Dwukolorowa spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji w celu zbadania interakcji białko-białko i dynamiki białek w żywych komórkach

Katherina Hemmen; Susobhan Choudhury; Mike Friedrich; Johannes Balkenhol; Felix Knote; Martin J. Lohse; Katrin G. Heinze

doi:10.3791/62954

Artykuł metodologiczny

Dwukolorowa spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji w celu zbadania interakcji białko-białko i dynamiki białek w żywych komórkach

5.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62954

⸱

11 grudnia 2021

Katherina Hemmen^*¹ , Susobhan Choudhury^*¹ , Mike Friedrich¹ , Johannes Balkenhol¹ , Felix Knote¹ , Martin J. Lohse² , Katrin G. Heinze¹

¹Rudolf Virchow Center for Integrative and Translation Bioimaging, Julius-Maximilian University Wuerzburg, ²Max Delbrück Center for Molecular Medicine, Berlin

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy eksperymentalny protokół i proces analizy danych do przeprowadzenia dwukolorowej spektroskopii korelacji krzyżowej fluorescencji (FCCS) na żywo w połączeniu z transferem energii rezonansowej Förster (FRET) w celu zbadania dynamiki receptorów błonowych w żywych komórkach przy użyciu nowoczesnych technik znakowania fluorescencji.

Streszczenie

Prezentujemy protokół i przepływ pracy do wykonywania dwukolorowej spektroskopii krzyżowej fluorescencji (FCCS) na żywo w połączeniu z transferem energii rezonansu Förster (FRET) w celu zbadania dynamiki receptorów błonowych w żywych komórkach przy użyciu nowoczesnych technik znakowania fluorescencji. W dwukolorowym FCCS, gdzie fluktuacje intensywności fluorescencji reprezentują dynamiczny "odcisk palca" danej biomolekuły fluorescencyjnej, możemy badać kodyfuzję lub wiązanie receptorów. FRET, ze względu na wysoką czułość na odległości molekularne, służy jako dobrze znany "nanolinijka" do monitorowania zmian wewnątrzcząsteczkowych. Podsumowując, zmiany konformacyjne i kluczowe parametry, takie jak lokalne stężenia receptorów i stałe ruchliwości, stają się dostępne w warunkach komórkowych.

Ilościowe metody fluorescencji są trudne w komórkach ze względu na wysoki poziom hałasu i wrażliwość próbki. Tutaj pokazujemy, jak przeprowadzić ten eksperyment, w tym etapy kalibracji przy użyciu dwukolorowego oznaczenia β receptor 2-adrenergiczny (β₂AR) oznaczony eGFP i SNAP-tag-TAMRA. Procedura analizy danych krok po kroku jest dostępna przy użyciu oprogramowania typu open source i szablonów, które można łatwo dostosować.

Nasze wytyczne umożliwiają badaczom rozwikłanie molekularnych oddziaływań biomolekuł w żywych komórkach in situ z wysoką niezawodnością, pomimo ograniczonego poziomu sygnału do szumu w eksperymentach z żywymi komórkami. Okno operacyjne FRET, a w szczególności FCCS przy niskich stężeniach, umożliwia analizę ilościową w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.

Wprowadzenie

Spektroskopia fluorescencyjna jest jedną z głównych metod ilościowego określania dynamiki białek i interakcji białko-białko przy minimalnych zakłóceniach w kontekście komórkowym. Konfokalna spektroskopia korelacji fluorescencji (FCS) jest jedną z potężnych metod analizy dynamiki molekularnej, ponieważ jest wrażliwa na pojedyncze cząsteczki, wysoce selektywna i kompatybilna z żywymi komórkami¹. W porównaniu z innymi podejściami zorientowanymi na dynamikę, FCS ma szerszy mierzalny zakres czasowy obejmujący od ~ ns do ~ s, co najważniejsze, obejmujący szybkie skale czasowe, które często są niedostępne dla metod opartych na obrazowaniu. Co więcej, zapewnia również selektywność przestrzenną, dzięki czemu można łatwo odróżnić dynamikę molekularną błony, cytoplazmy i jądra ². W ten sposób mruganie molekularne, średnie stężenie lokalne i współczynnik dyfuzji można analizować ilościowo za pomocą FCS. Dynamika międzycząsteczkowa, taka jak wiązanie, staje się łatwo dostępna podczas badania kodyfuzji dwóch gatunków molekularnych w analizie spektroskopii fluorescencji krzyżowej korelacji krzyżowej (FCCS)³^,⁴^,⁵ w podejściu dwukolorowym.

Główną podstawową zasadą spektroskopii korelacji jest analiza statystyczna fluktuacji intensywności emitowanych przez fluorescencyjnie znakowane biomolekuły dyfundujące do i z ogniska laserowego (Rysunek 1A). Wynikowe funkcje korelacji automatycznej lub krzyżowej mogą być następnie dalej analizowane przez dopasowanie krzywej, aby ostatecznie wyprowadzić interesujące stałe szybkości. Innymi słowy, metody statystyczne FCS i FCCS nie dostarczają śladów pojedynczych cząsteczek, jak w przypadku śledzenia pojedynczych cząstek, ale dynamiczny wzór lub "odcisk palca" badanej próbki o wysokiej rozdzielczości czasowej. W połączeniu z rezonansowym transferem energii Förstera (FRET), dynamika wewnątrzcząsteczkowa, taka jak zmiany konformacyjne, może być monitorowana w tym samym czasie we wspólnym układzie konfokalnym⁵^,⁶. FRET sonduje odległość dwóch fluoroforów i jest często określany jako molekularny "nanolinijka". Transfer energii zachodzi tylko wtedy, gdy cząsteczki znajdują się w bliskim sąsiedztwie (< 10 nm), widmo emisyjne donora znacznie pokrywa się z widmem absorpcyjnym cząsteczki akceptora, a orientacja dipola donora i akceptora jest (wystarczająco) równoległa. W ten sposób połączenie FRET i FCCS zapewnia technikę o bardzo wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej. Gdy wymagana jest selektywność przestrzenna, czułość, a także kompatybilność z żywymi komórkami, FRET-FCCS ma oczywistą przewagę nad innymi metodami, takimi jak kalorymetria miareczkowa izotermiczna (ITC)⁷, powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR)⁸, lub magnetyczny rezonans jądrowy (NMR)⁹^,¹⁰ do pomiaru dynamiki i interakcji białek.

Pomimo możliwości i obietnicy dwukolorowej spektroskopii korelacji krzyżowej fluorescencji (dc-FCCS), wykonywanie DC-FCCS w żywych komórkach jest technicznie trudne ze względu na widmowe przesłuchy lub przesłuchy między kanałami³^,⁴, różnica w objętościach konfokalnych wynikająca z widmowo odrębnych linii laserowych³^,⁴^,¹¹, sygnał tła i szum lub ograniczona fotostabilność próbek¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵. Wprowadzenie wzbudzenia impulsowego z przeplotem (PIE) do FCCS było ważną modyfikacją mającą na celu czasowe rozprzęgnięcie różnych wzbudzeń laserowych w celu zmniejszenia przesłuchów spektralnych między kanałami¹⁶. Inne metody korekcji przeciwdziałające przebijaniu widma¹⁷^,¹⁸^,¹⁹ i poprawki tła również zostały dobrze zaakceptowane¹⁷^,¹⁸^,¹⁹. Aby uzyskać szczegółowe informacje i podstawy dotyczące FCS, PIE lub FRET, czytelnik jest odsyłany do następujących odniesień²^,⁴^,⁶^,¹⁶^,²⁰^,²¹^,²²^,²³^,²⁴.

Tutaj przedstawiono wszystkie niezbędne eksperymenty kalibracyjne i analizy wraz z wynikami eksperymentalnymi prototypowego receptora sprzężonego z białkiem G, receptora 2-adrenergicznego (β₂AR), β dla trzech różnych scenariuszy: (1) jednoznakowane cząsteczki posiadające "zielony" (eGFP) lub "czerwony" (etykietowanie oparte na znacznikach SNAP)²⁵ fluorofor; (2) podwójnie znakowany konstrukt, który zawiera N-końcowy znacznik SNAP i wewnątrzkomórkowy eGFP (NT-SNAP) [w tym przypadku obie etykiety znajdują się przy tym samym białku. W związku z tym oczekuje się 100% kodyfuzji]; oraz (3) podwójnie znakowaną próbkę, w której oba fluorofory znajdują się po tej samej stronie błony komórkowej (CT-SNAP). Zawiera C-końcowy znacznik SNAP i wewnątrzkomórkowy eGFP. W tym przypadku obie etykiety są na tym samym białku z oczekiwaną 100% kodyfuzją. Ponieważ obie etykiety znajdują się bardzo blisko siebie, po tej samej stronie błony komórkowej, wykazuje to potencjał do obserwowania FRET i zachowania antyskorelowanego. Wszystkie konstrukty zostały transfekowane w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO), a następnie znakowane czerwonym substratem fluorescencyjnym, który jest nieprzepuszczalny dla konstrukcji NT-SNAP i przepuszczalny dla membrany dla konstruktu CT-SNAP. Wreszcie, symulowane dane ilustrują wpływ parametrów eksperymentalnych na antykorelację indukowaną przez FRET oraz wpływ oddziaływań białko-białko na amplitudę kodyfuzji.

Tak więc, ten protokół dostarcza kompletnego przewodnika do przeprowadzania połączonego FRET-FCCS w żywych komórkach, aby zrozumieć dynamikę białek i interakcje białko-białko, jednocześnie uświadamiając techniczne/fizyczne artefakty, wyzwania i możliwe rozwiązania.

Protokół

1. Protokół eksperymentalny

Przygotowanie próbki
UWAGA: Wysiew i transfekcję komórek należy przeprowadzić w sterylnych warunkach.
1. Umieścić oczyszczone szkiełko nakrywkowe na studzience na 6-dołkowej płytce hodowlanej i przemyć trzykrotnie sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS).
  UWAGA: Protokół czyszczenia szkiełka nakrywkowego jest szczegółowo opisany w uwadze uzupełniającej 1.
2. Do każdego dołka dodać 2 ml kompletnej pożywki do hodowli komórkowych zawierającej czerwień fenolową (uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 μg/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny) i odłożyć płytkę na bok.
3. Hodować komórki CHO w tym samym pożywce zawierającej czerwień fenolową w temperaturze 37 °C i 5 % CO_{2 .}Umyj komórki 5 ml PBS, aby usunąć martwe komórki.
4. Dodaj 2 ml trypsyny i inkubuj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej (RT).
5. Rozcieńczyć oderwane komórki 8 ml pożywki zawierającej czerwień fenolową i dokładnie wymieszać pipetując.
6. Policz komórki w komorze Neubauera i zasiej nasiona o gęstości 1,5 x 10⁵ komórek/basenik na 6-dołkowej płytce do hodowli komórkowej zawierającej szkiełka nakrywkowe (przygotowanej w kroku 1.1.1-1.1.2).
7. Pozwól komórkom rosnąć w inkubatorze (37 °C, 5% CO₂ ) przez 24 godziny, aby osiągnąć około 80% zbieżności.
8. Rozcieńczyć 2 μg pożądanego DNA wektora (np. CT-SNAP lub NT-SNAP) i 6 μl odczynnika do transfekcji w dwóch oddzielnych probówkach, z których każda zawiera 500 μl pożywki o zredukowanej surowicy dla każdej studzienki i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
9. Wymieszać oba roztwory razem, aby otrzymać mieszaninę transfekcji i inkubować ją przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
10. W międzyczasie umyj wysiane komórki CHO raz sterylnym PBS.
11. Zastąp PBS 1 ml / studzienkę pożywki wolnej od czerwieni fenolowej uzupełnionej 10% FBS bez żadnych antybiotyków.
12. Dodać kroplami cały 1 ml mieszaniny transfekcji do każdej studzienki i inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C, w 5% CO₂ .
13. W celu oznakowania konstruktu SNAP należy rozcieńczyć odpowiedni roztwór podstawowy substratu SNAP w 1 ml pożywki uzupełnionej 10% FBS, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μM.
14. Przemyć transfekowane komórki raz PBS i dodać 1 ml na studzienkę 1 μM roztworu substratu SNAP. Inkubować komórki przez 20 minut w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ .
15. Umyj komórki trzykrotnie pożywką wolną od czerwieni fenolowej i dodaj 2 ml na dołek pożywki bez czerwieni fenolowej. Inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ .
16. Następnie przenieść szkiełka nakrywkowe wszystkich próbek do komory obrazowania i przemyć buforem obrazowym o pojemności 500 μl. Dodaj bufor obrazowania o pojemności 500 μl przed przejściem do konfiguracji FRET-FCS.
Pomiary kalibracyjne
UWAGA: Zestaw FRET-FCS jest wyposażony w obiektyw wodny z mikroskopem konfokalnym, dwie linie laserowe, system zliczania pojedynczych fotonów skorelowanych w czasie (TCSPC), dwie hybrydowe tuby fotopowielacza (PMT) i dwie fotodiody lawinowe (APD) do zbierania fotonów i oprogramowania do zbierania danych. Bardzo ważne jest, aby wyrównać konfigurację za każdym razem przed pomiarami na żywo komórek. Szczegółowy opis konfiguracji można znaleźć w uwadze uzupełniającej 2. Zarówno lasery, jak i wszystkie detektory (dwa PMT i dwa APD) są zawsze włączone podczas pomiarów, ponieważ wszystkie pomiary muszą być przeprowadzane w identycznych warunkach. Do pomiarów kalibracyjnych należy użyć szkiełka nakrywkowego z tej samej partii, na której wysiano komórki, co zmniejsza zmienność korekcji pierścienia kołnierza.
1. Aby wyregulować ostrość, położenie otworka i pierścienia kołnierza, umieść zielony roztwór kalibracyjny 2 nM na szklanym szkiełku nakrywkowym i włącz laser 485 nm i 560 nm. Uruchom laser w trybie wzbudzenia impulsowego z przeplotem (PIE)¹⁶.
2. Skoncentruj się na roztworze i dostosuj położenie pierścienia otworkowego i kołnierza tak, aby uzyskać najwyższą szybkość zliczania i najmniejszą objętość konfokalną, aby uzyskać maksymalną jasność molekularną.
3. Powtórzyć ten proces dla kanałów czerwonych z czerwonym roztworem kalibracyjnym 10 nM i mieszaniną zarówno zielonego, jak i czerwonego roztworu kalibracyjnego.
4. Umieść roztwór DNA 10 nM na szklanym szkiełku nakrywkowym i dostosuj ognisko, otwór i położenie pierścienia kołnierza tak, aby korelacja krzyżowa między zielonymi i czerwonymi kanałami detekcji była najwyższa, tj. wykazywała najwyższą amplitudę.
  UWAGA: Kroki 1.2.1 i 1.2.4 mogą wymagać powtórzenia tam iz powrotem, aby znaleźć optymalne wyrównanie. Wykonaj 3-5 pomiarów z każdego roztworu kalibracyjnego przez 30 s - 120 s po optymalnym ustawieniu ostrości, otworka i pierścienia kołnierza dla zielonego i czerwonego kanału detekcji oraz objętości nakładania się konfokalnego.
5. Zmierz kroplę ddH₂O, pożywkę do obrazowania i nietransfekowaną komórkę 3-5 razy każdy przez 30 s - 120 s, aby określić szybkość zliczania tła.
6. Zbierz funkcję odpowiedzi przyrządu z 3-5 pomiarami przez 30 s - 120 s. Jest to opcjonalne, ale wysoce zalecane.
Pomiary żywych komórek
1. Znajdź odpowiednią komórkę, oświetlając ją lampą rtęciową i obserwując przez okular.
  UWAGA: Odpowiednie komórki są żywe, wykazując typową morfologię odpowiedniej przylegającej linii komórkowej. Fluorescencja interesującego nas białka, w tym przypadku receptora powierzchniowego, jest widoczna na całej powierzchni. Mniej jasne komórki są bardziej odpowiednie niż jaśniejsze ze względu na lepszy kontrast w FCS, gdy w centrum uwagi znajduje się niewielka liczba cząsteczek.
2. Włącz oba lasery w trybie PIE i skup się na membranie, patrząc na maksymalne zliczenia na sekundę.
  UWAGA: Może być konieczne zmniejszenie mocy lasera w przypadku próbek ogniw (mniej niż 5 μW przy obiektywie). Zależy to od użytych fluoroforów i konfiguracji.
3. Obserwuj krzywe automatycznej i krzyżowej korelacji eGFP lub oznakowanego znacznika SNAP przymocowanego do β₂AR w podglądzie online oprogramowania do zbierania danych i zbierz kilka krótkich pomiarów (~2 -10) z czasem akwizycji od 60 do 180 s.
  UWAGA: Nie pobudzaj komórek przez długi czas w sposób ciągły, ponieważ fluorofory mogą wybielić. Będzie to jednak zależeć od jasności każdej komórki, długości pomiarów i liczby pomiarów, które można w sumie wykonać.

2. Analiza danych

Eksport danych
1. Eksportuj krzywe korelacji, G(t_c) i współczynniki zliczania, CR, ze wszystkich pomiarów.
2. Zadbaj o poprawne zdefiniowanie okien czasowych "podpowiedzi" i "opóźnienia" oraz użyj opcji "bramkowania mikroczasowego" w oprogramowaniu do korelacji danych.
  UWAGA: W sumie wymagane są trzy różne korelacje: (1) autokorelacja kanału zielonego w oknie czasowym monitu (ACF_gp), (2) autokorelacja kanałów czerwonych w oknie czasowym opóźnienia (ACF_rd) i wreszcie (3) korelacja krzyżowa sygnału kanału zielonego w oknie czasowym monitu z sygnałem kanału czerwonego w oknie czasowym opóźnienia (CCF_PIE). Eksport danych jest pokazany krok po kroku dla różnych programów w uwadze dodatkowej 3.
Pomiary kalibracyjne
1. Użyj funkcji autokorelacji roztworów fluoroforu zielonego (ACF_gp) i czerwonego (ACF_rd) i dopasuj je do modelu dyfuzji 3D z dodatkowym terminem trypletowym, jeśli jest to wymagane (równanie 1), aby skalibrować kształt i rozmiar objętości detekcji konfokalnej dla dwóch używanych kanałów kolorów:
  równanie 1
  Tutaj b jest linią bazową krzywej, N liczbą cząsteczek w ognisku, t_D czasem dyfuzji (w ms), a s = z₀/w₀ współczynnikiem kształtu konfokalnego elementu objętościowego. Mruganie trypletowe lub inna fotofizyka jest opisana przez jej amplitudę _R i czas relaksacji t_R.
  UWAGA: Wszystkie zmienne i symbole używane w protokole są wymienione w Tabeli 1.
2. Użyj znanych współczynników dyfuzji D dla green²⁶ i czerwonego standardu kalibracji²⁷ oraz otrzymanych współczynników kształtu s_zielonego i _{s czerwonego}, aby określić wymiary (szerokość w₀ i wysokość z₀) oraz objętość V_eff konfokalnego elementu objętościowego (równanie 2a-c).
  eq. 2a
  równanie 2b
  eq. 2c
  UWAGA: Szablony do obliczania parametru kalibracji są dostarczane jako pliki uzupełniające (S7).
3. Obliczyć α spektralny przesłuchu sygnału zielonej fluorescencji (zebranego w kanałach 0 i 2) do czerwonych kanałów detekcji (kanał numer 1 i 3) jako stosunek sygnałów z korekcją tła (BG) (równanie 3).
  
  Równanie 3
4. Określić bezpośrednie wzbudzenie δ fluoroforowego akceptora przez długość fali wzbudzenia donora przez stosunek szybkości zliczania z korekcją tła pomiarów kalibracji czerwieni w "szybkim" oknie czasowym (wzbudzenie zielonym laserem) do szybkości zliczania skorygowanej o tło w oknie czasowym "opóźnienia" (wzbudzenie czerwonym laserem) (równanie 4).
  
  równanie 4
5. Obliczyć jasność molekularną B zarówno zielonego, jak i czerwonego fluoroforu (równanie 5a-b) na podstawie współczynników zliczania skorygowanych o tło i uzyskanej liczby cząsteczek w ognisku, N, z dopasowania dyfuzyjnego 3D (równanie 1):
  eq. 5a
  równanie 5b
6. Dopasuj zarówno ACF_gp, jak i ACF_rd, a także CCF_PIE podwójnie znakowanego DNA do modelu dyfuzji 3D (równanie 1). Uzyskane współczynniki kształtu, s_zielony i s_czerwony, należy utrzymywać na stałym poziomie odpowiednio dla ACF_gp i ACF_rd. Współczynnik kształtu dla _{CCF PIE,} s_PIE, znajduje się zwykle pomiędzy tymi dwiema wartościami.
  UWAGA: W idealnej konfiguracji zarówno V_eff, _zielony, jak i V_{eff, czerwony} miałyby ten sam rozmiar i idealnie na siebie zachodziłyby.
7. Określić amplitudę przy zerowym czasie korelacji, G₀(t_c), na podstawie znalezionych wartości pozornej liczby cząsteczek w ognisku (N_zielony, N_czerwony i N_PIE).
8. Obliczyć stosunek amplitudy r_GR i r_RGdla próbki ze 100% kodyfuzją fluoroforów zielonych i czerwonych (równanie 6). Należy pamiętać, że N_PIE nie odzwierciedla liczby podwójnie znakowanych cząsteczek w ognisku, ale odzwierciedla tylko 1/G₀(t_c).
  i równanie 6
Eksperymenty z żywymi komórkami
1. W przypadku konstrukcji z pojedynczym etykietą dopasuj próbki komórek do odpowiedniego modelu. W przypadku pokazanego receptora błonowego dyfuzja zachodzi w sposób bimodalny z krótkim i długim czasem dyfuzji. Dodatkowo należy wziąć pod uwagę fotofizykę i mruganie fluoroforów:
  równanie 7
  Tutaj t_d1 i t_d2 to dwa wymagane czasy dyfuzji, a₁ to ułamek pierwszego czasu dyfuzji.
  UWAGA: W przeciwieństwie do pomiarów kalibracyjnych, w których wolne barwniki i nici DNA swobodnie dyfundują we wszystkich kierunkach, receptor błonowy wykazuje tylko dyfuzję 2D wzdłuż błon komórkowych. Ta różnica między dyfuzją 3D i 2D znajduje odzwierciedlenie w zmodyfikowanym współczynniku dyfuzji (porównaj równanie 1), gdzie _{t D} w przypadku 2D nie zależy od współczynnika kształtu s konfokalnego elementu objętościowego.
2. Obliczyć stężenie c białek znakowanych na zielono lub czerwono z odpowiednich N i V_eff, korzystając z podstawowej matematyki (równanie 8):
  eq. 8
  gdzie _{N A} = liczba Avogadro
3. Dla N-końcowej etykiety SNAP i wewnątrzkomórkowego eGFP dopasuj dwie autokorelacje (ACF_gp i ACF_rd) podwójnie znakowanej próbki przy użyciu tego samego modelu, co dla jednoznakowanych konstruktów dla ACF (równanie 7) i CCF_PIE przy użyciu bimodalnego modelu dyfuzji (równanie 9):
  eq. 9
  UWAGA: Aby uzyskać globalny opis systemu, wszystkie trzy krzywe muszą być dopasowane razem: Składnik dyfuzji jest identyczny dla wszystkich trzech krzywych, a jedyną różnicą jest składnik relaksacji dla _{CCF PIE}. Ponieważ fotofizyka dwóch fluoroforów zwykle nie jest ze sobą powiązana, nie jest wymagany żaden termin korelacji. Ten brak warunków relaksacji skutkuje płaskim _{CCF PIE} w krótkich czasach korelacji. Jednak przesłuchy i bezpośrednie wzbudzenie akceptora przez fluorofor donorowy mogą wykazywać fałszywie dodatnie amplitudy i powinny być dokładnie sprawdzone pod kątem użycia pomiarów kalibracyjnych.
4. Obliczyć stężenie c białek znakowanych na zielono lub czerwono z odpowiednich N i V_eff, stosując równanie 8.
5. Oszacować frakcję lub stężenie, c_GR lub c_RG, oddziałujących na siebie białek znakowanych na zielono i czerwono z próbek komórkowych, stosując współczynniki korygujące otrzymane z próbek DNA, współczynniki amplitudy r_GR i r_RG próbki komórkowej oraz ich odpowiednie otrzymane stężenia (równanie 10).
  i eq. 10
6. W przypadku C-końcowej etykiety SNAP i wewnątrzkomórkowego eGFP dopasuj dwie autokorelacje (ACF_gp i ACF_rd) próbki FRET jako próbki znakowane pojedynczo (równanie 7) i CCF_FRET do bimodalnego modelu dyfuzji zawierającego człon antykorelacji (równanie 11)
  równanie 11
  gdzie_f odzwierciedla amplitudę całkowitej antykorelacji, a_R i t_R odpowiednią amplitudę i czas relaksacji.
  UWAGA: W przypadku antyskorelowanych zmian fluorescencji spowodowanych FRET, może być wymagany jeden lub kilka warunków antykorelacji (równanie 11), co skutkuje "spadkiem" _{CCF FRET} w niskich czasach korelacji zbiegających się ze wzrostem dwóch autokorelacji (ACF_gp i ACF_rd). Należy jednak pamiętać, że fotofizyka, taka jak mruganie trypletowe, może maskować termin antykorelacji poprzez tłumienie antykorelacji wywołanej przez FRET. Wspólna analiza uzupełniona o filtrowane metody FCS może pomóc w zdemaskowaniu terminu antykorelacji. Ponadto należy wykluczyć artefakty techniczne wynikające z martwych czasów w elektronice liczącej w zakresie nanosekund¹⁶. Bardziej szczegółowa procedura krok po kroku, jak przeprowadzić analizę w ChiSurf²⁸ oraz szablony do obliczania objętości konfokalnej lub jasności molekularnej są dostępne w repozytorium Github (https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS) oraz jako pliki uzupełniające (uwaga uzupełniająca 4 i uwaga uzupełniająca 6). Dodatkowo można tam znaleźć skrypty Pythona do wsadowego eksportu danych pozyskanych za pomocą oprogramowania Symphotime w formacie .ptu.

Wyniki

Przykładowe wyniki kalibracji i pomiarów na żywych komórkach są omówione poniżej. Dodatkowo wykazano wpływ FRET na krzywe korelacji krzyżowej na podstawie symulowanych danych obok wpływu interakcji białko-białko zwiększającego amplitudę _{CCF PIE}.

Eksport danych FCS oparty na PIE
W eksperymentach PIE dane są zbierane w trybie time-tag time-resolution mode (TTTR)²⁹^,³⁰. Rysunek 1B pokazuje histogramy czasu nadejścia fotonów pomiaru PIE podwójnie znakowanej nici DNA na opisanym układzie (Uwaga uzupełniająca 1). Konfiguracja ma cztery kanały detekcji. Emisja fluorescencji jest najpierw rozdzielana przez polaryzację w kierunkach "S" i "P" (odnoszących się do płaszczyzny prostopadłej i równoległej, w której oscyluje pole elektryczne fali świetlnej). Po drugie, każdy kierunek polaryzacji jest następnie dzielony na dwa kanały kolorów (zielony, czerwony) przed wykryciem, w wyniku czego powstają cztery kanały (S-zielony, S-czerwony, P-zielony, P-czerwony). W oknie czasowym "prompt" zielony fluorofor zostaje wzbudzony, a sygnał jest wykrywany zarówno w kanale zielonym, jak i czerwonym z powodu FRET. W oknie czasowym opóźnienia widoczny jest tylko czerwony fluorofor (w kanale czerwonym). Na podstawie kanałów detekcji i okien czasowych "prompt" i "delayed" można uzyskać co najmniej pięć różnych krzywych korelacji (3 krzywe autokorelacji (ACF) i 2 krzywe korelacji krzyżowej (CCF)) (Rysunek 1C-D): (1) zielony sygnał w oknie czasu monitu (ACF_gp), (2) czerwony sygnał w oknie czasu monitu (w przypadku FRET, ACF_rp) i (3) czerwony sygnał w oknie czasowym opóźnienia (ACF_rd). Te ACF informują o ruchliwości białek, fotofizyce (np. mruganie trypletów) i innych skorelowanych w czasie zmianach jasności we fluoroforach (np. z powodu FRET). (4) Oparta na PIE korelacja krzyżowa CCF_PIE zielonego sygnału w oknie czasowym monitu z czerwonym sygnałem w oknie czasu opóźnienia pozwala określić frakcję kodyfuzji zielonego i czerwonego fluoroforu ¹⁶. (5) Oparta na FRET korelacja krzyżowa CCF_FRET koloru zielonego z sygnałem czerwonym w oknie czasu monitu jest związana z wywołanymi przez FRET, antykorelowanymi zmianami jasności sygnałów zielonego i czerwonego^31,³²^,³³.

figure-results-1
Rysunek 1: Spektroskopia korelacji fluorescencyjnej (F(C)CS oparta na wzbudzeniu impulsowo-przeplotowym (PIE). (A) W FCS cząsteczki znakowane fluorescencyjnie dyfundują swobodnie do i z (ograniczonej dyfrakcją) objętości ogniskowej kształtowanej przez skupioną wiązkę laserową, która indukuje fluorescencję w tej małej objętości. Wynikające z tego fluktuacje intensywności cząsteczek wchodzących i wychodzących z objętości są skorelowane i dostarczają informacji na temat ruchliwości cząsteczek. (B) W PIE dwie różne linie laserowe ("natychmiastowa" i "opóźniona") są używane do wzbudzenia próbki oznakowanej dwoma różnymi fluoroforami ("zielonymi" i "czerwonymi"). Różnica czasu między oboma impulsami wzbudzenia jest dostosowana do czasów życia fluorescencji odpowiednich fluoroforów, tak aby jeden z nich rozpadł się przed wzbudzeniem drugiego. W pokazanej podwójnie znakowanej próbce oba fluorofory są wystarczająco blisko, aby przejść transfer energii rezonansu Förstera (FRET) z "zielonego" fluoroforu donorowego do "czerwonego" fluoroforu akceptorowego. W ten sposób emisja czerwonej fluorescencji może być wykryta w "natychmiastowym" oknie czasowym po wzbudzeniu zielonego donora. W zastosowanym układzie (uwaga uzupełniająca 2) dla każdego koloru stosowane są dwa detektory, jeden zorientowany równolegle do orientacji wiązki wzbudzenia (oznaczony "p"), a drugi prostopadły (oznaczony "s"). (C) W eksperymencie PIE można wyznaczyć trzy różne funkcje autokorelacji: korelacja i) sygnałów kanału zielonego w oknie czasowym monitu (ACF_gp), ii) sygnałów kanału czerwonego w oknie czasu monitu (ACF_rp) oraz iii) sygnałów kanału czerwonego w oknie czasu opóźnienia (ACF_rd). (D) Można wyznaczyć dwie różne funkcje korelacji krzyżowej: iv) korelację krzyżową "PIE" (CCF_PIE) z sygnałami kanału zielonego w oknie czasowym sygnału skorelowanym z sygnałami kanału czerwonego w oknie opóźnienia, gdzie amplituda tej krzywej jest związana z kodyfuzją fluoroforów; oraz v) korelacja krzyżowa "FRET" (CCF_FRET) z sygnałami kanału zielonego w oknie czasowym zachęty skorelowana z sygnałami kanału czerwonego w tym samym oknie podpowiedzi; tutaj kształt tej krzywej czasami szybszy niż dyfuzja jest związany ze zmianami intensywności wywołanymi przez FRET. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Kalibracja
Rysunek 2A-B pokazuje pomiar kalibracyjny odpowiednio dyfuzyjnych zielonych i czerwonych fluoroforów. Na podstawie dopasowania z równaniem 1 i znanym współczynnikiem dyfuzji D_green²⁶ i D_red²⁷ kształt (z₀ i w₀) oraz rozmiar (V_eff) przestrzeni detekcji są obliczane przy użyciu równania 2a-c. Wyniki dopasowania z ACF_gp z zielonego fluoroforu i ACF_rd z czerwonego fluoroforu są podsumowane w Rysunek 2C. Oba fluorofory wykazują dodatkową stałą czasu relaksacji wynoszącą odpowiednio 8,6 μs (18%) i 36 μs (15%). Jasność molekularna (równanie 5a-b) zielonego i czerwonego fluoroforu wynosi odpowiednio 12,5 kHz na cząsteczkę i 2,7 kHz na cząsteczkę.

Dla wiarygodnego oszacowania wielkości i kształtu objętości konfokalnej, jak również jasności molekularnej, zaleca się wykonanie 3-5 pomiarów na eksperyment kalibracyjny i łączne (lub globalne) dopasowanie wszystkich powtórzeń.

Przesłuch α (Rysunek 2D, równanie 3) i bezpośrednie wzbudzenie akceptora przez δ zielonego lasera (Rysunek 2E, równanie 4) dla tej pary fluoroforów wynoszą odpowiednio ~15% i ~ 38%.

figure-results-2
Rysunek 2: Pomiary kalibracyjne swobodnie dyfuzyjnego wzorca kalibracyjnego koloru zielonego i czerwonego. (A-B) Reprezentatywny pomiar 60 s wzorca kalibracyjnego 2 nM zielonego (A) i 10 nM czerwonego (B) dopasowanego do modelu dyfuzji 3D, z uwzględnieniem dodatkowego czasu relaksacji (równanie 1). Tabela w panelu (C) pokazuje wyniki dopasowania i parametr pochodny na podstawie równania 2a-c i równania 5a-b. *Współczynniki dyfuzji zostały zaczerpnięte z literatury²⁶^,²⁷. (D) Wyznaczenie α przesłuchu sygnału zielonego do kanałów czerwonych (równanie 3). Widmo wzbudzenia zielonego standardu jest pokazane w kolorze niebieskozielonym, widmo emisyjne w kolorze zielonym. Linie lasera wzbudzenia o długości fali 485 nm (niebieska) i 561 nm (pomarańczowa) są pokazane jako linie przerywane. Przezroczyste pola w kolorze zielonym i purpurowym pokazują zebrany zakres emisji (uwaga uzupełniająca 2). (E) Wyznaczanie bezpośredniego δ wzbudzenia czerwonego fluoroforu za pomocą lasera o długości fali 485 nm (równanie 4). Kod kolorystyczny jest identyczny z (D), jasny i ciemnopomarańczowy pokazują odpowiednio widmo wzbudzenia i emisji czerwonego wzorca. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby określić i skalibrować nakładanie się objętości wzbudzenia zielonego i czerwonego, używa się podwójnie znakowanej podwójnej nici DNA (Rysunek 3A), jak opisano powyżej. W tym przypadku fluorofory są oddalone od siebie o 40 pz, tak że nie może wystąpić FRET między zielonymi i czerwonymi fluoroforami przyczepionymi do końców podwójnych nici DNA. Rysunek 3B pokazuje autokorelacje zarówno z fluoroforów w kolorze zielonym (ACF_gp) i magenta (ACF_rd) oraz korelację krzyżową PIE, CCF_PIE, w kolorze cyjan. Należy pamiętać, że dla CCF_PIE sygnał w zielonych kanałach w oknie czasu zachęty jest skorelowany z sygnałem w czerwonych kanałach w oknie czasu opóźnienia¹⁶.

Tutaj uzyskuje się średni współczynnik dyfuzji dla nici DNA D₌ 77 μm²/s. Więcej szczegółów na temat obliczeń można znaleźć w protokole krok po kroku, uwaga uzupełniająca 4. Wartość tę uzyskuje się przez wstawienie do równania 2a skalibrowanych wielkości skalibrowanych zielonych i czerwonych objętości detekcji ( 2) oraz odpowiednich czasów dyfuzji ACF_gp i ACF_rd nici DNA ( Rysunek 3C). Następnie, korzystając z uzyskanych wartości korekcyjnych r_GR i r_RG, a następnie stosując równanie 6, można określić ilość kodyfuzji, tj. podwójnie znakowanych cząsteczek (lub kompleksów białkowych w przypadku kotransfekcji dwóch różnych białek) z próbek komórkowych.

figure-results-3
Rysunek 3: Kalibracja objętości zielono-czerwonej nakładającej się na siebie za pomocą próbki DNA. (A) Nić DNA używana do kalibracji zawiera zielony i czerwony fluorofor kalibracyjny, z odległością 40 pz pomiędzy nimi. Odległość między barwnikami musi być wystarczająco duża, aby wykluczyć FRET między fluoroforami. (B) Reprezentatywny pomiar 60 s roztworu DNA o stężeniu 10 nM. Autokorelacje z obu fluoroforów w kolorze zielonym (ACF_gp, zielony standard) i magenta (ACF_rd, czerwony standard) oraz korelacji krzyżowej PIE, CCF_PIE, w kolorze niebieskim. Tabela w panelu (C) przedstawia wyniki dopasowania w oparciu o model dyfuzji 3D z uwzględnieniem dodatkowego współczynnika relaksacji (równanie 1) i pochodnego parametru współczynnik dyfuzji DNA, _{D DNA} (równanie 2a), wielkość i kształt objętości nakładania się (równanie 2a-c) oraz współczynniki korekcji r_GR i r_RG (równanie 6). Należy pamiętać, że wartości zielonej i czerwonej objętości detekcji (oznaczonej *) zostały zaczerpnięte z dopasowania poszczególnych fluoroforów pokazanych na Rysunek 2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Eksperymenty z żywymi komórkami
W poniższej sekcji przedstawiono analizę eksperymentów na żywych komórkach dla różnych konstruktów AR β₂. Ponieważ β₂AR jest białkiem błonowym, jego dyfuzja jest w dużej mierze ograniczona do dwuwymiarowej dyfuzji (Rysunek 4A) wzdłuż błony komórkowej (z wyjątkiem procesów transportu lub recyklingu do lub z błony) ². Przy ograniczeniu do dyfuzji 2D współczynnik kształtu s = z₀/w₀ w równaniu 1 staje się przestarzały, co skutkuje uproszczonym modelem dyfuzji (równanie 9).

Konstrukcje z pojedynczymi etykietami: β₂AR-IL3-eGFP i NT-SNAP-β ₂AR
Rysunek 4 pokazuje przykładowe pomiary konstruktu pojedynczej etykiety_{β 2}AR-IL3-eGFP (Rysunek 4B), gdzie eGFP jest wstawiony do pętli wewnątrzkomórkowej 3, oraz konstrukcji NT-SNAP-β₂AR (Rysunek 4C), gdzie znacznik SNAP jest sprzężony z N-końcem β₂AR. Znacznik SNAP jest oznaczony nieprzepuszczalnym dla membrany podłożem powierzchniowym SNAP. Krzywe reprezentatywne pokazują średnią z 4-6 powtórzonych pomiarów z czasami akwizycji 120 - 200 s każdy. Odpowiednie autokorelacje ACF_gp i ACF_rd sygnału eGFP i SNAP są dopasowane do bimodalnego, dwuwymiarowego modelu dyfuzji (równanie 9). Jeśli chodzi o szybką dynamikę, eGFP pokazuje tylko oczekiwane migotanie trypletu przy t_R1 ~ 9 μs, podczas gdy sygnał SNAP wymaga dwóch czasów relaksacji, jednego przy typowym czasie trypletu t_R1 ~ 5 μs, a drugi przy t_R2 ~ 180 μs.

Molekularna jasność fluoroforów w żywych komórkach wynosi 0,8 KHz (eGFP) i 1,7 kHz (SNAP) na cząsteczkę w danych warunkach wzbudzenia (eqs. 5a-b). Stężenie znakowanych β₂konstruktów AR wbudowanych w błonę komórkową powinno mieścić się w zakresie nanomolowym i można je określić na podstawie średniej liczby cząsteczek (równanie 9, Rysunek 4C) i wielkości odpowiedniej objętości konfokalnej dla kanału zielonego i czerwonego ( Rysunek 2) przy użyciu równania 8.

figure-results-4
Rysunek 4: Reprezentatywny pomiar konstrukcji o pojedynczej etykiecie. (A) W tym badaniu jako przykład użyto receptora błonowego_{β 2}AR. W przeciwieństwie do fluoroforów i nici DNA używanych do kalibracji, które mogą swobodnie unosić się w przestrzeni detekcji, białka błonowe dyfundują głównie bocznie wzdłuż błony, co określa się mianem dyfuzji dwuwymiarowej. (B, D) ACF_gp i ACF_rd konstrukcji jednoznacznikowych β₂AR-IL3-eGFP (B) i NT-SNAP-β₂AR (D). Pokazano średnią z 4-6 pomiarów, z których każdy został wykonany przez 120 - 200 s. Tabela w panelu (C) przedstawia wyniki dopasowania danych do bimodalnego dwuwymiarowego modelu dyfuzji z uwzględnieniem dodatkowych warunków relaksacji (równanie 7). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Konstrukcja z podwójnym znacznikiem: NT-SNAP-β ₂AR-IL3-eGFP
W podwójnie znakowanej konstrukcji NT-SNAP-β₂AR-IL3-eGFP (w skrócie NT-SNAP), eGFP jest wprowadzany do pętli wewnątrzkomórkowej 3, a znacznik SNAP jest sprzężony z N-końcem_{β 2}AR (Rysunek 5A). W tej konfiguracji eGFP znajduje się po wewnętrznej stronie membrany, a SNAP po stronie zewnętrznej, przy czym odległości są zbyt duże dla FRET. W idealnym przypadku ten konstrukt wykazywałby 100% kodyfuzję zielonego i czerwonego fluoroforu i brak sygnału FRET. Rysunek 5B-D pokazuje dwa pomiary NT-SNAP w dwóch komórkach w dwóch różnych dniach pomiaru. Dopasowanie ACF_gp i ACF_rd do "lepszego" pomiaru pokazanego w Rysunek 5B z równaniem 7 i CCF_PIE z równaniem 9, ujawnia 50-60 cząsteczek w centrum uwagi dla ACF_gp i ACF_rd, podczas gdy N_app, a więc 1/G₀(t_c) ~ 114 dla CCF_PIE (Rysunek 5C). Stężenie znakowanych receptorów mieści się w zakresie ~100 nM, jak określono za pomocą równania 8. Aby określić średnie stężenie podwójnie znakowanych cząsteczek, najpierw oblicza się stosunek G₀(t_c) (reprezentowany przez 1/N_(app)) _{CCF PIE} do ACF_gp i ACF_rd, odpowiednio, (równanie 6). Następnie wartości te, r_GRcell= 0,43 i r_RGcell = 0,53, są porównywane z wartościami uzyskanymi z pomiaru DNA (r_{GR, DNA}= 0,51 i r_{RG, DNA} = 0,79 w tym dniu pomiaru). Stosując regułę proporcji, a r_GRcell = 0,43 od ACF_gp sygnału eGFP odbija się do frakcji kodyfuzji (r_GRcell/r_GR,DNA) wynoszącej 0,84, podczas gdy dla drugiego przypadku ACF_rd sygnału substratu SNAP wartość ta wynosi 0,67. Średnie stężenie podwójnie znakowanego konstruktu NT-SNAP można ostatecznie obliczyć na podstawie równania 10. Natomiast w pomiarze pokazanym na Rysunek 5D z innego dnia, stężenie receptorów jest dość niskie, a dane bardzo zaszumione, tak że zakres dopasowania jest ograniczony do ~ 10 μs. Ponadto obserwuje się tylko niewielką ilość kodyfuzji (15 - 26%).

figure-results-5
Rysunek 5: Podwójnie oznaczona konstrukcja NT-SNAP-β₂AR-IL3-eGFP. (A) W konstrukcji podwójnie znakowanej eGFP wprowadza się do pętli wewnątrzkomórkowej 3, a znacznik SNAP dołącza się do N-końca β₂AR (NT-SNAP). (B, D) ACF_gp, ACF_rd i CCF_PIE z dwóch pomiarów podwójnie znakowanego konstruktu. Dane są dopasowane do bimodalnego dwuwymiarowego modelu dyfuzji (równanie 9, CCF_PIE) i zawierają dodatkowe warunki relaksacji (równanie 7, ACF_gpi ACF_rd). Tabela w panelu (C) przedstawia wyniki dopasowania i wyprowadzony parametr stężenie (równanie 8), stosunek amplitudy korelacji przy zerowym czasie korelacji (G₀(t_c)) i frakcji cząsteczek współdyfuzyjnych (równanie 10). Należy pamiętać, że pomiary zostały wykonane w różnych dniach, a więc zastosowano nieco inny współczynnik do korekcji amplitudy (B: r_GR,DNA = 0,51 i r_RG,DNA = 0,79; D: r_GR,DNA = 0,51 i r_RG,DNA = 0,56). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Podwójnie oznakowana konstrukcja w trakcie FRET: β₂AR-IL3-eGFP-CT-SNAP
W podwójnie znakowanym konstrukcie β₂AR-IL3-eGFP-CT-SNAP (Rysunek 6A), eGFP jest wprowadzany do wewnątrzkomórkowej pętli 3 identycznej jak konstrukcja NT-SNAP-β₂AR-IL3-eGFP ze znacznikiem SNAP dołączonym do C-końca. W tym przypadku obie etykiety znajdują się po tej samej stronie błony komórkowej komórek, tak że fluorofory znajdują się w bliskim sąsiedztwie, tak że FRET występuje zgodnie z wygaszonym czasem życia eGFP (uwaga uzupełniająca 5). Biorąc pod uwagę elastyczność stosunkowo nieustrukturyzowanych regionów białkowych, takich jak C-endus³⁴ i co najmniej dwie różne konformacje białek GPCRs³⁵, "high FRET" (HF) lub "low FRET" (LF), dynamiczne zmiany wydajności FRET spowodowane zmianami odległości eGFP-SNAP można zaobserwować i zidentyfikować za pomocą składnika antykorelacji w _{CCF FRET} (pomarańczowa krzywa w Rysunek 6B). Wykazano, że fluktuacje FRET są antyskorelowane, ponieważ receptor może znajdować się tylko w jednym stanie na raz, albo HF, albo LF. Łączne (lub globalne) dopasowanie wszystkich pięciu krzywych korelacji (Rysunek 6B) ujawnia ~70% wolno dyfuzyjnych cząsteczek przy ~ 100 ms, podczas gdy reszta dyfunduje z ~ 1 ms. Wszystkie autokorelacje i _{CCF FRET} wykazują warunki relaksacji przy 37 μs i 3 μs; te korelacje zdominowane przez sygnał czerwony (ACF_rp, ACF_rd i CCF_FRET) pokazują dodatkową powolną składową ~ 50 ms (Rysunek 6C).

Zmiany wywołane przez _{FRET na CCF FRET} w różnych warunkach (Rysunek 6D) są demonstrowane przez serię symulacji systemu dwustanowego z czasem fluktuacji 70 μs między stanami LF i HF. Po przełączeniu ze stanu LF na HF zmiany w sygnale antyskorelowanym są obserwowane w oknie czasowym zachęty: sygnał zielony maleje, a sygnał czerwony wzrasta (odwrotnie w przypadku przełączania HF -> LF). Jeśli przełączanie HF-LF zachodzi w skalach czasowych szybszych niż czas dyfuzji, innymi słowy podczas czasu przebywania cząsteczki w ognisku, szybkość można wyprowadzić z antykorelacji w CCF_FRET⁶^,³¹^,³⁶. Należy pamiętać, że w FCS nie można zaobserwować procesów dynamicznych wolniejszych niż czas dyfuzji.

W tej demonstracji założono dwa różne scenariusze FRET, pokazujące umiarkowaną lub maksymalną zmianę efektywności FRET między dwoma stanami. Symulacje zostały przeprowadzone przy użyciu Burbulator³⁷ i uwzględniają brak lub obecność mrugania trypletów i zwiększającą się ilość przesłuchów dawcy do kanałów czerwonych. Człon dyfuzji modelowano jako rozkład bimodalny, w którym 30% cząsteczek szybko dyfundujących przy t_D1 = 1 ms i pozostałych cząsteczkach dyfundujących powoli przy t_D2 = 100 ms. W sumie zasymulowano 10⁷ fotonów w objętości 3D w kształcie Gaussa z w₀ = 0,5 μm i z₀ = 1,5 μm, rozmiarem pudełka 20 i N_FCS = 0,01.

Rysunek 6E-F pokazuje wyniki symulacji dla indukowanej przez FRET korelacji krzyżowej_{CCF FRET} dla umiarkowanego (Rysunek 6E) i maksymalnego kontrastu FRET (Rysunek 6F) w przypadku braku (linie ciągłe) i obecności mrugania trypletów (linie przerywane). Antykorelację indukowaną przez FRET można łatwo zobaczyć w Rysunek 6F. Efekt "tłumienia" po dodaniu dodatkowego stanu trypletu zmniejsza amplitudę korelacji (Rysunek 6E-F)³⁸^,³⁹.

figure-results-6
Rysunek 6: Symulacja podwójnie znakowanej próbki pokazującej dynamiczny FRET. (A) Podwójnie znakowany β₂AR z eGFP wstawionym do pętli wewnątrzkomórkowej 3 i C-końcowym znacznikiem SNAP. Oba fluorofory są wystarczająco blisko, aby ulegać FRET i wykazują zmiany w wydajności FRET, jeśli receptor ulega dynamice białka. (B) Autokorelacja (ACF_gp, ACF_rp i ACF_rd, dopasowanie do równania 7) i krzywe korelacji krzyżowej (CCF_FRET (równanie 7) i CCF_PIE (równanie 9)) przykładowego pomiaru. Tabela w panelu (C) pokazuje wyniki dopasowania. (D-F) W celu ukazania wpływu parametru eksperymentalnego na oczekiwany, indukowany przez FRET składnik antykorelacji przeprowadzono 12 symulacji, w których modelowano zmianę wydajności FRET (małą lub dużą), różną ilość przesłuchów donorowych do kanałów akceptorowych (0%, 1% lub 10%) oraz brak i obecność mrugania trypletowego. Ułamek równowagowy obu stanów FRET przyjęto na 50:50, a ich kursy dostosowano tak, aby uzyskany czas relaksacji t_R = 70 μs. Więcej szczegółów na temat symulacji znajduje się w tekście. (E) CCF_FRET wyników symulacji z umiarkowanym kontrastem FRET i przy braku przesłuchów (ciemnopomarańczowy), 1% przesłuchu (pomarańczowy) i 10% przesłuchu (jasnopomarańczowy). Linie ciągłe pokazują wyniki przy braku trypletu, linie przerywane w obecności trójki. (F) _{CCF FRET} wyników symulacji z maksymalnym kontrastem FRET. Kod koloru jest identyczny z (E). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Jednak w symulacji najbardziej zbliżonej do warunków eksperymentalnych (α = 10%, 15% trypletowego mrugania i umiarkowany kontrast FRET, przerywana żółta linia w Rysunek 6E), człon antykorelacji jest prawie zaniżony. Rysunek 7 pokazuje wynik analizy tych symulowanych danych przy użyciu informacji zakodowanych w histogramach czasu nadejścia fotonów (tj. czasu życia fluorescencji) za pomocą spektroskopii korelacji czasu życia fluorescencji (FLCS)¹⁷^,¹⁹ lub FCS filtrowany gatunkowo (fFCS)¹⁸. W tym przypadku czasy życia fluorescencji znanych gatunków HF i LF (Rysunek 7A) są wykorzystywane do generowania wag lub "filtrów" (Rysunek 7B), które są stosowane podczas procedury korelacji. W otrzymanych krzywych autokorelacji gatunkowej i krzyżowej (Rysunek 7C-D) można wyraźnie zaobserwować antykorelację.

figure-results-7
Rysunek 7: Filtrowany przez cały czas życia FCS może pomóc w odkryciu opartych na dynamice białek fluktuacji wydajności FRET w próbkach o wysokim przesłuchu, znaczącym mruganiu trypletów lub innych właściwościach fotofizycznych lub eksperymentalnych maskujących antykorelację indukowaną przez _{FRET w CCF FRET.} W tym miejscu podejście jest pokazane przykładowo dla danych pokazanych w Rysunek 6E dla symulacji zawierającej 10% przesłuchów i 5% trypletowego mrugania. (A) Znormalizowane wzorce intensywności zaniku fluorescencji dla dwóch gatunków FRET (jasnozielony i ciemnozielony odpowiednio dla wysokiego i niskiego FRET) oraz IRF (szary). Wzorzec dla równoległego kanału detekcji jest pokazany liniami ciągłymi, liniami przerywanymi dla prostopadłego kanału detekcji. (B) Funkcja ważenia lub "filtr" zostały wygenerowane na podstawie wzorów pokazanych w (A), kod koloru jest identyczny jak w (A). Należy pamiętać, że uwzględniany jest tutaj tylko sygnał w zielonych kanałach detekcji, a tym samym wygaszanie dawcy wywołane przez FRET. (C) Uzyskuje się cztery różne korelacje gatunkowe: autokorelacje gatunkowe stanu niskiego FRET (sACF_LF-LF, ciemnozielony) i wysokiego stanu FRET (sACF_HF-HF, jasnozielony) oraz dwie korelacje międzygatunkowe między stanem niskiego FRET a stanem wysokiego FRET (sCCF_LF-HF, ciemnopomarańczowy) i odwrotnie (sCCF_HF-LF, pomarańczowy). sCCF wyraźnie pokazuje antykorelację w zakresie μs. Przerywane czarne linie pokazują pasowania. sACF były dopasowane do równania 9, a sCCF do równania 11. Tabela w panelu (D) pokazuje wyniki dopasowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

CCF_PIE amplituda do badania interakcji białko-białko (PPI)
Wreszcie, częstym przypadkiem użycia FCS opartego na PIE w żywych komórkach jest badanie interakcji między dwoma różnymi białkami. Tutaj parametrem odczytu jest amplituda _{CCF PIE,} a dokładniej stosunek amplitud autokorelacji ACF_gp i ACF_rd do amplitudy CCF_PIE. Aby pokazać wpływ rosnącej kodyfuzji na CCF_PIE, przeprowadzono symulacje w oparciu o dwa jednoznakowane konstrukty, β₂AR-IL3-eGFP i NT-SNAP-β₂AR (Rysunek 8A). Rysunek 8B pokazuje, jak zwiększa się amplituda _{CCF PIE}, gdy frakcja cząsteczek współdyfuzyjnych zmienia się z 0% na 100%. Należy pamiętać, że 1% przesłuch sygnału zielonego do kanałów czerwonych w oknie czasu opóźnienia został dodany z komponentami dyfuzyjnymi inaczej modelowanymi, jak pokazano powyżej.

figure-results-8
Rysunek 8: _{CCF PIE} może być używany do badania interakcji dwóch białek. (A) Tutaj zasymulowano badanie kotransfekcji_{β 2}AR-IL3-eGFP z NT-SNAP-β₂AR (posiadającym "czerwoną" etykietę SNAP). (B) Dla rosnącej ilości cząsteczek współdyfuzyjnych (0% (ciemnoniebieski) -> 100% (jasnoniebieski)) amplituda G(t_c) wzrasta. Okres dyfuzji został ponownie zamodelowany jako rozkład bimodalny, w którym 30% cząsteczek szybko dyfunduje przy t_D1 = 1 ms, a reszta cząsteczek dyfunduje powoli przy t_D2 = 100 ms. Dodatkowo dodano 1% przesłuchu sygnału zielonego do czerwonego okna czasowego opóźnienia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

symbol	Znaczenie (wspólna jednostka)
α	przesłuch zielonego fluoroforu po wzbudzeniu zielonym do czerwonych kanałów detekcyjnych (%)
a₁	frakcja pierwszego składnika dyfuzji w bimodalnym modelu dyfuzji receptorów błonowych
a_f	całkowita amplituda członu antykorelacji
_{a R}	amplituda fotofizyki /tryplet mrugania
b	linia bazowa / przesunięcie krzywej korelacji
W	jasność molekularna fluoroforu ((kilo-)liczy się na cząsteczkę i sekundę)
Bg	background (np. z odpowiedniej próbki referencyjnej: ddH2O, bufor, komórka nietransfekowana itp.)
c	koncentracja
Cr	szybkość zliczania (KHz lub (kilo-) zliczenia na sekundę)
δ	bezpośrednie wzbudzenie czerwonego fluoroforu po wzbudzeniu zielonym (%)
D	współczynnik dyfuzji (μm²/s)
G(t_c)	funkcja korelacji
N	liczba cząsteczek w centrum uwagi
N_A	liczba Avogadro (6.022*10²³ ^Mol-1)
r_GR, r_RG	stosunek amplitudy zielonej lub czerwonej funkcji autokorelacji do funkcji korelacji krzyżowej opartej na PIE
s	współczynnik kształtu konfokalnego elementu objętościowego
t_c	czas korelacji (zwykle w milisekundach)
_{t D}	czas dyfuzji (zwykle w milisekundach lub mikrosekundach)
_{t R}	czas relaksacji fotofizyki (zwykle w mikrosekundach)
t_T	czas relaksu mrugania trypletów (zwykle w mikrosekundach)
w₀	połowa szerokości konfokalnego elementu objętościowego (μm)
z₀	połowa wysokości konfokalnego elementu objętościowego (μm)

Tabela 1: Lista zmiennych i skrótów. Do stosowania symboli i definicji w eksperymentach fluorescencyjnych i FRET zalecane są wytyczne społeczności FRET⁴⁰.

PLIKI DODATKOWE:

SuppNote1_Coverslip cleaning.docx Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

SuppNote2_Confocal Setup.docx Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

SuppNote3_Data export.docx Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

SuppNote4_FCCS analiza kalibracji za pomocą ChiSurf.docx Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

SuppNote5_Fluorescence histograms.docx dożywotni Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

S6_Scripts.zip Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

S7_Excel_templates.zip Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Techniki FCS w GPCR pozwalają na ocenę ruchliwości i interakcji receptorów wewnątrz żywych komórek⁴¹. Zaletą techniki FRET-FCS jest to, że wraz z mobilnością można badać dynamikę konformacyjną GPCR. Jednak wykonanie FRET-FCS w żywych komórkach jest trudne i wymaga komórek, które wykazują niską (lub maksymalnie umiarkowaną) ekspresję białka znakowanego fluorescencyjnie, dobrze skalibrowaną konfigurację i dobry potok do analizy danych. W tym miejscu najpierw omówiono krytyczne punkty przygotowania próbki i procedury eksperymentalnej z punktu widzenia biologicznego, spektroskopowego i technicznego.

Krytyczne etapy eksperymentalne obejmują minimalizację tła i autofluorescencji (przy użyciu dokładnie oczyszczonych szkiełek nakrywkowych i pożywek wolnych od czerwieni fenolowej), optymalizację warunków transfekcji (np. ilość plazmidowego DNA i czas po transfekcji) w celu osiągnięcia niskich poziomów ekspresji i wydajnego znakowania. Oczywiście ważne jest również, aby upewnić się, że funkcja znakowanego białka nie jest zakłócona. Tak więc w eksperymentach z żywymi komórkami decyzja o strategii znakowania i pozycji znacznika jest często podejmowana na korzyść białek fluorescencyjnych lub znacznika SNAP / CLIP przymocowanego do elastycznego końca N lub C^42,43. W ostatnich latach pojawiły się alternatywne strategie znakowania, takie jak wstawienie nienaturalnego aminokwasu z reaktywnym łańcuchem bocznym w celu znakowania za pomocą organicznego fluoroforu⁴⁴.

W przypadku dwukolorowego PIE-FCS, w którym badane jest tylko oddziaływanie dwóch cząsteczek będących przedmiotem zainteresowania, fluorofory można wybrać z szerokiej gamy uznanych białek fluorescencyjnych lub substratów SNAP/CLIP. Tutaj, z punktu widzenia spektroskopii, celem powinno być wybranie pary tak, aby występowały niewielkie przesłuchy lub bezpośrednie wzbudzenie akceptora. Dodatkowo, wybrane fluorofory powinny być fotostabilne i wykazywać niewielkie lub żadne wybielanie w wybranych warunkach eksperymentalnych. Zaleca się wybór fluoroforów w czerwonym zakresie spektralnym, ponieważ (1) tło autofluorescencji z komórki jest zmniejszone i (2) światło wzbudzające ma większą długość fali, a zatem jest mniej fototoksyczne¹⁴. Fotowybielanie można zminimalizować, przeprowadzając najpierw tak zwany "szereg mocy", w którym moc lasera jest zwiększana stopniowo i obserwuje się jasność molekularną. Optymalny zakres intensywności wzbudzenia leży w liniowym zakresie wyników⁴⁵.

Jeśli te dwie etykiety mają również informować o dynamice konformacji białek za pomocą FRET, to wybór dostępnych fluoroforów jest bardziej ograniczony. W tym przypadku możliwa minimalna/maksymalna odległość między dwoma fluoroforami powinna być oszacowana z góry, np. na podstawie dostępnych struktur lub wielkości cząsteczki, a para fluoroforów wybrana z rozsądnym promieniem Förstera R₀ tak, że FRET może faktycznie wystąpić²⁰.

W tym przypadku do etykietowania wybrano eGFP i znacznik SNAP, a znacznik SNAP został oznaczony substratem wewnątrzkomórkowym lub nieprzepuszczalnym dla błony. Widma są podobne do tych pokazanych na rysunku 2C-D. Ta kombinacja fluoroforów wykazuje wysoki przesłuch eGFP do czerwonych kanałów detekcji i bezpośrednie wzbudzenie akceptora substratu SNAP przez zielone wzbudzenie w oknie czasowym monitu i powoduje znaczący "fałszywy" sygnał w czerwonych kanałach w oknie czasowym monitu. Idealnie, obie wartości, przesłuch i bezpośrednie wzbudzenie akceptora, nie powinny przekraczać 5%^5,6,38. Jednak dzięki promieniowi Förstera wynoszącemu 57 A idealnie nadaje się do sondowania odległości między etykietami w konstrukcji β₂AR-IL3-eGFP-CT-SNAP, która może być oceniona na podstawie wygaszonego czasu życia eGFP (uwaga uzupełniająca 5).

Technicznie, tak jak w przypadku każdego eksperymentu ze spektroskopią fluorescencyjną, urządzenie powinno być dobrze ustawione i powinno posiadać odpowiednie źródła wzbudzenia, filtr emisyjny i czułe detektory. Aby uniknąć artefaktów spowodowanych impulsami detektora w skali czasu μs, powinny być obecne co najmniej dwa detektory każdego koloru, które mogą być skorelowane krzyżowo. We współczesnej elektronice liczącej pojedyncze fotony skorelowanej w czasie, czas martwy karty detekcyjnej w zakresie czasu ns prawie nie odgrywa roli ze względu na niezależne kanały routingu, jednak można go sprawdzić zgodnie z propozycją Müllera i wsp. ¹⁶, pod warunkiem, że interesujący go zakres czasowy leży w zakresie czasu sub-μs/ns. Dodatkowo, aby uzyskać jeszcze wyższe rozdzielczości czasowe w zakresie ps, każdy kanał detekcji powinien być podwojony, tj. należy użyć czterech detektorów na kolor, aby ominąć również czasy martwego detektora 2,15,29,46. Podczas gdy średni czas życia fluorescencji można oszacować za pomocą niespolaryzowanej detekcji fluorescencji, do analizy odległości (~rozkładu) między fluoroforami emisja musi być zbierana w zależności od polaryzacji. Wynika to z faktu, że efektywność transferu energii w FRET zależy od orientacji dwóch fluoroforów. Więcej szczegółowych informacji można znaleźć tutaj 20,28,47. Wreszcie, w eksperymentach PIE, odległość między impulsem szybkim i opóźnionym jest krytyczna i powinna być tak dobrana, aby intensywność fluorescencji fluoroforów została w znacznym stopniu zaniżona (Rysunek 1B). Powszechną zasadą jest umieszczanie dwóch impulsów w odległości 5-krotności czasu trwania fluorescencji od siebie, tj. dla eGFP o czasie trwania fluorescencji 2,5 ns odległość powinna wynosić 12,5 ns przy minimum²².

Po wyszczególnieniu wszystkich rozważań dotyczących procedury eksperymentalnej, dane i ich analiza są omawiane bardziej szczegółowo. Jak wspomniano w sekcji protokołu, wyrównanie konfiguracji musi być sprawdzane codziennie, w tym analiza pomiarów kalibracyjnych. Dane pokazane na rysunku 2A-C pokazują np. dodatkową składową relaksacyjną w zakresie 8-40 μs. Wiadomo, że typowe trypletowe mruganie zielonego fluoroforu kalibracyjnego występuje w zakresie 2-10 μs 13,15,48. Składnik powolnej relaksacji wymagany we wszystkich krzywych próbki DNA (ryc. 3C), zbyt wolny dla rzeczywistego mrugania trypletów, może wynikać z oddziaływań DNA z fluoroforami³⁹. Jednak ten składnik nie byłby oczekiwany w CCF_PIE i najprawdopodobniej wynika z przesłuchów szczątkowych. W związku z tym zdecydowanie zaleca się przeprowadzenie analizy próbek kalibracyjnych bezpośrednio przed przystąpieniem do eksperymentów z komórkami, aby ocenić jakość wyrównania w ciągu dnia.

Właściwa kalibracja objętości nakładania się konfokalnego wymaga próbki ze 100% kodyfuzją zielonej i czerwonej etykiety. W tym przypadku stosuje się znakowane fluorescencyjnie dwuniciowe DNA. Obie nici DNA można dostosować tak, aby miały pożądane fluorofory w wymaganej odległości od siebie. Zaprojektowane pasma można wyżarzać z dużą wydajnością. Jednak Dobra Praktyka Laboratoryjna zaleca sprawdzenie integralności i stopnia znakowania nici DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i pomiar widma absorpcji. Należy również sprawdzić wydajność zespołu dwuniciowego, ponieważ ten pomiar kalibracyjny opiera się na założeniu, że istnieje 100% kodyfuzja koloru zielonego z czerwoną etykietą. W przypadku gdy założenie nie jest prawidłowe, konieczne może być zastosowanie współczynników korygujących^16,22. W pomiarach kalibracyjnych pokazanych na rys. 2 i rys. 3 uzyskano objętość detekcji wynoszącą odpowiednio 1,4 fL i 1,9 fL w kanale zielonym i czerwonym. Ta różnica wielkości jest oczekiwana dla układu o objętościach wzbudzenia prawie ograniczonych dyfrakcją (uwaga uzupełniająca 2). W tym stanie wielkość objętości wzbudzenia skaluje się wraz z długością fali wzbudzenia. To z kolei wyjaśnia różne amplitudy korelacji zaobserwowane na rysunku 3B. Wyprowadzone współczynniki korekcyjne r_GR = 0,56 i r_RG = 0,72 korygują tę rozbieżność wielkości i potencjalne niedoskonałe nakładanie się dwóch objętości wzbudzenia ^3,4.

Ryc. 4, Ryc. 5, Ryc. 6 i Ryc. 7 przedstawiają przebieg badania opartego na PIE-F(C)CS, którego celem jest zrozumienie dynamiki konformacyjnych białek. Po pierwsze, dwa jednoznakowane konstrukty β₂AR-IL3-eGFP i NT-SNAP-β₂AR służą jako kontrole do scharakteryzowania właściwości fluoroforu w komórkach pod nieobecność odpowiedniego innego fluoroforu (Figura 4). Następnie podwójnie znakowany konstrukt NT-SNAP-β₂AR-IL3-eGFP z tagiem SNAP skierowanym na zewnątrz komórki i eGFP po stronie cytoplazmatycznej służy jako kontrola "100% kodyfuzji" (ryc. 5). Ostatni konstrukt, β₂AR-IL3-eGFP-CT-SNAP, przenosi oba fluorofory po stronie cytoplazmatycznej i wystarczająco blisko siebie, aby przejść FRET. W tym przypadku ponownie oczekiwana byłaby 100% kodyfuzja w połączeniu z antyskorelowanymi fluktuacjami intensywności sygnału kanałów zielonego i czerwonego w oknie czasowym impulsu, tj. po wzbudzeniu donora, ze względu na dynamikę białka wpływającą na wydajność FRET 31,32,33. Ta dynamika może objawiać się jako antykorelacja w _{CCF FRET} (Rysunek 6-7).

Wszystkie konstrukty GPCR β₂AR wykazują dyfuzję bimodalną na błonie komórkowej (ryc. 4A). Podczas gdy β₂AR-IL3-eGFP pokazuje tylko oczekiwane migotanie trypletowe (Rysunek 5B)^13,15, NT-SNAP-β₂AR pokazuje dodatkowy czas powolnego relaksowania (Rysunek 5C-D). Jest prawdopodobne, że t_R2 może pochodzić z niezwiązanego substratu SNAP. Można to wyjaśnić za pomocą dalszych eksperymentów, np. mierząc również właściwości dyfuzyjne i fotofizyczne zastosowanego substratu SNAP w roztworze wodnym. Warto zauważyć, że prostym eksperymentem mającym na celu rozróżnienie czasów dyfuzji i relaksacji jest zmiana otworka w układzie konfokalnym, tj. zwiększenie efektywnej objętości: Podczas gdy czasy dyfuzji zwiększają się wraz ze wzrostem objętości efektywnej, warunki relaksacji pozostają niezmienione¹³. Określając stężenie białka fluorescencyjnego (FP) na podstawie wyników dopasowania, należy pamiętać, że FP na ogół przechodzą proces dojrzewania, w którym ostatecznie powstaje chromofor¹². Ten czas dojrzewania może się różnić w zależności od FP oprócz fotofizyki, która zależy od lokalnego środowiska chemicznego^13,15. W związku z tym rzeczywiste stężenie białka obecnego w próbce zgłaszanej przez FCS jest zwykle niedoszacowane, co można skorygować, jeśli w doświadczeniu można określić frakcję niefluorescencyjnych FP. Na koniec wskazane jest sprawdzenie widm fluoroforów w żywych komórkach, aby skorygować wartości dla α i δ, jeśli jest to wymagane, ponieważ większość fluoroforów reaguje wrażliwie na środowisko 13,15,48. Tło do odjęcia jest określane przez sygnał zebrany w komórkach nietransfekowanych. Dodatkowo należy sprawdzić autokorelację odpowiedniego innego kanału koloru i _{CCF PIE}, aby móc zidentyfikować fałszywe sygnały (uwaga uzupełniająca 4 - rysunek 30).

Dwa pomiary z NT-SNAP-β₂AR-IL3-eGFP (ryc. 5D), w których fluorofory znajdują się po różnych stronach błony, zostały uzyskane w różnych dniach i pokazują znaczenie statystyki w fluorescencji pojedynczej cząsteczki rozdzielczej w czasie. W tym przypadku różne wyniki mogą wynikać z różnego stopnia oznakowania: w jednej komórce wyższy stopień etykietowania i uśredniania pomiarów skutkował stosunkowo niskim poziomem szumów (rysunek 5B), podczas gdy z drugiej komórki można było zebrać tylko dwa pomiary (rysunek 5A). Poza zebraniem wystarczającej ilości danych, kluczowe znaczenie ma ocena wyników w odpowiednim czasie i być może optymalizacja strategii etykietowania. Projektując eksperymenty, należy pamiętać, że FRET jest czuły, ale ograniczony do odległości do 10 nm i poza tym "ślepy". W naszym przypadku na tę "ślepotę" wskazuje niezmieniony czas życia fluorescencji eGFP (uwaga uzupełniająca 5). W konstrukcji β₂AR-IL3-eGFP-CT-SNAP (rysunek 6A) FRET można określić na podstawie wygaszonego czasu życia eGFP (uwaga uzupełniająca 5). Nie obserwuje się jednak żadnego składnika antykorelacji (ryc. 6B), co oznacza, że FRET albo nie ulega wahaniom, albo działa w skali czasowej wolniej niż czas dyfuzji. W ACF_gp, ACF_rp, ACF_rd i CCF_FRET wymagane są maksymalnie trzy dodatkowe warunki rozluźnienia (rysunek 6C). Powolny składnik w ACF_rp, ACF_rd i CCF_FRET może być spowodowany bieleniem akceptorowym i oczywiście wpływa na uzyskaną wartość powolnej dyfuzji stwierdzonej w tych krzywych (~350 ms w porównaniu do 117 ms w ACF_gp). Przyjmuje się, że t_D w kanale czerwonym jest nieco większe niż w kanale zielonym ze względu na różnej wielkości objętości konfokalne (ryc. 2) - ale tylko o współczynnik porównywalny z różnicą wielkości. Bardzo szybki czas relaksacji wynoszący 3 μs odzwierciedla trypletowe migotanie fluoroforów^13,15,48, podczas gdy wolniejszy czas relaksacji wynoszący 37 μs może być spowodowany FRET: Podobnie, ponieważ FRET indukuje antykorelację w CCF_FRET, dodatnie korelacje są oczekiwane w autokorelacjach 31,32,33. Obecność tego terminu jako "pozytywnego" w CCF_FRET i jego obecność w ACF_rd może być wyjaśniona wysokim przesłuchem i powinna być dokładniej wyjaśniona. Należy zauważyć, że _{CCF PIE} jest płaski w krótkich czasach korelacji zgodnie z oczekiwaniami.

Z drugiej strony należy zauważyć, że występowanie FRET w układzie będącym przedmiotem zainteresowania prowadzi do nieliniowych efektów na krzywe korelacji⁶. Jasność molekularna, np. cząsteczki, skaluje się do kwadratu amplitudy korelacji, a każdy stan FRET (i zawsze obecne cząsteczki bez aktywnego receptora) wykazuje inną jasność molekularną. Rzeczywiście, FRET zmniejsza pozorne stężenie wykrytych zielonych cząsteczek (tj. zwiększa amplitudę _{ACF gp}), a liczba czerwonych cząsteczek (określona na podstawie czerwonego podpowiedzi) jest przeszacowana^{o 5}. Oba efekty wpływają na ilość interakcji pochodzącej zarówno z CCF_FRET, jak i CCF_PIE. Jednak analiza globalna, jak pokazano np. dla dynamiki wewnątrzcząsteczkowej kalmoduliny ^31,32 lub syntaksyny³³, może ujawnić dynamikę białek. Po dokładnym skalibrowaniu średnią wydajność FRET można wyprowadzić ze względnych amplitud _{CCF PIE} i ACF²², podczas gdy stany graniczne można określić na podstawie analizy rozkładu czasu życia fluorescencji donora³³.

Biorąc pod uwagę fakt, że w eksperymentach z żywymi komórkami z dużymi fluoroforami, takimi jak eGFP, kontrast FRET będzie prawdopodobnie nawet niższy niż zakładano dla symulacji pokazanych na rysunku 6 i że bezpośrednie wzbudzenie akceptora nie zostało dodane w symulacji, może wyjaśniać, dlaczego identyfikacja antykorelacji w eksperymentach z żywymi komórkami jest bardzo trudna. Obiecująca alternatywa analityczna polega na zebraniu informacji zakodowanych w histogramach czasu nadejścia fotonów (Rysunek 1B), dostępnych dzięki skorelowanemu w czasie zbiorowi danych dotyczących zliczania pojedynczych fotonów^29,30. Jeśli znany jest czas trwania fluorescencji (~wzorce) dwóch (lub więcej) (FRET) gatunków wewnątrz próbki (Rysunek 7A), można wybrać "filtr" lub wagi, które są stosowane podczas procesu korelacji (Rysunek 7B)17,18,19. Uzyskane w ten sposób krzywe korelacji nie reprezentują już korelacji kanałów detekcji, ale raczej auto- lub korelacje krzyżowe między dwoma różnymi gatunkami (FRET), których nazwę zmieniono na gatunek-ACF (sACF) lub gatunek-CCF (sCCF). Zastosowanie tego podejścia do symulowanych danych z umiarkowanym kontrastem FRET, wysokim przesłuchem i trypletowym mruganiem przywraca składnik antykorelacji (Rysunek 7C-D). Należy jednak zauważyć, że czasy relaksacji można uzyskać, ale związek z amplitudą zostaje utracony¹⁸. Podejście to było wcześniej stosowane w eksperymentach z żywymi komórkami, np. do badania interakcji EGFR z jego antagonistą⁴⁹ lub do oddzielania fluorescencji od białek przyłączonych do wariantów eGFP o wyjątkowo krótkim i długim czasie życia fluorescencji⁵⁰.

Podczas gdy pomiary FRET oparte na PIE w oczyszczonych białkach są w dużej mierze wykorzystywane do badania dynamiki białek³⁶ ²², w żywych komórkach koncentrują się na zrozumieniu interakcji białko-białko. Podejście to zostało zastosowane do badania regulacji aktywności kinazy MAP u drożdży⁵¹ lub do rozwiązania interakcji białek błonowych z ich cytozolowym partnerem wiążącym, jak podsumowano w ostatnim artykule⁵². W tym przypadku komplikacje mogą wystąpić, gdy znaczny przesłuch zielonych fluoroforów jest nadal obecny w oknie czasowym opóźnienia kanałów czerwonych lub czerwony sygnał w zielonych kanałach w oknie czasowym monitu. Pierwsze z nich może być spowodowane niewystarczającym opóźnieniem impulsu czerwonego w stosunku do impulsu zielonego, podczas gdy oba efekty wynikają ze zbyt silnie nakładających się na siebie widm wzbudzenia i emisji wybranych fluoroforów. Zaleca się dokładne sprawdzenie odpowiednich pojedynczych znakowanych konstruktów i skorygowanie ich pod kątem fałszywie dodatnich amplitud _{CCF PIE}, szczególnie w komórkach, w których autofluorescencja o bardzo krótkim czasie życia fluorescencji może być kolejnym czynnikiem komplikującym²².

Podsumowując, opisane tutaj podejście FRET-FCS ma ogromny potencjał w zakresie zrozumienia interakcji białko-białko i dynamiki białek w żywych komórkach w stężeniach zbliżonych do fizjologicznych. W protokole tym skoncentrowano się na wymaganych pomiarach kalibracyjnych i niezbędnej analizie ilościowej, które należy wykonać podczas pomiarów na żywych komórkach. W tym celu zaprezentowano różne pomiary żywych komórek uzupełnione symulacjami. Symulacje zapewniają tutaj ogólne zrozumienie, ponieważ parametry mogą być systematycznie zmieniane za pomocą dostosowanych modeli dopasowania, które opisują specyficzną mobilność i właściwości fotofizyczne odpowiednich danych. Analiza została przeprowadzona za pomocą narzędzi programowych typu open source z rozbudowanym protokołem krok po kroku i łatwymi do dostosowania szablonami. Wreszcie, postęp techniczny, a tym samym dostępność gotowych do zakupu stabilnych systemów PIE-FCS wraz z rozpowszechnieniem oprogramowania open source do analizy danych, sprawią, że technika ta będzie coraz bardziej dostępna dla większej społeczności badawczej, aby ostatecznie rozwikłać interakcję i dynamikę białek w żywych komórkach z najwyższą czułością.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych konfliktów.

Podziękowania

Ten projekt był wspierany przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB/TR 240, numer projektu 374031971, Projekt INF) dla J. B. i K.G.H.

Dziękujemy Centrum Rudolfa Virchowa za wsparcie finansowe oraz Core Unit Fluorescence Imaging za wsparcie techniczne. Dodatkowo dziękujemy Ashwinowi Balakrishnanowi za dokładną korektę.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1x Teleskop w konfiguracji 4f z pięcioma obiektywami	Qioptiq, Rhyl, UK	G063126000	Optics
2x Filtry pasmowo-przepustowe Brightline	AHF, Tü bingen, Niemcy	HC 525/50 i HC 600/52	Filtr
2x Dichroiczny rozdzielacz wiązki	AHF, Tü bingen, Niemcy	HC BS F38-573	Filtr
6-dołkowa płytka hodowlana Nunc	Thermo Scientific (Waltham, USA)	140675	Odczynnik
Alexa Fluor 488 NHS Ester (zielony wzorzec kalibracji)	Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)	Odczynnik A20000
Alexa Fluor 568 NHS Eater (czerwony wzorzec kalibracji)	Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)	Odczynnik A20003
Stolik ASI PZ-2000 XYZ	Visitron Systems GmbH, Puchheim, Niemcy	WK-XYB-PZ-IX71	Części mikroskopu
Komora celowa Attofluor, średnica 35 mm do 25 mm okrągłych szkiełek nakrywkowych	Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)	A7816	Szklany uchwyt na szkiełko nakrywkowe
Fotodioda lawinowa Perkin Elmer (SPCM-AQR-14)	Laser Components GmbH, Olching, Niemcy	SPCM-AQR-14	Detektor zliczający pojedyncze fotony
Beamsplitter	Newport, Darmstadt, Niemcy	10FC16PB.3	Filter
Biorender (oprogramowanie)	Science Suite Inc - o/a BioRender (Toronto, Kanada)	---	Oprogramowanie używane do tworzenia szkicu GPCR, https://app.biorender.com/
Linia komórkowa jajnika chomika chińskiego (CHO)	ATCC	CCL-61	Linie komórkowe
ChiSurf (oprogramowanie do analizy danych)	Thomas-Otavio Peulen, Wydział Bioinżynierii i Nauk Terapeutycznych, Uniwersytet Kalifornijski, San Francisco, USAoprogramowanie		oparte na ---tttrlib do analizy danych korelacji fluorescencji i histogramów zaniku fluorescencji, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf Samouczek: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&t=2s Ref: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017)
Chloroform	Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)	472476-2.5L	Odczynnik
DMSO	AppliChem GmbH (Darmstadt, Niemcy)	A3672,0250
Odczynnik DNA (odległość fluoroforu 40 pz)	IBA Lifesciences GmbH (Gö ttingen, Niemcy)	---	Odczynnik, 5' CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3', 3' GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5'
Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże Eagle: Mieszanina składników odżywczych F12 (z czerwienią fenolową i bez)	GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)	P04-41250, P04-41650	Odczynnik
Etanol (absolutny)	Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)	34852-1L-M
Erytrozyna B, Zawartość barwnika >=95 %	Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)	200964-5G	, funkcja odpowiedzi instrumentu, rozpuść w EtOH do 10 mg / ml
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Biochrom (Berlin, Niemcy)	S 0615	Odczynnik
Fluorescencyjne źródło światła X-Cite 120 Q	Excelitas Technologies, Ontario, Kanada	XI120-Q-5060	Części mikroskopu
Fluorescencyjne podłoże SNAP komórka: Komórka SNAP TMR-STAR	New England BioLabs (Frankfurt nad Menem, Niemcy)	Odczynnik S9105S
Fluorescencyjna powierzchnia podłoża SNAP: DY-549	New England BioLabs (Frankfurt nad Menem, Niemcy)	S9112S	Szkiełka nakrywkowe z odczynnikiem
(Wymiary: średnica 24 mm, grubość 0,13 - 0,16 mm)	Marienfeld-Superior (Lauda-Kö nigshofen, Niemcy)	111640	Odczynnik
Laser Controller	Picoquant, Berlin, Niemcy	910020 (PDL 828-S "SEPIA II")	optyka
Linie laserowe (480 nm i 560 nm)	Picoquant, Berlin, Niemcy	912485 (LDH-D-C-485), 912561 (LDH-D-TA-560)	Optics
Lipofectamine 2000	Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)	Odczynnik
Pakiet MFD (oprogramowanie)	AG Seidel, Uniwersytet Heinricha Heinego w Düsseldorfie, Niemcy	---	Pakiet oprogramowania do analizy eksperymentów fluorescencyjnych pojedynczych cząsteczek, w tym np. Kristine (korelacja danych tttr), Burbulator (symulacja eksperymentu z pojedynczą cząsteczką), https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis
Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25,4 mm	Thorlabs, Bergkirchen, Niemcy	AC254-150-A-ML	Druga część ekspandera wiązki
Komora Neubauera (głębokość 0,1 mm)	Marienfeld-Superior (Lauda-Kö nigshofen, Niemcy)	640110
Odczynnik Olympus IX 71 stoisko	Olympus, Hamburg, Niemcy	IX2-ILL100	Części mikroskopu
Opti-MEM (pożywka o obniżonej surowicy)	GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)	31985-047	Odczynnik
Penicylina/Streptomycyna	Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)	049M4857V	Odczynnik
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	GIBCO, Life Technologies (Karlowe Wary, USA)	14190144	Odczynnik
otworkowy (50 &mikro; M)	Newport, Darmstadt, Niemcy	PNH-50	Pinhole
PMT Hybrid-40	Picoquant, Berlin, Niemcy	932200 (PMA Hybrid 40)	Detektor zliczający pojedyncze fotony
Skrypty Python (oprogramowanie)	Katherina Hemmen, Centrum Obrazowania Integracyjnego i Translacyjnego im. Rudolfa-Virchowa, Uniwersytet w Wuerzburgu, Niemcy	---	Zbiór samodzielnie napisanych skryptów Pythona opartych na tttrlib (https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib) służących do (1) określania średnich szybkości zliczania, (2) korelacji danych i (3) budowania histogramów zaniku fluorescencji, https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS
Czterozakresowy rozdzielacz wiązki (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1)	AHF, Tü bingen, Niemcy	Filtr F73-421PH	Utrzymywanie
polaryzacji światłowodu jednomodowego, NA = 0,08 z kolimatorem	Picoquant, Berlin, Niemcy	02126	Optyka
Wodorotlenek sodu (NaOH)	Carl Roth (Karlsruhe, Niemcy)	6771.1	Odczynnik
Oprogramowanie SymPhotime x64 (Oprogramowanie do zbierania i eksportu danych)	Picoquant, Berlin, Niemcy	931073 (SPT64-1+2 dla jednego użytkownika)	Gromadzenie danych z rozdzielczością czasową (tttr) w samodzielnie zbudowanej konfiguracji FCCS, eksport danych
System zliczania pojedynczych fotonów skorelowanych w czasie (TCSPC) Hydraharp 400	Picoquant, Berlin, Niemcy	930010 (Hydraharp 400)	Optyka
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)	T4299-100ml	Odczynnik
Niezamontowane dublety achromatyczne, ARC: 400 - 700 nm, D=12.7 mm, F=-20 mm	Thorlabs, Bergkirchen, Niemcy	ACN127-020-A	Pierwsza część ekspandera wiązki
Obiektyw do zanurzenia w wodzie (UPlanSApo 60x/1.20 W)	Olympus, Hamburg, Niemcy	UPLSAPO60XW	Obiektyw

Odczynnik 11668-019

Bibliografia

Hess, S. T., Huang, S. H., Heikal, A. A., Webb, W. W. Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: A review. Biochemistry. 41 (3), 697-705 (2002).
Haustein, E., Schwille, P. Ultrasensitive investigations of biological systems by fluorescence correlation spectroscopy. Methods. 29 (2), 153-166 (2003).
Bacia, K., Kim, S. A., Schwille, P. Fluorescence cross-correlation spectroscopy in living cells. Nature Methods. 3 (2), 83-89 (2006).
Bacia, K., Schwille, P. Practical guidelines for dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nature Protocols. 2 (11), 2842-2856 (2007).
Kohl, T., Heinze, K. G., Kuhlemann, R., Koltermann, A., Schwille, P. A protease assay for two-photon crosscorrelation and FRET analysis based solely on fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (19), 12161-12166 (2002).
Sahoo, H., Schwille, P. FRET and FCS--friends or foes. Chemphyschem. 12 (3), 532-541 (2011).
Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. Enzyme Kinetics by Isothermal Titration Calorimetry: Allostery, Inhibition, and Dynamics. Frontiers in Molecular Bioscience. 7, 583826(2020).
Yanase, Y., et al. Surface plasmon resonance for cell-based clinical diagnosis. Sensors (Basel). 14 (3), 4948-4959 (2014).
Freedberg, D. I., Selenko, P. Live cell NMR. Annual Review of Biophysics. 43, 171-192 (2014).
Nishida, N., Ito, Y., Shimada, I. In situ structural biology using in-cell NMR. Biochimica et Biophysica Acta General Subjects. 1864 (2), 129364(2020).
Schwille, P., Meyer-Almes, F. J., Rigler, R. Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy for multicomponent diffusional analysis in solution. Biophysical Journal. 72 (4), 1878-1886 (1997).
Balleza, E., Kim, J. M., Cluzel, P. Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells. Nature Methods. 15 (1), 47-51 (2018).
Haupts, U., Maiti, S., Schwille, P., Webb, W. W. Dynamics of fluorescence fluctuations in green fluorescent protein observed by fluorescence correlation spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (23), 13573-13578 (1998).
Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003(2017).
Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. Photodynamic properties of green fluorescent proteins investigated by fluorescence correlation spectroscopy. Chemical Physics. 250 (2), 171-186 (1999).
Müller, B. K., Zaychikov, E., Bräuchle, C., Lamb, D. C. Pulsed interleaved excitation. Biophysical Journal. 89 (5), 3508-3522 (2005).
Böhmer, M., Wahl, M., Rahn, H. -J., Erdmann, R., Enderlein, J. Time-resolved fluorescence correlation spectroscopy. Chemical Physics Letters. 353 (5), 439-445 (2002).
Felekyan, S., Kalinin, S., Sanabria, H., Valeri, A., Seidel, C. A. M. Filtered FCS: Species Auto- and Cross-Correlation Functions Highlight Binding and Dynamics in Biomolecules. Chemphyschem. 13 (4), 1036-1053 (2012).
Kapusta, P., Wahl, M., Benda, A., Hof, M., Enderlein, J. Fluorescence lifetime correlation spectroscopy. Journal of Fluorescence. 17 (1), 43-48 (2007).
Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool-understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
Elson, E. L., Magde, D. Fluorescence Correlation Spectroscopy .1. Conceptual Basis and Theory. Biopolymers. 13 (1), 1-27 (1974).
Hendrix, J., Lamb, D. C. Pulsed interleaved excitation: principles and applications. Methods Enzymol. 518, 205-243 (2013).
Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization. Biopolymers. 13 (1), 29-61 (1974).
Thompson, N. L. Topics in Fluorescence Spectroscopy. Lakowicz, J. R. , Plenum Press. 337-378 (1991).
Cole, N. B. Site-specific protein labeling with SNAP-tags. Current protocols in protein science. 73, 1-16 (2013).
Petrásek, Z., Schwille, P. Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical Journal. 94 (4), 1437-1448 (2008).
Siegel, A. P., Baird, M. A., Davidson, M. W., Day, R. N. Strengths and Weaknesses of Recently Engineered Red Fluorescent Proteins Evaluated in Live Cells Using Fluorescence Correlation Spectroscopy. International Journal of Molecular Sciences. 14 (10), 20340-20358 (2013).
Peulen, T. O., Opanasyuk, O., Seidel, C. A. M. Combining Graphical and Analytical Methods with Molecular Simulations To Analyze Time-Resolved FRET Measurements of Labeled Macromolecules Accurately. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (35), 8211-8241 (2017).
Wahl, M., Rahn, H. J., Gregor, I., Erdmann, R., Enderlein, J. Dead-time optimized time-correlated photon counting instrument with synchronized, independent timing channels. Review of Scientific Instruments. 78 (3), 033106(2007).
Wahl, M., et al. Scalable time-correlated photon counting system with multiple independent input channels. Review of Scientific Instruments. 79 (12), 123113(2008).
Price, E. S., Aleksiejew, M., Johnson, C. K. FRET-FCS Detection of Intralobe Dynamics in Calmodulin. The Journal of Physical Chemistry B. 115 (29), 9320-9326 (2011).
Price, E. S., DeVore, M. S., Johnson, C. K. Detecting intramolecular dynamics and multiple Forster resonance energy transfer states by fluorescence correlation spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (17), 5895-5902 (2010).
Margittai, M., et al. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (26), 15516-15521 (2003).
Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318 (5854), 1258-1265 (2007).
Manglik, A., et al. Structural Insights into the Dynamic Process of beta2-Adrenergic Receptor Signaling. Cell. 161 (5), 1101-1111 (2015).
Olofsson, L., et al. Fine tuning of sub-millisecond conformational dynamics controls metabotropic glutamate receptors agonist efficacy. Nature Communications. 5 (1), 5206(2014).
Kalinin, S., Valeri, A., Antonik, M., Felekyan, S., Seidel, C. A. Detection of structural dynamics by FRET: a photon distribution and fluorescence lifetime analysis of systems with multiple states. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (23), 7983-7995 (2010).
Hom, E. F. Y., Verkman, A. S. Analysis of coupled bimolecular reaction kinetics and diffusion by two-color fluorescence correlation spectroscopy: Enhanced resolution of kinetics by resonance energy transfer. Biophysical Journal. 83 (1), 533-546 (2002).
Widengren, J., Schweinberger, E., Berger, S., Seidel, C. A. M. Two new concepts to measure fluorescence resonance energy transfer via fluorescence correlation spectroscopy: Theory and experimental realizations. Journal of Physical Chemistry A. 105 (28), 6851-6866 (2001).
Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
Briddon, S. J., Kilpatrick, L. E., Hill, S. J. Studying GPCR Pharmacology in Membrane Microdomains: Fluorescence Correlation Spectroscopy Comes of Age. Trends in Pharmacological Sciences. 39 (2), 158-174 (2018).
Barak, L. S., et al. Internal trafficking and surface mobility of a functionally intact beta2-adrenergic receptor-green fluorescent protein conjugate. Molecular Pharmacology. 51 (2), 177-184 (1997).
Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (2), 743(2013).
Nikić, I., Kang, J. H., Girona, G. E., Aramburu, I. V., Lemke, E. A. Labeling proteins on live mammalian cells using click chemistry. Nature Protocols. 10 (5), 780-791 (2015).
Robert, T. Y., Haibing, T. Measuring protein dynamics in live cells: protocols and practical considerations for fluorescence fluctuation microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (9), 1-24 (2014).
Felekyan, S., et al. Full correlation from picoseconds to seconds by time-resolved and time-correlated single photon detection. Review of Scientific Instruments. 76 (8), 083104(2005).
Forster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung Und Fluoreszenz. Annalen Der Physik. 2 (1-2), 55-75 (1948).
Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. Fluorescence Correlation Spectroscopy of Triplet-States in Solution - a Theoretical and Experimental-Study. Journal of Physical Chemistry. 99 (36), 13368-13379 (1995).
Chen, J., Irudayaraj, J. Fluorescence lifetime cross correlation spectroscopy resolves EGFR and antagonist interaction in live cells. Analytical Chemistry. 82 (15), 6415-6421 (2010).
Stefl, M., Herbst, K., Rubsam, M., Benda, A., Knop, M. Single-Color Fluorescence Lifetime Cross-Correlation Spectroscopy In Vivo. Biophysical Journal. 119 (7), 1359-1370 (2020).
Maeder, C. I., et al. Spatial regulation of Fus3 MAP kinase activity through a reaction-diffusion mechanism in yeast pheromone signalling. Nature Cell Biololy. 9 (11), 1319-1326 (2007).
Christie, S., Shi, X., Smith, A. W. Resolving Membrane Protein-Protein Interactions in Live Cells with Pulsed Interleaved Excitation Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 53 (4), 792-799 (2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie ywych kom rek dwukolorowe FCCS analiza FRET dynamika receptor w b onowych mikroskopia konfokalna receptor beta 2 adrenergiczny dyfuzja bia ek znakowanie SNAP Tag

Dwukolorowa spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji w celu zbadania interakcji białko-białko i dynamiki białek w żywych komórkach

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Wprowadzenie

Protokół

Wyniki

Dyskusja

Oświadczenia

Podziękowania

Materiały

Bibliografia

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Powiązane artykuły