Dwukolorowa spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji w celu zbadania interakcji białko-białko i dynamiki białek w żywych komórkach

Spektroskopia fluorescencyjna jest jedną z głównych metod ilościowego określania dynamiki białek i interakcji białko-białko przy minimalnych zakłóceniach w kontekście komórkowym. Konfokalna spektroskopia korelacji fluorescencji (FCS) jest jedną z potężnych metod analizy dynamiki molekularnej, ponieważ jest wrażliwa na pojedyncze cząsteczki, wysoce selektywna i kompatybilna z żywymi komórkami¹. W porównaniu z innymi podejściami zorientowanymi na dynamikę, FCS ma szerszy mierzalny zakres czasowy obejmujący od ~ ns do ~ s, co najważniejsze, obejmujący szybkie skale czasowe, które często są niedostępne dla metod opartych na obrazowaniu. Co więcej, zapewnia również selektywność przestrzenną, dzięki czemu można łatwo odróżnić dynamikę molekularną błony, cytoplazmy i jądra ². W ten sposób mruganie molekularne, średnie stężenie lokalne i współczynnik dyfuzji można analizować ilościowo za pomocą FCS. Dynamika międzycząsteczkowa, taka jak wiązanie, staje się łatwo dostępna podczas badania kodyfuzji dwóch gatunków molekularnych w analizie spektroskopii fluorescencji krzyżowej korelacji krzyżowej (FCCS)^3,4,5 w podejściu dwukolorowym.

Główną podstawową zasadą spektroskopii korelacji jest analiza statystyczna fluktuacji intensywności emitowanych przez fluorescencyjnie znakowane biomolekuły dyfundujące do i z ogniska laserowego (Rysunek 1A). Wynikowe funkcje korelacji automatycznej lub krzyżowej mogą być następnie dalej analizowane przez dopasowanie krzywej, aby ostatecznie wyprowadzić interesujące stałe szybkości. Innymi słowy, metody statystyczne FCS i FCCS nie dostarczają śladów pojedynczych cząsteczek, jak w przypadku śledzenia pojedynczych cząstek, ale dynamiczny wzór lub "odcisk palca" badanej próbki o wysokiej rozdzielczości czasowej. W połączeniu z rezonansowym transferem energii Förstera (FRET), dynamika wewnątrzcząsteczkowa, taka jak zmiany konformacyjne, może być monitorowana w tym samym czasie we wspólnym układzie konfokalnym^5,6. FRET sonduje odległość dwóch fluoroforów i jest często określany jako molekularny "nanolinijka". Transfer energii zachodzi tylko wtedy, gdy cząsteczki znajdują się w bliskim sąsiedztwie (< 10 nm), widmo emisyjne donora znacznie pokrywa się z widmem absorpcyjnym cząsteczki akceptora, a orientacja dipola donora i akceptora jest (wystarczająco) równoległa. W ten sposób połączenie FRET i FCCS zapewnia technikę o bardzo wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej. Gdy wymagana jest selektywność przestrzenna, czułość, a także kompatybilność z żywymi komórkami, FRET-FCCS ma oczywistą przewagę nad innymi metodami, takimi jak kalorymetria miareczkowa izotermiczna (ITC)⁷, powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR)⁸, lub magnetyczny rezonans jądrowy (NMR)^9,10 do pomiaru dynamiki i interakcji białek.

Pomimo możliwości i obietnicy dwukolorowej spektroskopii korelacji krzyżowej fluorescencji (dc-FCCS), wykonywanie DC-FCCS w żywych komórkach jest technicznie trudne ze względu na widmowe przesłuchy lub przesłuchy między kanałami^3,4, różnica w objętościach konfokalnych wynikająca z widmowo odrębnych linii laserowych^3,4,11, sygnał tła i szum lub ograniczona fotostabilność próbek^12,13,14,15. Wprowadzenie wzbudzenia impulsowego z przeplotem (PIE) do FCCS było ważną modyfikacją mającą na celu czasowe rozprzęgnięcie różnych wzbudzeń laserowych w celu zmniejszenia przesłuchów spektralnych między kanałami¹⁶. Inne metody korekcji przeciwdziałające przebijaniu widma^17,18,19 i poprawki tła również zostały dobrze zaakceptowane^17,18,19. Aby uzyskać szczegółowe informacje i podstawy dotyczące FCS, PIE lub FRET, czytelnik jest odsyłany do następujących odniesień^{2,4,6,16,20,21,22,23,24}.

Tutaj przedstawiono wszystkie niezbędne eksperymenty kalibracyjne i analizy wraz z wynikami eksperymentalnymi prototypowego receptora sprzężonego z białkiem G, receptora 2-adrenergicznego (β₂AR), β dla trzech różnych scenariuszy: (1) jednoznakowane cząsteczki posiadające "zielony" (eGFP) lub "czerwony" (etykietowanie oparte na znacznikach SNAP)²⁵ fluorofor; (2) podwójnie znakowany konstrukt, który zawiera N-końcowy znacznik SNAP i wewnątrzkomórkowy eGFP (NT-SNAP) [w tym przypadku obie etykiety znajdują się przy tym samym białku. W związku z tym oczekuje się 100% kodyfuzji]; oraz (3) podwójnie znakowaną próbkę, w której oba fluorofory znajdują się po tej samej stronie błony komórkowej (CT-SNAP). Zawiera C-końcowy znacznik SNAP i wewnątrzkomórkowy eGFP. W tym przypadku obie etykiety są na tym samym białku z oczekiwaną 100% kodyfuzją. Ponieważ obie etykiety znajdują się bardzo blisko siebie, po tej samej stronie błony komórkowej, wykazuje to potencjał do obserwowania FRET i zachowania antyskorelowanego. Wszystkie konstrukty zostały transfekowane w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO), a następnie znakowane czerwonym substratem fluorescencyjnym, który jest nieprzepuszczalny dla konstrukcji NT-SNAP i przepuszczalny dla membrany dla konstruktu CT-SNAP. Wreszcie, symulowane dane ilustrują wpływ parametrów eksperymentalnych na antykorelację indukowaną przez FRET oraz wpływ oddziaływań białko-białko na amplitudę kodyfuzji.

Tak więc, ten protokół dostarcza kompletnego przewodnika do przeprowadzania połączonego FRET-FCCS w żywych komórkach, aby zrozumieć dynamikę białek i interakcje białko-białko, jednocześnie uświadamiając techniczne/fizyczne artefakty, wyzwania i możliwe rozwiązania.

1. Protokół eksperymentalny

1. Przygotowanie próbki
   UWAGA: Wysiew i transfekcję komórek należy przeprowadzić w sterylnych warunkach.
   1. Umieścić oczyszczone szkiełko nakrywkowe na studzience na 6-dołkowej płytce hodowlanej i przemyć trzykrotnie sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS).
      UWAGA: Protokół czyszczenia szkiełka nakrywkowego jest szczegółowo opisany w uwadze uzupełniającej 1.
   2. Do każdego dołka dodać 2 ml kompletnej pożywki do hodowli komórkowych zawierającej czerwień fenolową (uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 μg/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny) i odłożyć płytkę na bok.
   3. Hodować komórki CHO w tym samym pożywce zawierającej czerwień fenolową w temperaturze 37 °C i 5 % CO_{2 .} Umyj komórki 5 ml PBS, aby usunąć martwe komórki.
   4. Dodaj 2 ml trypsyny i inkubuj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej (RT).
   5. Rozcieńczyć oderwane komórki 8 ml pożywki zawierającej czerwień fenolową i dokładnie wymieszać pipetując.
   6. Policz komórki w komorze Neubauera i zasiej nasiona o gęstości 1,5 x 10⁵ komórek/basenik na 6-dołkowej płytce do hodowli komórkowej zawierającej szkiełka nakrywkowe (przygotowanej w kroku 1.1.1-1.1.2).
   7. Pozwól komórkom rosnąć w inkubatorze (37 °C, 5% CO₂ ) przez 24 godziny, aby osiągnąć około 80% zbieżności.
   8. Rozcieńczyć 2 μg pożądanego DNA wektora (np. CT-SNAP lub NT-SNAP) i 6 μl odczynnika do transfekcji w dwóch oddzielnych probówkach, z których każda zawiera 500 μl pożywki o zredukowanej surowicy dla każdej studzienki i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   9. Wymieszać oba roztwory razem, aby otrzymać mieszaninę transfekcji i inkubować ją przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
   10. W międzyczasie umyj wysiane komórki CHO raz sterylnym PBS.
   11. Zastąp PBS 1 ml / studzienkę pożywki wolnej od czerwieni fenolowej uzupełnionej 10% FBS bez żadnych antybiotyków.
   12. Dodać kroplami cały 1 ml mieszaniny transfekcji do każdej studzienki i inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C, w 5% CO₂ .
   13. W celu oznakowania konstruktu SNAP należy rozcieńczyć odpowiedni roztwór podstawowy substratu SNAP w 1 ml pożywki uzupełnionej 10% FBS, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μM.
   14. Przemyć transfekowane komórki raz PBS i dodać 1 ml na studzienkę 1 μM roztworu substratu SNAP. Inkubować komórki przez 20 minut w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ .
   15. Umyj komórki trzykrotnie pożywką wolną od czerwieni fenolowej i dodaj 2 ml na dołek pożywki bez czerwieni fenolowej. Inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ .
   16. Następnie przenieść szkiełka nakrywkowe wszystkich próbek do komory obrazowania i przemyć buforem obrazowym o pojemności 500 μl. Dodaj bufor obrazowania o pojemności 500 μl przed przejściem do konfiguracji FRET-FCS.
2. Pomiary kalibracyjne
   UWAGA: Zestaw FRET-FCS jest wyposażony w obiektyw wodny z mikroskopem konfokalnym, dwie linie laserowe, system zliczania pojedynczych fotonów skorelowanych w czasie (TCSPC), dwie hybrydowe tuby fotopowielacza (PMT) i dwie fotodiody lawinowe (APD) do zbierania fotonów i oprogramowania do zbierania danych. Bardzo ważne jest, aby wyrównać konfigurację za każdym razem przed pomiarami na żywo komórek. Szczegółowy opis konfiguracji można znaleźć w uwadze uzupełniającej 2. Zarówno lasery, jak i wszystkie detektory (dwa PMT i dwa APD) są zawsze włączone podczas pomiarów, ponieważ wszystkie pomiary muszą być przeprowadzane w identycznych warunkach. Do pomiarów kalibracyjnych należy użyć szkiełka nakrywkowego z tej samej partii, na której wysiano komórki, co zmniejsza zmienność korekcji pierścienia kołnierza.
   1. Aby wyregulować ostrość, położenie otworka i pierścienia kołnierza, umieść zielony roztwór kalibracyjny 2 nM na szklanym szkiełku nakrywkowym i włącz laser 485 nm i 560 nm. Uruchom laser w trybie wzbudzenia impulsowego z przeplotem (PIE)¹⁶.
   2. Skoncentruj się na roztworze i dostosuj położenie pierścienia otworkowego i kołnierza tak, aby uzyskać najwyższą szybkość zliczania i najmniejszą objętość konfokalną, aby uzyskać maksymalną jasność molekularną.
   3. Powtórzyć ten proces dla kanałów czerwonych z czerwonym roztworem kalibracyjnym 10 nM i mieszaniną zarówno zielonego, jak i czerwonego roztworu kalibracyjnego.
   4. Umieść roztwór DNA 10 nM na szklanym szkiełku nakrywkowym i dostosuj ognisko, otwór i położenie pierścienia kołnierza tak, aby korelacja krzyżowa między zielonymi i czerwonymi kanałami detekcji była najwyższa, tj. wykazywała najwyższą amplitudę.
      UWAGA: Kroki 1.2.1 i 1.2.4 mogą wymagać powtórzenia tam iz powrotem, aby znaleźć optymalne wyrównanie. Wykonaj 3-5 pomiarów z każdego roztworu kalibracyjnego przez 30 s - 120 s po optymalnym ustawieniu ostrości, otworka i pierścienia kołnierza dla zielonego i czerwonego kanału detekcji oraz objętości nakładania się konfokalnego.
   5. Zmierz kroplę ddH₂O, pożywkę do obrazowania i nietransfekowaną komórkę 3-5 razy każdy przez 30 s - 120 s, aby określić szybkość zliczania tła.
   6. Zbierz funkcję odpowiedzi przyrządu z 3-5 pomiarami przez 30 s - 120 s. Jest to opcjonalne, ale wysoce zalecane.
3. Pomiary żywych komórek
   1. Znajdź odpowiednią komórkę, oświetlając ją lampą rtęciową i obserwując przez okular.
      UWAGA: Odpowiednie komórki są żywe, wykazując typową morfologię odpowiedniej przylegającej linii komórkowej. Fluorescencja interesującego nas białka, w tym przypadku receptora powierzchniowego, jest widoczna na całej powierzchni. Mniej jasne komórki są bardziej odpowiednie niż jaśniejsze ze względu na lepszy kontrast w FCS, gdy w centrum uwagi znajduje się niewielka liczba cząsteczek.
   2. Włącz oba lasery w trybie PIE i skup się na membranie, patrząc na maksymalne zliczenia na sekundę.
      UWAGA: Może być konieczne zmniejszenie mocy lasera w przypadku próbek ogniw (mniej niż 5 μW przy obiektywie). Zależy to od użytych fluoroforów i konfiguracji.
   3. Obserwuj krzywe automatycznej i krzyżowej korelacji eGFP lub oznakowanego znacznika SNAP przymocowanego do β₂AR w podglądzie online oprogramowania do zbierania danych i zbierz kilka krótkich pomiarów (~2 -10) z czasem akwizycji od 60 do 180 s.
      UWAGA: Nie pobudzaj komórek przez długi czas w sposób ciągły, ponieważ fluorofory mogą wybielić. Będzie to jednak zależeć od jasności każdej komórki, długości pomiarów i liczby pomiarów, które można w sumie wykonać.

2. Analiza danych

1. Eksport danych
   1. Eksportuj krzywe korelacji, G(t_c) i współczynniki zliczania, CR, ze wszystkich pomiarów.
   2. Zadbaj o poprawne zdefiniowanie okien czasowych "podpowiedzi" i "opóźnienia" oraz użyj opcji "bramkowania mikroczasowego" w oprogramowaniu do korelacji danych.
      UWAGA: W sumie wymagane są trzy różne korelacje: (1) autokorelacja kanału zielonego w oknie czasowym monitu (ACF_gp), (2) autokorelacja kanałów czerwonych w oknie czasowym opóźnienia (ACF_rd) i wreszcie (3) korelacja krzyżowa sygnału kanału zielonego w oknie czasowym monitu z sygnałem kanału czerwonego w oknie czasowym opóźnienia (CCF_PIE). Eksport danych jest pokazany krok po kroku dla różnych programów w uwadze dodatkowej 3.
2. Pomiary kalibracyjne
   1. Użyj funkcji autokorelacji roztworów fluoroforu zielonego (ACF_gp) i czerwonego (ACF_rd) i dopasuj je do modelu dyfuzji 3D z dodatkowym terminem trypletowym, jeśli jest to wymagane (równanie 1), aby skalibrować kształt i rozmiar objętości detekcji konfokalnej dla dwóch używanych kanałów kolorów:
      równanie 1
      Tutaj b jest linią bazową krzywej, N liczbą cząsteczek w ognisku, t_D czasem dyfuzji (w ms), a s = z₀/w₀ współczynnikiem kształtu konfokalnego elementu objętościowego. Mruganie trypletowe lub inna fotofizyka jest opisana przez jej amplitudę _R i czas relaksacji t_R.
      UWAGA: Wszystkie zmienne i symbole używane w protokole są wymienione w Tabeli 1.
   2. Użyj znanych współczynników dyfuzji D dla green²⁶ i czerwonego standardu kalibracji²⁷ oraz otrzymanych współczynników kształtu s_zielonego i _{s czerwonego}, aby określić wymiary (szerokość w₀ i wysokość z₀) oraz objętość V_eff konfokalnego elementu objętościowego (równanie 2a-c).
      eq. 2a
      równanie 2b
      eq. 2c
      UWAGA: Szablony do obliczania parametru kalibracji są dostarczane jako pliki uzupełniające (S7).
   3. Obliczyć α spektralny przesłuchu sygnału zielonej fluorescencji (zebranego w kanałach 0 i 2) do czerwonych kanałów detekcji (kanał numer 1 i 3) jako stosunek sygnałów z korekcją tła (BG) (równanie 3).
      
      Równanie 3
   4. Określić bezpośrednie wzbudzenie δ fluoroforowego akceptora przez długość fali wzbudzenia donora przez stosunek szybkości zliczania z korekcją tła pomiarów kalibracji czerwieni w "szybkim" oknie czasowym (wzbudzenie zielonym laserem) do szybkości zliczania skorygowanej o tło w oknie czasowym "opóźnienia" (wzbudzenie czerwonym laserem) (równanie 4).
      
      równanie 4
   5. Obliczyć jasność molekularną B zarówno zielonego, jak i czerwonego fluoroforu (równanie 5a-b) na podstawie współczynników zliczania skorygowanych o tło i uzyskanej liczby cząsteczek w ognisku, N, z dopasowania dyfuzyjnego 3D (równanie 1):
      eq. 5a
      równanie 5b
   6. Dopasuj zarówno ACF_gp, jak i ACF_rd, a także CCF_PIE podwójnie znakowanego DNA do modelu dyfuzji 3D (równanie 1). Uzyskane współczynniki kształtu, s_zielony i s_czerwony, należy utrzymywać na stałym poziomie odpowiednio dla ACF_gp i ACF_rd. Współczynnik kształtu dla _{CCF PIE,} s_PIE, znajduje się zwykle pomiędzy tymi dwiema wartościami.
      UWAGA: W idealnej konfiguracji zarówno V_eff, _zielony, jak i V_{eff, czerwony} miałyby ten sam rozmiar i idealnie na siebie zachodziłyby.
   7. Określić amplitudę przy zerowym czasie korelacji, G₀(t_c), na podstawie znalezionych wartości pozornej liczby cząsteczek w ognisku (N_zielony, N_czerwony i N_PIE).
   8. Obliczyć stosunek amplitudy r_GR i r_RG dla próbki ze 100% kodyfuzją fluoroforów zielonych i czerwonych (równanie 6). Należy pamiętać, że N_PIE nie odzwierciedla liczby podwójnie znakowanych cząsteczek w ognisku, ale odzwierciedla tylko 1/G₀(t_c).
      i równanie 6
3. Eksperymenty z żywymi komórkami
   1. W przypadku konstrukcji z pojedynczym etykietą dopasuj próbki komórek do odpowiedniego modelu. W przypadku pokazanego receptora błonowego dyfuzja zachodzi w sposób bimodalny z krótkim i długim czasem dyfuzji. Dodatkowo należy wziąć pod uwagę fotofizykę i mruganie fluoroforów:
      równanie 7
      Tutaj t_d1 i t_d2 to dwa wymagane czasy dyfuzji, a₁ to ułamek pierwszego czasu dyfuzji.
      UWAGA: W przeciwieństwie do pomiarów kalibracyjnych, w których wolne barwniki i nici DNA swobodnie dyfundują we wszystkich kierunkach, receptor błonowy wykazuje tylko dyfuzję 2D wzdłuż błon komórkowych. Ta różnica między dyfuzją 3D i 2D znajduje odzwierciedlenie w zmodyfikowanym współczynniku dyfuzji (porównaj równanie 1), gdzie _{t D} w przypadku 2D nie zależy od współczynnika kształtu s konfokalnego elementu objętościowego.
   2. Obliczyć stężenie c białek znakowanych na zielono lub czerwono z odpowiednich N i V_eff, korzystając z podstawowej matematyki (równanie 8):
      eq. 8
      gdzie _{N A} = liczba Avogadro
   3. Dla N-końcowej etykiety SNAP i wewnątrzkomórkowego eGFP dopasuj dwie autokorelacje (ACF_gp i ACF_rd) podwójnie znakowanej próbki przy użyciu tego samego modelu, co dla jednoznakowanych konstruktów dla ACF (równanie 7) i CCF_PIE przy użyciu bimodalnego modelu dyfuzji (równanie 9):
      eq. 9
      UWAGA: Aby uzyskać globalny opis systemu, wszystkie trzy krzywe muszą być dopasowane razem: Składnik dyfuzji jest identyczny dla wszystkich trzech krzywych, a jedyną różnicą jest składnik relaksacji dla _{CCF PIE}. Ponieważ fotofizyka dwóch fluoroforów zwykle nie jest ze sobą powiązana, nie jest wymagany żaden termin korelacji. Ten brak warunków relaksacji skutkuje płaskim _{CCF PIE} w krótkich czasach korelacji. Jednak przesłuchy i bezpośrednie wzbudzenie akceptora przez fluorofor donorowy mogą wykazywać fałszywie dodatnie amplitudy i powinny być dokładnie sprawdzone pod kątem użycia pomiarów kalibracyjnych.
   4. Obliczyć stężenie c białek znakowanych na zielono lub czerwono z odpowiednich N i V_eff, stosując równanie 8.
   5. Oszacować frakcję lub stężenie, c_GR lub c_RG, oddziałujących na siebie białek znakowanych na zielono i czerwono z próbek komórkowych, stosując współczynniki korygujące otrzymane z próbek DNA, współczynniki amplitudy r_GR i r_RG próbki komórkowej oraz ich odpowiednie otrzymane stężenia (równanie 10).
      i eq. 10
   6. W przypadku C-końcowej etykiety SNAP i wewnątrzkomórkowego eGFP dopasuj dwie autokorelacje (ACF_gp i ACF_rd) próbki FRET jako próbki znakowane pojedynczo (równanie 7) i CCF_FRET do bimodalnego modelu dyfuzji zawierającego człon antykorelacji (równanie 11)
      równanie 11
      gdzie_f odzwierciedla amplitudę całkowitej antykorelacji, a_R i t_R odpowiednią amplitudę i czas relaksacji.
      UWAGA: W przypadku antyskorelowanych zmian fluorescencji spowodowanych FRET, może być wymagany jeden lub kilka warunków antykorelacji (równanie 11), co skutkuje "spadkiem" _{CCF FRET} w niskich czasach korelacji zbiegających się ze wzrostem dwóch autokorelacji (ACF_gp i ACF_rd). Należy jednak pamiętać, że fotofizyka, taka jak mruganie trypletowe, może maskować termin antykorelacji poprzez tłumienie antykorelacji wywołanej przez FRET. Wspólna analiza uzupełniona o filtrowane metody FCS może pomóc w zdemaskowaniu terminu antykorelacji. Ponadto należy wykluczyć artefakty techniczne wynikające z martwych czasów w elektronice liczącej w zakresie nanosekund¹⁶. Bardziej szczegółowa procedura krok po kroku, jak przeprowadzić analizę w ChiSurf²⁸ oraz szablony do obliczania objętości konfokalnej lub jasności molekularnej są dostępne w repozytorium Github (https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS) oraz jako pliki uzupełniające (uwaga uzupełniająca 4 i uwaga uzupełniająca 6). Dodatkowo można tam znaleźć skrypty Pythona do wsadowego eksportu danych pozyskanych za pomocą oprogramowania Symphotime w formacie .ptu.

Przykładowe wyniki kalibracji i pomiarów na żywych komórkach są omówione poniżej. Dodatkowo wykazano wpływ FRET na krzywe korelacji krzyżowej na podstawie symulowanych danych obok wpływu interakcji białko-białko zwiększającego amplitudę CCF PIE.

Eksport danych FCS oparty na PIE
W eksperymentach PIE dane są zbierane w trybie time-tag time-resolution mode (TTTR)29,30. Rysunek 1B pokazuje histogramy czasu nadejścia fotonów pomiaru PIE podwójnie znakowanej nici DNA na opisanym układzie (Uwaga uzupełniająca 1). Konfiguracja ma cztery kanały detekcji. Emisja fluorescencji jest najpierw rozdzielana przez polaryzację w kierunkach "S" i "P" (odnoszących się do płaszczyzny prostopadłej i równoległej, w której oscyluje pole elektryczne fali świetlnej). Po drugie, każdy kierunek polaryzacji jest następnie dzielony na dwa kanały kolorów (zielony, czerwony) przed wykryciem, w wyniku czego powstają cztery kanały (S-zielony, S-czerwony, P-zielony, P-czerwony). W oknie czasowym "prompt" zielony fluorofor zostaje wzbudzony, a sygnał jest wykrywany zarówno w kanale zielonym, jak i czerwonym z powodu FRET. W oknie czasowym opóźnienia widoczny jest tylko czerwony fluorofor (w kanale czerwonym). Na podstawie kanałów detekcji i okien czasowych "prompt" i "delayed" można uzyskać co najmniej pięć różnych krzywych korelacji (3 krzywe autokorelacji (ACF) i 2 krzywe korelacji krzyżowej (CCF)) (Rysunek 1C-D): (1) zielony sygnał w oknie czasu monitu (ACFgp), (2) czerwony sygnał w oknie czasu monitu (w przypadku FRET, ACFrp) i (3) czerwony sygnał w oknie czasowym opóźnienia (ACFrd). Te ACF informują o ruchliwości białek, fotofizyce (np. mruganie trypletów) i innych skorelowanych w czasie zmianach jasności we fluoroforach (np. z powodu FRET). (4) Oparta na PIE korelacja krzyżowa CCFPIE zielonego sygnału w oknie czasowym monitu z czerwonym sygnałem w oknie czasu opóźnienia pozwala określić frakcję kodyfuzji zielonego i czerwonego fluoroforu 16. (5) Oparta na FRET korelacja krzyżowa CCFFRET koloru zielonego z sygnałem czerwonym w oknie czasu monitu jest związana z wywołanymi przez FRET, antykorelowanymi zmianami jasności sygnałów zielonego i czerwonego31,32,33.

Rysunek 1: Spektroskopia korelacji fluorescencyjnej (F(C)CS oparta na wzbudzeniu impulsowo-przeplotowym (PIE). (A) W FCS cząsteczki znakowane fluorescencyjnie dyfundują swobodnie do i z (ograniczonej dyfrakcją) objętości ogniskowej kształtowanej przez skupioną wiązkę laserową, która indukuje fluorescencję w tej małej objętości. Wynikające z tego fluktuacje intensywności cząsteczek wchodzących i wychodzących z objętości są skorelowane i dostarczają informacji na temat ruchliwości cząsteczek. (B) W PIE dwie różne linie laserowe ("natychmiastowa" i "opóźniona") są używane do wzbudzenia próbki oznakowanej dwoma różnymi fluoroforami ("zielonymi" i "czerwonymi"). Różnica czasu między oboma impulsami wzbudzenia jest dostosowana do czasów życia fluorescencji odpowiednich fluoroforów, tak aby jeden z nich rozpadł się przed wzbudzeniem drugiego. W pokazanej podwójnie znakowanej próbce oba fluorofory są wystarczająco blisko, aby przejść transfer energii rezonansu Förstera (FRET) z "zielonego" fluoroforu donorowego do "czerwonego" fluoroforu akceptorowego. W ten sposób emisja czerwonej fluorescencji może być wykryta w "natychmiastowym" oknie czasowym po wzbudzeniu zielonego donora. W zastosowanym układzie (uwaga uzupełniająca 2) dla każdego koloru stosowane są dwa detektory, jeden zorientowany równolegle do orientacji wiązki wzbudzenia (oznaczony "p"), a drugi prostopadły (oznaczony "s"). (C) W eksperymencie PIE można wyznaczyć trzy różne funkcje autokorelacji: korelacja i) sygnałów kanału zielonego w oknie czasowym monitu (ACFgp), ii) sygnałów kanału czerwonego w oknie czasu monitu (ACFrp) oraz iii) sygnałów kanału czerwonego w oknie czasu opóźnienia (ACFrd). (D) Można wyznaczyć dwie różne funkcje korelacji krzyżowej: iv) korelację krzyżową "PIE" (CCFPIE) z sygnałami kanału zielonego w oknie czasowym sygnału skorelowanym z sygnałami kanału czerwonego w oknie opóźnienia, gdzie amplituda tej krzywej jest związana z kodyfuzją fluoroforów; oraz v) korelacja krzyżowa "FRET" (CCFFRET) z sygnałami kanału zielonego w oknie czasowym zachęty skorelowana z sygnałami kanału czerwonego w tym samym oknie podpowiedzi; tutaj kształt tej krzywej czasami szybszy niż dyfuzja jest związany ze zmianami intensywności wywołanymi przez FRET. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Kalibracja
Rysunek 2A-B pokazuje pomiar kalibracyjny odpowiednio dyfuzyjnych zielonych i czerwonych fluoroforów. Na podstawie dopasowania z równaniem 1 i znanym współczynnikiem dyfuzji Dgreen26 i Dred27 kształt (z0 i w0) oraz rozmiar (Veff) przestrzeni detekcji są obliczane przy użyciu równania 2a-c. Wyniki dopasowania z ACFgp z zielonego fluoroforu i ACFrd z czerwonego fluoroforu są podsumowane w Rysunek 2C. Oba fluorofory wykazują dodatkową stałą czasu relaksacji wynoszącą odpowiednio 8,6 μs (18%) i 36 μs (15%). Jasność molekularna (równanie 5a-b) zielonego i czerwonego fluoroforu wynosi odpowiednio 12,5 kHz na cząsteczkę i 2,7 kHz na cząsteczkę.

Dla wiarygodnego oszacowania wielkości i kształtu objętości konfokalnej, jak również jasności molekularnej, zaleca się wykonanie 3-5 pomiarów na eksperyment kalibracyjny i łączne (lub globalne) dopasowanie wszystkich powtórzeń.

Przesłuch α (Rysunek 2D, równanie 3) i bezpośrednie wzbudzenie akceptora przez δ zielonego lasera (Rysunek 2E, równanie 4) dla tej pary fluoroforów wynoszą odpowiednio ~15% i ~ 38%.

Rysunek 2: Pomiary kalibracyjne swobodnie dyfuzyjnego wzorca kalibracyjnego koloru zielonego i czerwonego. (A-B) Reprezentatywny pomiar 60 s wzorca kalibracyjnego 2 nM zielonego (A) i 10 nM czerwonego (B) dopasowanego do modelu dyfuzji 3D, z uwzględnieniem dodatkowego czasu relaksacji (równanie 1). Tabela w panelu (C) pokazuje wyniki dopasowania i parametr pochodny na podstawie równania 2a-c i równania 5a-b. *Współczynniki dyfuzji zostały zaczerpnięte z literatury26,27. (D) Wyznaczenie α przesłuchu sygnału zielonego do kanałów czerwonych (równanie 3). Widmo wzbudzenia zielonego standardu jest pokazane w kolorze niebieskozielonym, widmo emisyjne w kolorze zielonym. Linie lasera wzbudzenia o długości fali 485 nm (niebieska) i 561 nm (pomarańczowa) są pokazane jako linie przerywane. Przezroczyste pola w kolorze zielonym i purpurowym pokazują zebrany zakres emisji (uwaga uzupełniająca 2). (E) Wyznaczanie bezpośredniego δ wzbudzenia czerwonego fluoroforu za pomocą lasera o długości fali 485 nm (równanie 4). Kod kolorystyczny jest identyczny z (D), jasny i ciemnopomarańczowy pokazują odpowiednio widmo wzbudzenia i emisji czerwonego wzorca. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby określić i skalibrować nakładanie się objętości wzbudzenia zielonego i czerwonego, używa się podwójnie znakowanej podwójnej nici DNA (Rysunek 3A), jak opisano powyżej. W tym przypadku fluorofory są oddalone od siebie o 40 pz, tak że nie może wystąpić FRET między zielonymi i czerwonymi fluoroforami przyczepionymi do końców podwójnych nici DNA. Rysunek 3B pokazuje autokorelacje zarówno z fluoroforów w kolorze zielonym (ACFgp) i magenta (ACFrd) oraz korelację krzyżową PIE, CCFPIE, w kolorze cyjan. Należy pamiętać, że dla CCFPIE sygnał w zielonych kanałach w oknie czasu zachęty jest skorelowany z sygnałem w czerwonych kanałach w oknie czasu opóźnienia16.

Tutaj uzyskuje się średni współczynnik dyfuzji dla nici DNA D= 77 μm²/s. Więcej szczegółów na temat obliczeń można znaleźć w protokole krok po kroku, uwaga uzupełniająca 4. Wartość tę uzyskuje się przez wstawienie do równania 2a skalibrowanych wielkości skalibrowanych zielonych i czerwonych objętości detekcji ( 2) oraz odpowiednich czasów dyfuzji ACFgp i ACFrd nici DNA ( Rysunek 3C). Następnie, korzystając z uzyskanych wartości korekcyjnych rGR i rRG, a następnie stosując równanie 6, można określić ilość kodyfuzji, tj. podwójnie znakowanych cząsteczek (lub kompleksów białkowych w przypadku kotransfekcji dwóch różnych białek) z próbek komórkowych.

Rysunek 3: Kalibracja objętości zielono-czerwonej nakładającej się na siebie za pomocą próbki DNA. (A) Nić DNA używana do kalibracji zawiera zielony i czerwony fluorofor kalibracyjny, z odległością 40 pz pomiędzy nimi. Odległość między barwnikami musi być wystarczająco duża, aby wykluczyć FRET między fluoroforami. (B) Reprezentatywny pomiar 60 s roztworu DNA o stężeniu 10 nM. Autokorelacje z obu fluoroforów w kolorze zielonym (ACFgp, zielony standard) i magenta (ACFrd, czerwony standard) oraz korelacji krzyżowej PIE, CCFPIE, w kolorze niebieskim. Tabela w panelu (C) przedstawia wyniki dopasowania w oparciu o model dyfuzji 3D z uwzględnieniem dodatkowego współczynnika relaksacji (równanie 1) i pochodnego parametru współczynnik dyfuzji DNA, D DNA (równanie 2a), wielkość i kształt objętości nakładania się (równanie 2a-c) oraz współczynniki korekcji rGR i rRG (równanie 6). Należy pamiętać, że wartości zielonej i czerwonej objętości detekcji (oznaczonej *) zostały zaczerpnięte z dopasowania poszczególnych fluoroforów pokazanych na Rysunek 2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Eksperymenty z żywymi komórkami
W poniższej sekcji przedstawiono analizę eksperymentów na żywych komórkach dla różnych konstruktów AR β2. Ponieważ β2AR jest białkiem błonowym, jego dyfuzja jest w dużej mierze ograniczona do dwuwymiarowej dyfuzji (Rysunek 4A) wzdłuż błony komórkowej (z wyjątkiem procesów transportu lub recyklingu do lub z błony) 2. Przy ograniczeniu do dyfuzji 2D współczynnik kształtu s = z0/w0 w równaniu 1 staje się przestarzały, co skutkuje uproszczonym modelem dyfuzji (równanie 9).

Konstrukcje z pojedynczymi etykietami: β2AR-IL3-eGFP i NT-SNAP-β 2AR
Rysunek 4 pokazuje przykładowe pomiary konstruktu pojedynczej etykietyβ 2AR-IL3-eGFP (Rysunek 4B), gdzie eGFP jest wstawiony do pętli wewnątrzkomórkowej 3, oraz konstrukcji NT-SNAP-β2AR (Rysunek 4C), gdzie znacznik SNAP jest sprzężony z N-końcem β2AR. Znacznik SNAP jest oznaczony nieprzepuszczalnym dla membrany podłożem powierzchniowym SNAP. Krzywe reprezentatywne pokazują średnią z 4-6 powtórzonych pomiarów z czasami akwizycji 120 - 200 s każdy. Odpowiednie autokorelacje ACFgp i ACFrd sygnału eGFP i SNAP są dopasowane do bimodalnego, dwuwymiarowego modelu dyfuzji (równanie 9). Jeśli chodzi o szybką dynamikę, eGFP pokazuje tylko oczekiwane migotanie trypletu przy tR1 ~ 9 μs, podczas gdy sygnał SNAP wymaga dwóch czasów relaksacji, jednego przy typowym czasie trypletu tR1 ~ 5 μs, a drugi przy tR2 ~ 180 μs.

Molekularna jasność fluoroforów w żywych komórkach wynosi 0,8 KHz (eGFP) i 1,7 kHz (SNAP) na cząsteczkę w danych warunkach wzbudzenia (eqs. 5a-b). Stężenie znakowanych β2konstruktów AR wbudowanych w błonę komórkową powinno mieścić się w zakresie nanomolowym i można je określić na podstawie średniej liczby cząsteczek (równanie 9, Rysunek 4C) i wielkości odpowiedniej objętości konfokalnej dla kanału zielonego i czerwonego ( Rysunek 2) przy użyciu równania 8.

Rysunek 4: Reprezentatywny pomiar konstrukcji o pojedynczej etykiecie. (A) W tym badaniu jako przykład użyto receptora błonowegoβ 2AR. W przeciwieństwie do fluoroforów i nici DNA używanych do kalibracji, które mogą swobodnie unosić się w przestrzeni detekcji, białka błonowe dyfundują głównie bocznie wzdłuż błony, co określa się mianem dyfuzji dwuwymiarowej. (B, D) ACFgp i ACFrd konstrukcji jednoznacznikowych β2AR-IL3-eGFP (B) i NT-SNAP-β2AR (D). Pokazano średnią z 4-6 pomiarów, z których każdy został wykonany przez 120 - 200 s. Tabela w panelu (C) przedstawia wyniki dopasowania danych do bimodalnego dwuwymiarowego modelu dyfuzji z uwzględnieniem dodatkowych warunków relaksacji (równanie 7). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Konstrukcja z podwójnym znacznikiem: NT-SNAP-β 2AR-IL3-eGFP
W podwójnie znakowanej konstrukcji NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP (w skrócie NT-SNAP), eGFP jest wprowadzany do pętli wewnątrzkomórkowej 3, a znacznik SNAP jest sprzężony z N-końcemβ 2AR (Rysunek 5A). W tej konfiguracji eGFP znajduje się po wewnętrznej stronie membrany, a SNAP po stronie zewnętrznej, przy czym odległości są zbyt duże dla FRET. W idealnym przypadku ten konstrukt wykazywałby 100% kodyfuzję zielonego i czerwonego fluoroforu i brak sygnału FRET. Rysunek 5B-D pokazuje dwa pomiary NT-SNAP w dwóch komórkach w dwóch różnych dniach pomiaru. Dopasowanie ACFgp i ACFrd do "lepszego" pomiaru pokazanego w Rysunek 5B z równaniem 7 i CCFPIE z równaniem 9, ujawnia 50-60 cząsteczek w centrum uwagi dla ACFgp i ACFrd, podczas gdy Napp, a więc 1/G0(tc) ~ 114 dla CCFPIE (Rysunek 5C). Stężenie znakowanych receptorów mieści się w zakresie ~100 nM, jak określono za pomocą równania 8. Aby określić średnie stężenie podwójnie znakowanych cząsteczek, najpierw oblicza się stosunek G0(tc) (reprezentowany przez 1/N(app)) CCF PIE do ACFgp i ACFrd, odpowiednio, (równanie 6). Następnie wartości te, rGRcell= 0,43 i rRGcell = 0,53, są porównywane z wartościami uzyskanymi z pomiaru DNA (rGR, DNA= 0,51 i rRG, DNA = 0,79 w tym dniu pomiaru). Stosując regułę proporcji, a rGRcell = 0,43 od ACFgp sygnału eGFP odbija się do frakcji kodyfuzji (rGRcell/rGR,DNA) wynoszącej 0,84, podczas gdy dla drugiego przypadku ACFrd sygnału substratu SNAP wartość ta wynosi 0,67. Średnie stężenie podwójnie znakowanego konstruktu NT-SNAP można ostatecznie obliczyć na podstawie równania 10. Natomiast w pomiarze pokazanym na Rysunek 5D z innego dnia, stężenie receptorów jest dość niskie, a dane bardzo zaszumione, tak że zakres dopasowania jest ograniczony do ~ 10 μs. Ponadto obserwuje się tylko niewielką ilość kodyfuzji (15 - 26%).

Rysunek 5: Podwójnie oznaczona konstrukcja NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP. (A) W konstrukcji podwójnie znakowanej eGFP wprowadza się do pętli wewnątrzkomórkowej 3, a znacznik SNAP dołącza się do N-końca β2AR (NT-SNAP). (B, D) ACFgp, ACFrd i CCFPIE z dwóch pomiarów podwójnie znakowanego konstruktu. Dane są dopasowane do bimodalnego dwuwymiarowego modelu dyfuzji (równanie 9, CCFPIE) i zawierają dodatkowe warunki relaksacji (równanie 7, ACFgp i ACFrd). Tabela w panelu (C) przedstawia wyniki dopasowania i wyprowadzony parametr stężenie (równanie 8), stosunek amplitudy korelacji przy zerowym czasie korelacji (G0(tc)) i frakcji cząsteczek współdyfuzyjnych (równanie 10). Należy pamiętać, że pomiary zostały wykonane w różnych dniach, a więc zastosowano nieco inny współczynnik do korekcji amplitudy (B: rGR,DNA = 0,51 i rRG,DNA = 0,79; D: rGR,DNA = 0,51 i rRG,DNA = 0,56). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Podwójnie oznakowana konstrukcja w trakcie FRET: β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP
W podwójnie znakowanym konstrukcie β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP (Rysunek 6A), eGFP jest wprowadzany do wewnątrzkomórkowej pętli 3 identycznej jak konstrukcja NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP ze znacznikiem SNAP dołączonym do C-końca. W tym przypadku obie etykiety znajdują się po tej samej stronie błony komórkowej komórek, tak że fluorofory znajdują się w bliskim sąsiedztwie, tak że FRET występuje zgodnie z wygaszonym czasem życia eGFP (uwaga uzupełniająca 5). Biorąc pod uwagę elastyczność stosunkowo nieustrukturyzowanych regionów białkowych, takich jak C-endus34 i co najmniej dwie różne konformacje białek GPCRs35, "high FRET" (HF) lub "low FRET" (LF), dynamiczne zmiany wydajności FRET spowodowane zmianami odległości eGFP-SNAP można zaobserwować i zidentyfikować za pomocą składnika antykorelacji w CCF FRET (pomarańczowa krzywa w Rysunek 6B). Wykazano, że fluktuacje FRET są antyskorelowane, ponieważ receptor może znajdować się tylko w jednym stanie na raz, albo HF, albo LF. Łączne (lub globalne) dopasowanie wszystkich pięciu krzywych korelacji (Rysunek 6B) ujawnia ~70% wolno dyfuzyjnych cząsteczek przy ~ 100 ms, podczas gdy reszta dyfunduje z ~ 1 ms. Wszystkie autokorelacje i CCF FRET wykazują warunki relaksacji przy 37 μs i 3 μs; te korelacje zdominowane przez sygnał czerwony (ACFrp, ACFrd i CCFFRET) pokazują dodatkową powolną składową ~ 50 ms (Rysunek 6C).

Zmiany wywołane przez FRET na CCF FRET w różnych warunkach (Rysunek 6D) są demonstrowane przez serię symulacji systemu dwustanowego z czasem fluktuacji 70 μs między stanami LF i HF. Po przełączeniu ze stanu LF na HF zmiany w sygnale antyskorelowanym są obserwowane w oknie czasowym zachęty: sygnał zielony maleje, a sygnał czerwony wzrasta (odwrotnie w przypadku przełączania HF -> LF). Jeśli przełączanie HF-LF zachodzi w skalach czasowych szybszych niż czas dyfuzji, innymi słowy podczas czasu przebywania cząsteczki w ognisku, szybkość można wyprowadzić z antykorelacji w CCFFRET6,31,36. Należy pamiętać, że w FCS nie można zaobserwować procesów dynamicznych wolniejszych niż czas dyfuzji.

W tej demonstracji założono dwa różne scenariusze FRET, pokazujące umiarkowaną lub maksymalną zmianę efektywności FRET między dwoma stanami. Symulacje zostały przeprowadzone przy użyciu Burbulator37 i uwzględniają brak lub obecność mrugania trypletów i zwiększającą się ilość przesłuchów dawcy do kanałów czerwonych. Człon dyfuzji modelowano jako rozkład bimodalny, w którym 30% cząsteczek szybko dyfundujących przy tD1 = 1 ms i pozostałych cząsteczkach dyfundujących powoli przy tD2 = 100 ms. W sumie zasymulowano 107 fotonów w objętości 3D w kształcie Gaussa z w0 = 0,5 μm i z0 = 1,5 μm, rozmiarem pudełka 20 i NFCS = 0,01.

Rysunek 6E-F pokazuje wyniki symulacji dla indukowanej przez FRET korelacji krzyżowejCCF FRET dla umiarkowanego (Rysunek 6E) i maksymalnego kontrastu FRET (Rysunek 6F) w przypadku braku (linie ciągłe) i obecności mrugania trypletów (linie przerywane). Antykorelację indukowaną przez FRET można łatwo zobaczyć w Rysunek 6F. Efekt "tłumienia" po dodaniu dodatkowego stanu trypletu zmniejsza amplitudę korelacji (Rysunek 6E-F)38,39.

Rysunek 6: Symulacja podwójnie znakowanej próbki pokazującej dynamiczny FRET. (A) Podwójnie znakowany β2AR z eGFP wstawionym do pętli wewnątrzkomórkowej 3 i C-końcowym znacznikiem SNAP. Oba fluorofory są wystarczająco blisko, aby ulegać FRET i wykazują zmiany w wydajności FRET, jeśli receptor ulega dynamice białka. (B) Autokorelacja (ACFgp, ACFrp i ACFrd, dopasowanie do równania 7) i krzywe korelacji krzyżowej (CCFFRET (równanie 7) i CCFPIE (równanie 9)) przykładowego pomiaru. Tabela w panelu (C) pokazuje wyniki dopasowania. (D-F) W celu ukazania wpływu parametru eksperymentalnego na oczekiwany, indukowany przez FRET składnik antykorelacji przeprowadzono 12 symulacji, w których modelowano zmianę wydajności FRET (małą lub dużą), różną ilość przesłuchów donorowych do kanałów akceptorowych (0%, 1% lub 10%) oraz brak i obecność mrugania trypletowego. Ułamek równowagowy obu stanów FRET przyjęto na 50:50, a ich kursy dostosowano tak, aby uzyskany czas relaksacji tR = 70 μs. Więcej szczegółów na temat symulacji znajduje się w tekście. (E) CCFFRET wyników symulacji z umiarkowanym kontrastem FRET i przy braku przesłuchów (ciemnopomarańczowy), 1% przesłuchu (pomarańczowy) i 10% przesłuchu (jasnopomarańczowy). Linie ciągłe pokazują wyniki przy braku trypletu, linie przerywane w obecności trójki. (F) CCF FRET wyników symulacji z maksymalnym kontrastem FRET. Kod koloru jest identyczny z (E). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Jednak w symulacji najbardziej zbliżonej do warunków eksperymentalnych (α = 10%, 15% trypletowego mrugania i umiarkowany kontrast FRET, przerywana żółta linia w Rysunek 6E), człon antykorelacji jest prawie zaniżony. Rysunek 7 pokazuje wynik analizy tych symulowanych danych przy użyciu informacji zakodowanych w histogramach czasu nadejścia fotonów (tj. czasu życia fluorescencji) za pomocą spektroskopii korelacji czasu życia fluorescencji (FLCS)17,19 lub FCS filtrowany gatunkowo (fFCS)18. W tym przypadku czasy życia fluorescencji znanych gatunków HF i LF (Rysunek 7A) są wykorzystywane do generowania wag lub "filtrów" (Rysunek 7B), które są stosowane podczas procedury korelacji. W otrzymanych krzywych autokorelacji gatunkowej i krzyżowej (Rysunek 7C-D) można wyraźnie zaobserwować antykorelację.

Rysunek 7: Filtrowany przez cały czas życia FCS może pomóc w odkryciu opartych na dynamice białek fluktuacji wydajności FRET w próbkach o wysokim przesłuchu, znaczącym mruganiu trypletów lub innych właściwościach fotofizycznych lub eksperymentalnych maskujących antykorelację indukowaną przez FRET w CCF FRET. W tym miejscu podejście jest pokazane przykładowo dla danych pokazanych w Rysunek 6E dla symulacji zawierającej 10% przesłuchów i 5% trypletowego mrugania. (A) Znormalizowane wzorce intensywności zaniku fluorescencji dla dwóch gatunków FRET (jasnozielony i ciemnozielony odpowiednio dla wysokiego i niskiego FRET) oraz IRF (szary). Wzorzec dla równoległego kanału detekcji jest pokazany liniami ciągłymi, liniami przerywanymi dla prostopadłego kanału detekcji. (B) Funkcja ważenia lub "filtr" zostały wygenerowane na podstawie wzorów pokazanych w (A), kod koloru jest identyczny jak w (A). Należy pamiętać, że uwzględniany jest tutaj tylko sygnał w zielonych kanałach detekcji, a tym samym wygaszanie dawcy wywołane przez FRET. (C) Uzyskuje się cztery różne korelacje gatunkowe: autokorelacje gatunkowe stanu niskiego FRET (sACFLF-LF, ciemnozielony) i wysokiego stanu FRET (sACFHF-HF, jasnozielony) oraz dwie korelacje międzygatunkowe między stanem niskiego FRET a stanem wysokiego FRET (sCCFLF-HF, ciemnopomarańczowy) i odwrotnie (sCCFHF-LF, pomarańczowy). sCCF wyraźnie pokazuje antykorelację w zakresie μs. Przerywane czarne linie pokazują pasowania. sACF były dopasowane do równania 9, a sCCF do równania 11. Tabela w panelu (D) pokazuje wyniki dopasowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

CCFPIE amplituda do badania interakcji białko-białko (PPI)
Wreszcie, częstym przypadkiem użycia FCS opartego na PIE w żywych komórkach jest badanie interakcji między dwoma różnymi białkami. Tutaj parametrem odczytu jest amplituda CCF PIE, a dokładniej stosunek amplitud autokorelacji ACFgp i ACFrd do amplitudy CCFPIE. Aby pokazać wpływ rosnącej kodyfuzji na CCFPIE, przeprowadzono symulacje w oparciu o dwa jednoznakowane konstrukty, β2AR-IL3-eGFP i NT-SNAP-β2AR (Rysunek 8A). Rysunek 8B pokazuje, jak zwiększa się amplituda CCF PIE, gdy frakcja cząsteczek współdyfuzyjnych zmienia się z 0% na 100%. Należy pamiętać, że 1% przesłuch sygnału zielonego do kanałów czerwonych w oknie czasu opóźnienia został dodany z komponentami dyfuzyjnymi inaczej modelowanymi, jak pokazano powyżej.

Rysunek 8: CCF PIE może być używany do badania interakcji dwóch białek. (A) Tutaj zasymulowano badanie kotransfekcjiβ 2AR-IL3-eGFP z NT-SNAP-β2AR (posiadającym "czerwoną" etykietę SNAP). (B) Dla rosnącej ilości cząsteczek współdyfuzyjnych (0% (ciemnoniebieski) -> 100% (jasnoniebieski)) amplituda G(tc) wzrasta. Okres dyfuzji został ponownie zamodelowany jako rozkład bimodalny, w którym 30% cząsteczek szybko dyfunduje przy tD1 = 1 ms, a reszta cząsteczek dyfunduje powoli przy tD2 = 100 ms. Dodatkowo dodano 1% przesłuchu sygnału zielonego do czerwonego okna czasowego opóźnienia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Lista zmiennych i skrótów. Do stosowania symboli i definicji w eksperymentach fluorescencyjnych i FRET zalecane są wytyczne społeczności FRET40.

PLIKI DODATKOWE:

SuppNote1_Coverslip cleaning.docx Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

SuppNote2_Confocal Setup.docx Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

SuppNote3_Data export.docx Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

SuppNote4_FCCS analiza kalibracji za pomocą ChiSurf.docx Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

SuppNote5_Fluorescence histograms.docx dożywotni Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

S6_Scripts.zip Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

S7_Excel_templates.zip Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych konfliktów.