozytywnej zmianie w zależności od stężenia agonisty (CRP-XL, trombiny lub ADP). Szybkość aktywacji płytek krwi (B i E) oraz czas do osiągnięcia maksymalnej szybkości aktywacji płytek krwi (C i F) nie wykazały związku lub wykazały słabszy związek ze zmieniającym się stężeniem agonisty. Wartości P wskazują istotność w całym zakresie stężeń (test Kruskala-Wallisa), a gwiazdki oznaczają istotną różnicę (test porównań wielokrotnych) poszczególnych wartości w stosunku do najniższego stężenia. * P < 0.05, ** P < 0.01. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Szybkość, z jaką płytki krwi wykrywają, przetwarzają i reagują na bodźce aktywujące, może być istotnym wyznacznikiem tworzenia się skrzepliny. Wcześniejsze badania wykazały, że hamowanie elementów sygnałowych, które wpływają na szybkość, ale nie na ostateczny zakres aktywacji płytek krwi, powoduje powstawanie niestabilnych skrzeplin8. Wiele testów funkcji płytek krwi mierzy zakres aktywacji i agregacji płytek krwi w odpowiedzi na różne warunki i leczenie; Nie uwzględniają one jednak szybkości, z jaką uaktywniają się płytki krwi i czasu potrzebnego do zajścia tego złożonego procesu 3,4. Opracowane tutaj innowacyjne testy oparte na cytometrii przepływowej w sposób powtarzalny monitorują aktywację płytek krwi w czasie i przekładają ją na szereg wskaźników w celu obliczenia maksymalnej szybkości aktywacji płytek krwi oraz czasu potrzebnego do osiągnięcia tej maksymalnej szybkości i pełnej aktywacji.

Przedstawione dane podkreślają zdolność testu w czasie rzeczywistym do identyfikowania różnic między różnymi reakcjami na typ i stężenie agonisty oraz między osobami. Wiele wcześniejszych doniesień wykazało, że reaktywność płytek krwi jest bardzo zmienna między zdrowymi osobami15,16, co wskazuje, że szybkość aktywacji płytek krwi może się również znacznie różnić w obrębie populacji. Dane z tego badania pokazują, że szybkość degranulacji i wiązania fibrynogenu z płytkami krwi wydaje się być jeszcze bardziej zmienna niż maksymalne poziomy aktywacji płytek krwi. Pokazuje to, że cytometria przepływowa w czasie rzeczywistym może być również wykorzystywana jako cenne i niezawodne narzędzie do identyfikacji różnic w liczbie płytek krwi w populacji i wykrywania wpływu różnych czynników hamujących lub proaktywujących na liczbę płytek krwi jako dodatkowy sposób pomiaru funkcji płytek krwi.

Gdy czynność płytek krwi jest mierzona za pomocą testów końcowych, można dokonać porównań dotyczących zakresu wiązania fibrynogenu lub uwalniania granulek między różnymi agonistami. Krzywe lessowe porównujące wiązanie fibrynogenu w ciągu pierwszych 5 minut aktywacji płytek krwi pokazują zdolność testu w czasie rzeczywistym do wydobycia większej ilości szczegółów na temat różnic w kinetyce aktywacji płytek krwi, których nie można zmierzyć w testach pojedynczego punktu końcowego.

Dane zebrane z testu w czasie rzeczywistym pokazują, że szybkość, z jaką fibrynogen wiąże się z płytkami krwi, przebiega według nieco innego wzorca, w zależności od szlaku aktywującego (ryc. 3). Aby dokładnie ocenić kinetykę aktywacji płytek krwi, konieczne jest użycie bezciśnieniowego cytometru przepływowego, który umożliwia jednoczesne pozyskiwanie danych i stymulację próbki. Istotne jest również, aby agoniści byli dodawani szybko, aby zapewnić niemal natychmiastowe i całkowite wymieszanie agonisty i płytek krwi. Stymulacja trombiną, ADP i epinefryną wytwarza podobną krzywą, reprezentującą szybką inicjację sygnalizacji w odpowiedzi na uczulenie receptora, co skutkuje wiązaniem fibrynogenu z płytkami krwi w szybkim i stałym tempie. W przeciwieństwie do tego, płytki krwi stymulowane przez CRP-XL początkowo bardzo wolno wiążą fibrynogen po początkowym uczuleniu na receptor; Jednak szybkość wiązania fibrynogenu jest następnie gwałtownie zwiększona po tym początkowym opóźnieniu. Stymulacja płytek krwi za pomocą U46619, mimetyku TXA2, powoduje szybką początkową szybkość wiązania fibrynogenu, która gwałtownie spada do bardzo powolnej szybkości, co prowadzi do tylko niewielkiego i stałego wzrostu wiązania fibrynogenu w czasie.

Kinetx został zaprojektowany tak, aby był open-source, powtarzalny i łatwy do wdrożenia, aby obejść problemy z zastrzeżonym oprogramowaniem, takie jak koszty i brak elastyczności. W związku z tym musiał być rozwijany przy użyciu oprogramowania, które nie było zastrzeżone. R został wybrany, ponieważ jest szeroko stosowany przez biologów, łatwy w instalacji, bezpłatny i typu open source. To środowisko typu open source umożliwia użytkownikom biegłym w języku R zmianę parametrów, takich jak stopień wygładzenia, identyfikacja odległych punktów danych lub skale czasowe. Jednak, aby pomóc badaczom, którzy nie są zaznajomieni z R, Kinetix został również opracowany tak, aby analiza mogła być wykonywana za pomocą jednego polecenia (kinetxProcess lub kinetxProcessCalcium, w zależności od analizowanych danych). Zademonstrowane tutaj oprogramowanie Kinetix może obliczać szereg wskaźników, w tym wartości maksymalnych poziomów, szybkość i przyspieszenie wiązania fibrynogenu lub ekspozycji na selektynę P oraz punkty czasowe, w których te maksima występują. Kinetykę aktywacji płytek krwi w odpowiedzi na różne szlaki stymulacyjne można dokładniej porównać za pomocą tych liczb.

Porównania między różnymi stymulacjami agonistów w maksymalnych poziomach wiązania fibrynogenu i szybkościach wiązania fibrynogenu z płytkami krwi są dobrymi przykładami tego, gdzie szybkość aktywacji płytek krwi może się różnić niezależnie od maksymalnego wiązania. Porównując maksymalne wiązanie fibrynogenu po 5 minutach stymulacji z 0,04 μM ADP (3,85 LogFU) i 0,04 μg / mL CRP-XL (3,70 LogFU), obaj agoniści uzyskali podobną ilość związanego fibrynogenu (ryc. 5A). Maksymalne szybkości wiązania fibrynogenu wykazują jeszcze mniejszą różnicę (0,04 μM ADP - 0,0050 LogFU/minutę; 0,04 μg/mL CRP-XL - 0,0054 LogFU/min), co wskazuje, że ogólna szybkość wiązania fibrynogenu jest podobna między tymi dwiema stymulacjami (Figura 5B). Jednakże, gdy porówna się czas opóźnienia aktywacji płytek krwi, istnieje wyraźna różnica pokazująca, że CRP-XL (117 s do maksymalnej szybkości) przyspiesza w znacznie wolniejszym tempie niż ADP (47 s do maksymalnej szybkości) (Figura 5C). W ten sposób staje się jasne, że stymulacja ADP powoduje znacznie szybszą początkową odpowiedź (P < 0,001) w porównaniu z CRP-XL. Obserwowane razem, te pomiary kinetyki płytek krwi w odpowiedzi na dwóch różnych agonistów opisują szybką początkową reakcję na stymulację ADP, która przyspiesza powoli i utrzymuje się w stałym tempie. W przeciwieństwie do tego, stymulacja CRP-XL powoduje powolną początkową szybkość aktywacji, która gwałtownie przyspiesza w znacznie późniejszym czasie, ostatecznie prowadząc do podobnego ogólnego tempa i poziomów wiązania fibrynogenu jak ADP. Te różnice między maksymalnymi poziomami, szybkością i przyspieszeniem wiązania fibrynogenu pokazują, że wiele parametrów jest zaangażowanych w pomiar, jak szybko płytki krwi stają się aktywowane. Test w czasie rzeczywistym i analiza Kinetx mogą mierzyć i porównywać te parametry, opisywać czas od uczulenia receptora do odpowiedzi płytek krwi i porównywać go między różnymi szlakami sygnałowymi.

Zwiększenie stężenia agonisty nie ma istotnego wpływu na szybkość wiązania fibrynogenu z płytkami krwi. Jednak czas potrzebny do osiągnięcia maksymalnej szybkości wiązania fibrynogenu skraca się wraz ze wzrostem stężenia agonisty, co sugeruje, że płytki krwi wiążą fibrynogen ze stałą szybkością, a nasycenie receptora odgrywa bardziej znaczącą rolę w tym, jak szybko płytki krwi wiążą fibrynogen.

Opisany test i analiza strumienia wapnia to szybki i łatwy do wykonania test wapnia, który można włączyć jako dodatkowe próbki do testu w czasie rzeczywistym, co pozwala na analizę wiązania fibrynogenu wapnia i płytek krwi oraz selektyny P w tej samej serii próbek. Indywidualny pakiet analiz zapewnia dogłębną ocenę kinetyki strumienia wapnia, w tym kształtu odpowiedzi, maksymalnej odpowiedzi i czasu do maksymalnej odpowiedzi. Parametry te można następnie porównać pod kątem różnic między dawcami i w odpowiedzi na różne środki farmaceutyczne. Strumień wapnia w płytkach krwi był wcześniej badany w płytkach krwi przy użyciu różnych testów opartych na cytometrii przepływowej 17,18,19. Aliotta i wsp.14 opisują elegancki test zdolny do analizy kinetyki wielu jonów wewnątrzkomórkowych. Przedstawiony tutaj test wapnia opiera się na tych wcześniej opublikowanych testach, obejmując pakiet analityczny umożliwiający większą elastyczność i bardziej dogłębną eksplorację danych z korzyścią dla analizy o wysokiej przepustowości dla wielu dawców w krótkim czasie.

Wcześniejsze badania wykazały, że hamowanie lub brak pewnych cząsteczek sygnałowych powoduje zmianę szybkości aktywacji płytek krwi, co bezpośrednio przekłada się na tworzenie skrzeplin 8,9. W przeszłości kinetykę aktywacji płytek krwi można było mierzyć za pomocą cytometrii przepływowej w kilku stałych punktach czasowych, które można było następnie wykorzystać do obliczenia i porównania, na przykład, szybkości eksternalizacji GPIIbIIIa w odpowiedzi na różnych agonistów20. Test w czasie rzeczywistym i analiza Kinetx opisane w tym artykule zapewniają prostą, ogólnodostępną i dokładną metodę pomiaru zarówno szybkości, jak i punktu końcowego aktywacji płytek krwi z płytek krwi w spoczynku. Jest to prawdopodobnie ważne w identyfikacji fizjologicznie istotnych zmian w funkcji płytek krwi, które mogą zostać pominięte, gdy mierzone są tylko odczyty końcowe.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ten projekt był wspierany przez British Heart Foundation (PG/16/36/31967, RG/20/7/34866 i RG/15/2/31224).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
9,11-Dideoksy-11&alfa;,9&alfa;-epoksymetanoprostaglandyna F2α - U46619Sigma-Aldrich, Poole, Wielka BrytaniaD8174-1MG
Accuri C6 z próbkarką BDBeckton Dickinson, Wielka Brytania660517 + 660519
Difosforan adenozynySigma-Aldrich, Poole, Wielka BrytaniaA2754-1G
Anty-selektyna P (CD62p) znakowana APC BDBiosciences, Wielka Brytania
Corning polipropylen 96-dołkowa, okrągłodenna, niepoddana obróbce płytka do mikromiareczkowaniaSigma-Aldrich, Poole, Wielka BrytaniaCLS3879-50EA
Peptyd związany z usieciowanym kolagenem (CRP-XL)CambCol, Wielka Brytania
EpinefrynaSigma-Aldrich, Poole, Wielka BrytaniaE4375-1G
Przeciwciało antyfibrynogenowe znakowane FITCDako, Agilent Technologies, Wielka BrytaniaF011102-2 Fluo-4
Barwnik bezpośredniThermo-Fisher ScientificF10472
Końcówki ładujące żelStarlab, Wielka BrytaniaI1022-0600
Peptyd Gly-Pro-Arg-ProSigma-Aldrich, Poole, Wielka BrytaniaG1895-5MG
TrombinSigma-Aldrich, Poole, Wielka BrytaniaSRE0003-10KU
Peptyd aktywujący receptor trombiny 6 (TRAP-6)Bachem, St Helens, Wielka BrytaniaH-2936.0005
Vacuette 9NC Koagulacja 3,2% cytrynian trisodowy (0,109 mol/L)Greiner Bio-one LTD, Stonehouse, Wielka Brytania454327
Cytometr przepływowy 550888

Bibliografia

  1. Bye, A. P., Unsworth, A. J., Gibbins, J. M. Platelet signaling: a complex interplay between inhibitory and activatory networks. Journal of Thrombosis and Haemostasis: JTH. 14 (5), 918-930 (2016).
  2. Jones, C. I., Barrett, N. E., Moraes, L. A., Gibbins, J. M., Jackson, D. E. Endogenous inhibitory mechanisms and the regulation of platelet function. Methods in Molecular Biology. 788, 341-366 (2012).
  3. Paniccia, R., Priora, R., Liotta, A. A., Abbate, R. Platelet function tests: a comparative review. Vascular Health and Risk Management. 11, 133-148 (2015).
  4. Saboor, M., Moinuddin, M., Ilyas, S. New horizons in platelets flow cytometry. The Malaysian Journal of Medical Sciences : MJMS. 20 (2), 62-66 (2013).
  5. Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. Platelets and shear stress. Blood. 88, 1525-1541 (1996).
  6. Pasquet, J. M., Noury, M., Nurden, A. T. Evidence that the platelet integrin alphaIIb beta3 is regulated by the integrin-linked kinase, ILK, in a PI3-kinase dependent pathway. Thrombosis and Haemostasis. 88 (1), 115-122 (2002).
  7. Stevens, J. M., Jordan, P. A., Sage, T., Gibbins, J. M. The regulation of integrin-linked kinase in human platelets: evidence for involvement in the regulation of integrin alpha 2 beta 1. Journal of Thrombosis and Haemostasis: JTH. 2 (8), 1443-1452 (2004).
  8. Jones, C. I., et al. Integrin-linked kinase regulates the rate of platelet activation and is essential for the formation of stable thrombi. Journal of Thrombosis and Haemostasis: JTH. 12 (8), 1342-1352 (2014).
  9. Cifuni, S. M., Wagner, D. D., Bergmeier, W. CalDAG-GEFI and protein kinase C represent alternative pathways leading to activation of integrin alphaIIbbeta3 in platelets. Blood. 112 (5), 1696-1703 (2008).
  10. Stolla, M., et al. The kinetics of alphaIIbbeta3 activation determines the size and stability of thrombi in mice: implications for antiplatelet therapy. Blood. 117 (3), 1005-1013 (2011).
  11. Kawasaki, H., et al. A Rap guanine nucleotide exchange factor enriched highly in the basal ganglia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (22), 13278-13283 (1998).
  12. Kinetx. , Available from: http://github.com/cardiomaths/Kinetx (2021).
  13. R. , Available from: https://www.r-project.org/ (2021).
  14. R Studio. , Available from: https://rstudio.com/products/rstudio/download/ (2021).
  15. Yee, D. L., Sun, C. W., Bergeron, A. L., Dong, J. F., Bray, P. F. Aggregometry detects platelet hyperreactivity in healthy individuals. Blood. 106 (8), 2723-2729 (2005).
  16. Panzer, S., Hocker, L., Koren, D. Agonists-induced platelet activation varies considerably in healthy male individuals: studies by flow cytometry. Annals of Hematology. 85 (2), 121-125 (2006).
  17. Aliotta, A., Bertaggia Calderara, D., Alberio, L. Flow cytometric monitoring of dynamic cytosolic calcium, sodium, and potassium fluxes following platelet activation. Cytometry. Part A : The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 97 (9), 933-944 (2020).
  18. do Ceu Monteiro, M., Sansonetty, F., Goncalves, M. J., O'Connor, J. E. Flow cytometric kinetic assay of calcium mobilization in whole blood platelets using Fluo-3 and CD41. Cytometry. 35 (4), 302-310 (1999).
  19. Vines, A., McBean, G. J., Blanco-Fernandez, A. A flow-cytometric method for continuous measurement of intracellular Ca(2+) concentration. Cytometry. Part A : The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (11), 1091-1097 (2010).
  20. Weber, A. A., Schror, K. Differential inhibition of adenosine diphosphate- versus thrombin receptor-activating peptide-stimulated platelet fibrinogen binding by abciximab due to different glycoprotein IIb/IIIa activation kinetics. Blood. 98 (5), 1619-1621 (2001).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza funkcji p ytek krwipomiary kinetycznewi zanie fibrynogenuuwalnianie zawarto ci ziarnisto cistrumie jon w wapniaanaliza w czasie rzeczywistymoprogramowanie open sourcetworzenie zakrzepu
Film wkrótce dostępny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.