Artykuł metodologiczny

Generacja jednostek motorycznych człowieka z funkcjonalnymi połączeniami nerwowo-mięśniowymi w urządzeniach mikroprzepływowych

DOI:

10.3791/62959

⸱

7 września 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosciences, Experimental Neurology, and Leuven Brain Institute, KU Leuven - University of Leuven, 2VIB Bio Imaging Core, KU Leuven - University of Leuven, 3Department of Development and Regeneration, Stem Cell and Developmental Biology, KU Leuven - University of Leuven, 4Department of Neurology, University Hospitals Leuven

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metodę generowania ludzkich jednostek motorycznych w komercyjnie dostępnych urządzeniach mikroprzepływowych poprzez kokulturację ludzkich indukowanych pluripotencjalnych neuronów ruchowych pochodzących z komórek macierzystych z ludzkimi pierwotnymi miotubami pochodzącymi z mezoangioblastów, co prowadzi do powstania funkcjonalnie aktywnych połączeń nerwowo-mięśniowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Połączenia nerwowo-mięśniowe (NMJ) to wyspecjalizowane synapsy między aksonem dolnego neuronu ruchowego a mięśniem, ułatwiające włączenie skurczu mięśni. W zaburzeniach neuronu ruchowego, takich jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS) i rdzeniowy zanik mięśni (SMA), NMJ ulegają zwyrodnieniu, powodując zanik mięśni i postępujący paraliż. Mechanizm leżący u podstaw zwyrodnienia NMJ jest nieznany, głównie z powodu braku przekładalnych modeli badawczych. Badanie to miało na celu stworzenie wszechstronnego i powtarzalnego modelu in vitro ludzkiej jednostki motorycznej z funkcjonalnymi NMJ. W związku z tym neurony ruchowe pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) i ludzkie pierwotne miorurki pochodzące z mezoangioblastów (MAB) były hodowane wspólnie w dostępnych na rynku urządzeniach mikroprzepływowych. Zastosowanie płynnie izolowanych mikrokompartmentów pozwala na utrzymanie mikrośrodowisk specyficznych dla komórek, umożliwiając jednocześnie kontakt między komórkami przez mikrorowki. Stosując gradient chemotaktyczny i wolumetryczny, stymulowano wzrost neuronów ruchowych przez mikrorowki promujące interakcję miotubową i tworzenie NMJ. Te NMJ zidentyfikowano immunocytochemicznie poprzez kolokalizację markera presynaptycznego neuronu ruchowego synaptofizyny (SYP) i markera postsynaptycznego receptora acetylocholiny (AChR) α-bungarotoksyny (Btx) na mięśniówkach i scharakteryzowano morfologicznie za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Funkcjonalność NMJ potwierdzono poprzez pomiar odpowiedzi wapnia w miotubach po depolaryzacji neuronów ruchowych. Jednostka motoryczna wygenerowana przy użyciu standardowych urządzeń mikroprzepływowych i technologii komórek macierzystych może pomóc w przyszłych badaniach koncentrujących się na NMJ w zdrowiu i chorobie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NMJ ułatwiają komunikację między dolnymi neuronami ruchowymi rdzenia kręgowego a włóknami mięśni szkieletowych poprzez uwalnianie neuroprzekaźników1. W zaburzeniach neuronu ruchowego, takich jak ALS i SMA, NMJ ulegają degeneracji, co powoduje zakłócenia w komunikacji z mięśniami2,3,4,5,6,7. Powoduje to, że pacjenci stopniowo tracą funkcję mięśni, co powoduje, że są przykuci do wózka inwalidzkiego i ostatecznie zależni od podtrzymywania życia przez układ oddechowy z powodu postępującego zaniku ważnych grup mięśni, takich jak przepona. Dokładne mechanizmy odpowiedzialne za tę głęboką utratę NMJ w tych zaburzeniach nie są znane. Przeprowadzono wiele badań na transgenicznych modelach zwierzęcych, które dały nam pewien wgląd w patogenezę zwyrodnienia NMJ5,6,8,9,10,11. Jednak, aby w pełni zrozumieć patologię i przeciwdziałać odnerwieniu, ważne jest, aby mieć ludzki system, który umożliwia pełną dostępność.

Tutaj protokół opisuje stosunkowo prosty sposób generowania ludzkich NMJ poprzez kokulturację neuronów ruchowych pochodzących z hiPSC i ludzkich pierwotnych myotubek pochodzących z MAB za pomocą dostępnych na rynku urządzeń mikroprzepływowych. Zastosowanie mikrofluidyki do polaryzacji i płynnej izolacji somy i aksonów neuronów jest znane od czasu pierwszego opisu komór 'Campenot' 12 pod koniec lat siedemdziesiątych. Od tego czasu wyprodukowano więcej projektów mikroprzepływowych, w tym opcje komercyjne. Urządzenia używane w tym protokole zawierają dwie komory, a każda komora składa się z dwóch studzienek połączonych kanałem13. Dwie komory są lustrzane i połączone kilkoma mikrorowkami. Te mikrorowki mają rozmiar, który ułatwia wzrost neurytu, zachowując jednocześnie izolację płynów między dwoma przedziałami poprzez kapilarne ciśnienie hydrostatyczne13,14. Za pomocą tego systemu możliwe jest hodowanie neuronów ruchowych w jednym przedziale i komórek mięśniowych w drugim, każda w specyficznym pożywce hodowlanej, jednocześnie ułatwiając fizyczne połączenie poprzez neuryty przechodzące przez mikrorowki i angażujące się w komórki mięśniowe. Model ten zapewnia w pełni dostępny i adaptowalny system in vitro ludzkiej jednostki motorycznej, który może być wykorzystany do badania wczesnej patologii NMJ w chorobach takich jak ALS i SMA.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uzyskano pisemną świadomą zgodę od wszystkich badanych, którzy dostarczyli swoje próbki do generowania iPSC i zbierania MAB. Procedura została zatwierdzona przez komisję etyki medycznej Szpitala Uniwersyteckiego w Leuven (nr S5732-ML11268) oraz przez główną komisję etyczną ds. badań naukowych w Wielkiej Brytanii w ramach projektu StemBANCC. Wszystkie odczynniki i sprzęt używany w tym protokole są wymienione w Tabeli Materiałów i powinny być używane w stanie sterylnym. Media należy podgrzać do temperatury pokojowej (RT) przed użyciem, chyba że określono inaczej. Aby zapoznać się z omówieniem protokołu kokultury, zobacz Rysunek 1.

1. Różnicowanie komórek progenitorowych neuronów ruchowych od iPSC

  1. Postępuj zgodnie z protokołem różnicowania neuronów ruchowych15, zaadaptowanym z poprzedniego badania16, aż do osiągnięcia stanu neuronalnego progenitora (NPC) w dniu 10. Zgodnie z ramami czasowymi protokołu, różnicowanie jest inicjowane w poniedziałek (dzień 0), co skutkuje NPC dnia 10 w czwartek.
  2. Kriokonserwacja 10 dzień NPC w nokautującej surowicy zastępującej 10% dimetylosulfotlenku (DMSO) o gęstości 2 x 106-4 x 106 komórek na fiolkę.
    UWAGA: DMSO jest toksyczny: obsłużyć w dygestoriach ze środkami ochrony osobistej.
    UWAGA: Oczekuje się, że około 50% dnia 10 NPC będzie ważnych po rozmrożeniu. Zatrzymaj protokół różnicowania neuronów ruchowych w tym stanie "NPC dnia 10" i zakonserwuj NPC, aby wygenerować dużą liczbę NPC, które można przechowywać i używać później, skracając długość ogólnej osi czasu protokołu kokultury z 28 dni do 19 dni łącznie.

2. Wyprowadzanie i utrzymywanie ludzkich MABów

UWAGA: MABy to mezenchymalne komórki macierzyste związane z naczyniami krwionośnymi, które w tym przypadku zostały pobrane z biopsji pobranych od 58-letniego zdrowego dawcy. Dostępne są alternatywne źródła komercyjne. Protokół uzyskiwania MAB jest pokrótce wyjaśniony. Aby uzyskać więcej informacji, zapoznaj się ze szczegółowym protokołem17. Wszystkie media MAB należy podgrzać do 37 °C przed użyciem.

  1. Tkankę biopsyjną należy zmielić i inkubować na kolagenie (ze skóry cielęcej) pokrytym 6 cm szalkami w pożywce wzrostowej (Tabela 1) przez 2 tygodnie. Zmieniaj podłoże co 4 dni.
    1. Aby przygotować powłokę kolagenową, rozpuść 100 mg kolagenu w 20 ml 0,1 M kwasu octowego. Kolagen potrzebuje czasu, aby się rozpuścić, więc umieść mieszaninę na noc na platformie kołyszącej w temperaturze pokojowej. Następnego dnia uzupełnić 80 ml ddH2O do końcowej objętości 100 ml.
      UWAGA: Kwas octowy jest toksyczny; uchwyt w dygestorii z środkami ochrony indywidualnej.
      UWAGA: Kolagen z powłoki ze skóry cielęcej może być ponownie wykorzystany do 5x. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Pokryć całą powierzchnię naczynia lub kolby kolagenem, zamknąć i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej w przepływie laminarnym. Po 20 minutach odzyskać kolagen do nowego pojemnika, zamknąć puste naczynie/kolbę i pozostawić na 10 minut w temperaturze pokojowej w przepływie laminarnym.
    3. Przenieść naczynie/kolbę do inkubatora w celu inkubacji przez noc (lub co najmniej 6 godzin) (37 °C, 5 % CO2 ). Przemyć 5x buforowaną fosforanem solą fizjologiczną bez wapnia i magnezu (DPBS) firmy Dulbecco przed posiewem komórek.
  2. Po 14 dniach FACS (fluorescencyjne sortowanie komórek) sortuje MAB pod kątem ludzkiej fosfatazy alkalicznej17, a następnie następuje dalsza ekspansja. Utrzymuj MAB na kolbach T75 pokrytych kolagenem w pożywce wzrostowej i zmieniaj podłoże wzrostowe co 2 dni (10 ml na kolbę).
  3. Kriorezerwacja, pasaż lub nasiona MAB w urządzeniach po osiągnięciu 70% konfluencji.
    UWAGA: MAB tracą swój potencjał miogenny z powodu spontanicznych fuzji po kontakcie międzykomórkowym. Upewnij się, że nie przekraczasz 70% konfluencji podczas rozszerzania MAB. Jedna 70% zlewająca się kolba T75 zawiera około 600 000-800 000 komórek, które można kriokonserwować w ilości 100 000 komórek na fiolkę. Każda fiolka może być później rozmrożona i wysiana w kolbie T75 w celu rozprężenia.
  4. Aby przejść MAB, delikatnie przemyj je raz 7 ml DPBS, a następnie inkubuj w 7 ml roztworu dysocjacyjnego MAB przez 3 minuty w temperaturze 37 °C w 5% CO2 w celu dysocjacji komórek.
    1. Zneutralizować roztwór dysocjacyjny MAB za pomocą 7 ml pożywki wzrostowej, delikatnie zeskrobać komórki i przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Delikatnie przemyć kolbę dodatkowymi 5 ml pożywki wzrostowej, aby zebrać potencjalnie pozostałe MAB.
    2. Odwirować zawiesinę komórkową przez 3 minuty przy 300 x g, a następnie przejść bezpośrednio do nowej kolby T75 pokrytej kolagenem w celu rozprężenia, kriokonserwacji w zastępowaniu surowicy wykańczającej 10% DMSO lub policzyć do wysiewu w urządzeniu mikroprzepływowym.
      UWAGA: Pasaże są wykonywane 1x-2x w tygodniu w celu ekspansji komórek, aż do maksymalnej liczby pasaży 13. Po dysocjacji MAB wydają się kuliste i mają duży kształt, gdy są badane pod mikroskopem.

3. Przygotowanie wstępnie zmontowanych urządzeń mikroprzepływowych - Dzień 9

UWAGA: Protokół jest zaadaptowany z protokołu urządzenia neuronowego producenta urządzeń mikroprzepływowych i został dostosowany do korzystania zarówno z urządzeń wstępnie zmontowanych, jak i silikonowych. W tym przypadku wstępnie zmontowane urządzenia są używane do immunocytochemii (ICC) i zapisów stanów przejściowych wapnia z żywych komórek, podczas gdy urządzenia silikonowe są używane do SEM. Oś czasu protokołu jest zgodna z osią czasu protokołu różnicowania neuronów ruchowych.

  1. Przygotuj urządzenia mikroprzepływowe na dzień przed wysiewem komórek, ponieważ powłoka musi być inkubowana przez noc. Zgodnie z protokołem neuronu ruchowego będzie to środa. Dodaj ~10 ml 70%-100% etanolu do 10-centymetrowej szalki Petriego. Użyj kleszczy, aby przenieść urządzenie z pojemnika transportowego na szalkę Petriego w celu sterylizacji.
  2. Zanurz urządzenie w etanolu na 10 s i przenieś urządzenie za pomocą kleszczyków na kartkę papieru, aby wyschło na powietrzu w przepływie laminarnym przez ~30 min. Obróć urządzenie kilka razy, aby obie strony wyschły. Gdy urządzenie wyschnie, użyj kleszczyków, aby przesunąć każde urządzenie na indywidualną szalkę Petriego o średnicy 10 cm, aby ułatwić obsługę
    UWAGA: Etanol jest toksyczny; uchwyt w dygestorium z wyposażeniem ochrony indywidualnej
  3. Pokryć urządzenie poli-L-ornityną (PLO) (100 μg/ml) w DPBS i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 3 godziny.
    1. Za pomocą pipety P200 dodaj 100 μl PLO do DPBS w górnej studzience jak najbliżej otworu kanału i obserwuj płyn przepływający od górnej studzienki przez kanał do studzienki dolnej. Następnie dodaj 100 μl PLO w DPBS do studzienki dennej.
    2. Powtórzyć tę czynność po drugiej stronie mikrorowków i zakończyć, dodając 100 μl po jednej stronie urządzenia, aby utworzyć gradient objętości między dwiema lustrzanymi stronami urządzenia w celu pokrycia mikrorowków (np. prawa strona 200 μl, lewa strona 300 μl). Po 3 godzinach myj urządzenie 3x przez 5 min DPBS. W razie potrzeby użyj systemu ssącego.
      UWAGA: Upewnij się, że nie tworzy się pęcherzyków powietrza w kanałach w dowolnym momencie podczas powlekania lub hodowli komórek. Nawet małe pęcherzyki rozszerzają się w krótkim czasie, hamując w ten sposób powlekanie, wysiewanie komórek lub przepływ pożywki przez kanał. Jeśli płyn zatrzyma się w kanale podczas powlekania, ponownie zawiesić roztwór PLO bezpośrednio w kanale z obu stron. Jeśli pęcherzyki są nadal obecne, użyj 200 μl DPBS do przepłukania kanału i powtórz proces powlekania, jak opisano powyżej w krokach 3.3.1-3.3.2. Jeśli po wysianiu komórek pojawią się bąbelki, nie można odzyskać urządzenia, ponieważ przepłukanie kanału spowoduje uszkodzenie komórek.
  4. Pokryj urządzenie lamininą (20 μg/ml) w pożywce Neurobasel i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Postępuj zgodnie z tymi samymi instrukcjami dla powlekania PLO z kroków 3.3.1-3.3.2.
  5. Następnego dnia użyj pipety P200 i umieść końcówkę w studzience przeciwnej do otworu kanału, aby usunąć powłokę lamininy z dołków. Dodaj DPBS do wszystkich studzienek i pozostaw urządzenia z DPBS w przepływie laminarnym w RT w celu wysiewu komórek.
    UWAGA: Od tego momentu ważne jest, aby nie usuwać cieczy (powłoki lamininowej, DPBS, mediów, roztworu utrwalającego itp.) bezpośrednio z kanałów, ponieważ może to spowodować tworzenie się pęcherzyków powietrza. Zawsze sprawdzaj urządzenia pod mikroskopem przed wysiewem komórek.

4. Przygotowanie silikonowych urządzeń mikroprzepływowych - Dzień 9

  1. Silikonowe urządzenia mikroprzepływowe należy przygotować na dzień przed wysiewem komórek, ponieważ powłoka musi być inkubowana przez noc. Zgodnie z protokołem neuronu ruchowego będzie to środa.
    1. Dodaj ~10 ml 70%-100% etanolu do 10-centymetrowej szalki Petriego. Użyj kleszczy, aby przenieść urządzenie z pojemnika transportowego na szalkę Petriego w celu sterylizacji. Zanurz urządzenie w etanolu na 10 s i przenieś za pomocą kleszczy do studzienki w płytce 6-dołkowej w celu wyschnięcia na powietrzu w przepływie laminarnym przez ~30 min. Ustaw urządzenie na boku, aby wszystkie strony wyschły.
    2. Przytnij arkusze SEM do rozmiaru urządzenia (zostaw po kilka mm z każdej strony). Powtórzyć sterylizację, jak podano powyżej w kroku 4.1.1. Następnie przenieś kleszczami na 10-centymetrową szalkę Petriego do wyschnięcia. Dwa-trzy arkusze SEM zmieszczą się w jednym naczyniu.
  2. Pokryć urządzenia i arkusze SEM PLO (100 μg/ml) w DPBS i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 3 godziny.
    1. Dodaj 1 ml PLO w DPBS na studzienkę do każdego urządzenia w płytce 6-dołkowej. Upewnij się, że urządzenie unosi się na wierzchu roztworu PLO, a kanał i strona z mikrorowkami są skierowane w dół do cieczy. Dodaj 10 ml PLO do DPBS na 10 cm szalkę Petriego i użyj kleszczy, aby wepchnąć arkusze SEM do cieczy.
      UWAGA: Arkusze SEM zwykle unoszą się na wierzchu roztworu powłokowego. Przed montażem urządzenia i arkusza należy obrócić arkusz SEM tak, aby powierzchnia, która miała kontakt z PLO, stykała się z kanałem i powierzchnią mikrorowka urządzenia.
    2. Po 3 godzinach umyj urządzenie i prześcieradła SEM 2x przez 5 min DPBS, a następnie ponownie umyj przez 5 min sterylną wodą. W razie potrzeby użyj systemu ssącego. Przenieś każdy arkusz SEM na osobną szalkę Petriego o średnicy 10 cm, aby ułatwić obsługę.
      UWAGA: Zarówno urządzenia, jak i arkusze SEM muszą być całkowicie suche przed montażem. Końcowe mycie sterylną wodą usuwa potencjalne kryształki soli z DPBS, które w przeciwnym razie mogłyby zahamować montaż.
  3. Pracuj pod mikroskopem w przepływie laminarnym. Użyj kleszczyków, aby zamontować urządzenie silikonowe kanałem i stroną z mikrorowkiem do dołu pod kątem 90° na arkuszu SEM, upewniając się, że wszystkie boki są wyrównane. Lekko dociśnij urządzenie, aby upewnić się, że uszczelniłeś nie tylko zewnętrzne krawędzie, ale także wokół studzienek, kanałów i mikrorowków.
    UWAGA: Połączone obszary będą wyświetlane na szaro, podczas gdy te, które nie zostały jeszcze zamontowane, będą widoczne pod mikroskopem. Upewnij się, że wszystkie obszary są dobrze uszczelnione bez pęcherzyków powietrza, aby uniknąć odłączenia urządzenia podczas hodowli. W przypadku, gdy zanieczyszczenia lub kryształki soli blokują montaż, należy ponownie umyć zarówno arkusz SEM, jak i urządzenie w sterylnej wodzie i wysuszyć przed ponowną próbą montażu. Jeśli mikrorowki wydają się zniekształcone od zbyt mocnego nacisku na urządzenie, całkowicie wyjmij urządzenie z arkusza SEM i spróbuj ponownie zamontować. Zachowaj ostrożność podczas powlekania i wymiany nośnika po zamontowaniu urządzenia.
  4. Pracuj pod mikroskopem w przepływie laminarnym. Pokryj urządzenie lamininą (20 μg/ml) w pożywce Neurobasel i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
    UWAGA: Inkubacja przez noc utwardza silikonowe urządzenie i dodatkowo uszczelnia je na arkuszu SEM.
    1. Za pomocą pipety P200 dodaj 100 μl roztworu lamininy do górnej studzienki jak najbliżej otworu kanału i obserwuj płyn przepływający od górnej studzienki przez kanał do dolnej studzienki. Sprawdź, czy nie ma wycieków wokół studni i kanału.
    2. Następnie dodaj 100 μl roztworu lamininy do studzienki dennej i sprawdź, czy nie ma wycieków. Powtórz tę czynność po drugiej stronie mikrorowków i zakończ dodatkowymi 100 μl po jednej stronie urządzenia, aby utworzyć gradient objętości między dwiema lustrzanymi stronami urządzenia w celu pokrycia mikrorowków (np. prawa strona 200 μl, lewa strona 300 μl).
      UWAGA: W przypadku wycieku należy usunąć powłokę lamininy, zdemontować urządzenie i arkusze SEM i umyć je w sterylnej wodzie. Pozostaw do wyschnięcia i powtórz czynności od kroku 4.3.
    3. Następnego dnia usuń powłokę ze studzienek za pomocą pipety P200, umieszczając końcówkę w studzience naprzeciwko otworu kanału. Dodaj DPBS do wszystkich studzienek i pozostaw urządzenia z DPBS w przepływie laminarnym w RT w celu wysiewu komórek.
      UWAGA: Od tego momentu nie należy usuwać płynów (powłoki lamininy, DPBS, mediów, roztworu utrwalającego itp.) bezpośrednio z kanałów, ponieważ może to spowodować tworzenie się pęcherzyków powietrza. Zawsze sprawdzaj urządzenia pod mikroskopem przed wysiewem komórek.

5. Poszycie NPC w urządzeniach mikroprzepływowych - Dzień 10

UWAGA: Zgodnie z protokołem różnicowania neuronów ruchowych15, poszycie NPC dnia 10 następuje w czwartek.

  1. Użyj świeżo zdysocjowanych NPCs z dnia 1015 lub rozmrozić 1-2 fiolki z bankami NPC na 10 ml pożywki dla neuronów ruchowych dnia 10 (Tabela 2 i Tabela 3) z roztworem inhibitora ROCK (10 μL/ml) i odwirować zawiesinę komórkową o sile 100 x g przez 4 min.
  2. Zawiesić osad komórkowy w 500-1000 μl pożywki dla neuronów ruchowych dnia 10 z roztworem inhibitora ROCK (10 μL/ml) i policzyć żywe komórki przy użyciu dowolnej preferowanej metody liczenia.
    UWAGA: Jak stwierdzono poniżej, upewnij się, że NPC zostały ponownie zawieszone w odpowiedniej ilości podłoża, aby dostosować się do optymalnej objętości wysiewu.
  3. Usuń DPBS z dwóch studzienek po jednej stronie mikrorowków w urządzeniu za pomocą pipety P200 i zasiej 250 000 NPC na urządzenie w 60-100 μl pożywki neuronów ruchowych dnia 10.
    1. W prawym górnym dołku zasiej 30-50 μl zawiesiny komórek (125 000 komórek) blisko otworu kanału pod kątem 45° i delikatnie przeciągnij pozostały płyn wzdłuż dna studzienki w kierunku środka studzienki za pomocą końcówki pipety.
    2. Zatrzymaj się na kilka sekund, aby zawiesina komórek mogła przepłynąć przez kanał, a następnie powtórz to w dolnej studzience (125 000 komórek w 30-50 μl). Użyj długopisu, aby oznaczyć stronę z nasionami "NPC" lub odpowiednik, aby ułatwić orientację urządzenia bez mikroskopu.
    3. Inkubować urządzenie w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 5 minut, aby umożliwić przyłączenie komórek, przed uzupełnieniem studzienek z dwoma nasionami dodatkowym dożywką z neuronami ruchowymi 10 dnia (łącznie 200 μL/studzienkę) i ponownie inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
      UWAGA: Każda studzienka może zawierać 200 μl. Wysiewanie komórek zarówno w studzienkach, jak i kanałach zapewnia solidną strukturę hodowli, zmniejszając ryzyko oderwania się komórek podczas zmiany pożywki. Możliwe jest zasianie mniejszej liczby komórek w samym kanale. Spowoduje to jednak, że kultura będzie bardziej podatna na prąd objętościowy przepływający przez kanały podczas każdej zmiany podłoża.
  4. Użyj pipety P200, aby usunąć DPBS z dwóch dołków po drugiej stronie mikrorowków naprzeciwko świeżo wysianych NPC. Dodaj 200 μl / dołek pożywki neuronów ruchowych dnia 10 i odczekaj kilka sekund między górną a dolną studzienką, aby umożliwić przepływ pożywki przez kanał. Następnie dodaj 6 ml DPBS na 10 cm naczynie wokół urządzenia, aby zapobiec parowaniu pożywki podczas inkubacji.
    UWAGA: W razie potrzeby dodaj dodatkowe DPBS wokół urządzenia w okresie hodowli.
  5. Wykonaj pełną wymianę pożywki neuronu ruchowego w obu przedziałach urządzenia w dniu 11 (piątek), dniu 14 (poniedziałek) i dniu 16 (środa) (Tabela 2 i Tabela 3). Dodaj świeże suplementy pożywki w dniu zmiany podłoża.
    UWAGA: Od tego momentu wszystkie zmiany podłoża należy wykonywać za pomocą pipety P200. Końcówkę pipety należy zawsze umieszczać z dala od kanału na krawędzi studzienki i nie usuwać płynu bezpośrednio z kanału. Uważaj, aby nie odczepić silikonowych urządzeń. Wyjmowanie i dodawanie pożywki powinno odbywać się powoli, aby zapobiec oderwaniu się komórek.
    1. Ostrożnie usuń wszystkie media z obu studzienek za pomocą NPC, umieszczając końcówkę pipety P200 na dolnej krawędzi ścianki studzienki naprzeciwko otworu kanału. Powoli dodaj 50-100 μl świeżej pożywki dla neuronów ruchowych do górnej studzienki, umieszczając końcówkę pipety P200 na górnej krawędzi ścianki studzienki naprzeciwko otworu kanału.
    2. Zatrzymaj się na kilka sekund, aby pożywka mogła przepłynąć przez kanał, a następnie dodaj 50-100 μl pożywki neuronów ruchowych do dolnej studzienki. Powtarzaj ten proces ostrożnie, aż obie studzienki będą zawierały 200 μl/studzienkę. Powtórz po stronie bez komórek.

6. Posiewanie MAB w urządzeniach mikroprzepływowych - Dzień 17

  1. Około 7 dni przed wysiewem MAB w urządzeniach mikroprzepływowych (10 dzień różnicowania neuronów ruchowych), rozmrozić MAB i wysiać je w pożywce wzrostowej (Tabela 1) w kolbie T75 pokrytej kolagenem, aby umożliwić wystarczającą ekspansję komórek. Patrz punkt 2.
  2. W 17 dniu różnicowania neuronów ruchowych (czwartek) rozdziel MAB, jak wyjaśniono w kroku 2.4, ponownie zawieś osad komórkowy w ~ 500 μl pożywki wzrostowej i policz żywe komórki przy użyciu dowolnej preferowanej metody liczenia.
    UWAGA: Jak stwierdzono poniżej, upewnij się, że MAB zostały ponownie zawieszone w odpowiedniej ilości podłoża, aby zapewnić optymalną objętość wysiewu.
  3. Usuń pożywkę neuronu ruchowego po niezasianej stronie mikrorowków w urządzeniu za pomocą pipety P200, delikatnie przemyj DPBS i zasiej 200 000 MAB na urządzenie w 60-100 μl pożywki wzrostowej.
    1. W prawym górnym dołku wysiew 30-50 μl zawiesiny komórek (100 000 komórek) blisko otworu kanału pod kątem 45° i delikatnie przeciągnij pozostały płyn wzdłuż dna studzienki w kierunku środka studzienki za pomocą końcówki pipety. Zatrzymaj się na kilka sekund, aby umożliwić przepływ komórek przez kanał przed powtórzeniem w dolnej studzience (100 000 komórek w 30-50 μl).
    2. Inkubować urządzenie w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 5 minut, aby umożliwić przyłączenie komórek, przed uzupełnieniem dwóch świeżo wysianych MAB studzienek dodatkowym podłożem wzrostowym (łącznie 200 μl/studzienkę). Ponownie inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
      UWAGA: W 17 dniu nie jest wymagana żadna zmiana pożywki po stronie neuronu ruchowego urządzenia. Zmiana pożywki dnia 17 zgodnie z wcześniej opublikowaną metodą różnicowania neuronów ruchowych15 jest wykonywana w dniu 18 (piątek).

7. Implementacja gradientu wolumetrycznego i chemotaktycznego w celu promowania wzrostu neurytów neuronów ruchowych w kierunku przedziału MAB

  1. W dniu 18 wykonaj pełną zmianę pożywki po stronie neuronu ruchowego za pomocą pożywki neuronu ruchowego dnia 18 (200 μL/studzienkę). Postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi średnich zmian wymienionymi w krokach 5.5.1-5.5.2. Zainicjować różnicowanie MAB w komorze MAB urządzenia (Tabela 2 i Tabela 4).
    1. Ostrożnie umyć komory MAB raz za pomocą DPBS przed dodaniem wstępnie podgrzanej pożywki różnicującej MAB (Tabela 4) uzupełnionej 0,01 μg/ml ludzkiego ziarna (200 μl/studzienkę).
      UWAGA: MAB łączą się i tworzą wielojądrowe miorurki w ciągu jednego tygodnia.
  2. W 21 dniu, zgodnie z protokołem różnicowania neuronów ruchowych (poniedziałek), zainicjuj gradient chemotaktyczny i wolumetryczny (Tabela 2 i Tabela 3).
    1. Dodać 200 μl / studzienkę podłoża podstawowego neuronu ruchowego z 30 ng / ml neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego (BDNF), czynnika neurotroficznego pochodzącego z linii komórek glejowych (GDNF) i neurotroficznego czynnika rzęskowego (CNTF), ludzkiego agrin (0,01 μg / ml) i lamininy (20 μg / ml) do przedziału miotubowego (wcześniej zdefiniowanego jako przedział MAB). Dodać podłoże podstawowe neuronu ruchowego (100 μl/dołek) bez czynników wzrostu do przedziału neuronu ruchowego.
  3. Powtarzaj krok 7.2 co drugi dzień, aż do 28 dnia różnicowania neuronów ruchowych. W weekendy nie jest wymagana zmiana nośników.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schematyczny przegląd protokołu jednostki motorycznej w urządzeniach mikroprzepływowych. Oś czasu różnicowania i przegląd kokultur od dnia 0 do dnia 28 zgodnie z osią czasu protokołu różnicowania neuronów ruchowych22. Różnicowanie neuronów ruchowych od iPSC rozpoczyna się w dniu 0 i odbywa się zgodnie z wcześniejszymi opisami przez kolejne 10 dni15. W 9 dniu urządzenie jest sterylizowane i powlekane PLO-lamininą. MAB rozmraża się w celu rozprężenia w kolbach T75. W dniu 10 neurony-NPC ruchowe są umieszczane w obu studzienkach i kanale jednego przedziału (jasnoszarego) urządzenia, gdzie ich różnicowanie w neurony ruchowe jest kontynuowane przez tydzień. MAB są posiewane w obu studzienkach i kanale przeciwległej komory (ciemnoszarej) w dniu 17. W 18 dniu rozpoczyna się różnicowanie MAB w miotube. W 21 dniu ustalany jest gradient wolumetryczny i chemotaktyczny w celu promowania polaryzacji neuronów ruchowych i neurytów przez mikrorowki urządzenia. Przedział neuronu ruchowego otrzymał 100 μl / dołek podłoża podstawowego neuronu ruchowego bez czynników wzrostu (jasnozielony przedział), podczas gdy przedział mięśniówki otrzymał 200 μl / studzienkę podłoża podstawowego neuronu ruchowego z 30 ng / ml czynników wzrostu (ciemnozielony przedział) (Tabela 2 i Tabela 3). Hodowlę kontynuuje się z gradientem wolumetrycznym i chemotaktycznym przez dodatkowe 7 dni, aż do analizy w 28 dniu. Obrazy w jasnym polu pokazują morfologię komórek w dniu 0, dniu 11, dniu 18 i dniu 28 hodowanych we wstępnie zmontowanych urządzeniach mikroprzepływowych. Podziałka liniowa, 100 μm. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie Stoklund Dittlau, K. et al.18. Ilustracje komórek zostały zmodyfikowane na podstawie Smart Server medical Art22. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

8. Fiksacja i ICC

UWAGA: Wszystkie kroki powinny być wykonane ostrożnie, aby zapobiec odłączeniu się kultur neuronalnych. Nie usuwaj płynu z kanałów podczas wykonywania poniższych czynności.

  1. Wykonaj utrwalanie w dygestoriach lub przepływie laminarnym: Przed utrwaleniem dokładnie umyj wszystkie studzienki w urządzeniu za pomocą DPBS. Utrwalić przy użyciu 4 % paraformaldehydu (PFA) w DPBS przez 15-20 minut w temperaturze pokojowej w przepływie laminarnym (100 μl/studzienkę).
    UWAGA: PFA jest toksyczny: obnosić się z dygestoriami ze środkami ochrony osobistej.
    1. Ostrożnie dodać 100 μl do górnej studzienki urządzenia i odczekać kilka sekund, aby roztwór utrwalający przepłynął przez kanał, zanim dodasz 100 μl do dolnej studzienki. Powtórz po drugiej stronie. Po inkubacji usunąć roztwór PFA i delikatnie przemyć 3x przez 5 min DPBS. Pozostawić w 200 μl/studzienkę DPBS do przechowywania i uszczelnić 10-centymetrową szalkę Petriego parafilmem i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu eksperymentu ICC.
      UWAGA: Upewnij się, że urządzenia nie wysychają podczas przechowywania.
  2. Inkubować komórki z roztworem przepuszczalnym (100 μl/basenik) 0,1% Triton X-100 w DPBS przez 20 minut w RT w 1. dniu procedury ICC. Usunąć roztwór permeabilizacyjny i dodać 5% normalnej surowicy osła do 0,1% roztworu Triton X-100/DPBS (100 μl/studzienkę) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Usunąć 5% normalny roztwór surowicy osła i inkubować urządzenia z przeciwciałami pierwszorzędowymi (tabela materiałów) w 2% normalnej surowicy osła w 0,1% roztworze Triton X-100/DPBS i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
    1. Zaimplementuj gradient woluminu. Dodać 100 μl/studzienkę roztworu przeciwciała po jednej stronie mikrorowków i 150 μl/basenik po drugiej (łącznie 500 μl na urządzenie).
      UWAGA: Możliwe jest zastosowanie różnych przeciwciał po obu stronach mikrorowków. W takim przypadku nie należy wdrażać gradientu objętości z przeciwciałami pierwszorzędowymi lub drugorzędowymi w poprzek mikrorowków, aby utrzymać izolację płynową między przedziałami. Neuryty w mikrorowkach nie zostaną zabarwione bez gradientu.
  4. Następnego dnia (2 dzień procedury ICC) należy usunąć przeciwciała pierwszorzędowe i ostrożnie umyć urządzenie 3x przez 5 min 0,1% roztworem Triton X-100/DPBS.
    UWAGA: W kulturach łatwo odłączających mycie 3x przez 5 min można zastąpić 1x przez 30 min.
  5. Od teraz pracuj w ciemności, ponieważ przeciwciała drugorzędowe (tabela materiałów) są wrażliwe na światło. Inkubować komórki z przeciwciałami drugorzędowymi w 2% normalnej surowicy osła w 0,1% roztworze Triton X-100/DPBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Zaimplementować gradient objętości, jak podano w kroku 8.3.1. Po inkubacji usunąć przeciwciała drugorzędowe i przemyć 3x przez 5 minut DPBS.
  6. Oznakuj jądrowe DNA za pomocą DAPI w DPBS (100 μl / dołek) przez 20 minut w RT, a następnie 3x-4x po 5 minut płukania 0,1% roztworem Triton X-100 / DPBS. Usuń 0,1% roztwór Triton X-100/DPBS ze wszystkich studzienek i pozostaw kulturę do wyschnięcia na kilka sekund przed dodaniem jednej kropli fluorescencyjnego podłoża montażowego do każdej studzienki w celu uszczelnienia.
    UWAGA: Trzymaj urządzenia poziomo przez co najmniej 24 godziny, aby umożliwić ustawienie nośnika montażowego. Po 24 godzinach urządzenia można przechowywać w etui na prowadnice w temperaturze 4 °C.
  7. Obraz w stosach z odwróconym mikroskopem.
    1. Aby zobrazować NMJ, użyj obiektywu 40x, aby zlokalizować miotube'y oznaczone przeciwciałem myotube (tabela materiałów) i wykonaj zapisy z-stack, aby zapewnić obrazowanie neuronów i tkanek miotuby. Zrób wiele zdjęć na wypadek, gdyby rurka myotube była zbyt duża, aby zmieścić się w jednej klatce.
    2. W celu kwantyfikacji NMJ ręcznie policz liczbę kolokalizacji między neuronalnym markerem presynaptycznym a markerem AChR przez każdy stos z. Znormalizuj liczbę kolokalizacji do liczby myotubes obecnych w stosie z.

9. Mocowanie i przygotowanie urządzenia do SEM

UWAGA: Podczas zmiany płynów, zawsze zachowuj niewielką ilość, aby przykryć kulturę, aby uniknąć zapadania się komórek. Protokół ten wykorzystuje wysoce toksyczne substancje i podczas całego procesu wymagana jest praca z osobistymi środkami ochrony oraz w dygestorium.

  1. Utrwalanie i demontaż: Przygotować świeży 2,5% aldehyd glutarowy (GA) w 0,1 M buforze kakodylanu sodu (pH 7,6), przefiltrować filtrem 0,2 μm i podgrzać do 37 °C.
    UWAGA: GA i kakodylan sodu są toksyczne: należy obchodzić się z wyciągiem z karkołem ochronnym.
    1. Ostrożnie umyj urządzenie raz za pomocą DPBS, aby usunąć nośnik i resztki komórek, a następnie poprzedz roztworem GA przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Za pomocą skalpela ostrożnie przytnij arkusz SEM do obwodu urządzenia, jednocześnie stabilizując urządzenie kleszczami. Uważaj, aby nie odłączać urządzenia podczas cięcia. Przenieś urządzenie i arkusz SEM za pomocą kleszczy na 3-centymetrową szalkę Petriego i umieść 3-centymetrową szalkę w 10-centymetrowym naczyniu, aby ułatwić obsługę.
    3. Po 15 minutach prefiksacji ostrożnie wyjmij urządzenie z arkusza SEM za pomocą kleszczy. Odłącz urządzenie w jednym rogu i powoli wyjmij je w kierunku ukośnym w kierunku przeciwległego rogu. Obserwuj, jak komórki odłączają się od urządzenia.
    4. Dodać dodatkowy roztwór GA, aby pokryć cały arkusz SEM w naczyniu o średnicy 3 cm i kontynuować utrwalanie przez łącznie 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Delikatnie wepchnij arkusz SEM pod roztwór GA za pomocą kleszczyków, unikając powierzchni pokrytych komórkami.
  2. Kontynuuj korzystanie ze standardowego protokołu dla SEM. Krótko mówiąc, inkubować w tetratlenku osmu, a następnie odwodnić za pomocą stopniowanej serii etanolu. Włóż arkusz SEM do uchwytu szkiełka nakrywkowego w celu wyschnięcia w krytycznym punkcie i zamontuj na króćcach wsporczych do naklejek węglowych i powłoki. Za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego wykonać obrazowanie przy napięciu przyspieszającym 5 kV i odległości roboczej 7 mm.

10. Ocena funkcjonalności NMJ za pomocą obrazowania żywych komórek wapnia

  1. Przygotuj urządzenia: Odśwież przedział mięśniówki za pomocą 200 μl / studzienkę pożywki podstawowej neuronu ruchowego dnia 18 za pomocą 30 ng / ml BDNF, GDNF i CNTF oraz przedział neuronu ruchowego za pomocą 200 μl / studzienek podłoża podstawowego neuronu ruchowego bez czynników wzrostu (Tabela 2 i Tabela 3).
    1. Dodać barwnik Fluo-4 AM rozcieńczony w rozpuszczalniku barwnika Fluo-4 do komory mioprobówki o końcowym stężeniu 5 μM i inkubować urządzenie w ciemności w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 25 minut. Podczas gdy urządzenie jest w inkubacji, rozcieńczyć chlorek potasu w pożywce podstawowej neuronu ruchowego bez czynników wzrostu w końcowym stężeniu 450 mM.
      UWAGA: Fluo-4 AM jest wskaźnikiem wapnia, który wykazuje wzrost fluorescencji po związaniu wapnia. Od teraz pracuj w ciemności, ponieważ barwnik jest wrażliwy na światło.
    2. Po 25 minutach odśwież kompartment miotubowy za pomocą 200 μl / studzienek pożywki podstawowej neuronu ruchowego dnia 18 z 30 ng / ml BDNF, GDNF i CNTF oraz przedział neuronu ruchowego z 100 μl / dołek podłoża podstawowego neuronu ruchowego bez czynników wzrostu, aby przywrócić gradient chemotaktyczny i wolumetryczny.
    3. Aby zablokować NMJ, należy uzupełnić pożywkę przedziału miotubowego o 19 μM konkurencyjnego antagonisty AChR, chlorowodorku tubokuraryny pentahydratu.
      UWAGA: Chlorowodorek tubokuraryny pentahydrat jest toksyczny: należy obchodzić w dygestoriach z wyposażeniem ochrony osobistej.
  2. Zapisy należy wykonywać za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w inkubator nastawiony na 37 °C, 5% CO2 .
    1. W przypadku obiektywu 10x użyj kanału jasnego pola, aby zlokalizować rurki myotube w komorze miotuby. Dostosuj moc, wzmocnienie i przesunięcie lasera dla kanału 488 do poziomu, w którym fluorescencja Fluo-4 oznacza poszczególne rurki miotube.
      UWAGA: Reprezentatywne wyniki uzyskano poprzez dostosowanie pasków przewijania w ustawieniach A1 oprogramowania do mocy lasera 5%, wzmocnienia 60 (HV) i przesunięcia 0.
  3. Ustaw czas nagrywania na 1 minutę z interwałami 1 s. Nagrywaj przez 5-10 s, aby uzyskać linię wyjściową, a następnie natychmiast stymuluj neurony ruchowe roztworem chlorku potasu.
    1. Po 5-10 sekundach od nagrania powoli dodaj 25 μl roztworu chlorku potasu do jednego dołka przedziału neuronu ruchowego, aby osiągnąć końcowe stężenie 50 mM.
      UWAGA: Unikaj zbyt szybkiego dodawania roztworu chlorku potasu, ponieważ spowoduje to powstanie fali przez kanał, powodując artefakty na nagraniu.
  4. Nagraj przedział miotubowy ze stymulacją neuronów ruchowych dwukrotnie z 2-minutową przerwą, a następnie bezpośrednią stymulację 25 μl roztworu chlorku potasu przedziału miotuby, aby ocenić bezpośrednią aktywność miotubki niezależnie od depolaryzacji neuronów ruchowych.
  5. W celu oceny ilościowej należy ręcznie zakreślić każdą rurkę myotube za pomocą oprogramowania rejestrującego i przeanalizować intensywność fluorescencji Fluo-4 w okresie 1 minuty. Aby określić wzrost napływu wapnia, należy odjąć średnią wartość wyjściową (tj. średnią z pierwszych 10 s przed stymulacją chlorkiem potasu) od wartości szczytowej po stymulacji chlorkiem potasu. Reprezentatywne wyniki uzyskano za pomocą narzędzia do pomiaru czasu w oprogramowaniu.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Generacja NMJ w urządzeniach mikroprzepływowych
Aby wygenerować ludzką jednostkę motoryczną z funkcjonalnymi NMJ w dostępnych na rynku urządzeniach mikroprzepływowych, wykorzystano ludzkie neurony ruchowe pochodzące z iPSC i ludzkie miorurki pochodzące z MAB. Jakość wyjściowego materiału komórkowego jest ważna, a zwłaszcza zdolność fuzji MAB do miotub ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego wyniku tego protokołu. MAB są łatwe do utrzymania w hodowli. Jednak ważne jest, aby ocenić zdolność do stapiania każdej partii przed zastosowaniem jej w urządzeniach mikroprzepływowych (rysunek uzupełniający 1A,B)18. Nie należy stosować żadnych partii, które nie wykazują tworzenia się miotub po 10 dniach różnicowania. Wskaźnik fuzji na rysunku uzupełniającym 1B określono poprzez obliczenie procentu jąder w miotubach dodatnich dla każdego markera miotubowego całkowitej liczby jąder na obrazie. Stwierdziliśmy, że wskaźnik fuzji wynoszący około 8% był wystarczający dla naszej kokultury w generowaniu NMJ.

Zawsze ważne jest, aby rozpocząć różnicowanie neuronów ruchowych od czystej kultury iPSC. Im czystsze dane wejściowe - tym czystszy wynik. Protokół różnicowania neuronów ruchowych generuje kultury neuronów ruchowych, które są zazwyczaj w 85%-95% dodatnie dla markerów neuronów ruchowych (rysunek uzupełniający 1C,D)18. Pozostałe komórki będą zwykle niezróżnicowanymi komórkami prekursorowymi, które w niektórych przypadkach ulegną nadmiernej proliferacji, a tym samym będą miały negatywny wpływ na jakość hodowli. Aby uzyskać najlepsze wyniki tego protokołu, należy ocenić skuteczność różnicowania neuronów ruchowych przed zastosowaniem w urządzeniu neuronów ruchowych NPC z 10 dnia. Ponadto w dniu 11 można przeprowadzić kontrolę jakości NPC w celu oceny ekspresji markera NPC Olig2 (rysunek uzupełniający 1E,F).

Początkowo, neurony ruchowe-NPC i MABy zostały posiane w tym samym momencie w dniu 10. W tym przypadku różnicowanie MAB zostało zainicjowane w dniu 11. Gradient objętości i czynnika wzrostu zaimplementowany w dniu 14 pozwolił nam ocenić powstawanie NMJ w dniu 21, skracając tym samym protokół o tydzień. Co ciekawe, udało nam się zaobserwować charakterystyczne powstawanie NMJ przez ICC (rysunek uzupełniający 2A). Jednak nie byliśmy w stanie uzyskać funkcjonalnego wyjścia za pomocą zapisów wapnia z żywych komórek na tak wczesnym etapie różnicowania neuronów ruchowych (dane nie pokazane). Doszliśmy do wniosku, że neurony ruchowe nie były jeszcze wystarczająco dojrzałe, aby utworzyć funkcjonalne połączenia NMJ z miotubami, mimo że morfologia NMJ wyglądała obiecująco. Jest to zgodne z naszymi wcześniejszymi obserwacjami, że spontaniczne potencjały czynnościowe w neuronach ruchowych, rejestrowane za pomocą analizy elektrofizjologicznej typu patch-clamp, występują dopiero w 35 dniu różnicowania neuronów ruchowych15.

Ponadto, próbowaliśmy przedłużyć dojrzewanie neuronów ruchowych, jak również trwałość wspólnej hodowli, poprzez dojrzewanie neuronów ruchowych w urządzeniu przez 2 tygodnie (dzień 24), przed posiewem MABs. Niestety, zaobserwowano dużą ilość spontanicznych neuronów ruchowych przechodzących przez mikrorowki, co spowodowało zahamowanie przyczepiania MAB (rysunek uzupełniający 2B). Ze względu na brak tworzenia się miotub w kanale, nie udało nam się zidentyfikować NMJ w 36 dniu i dlatego zastosowaliśmy protokół 28-dniowy (Rysunek 1).

Identyfikacja, kwantyfikacja i charakterystyka morfologiczna NMJ in vitro
Po zastosowaniu 28-dniowego protokołu (Rysunek 1) można uzyskać w pełni funkcjonalne NMJ. Zarówno in vivo, jak i in vitro, NMJ są charakteryzowane immunohisto- lub immunocytochemicznie poprzez kolokalizację markera presynaptycznego i markera postsynaptycznego. W tym badaniu zastosowano kombinację łańcucha ciężkiego neurofilamentu (NEFH) i SYP jako kombinacji markerów presynaptycznych, co pozwoliło na podążanie pojedynczego neurytu z somy neuronu ruchowego w kierunku najbardziej dystalnego procesu. Po stronie mięśni, Btx jest szeroko stosowany jako postsynaptyczny marker AChR i był również stosowany w tym badaniu. Suplementacja agryny i lamininy sprzyja grupowaniu AChR w sarcolemma19,20,21, ułatwiając identyfikację AChR in vitro i podobnie zwiększa liczbę obecnych AChR i NMJ18.

Aby zlokalizować i obliczyć NMJ w bezstronny sposób, każda rurka jest identyfikowana za pomocą dodatniego łańcucha ciężkiego miozyny (MyHC) i obrazowana w stosach z 40-krotnym powiększeniem za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego. W przypadku bardzo długich miotubek pozyskano wiele stosów z. Na potrzeby analizy obrazu liczba kolokalizacji między NEFH/SYP i Btx jest zliczana ręcznie przez każdy stos z, a liczba kolokalizacji jest normalizowana do liczby miotub obecnych w stosie z (Rysunek 2A-C)18. Nie wszystkie miorurki będą miały NMJ, jak widać w kwantyfikacji unerwionych miotub (Rysunek 2D). W związku z tym ważne jest, aby przeprowadzić bezstronne podejście do nagrywania, w którym wszystkie miorurki są obrazowane, niezależnie od obecności Btx.

W tym systemie in vitro można zidentyfikować dwa typy morfologii. NMJ pojawiają się albo jako NMJ z pojedynczym punktem kontaktowym, w którym neuryt dotyka klastra AChR w jednym punkcie interakcji, albo jako NMJ z wieloma punktami kontaktowymi, w których neuryt rozchodzi się i angażuje w klaster AChR na większej powierzchni. Te dwie morfologie można zidentyfikować zarówno immunocytochemicznie (Rysunek 2A)18), jak i za pomocą SEM (Rysunek 2B)18, a także można je również określić ilościowo (Rysunek 2C)18. Ogólnie rzecz biorąc, wiele punktów kontaktowych ułatwia szersze połączenie poprzez duże osadzenie mięśni, co wskazuje na bardziej dojrzałą formację NMJ. Natomiast NMJ z pojedynczym punktem kontaktowym są uważane za mniej dojrzałe ze względu na wczesny stan rozwojowy kultury.

Ocena funkcjonalna NMJ in vitro
Aby ocenić funkcjonalność NMJ, wykorzystano zapisy przejściowe wapnia z żywych komórek (Rysunek 3)18. Wykorzystując płynnie izolowany system urządzeń mikroprzepływowych, strona soma neuronu ruchowego została pobudzona wysokim stężeniem (50 mM) chlorku potasu, jednocześnie rejestrując napływ wapnia w miotubach, które zostały obciążone wrażliwym na wapń barwnikiem Fluo-4 (Figura 3A). Niemal natychmiast po aktywacji neuronu ruchowego mogliśmy zaobserwować napływ wapnia do miotub poprzez charakterystyczne tworzenie fali, co potwierdza funkcjonalne połączenie poprzez neuron ruchowy-neuryt i miotubę (Rysunek 3A-C)18. Nie zaobserwowano spontanicznych fal wapniowych ani spontanicznych skurczów miotuby, chociaż obserwowano skurcze miotubki po bezpośredniej stymulacji chlorkiem potasu. Specyficzność połączenia została dodatkowo potwierdzona przez dodanie kompetycyjnego antagonisty AChR, pięciowodnego chlorowodorku tubokuraryny (DTC) do przedziału miotubowego (Figura 3A), co spowodowało zahamowanie napływu wapnia ( Figura 3C). Efekt ten potwierdził, że połączenie między neuronami ruchowymi a rurkami mięśniowymi skutkuje w pełni funkcjonalnymi NMJ. Aby ocenić liczbę aktywnych miotub poprzez stymulację NMJ, przedział miotubowy stymulowano bezpośrednio chlorkiem potasu w celu zidentyfikowania całkowitej liczby aktywnych miotub w tym przedziale. Około 70% miotubek było aktywnych poprzez aktywację stymulowaną neuronami ruchowymi za pomocą chlorku potasu (Rysunek 3D)18.

Te wyniki potwierdzają optymalne powstawanie, liczbę, morfologię i funkcjonalność NMJ poprzez kokulturację neuronów ruchowych pochodzących z iPSC i miotub pochodzących z MAB podczas 28-dniowego protokołu.

figure-results-1
Rysunek 2: Powstawanie NMJ w urządzeniach mikroprzepływowych. (A) Konfokalne mikrofotografie powstawania NMJ w wstępnie zmontowanych urządzeniach mikroprzepływowych w dniu 28. NMJ są identyfikowane poprzez kolokalizację (groty strzałek) markerów presynaptycznych (NEFH i SYP) i postsynaptycznego markera AChR (Btx) na miotubkach barwionych MyHC. NMJ są identyfikowane morfologicznie poprzez tworzenie jednego lub wielu punktów kontaktowych między neurytami a klastrami AChR. Jądra znakowania DAPI. Podziałka liniowa, 25 μm. Wstawka przedstawia powiększenie NMJ. Wstawka podziałki, 10 μm. (B) SEM morfologii NMJ w silikonowych urządzeniach mikroprzepływowych w 28 dniu. Groty strzał przedstawiają osadzenie neurytu w miotubie. Podziałka, 2 μm. Wstawka pokazuje powiększenie NMJ. Wstawka skali paska, 1 μm. (C) Kwantyfikacja całkowitej liczby NMJ na mioprobówkę, jak również liczby pojedynczych i wielokrotnych NMJ punktów kontaktowych na mioprobówkę. Wykres przedstawiono jako średnią ± błąd standardowy średniej z czterech kontrprób biologicznych. Istotność statystyczną określa się za pomocą testu Manna-Whitneya o < 0,05. (D) Kwantyfikacja procentowej zawartości unerwionych miotub. Wykres przedstawiono jako średnią ± błąd standardowy średniej z czterech kontrprób biologicznych. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie Stoklund Dittlau, K. et al.18. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 3: Potwierdzenie funkcjonalności NMJ. (A) Schematyczna ilustracja przejściowych zapisów wapnia w żywych komórkach funkcji NMJ we wstępnie zmontowanych urządzeniach mikroprzepływowych w dniu 28 przed i po zablokowaniu NMJ za pomocą tubokuraryny (DTC)22. Neurony ruchowe w jasnozielonym przedziale są stymulowane przez 50 mM chlorku potasu (KCl), który powoduje wewnątrzkomórkową odpowiedź neuronu ruchowego przez neuryty. Wywołuje to napływ wapnia (Ca2+) do miotub, które są znakowane wrażliwym na wapń barwnikiem Fluo-4 (ciemnozielony przedział). (B) Mikrofotografie fluorescencyjne Fluo-4 przedstawiające wstępną stymulację, szczyt intensywności i post-stymulację rurki mięśniowej, przedstawiające falę wewnątrzkomórkowego wzrostu wapnia po stymulacji neuronów ruchowych za pomocą KCl. Wstawka pokazuje powiększenie unerwionej aktywnej rurki mięśniowej. Podziałka liniowa, 100 μm. Skala wstawkowa, 200 μm. (C) Reprezentatywne krzywe napływu wapnia w miotubach po stymulacji neuronów ruchowych KCl (strzałka) potwierdzające funkcjonalność NMJ. Myotube 1-3 pokazuje charakterystyczne krzywe wapniowe poprzez unerwienie neuronu ruchowego - rurki mięśniowej, podczas gdy myotube A-C DTC przedstawia krzywe po zablokowaniu NMJ za pomocą DTC. (D) Stosunek aktywnych miotub stymulowanych neuronami ruchowymi do całkowitej liczby aktywnych miotub. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie Stoklund Dittlau, K. et al.18. Ilustracje komórek zostały zmodyfikowane na podstawie Smart Server medical Art22. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Weryfikacja neuronów ruchowych, indeks fuzji MAB i kontrola jakości NPC. (A) Obrazy konfokalne miotubek pochodzących z MAB 10 dni po rozpoczęciu różnicowania. Rurki Myotube są znakowane markerami miotubowymi: desminą, MyHC, miogeniną (MyoG) i tytyną. Jądra są barwione DAPI. Podziałka skali, 100 μm. (B) Kwantyfikacja wskaźnika fuzji MAB 10 dni po rozpoczęciu różnicowania. Po zagłodzeniu MAB łączą się w wielojądrowe miotuby, które określono ilościowo pod kątem dodatniego markera miotubowego (AB +). Wykres przedstawia średnią ± błąd standardowy średniej z trzech kontrprób biologicznych. (C) Konfokalne obrazy neuronów ruchowych pochodzących z iPSC w 28 dniu różnicowania, które są znakowane markerami neuronów ruchowych NEFH, acetylotransferazą choliny (ChAT) i wyspą trzustkową-1 oprócz markera panneuronalnego βIII-tubuliny (tubulina). Jądra są barwione DAPI. Paski skali, 75 μm. (D) Kwantyfikacja liczby komórek, które są dodatnie dla neuronów ruchowych i markerów panneuronalnych (AB+). Wykres przedstawia średnią ± błąd standardowy średniej z trzech kontrprób biologicznych. (E) Konfokalne obrazy NPC pochodzących z iPSC w 11 dniu różnicowania neuronów ruchowych, które są znakowane markerem NPC Olig2 i markerem panneuronalnym βIII-tubuliną (tubulina). Jądra są barwione DAPI. Podziałka skali, 50 μm. (F) Kwantyfikacja liczby NPC, które są dodatnie dla Olig2 i βIII-tubuliny (AB+). Wykres przedstawia średnią ± błąd standardowy średniej z trzech kontrprób biologicznych. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie Stoklund Dittlau, K. et al.18. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Optymalizacja protokołu wspólnej hodowli (A) Konfokalne obrazy powstawania NMJ w 21 dniu różnicowania neuronów ruchowych, gdy MAB są wysiewane w tym samym punkcie czasowym co NPC w 10 dniu. NMJ są identyfikowane poprzez kolokalizację (groty strzałek) markerów presynaptycznych (NEFH i SYP) i postsynaptycznego markera AChR (Btx) na miotubkach barwionych MyHC. Podziałka liniowa (po lewej), 10 μm. Podziałka skali (po prawej), 5 μm. (B) Obraz kanału miotubowego w jasnym polu w 24 dniu przedstawiający spontaniczne skrzyżowanie neuronów ruchowych z neurytami, hamujące przyczepianie się MAB. Podziałka liniowa, 100 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

T . . . .
OdczynnikKoncentracja zapasówKońcowe stężenie
IMDM (Międzynarodowa Organizacja Zarządzania1x80%
Surowica bydlęca płodu15%
Penicylina/Streptomycyna5000 U/ml0,5 %
L-glutamina50-krotnie1 proc
Pirogronian sodu100 mM1 proc
Aminokwasy endogenne100x1 proc
Insulina transferyna selen100x1 proc
bFGF (dodano świeże)50 μg/ml5 ng/ml

Tabela 1: Podłoże wzrostu MAB. Pożywka wystarcza na 2 tygodnie w temperaturze 4 °C. bFGF dodaje się świeży w dniu użycia.

. . .
OdczynnikKoncentracja zapasówKońcowe stężenie
DMEM/F1250%
Podłoże nerwowo-podstawowe50%
Penicylina/Streptomycyna5000 U/ml1 proc
L-glutamina50-krotnie.5 %
Suplement N-2100x1 proc
B-27 bez witaminy A50-krotnie2 proc
β-merkaptoetanol50 mM0,1 %
kwas askorbinowy200 μM0,5 μM

Tabela 2: Podłoże neuronu ruchowego. Pożywka może wytrzymać 4 tygodnie w temperaturze 4 °C.

angielski) angielski) angielski) )
dzieńOdczynnikKoncentracja zapasówKońcowe stężenieprzedział
Dzień 10/11Wygładzony agonista10 mM500 nMOba
Kwas retinowy1 mM0,1 μM
DAPT (Język100 mM10 μM
BDNF powiedział:0,1 mg/ml10 ng/ml
Certyfikat GDNF0,1 mg/ml10 ng/ml
Dzień 14DAPT (Język100 mM20 μMOba
BDNF powiedział:0,1 mg/ml10 ng/ml
Certyfikat GDNF0,1 mg/ml10 ng/ml
Dzień 16DAPT (Język100 mM20 μMOba
BDNF powiedział:0,1 mg/ml10 ng/ml
Certyfikat GDNF0,1 mg/ml10 ng/ml
Kanał CNTF0,1 mg/ml10 ng/ml
Dzień 18BDNF powiedział:0,1 mg/ml10 ng/mlNeuron ruchowy
Certyfikat GDNF0,1 mg/ml10 ng/ml
Kanał CNTF0,1 mg/ml10 ng/ml
Dzień 21+BDNF powiedział:0,1 mg/ml30 ng/mlMyotube
Certyfikat GDNF0,1 mg/ml30 ng/ml
Kanał CNTF0,1 mg/ml30 ng/ml
Agrin (Gryzm50 μg/ml0,01 μg/ml
Laminina1 mg/ml20 μg/ml
Dzień 21+Bez dodatkówNeuron ruchowy

Tabela 3: Suplementy na pożywkę neuronu ruchowego. Suplementy dodaje się świeże w dniu użycia do podłoża podstawowego neuronu ruchowego.

. . )
dzieńOdczynnikKoncentracja zapasówKońcowe stężenieprzedział
Dzień 18DMEM/F1297%MAB
Pirogronian sodu100 mM1 proc
Surowica konia2 proc
Agrin (Gryzm50 μg/ml0,01 μg/ml

Tabela 4: Medium różnicujące MAB. Podłoże może wytrzymać 2 tygodnie w temperaturze 4 °C. Agrin dodaje się świeży w dniu użycia.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisuje stosunkowo łatwą w użyciu metodę, która generuje ludzkie jednostki motoryczne z funkcjonalnymi NMJ w dostępnych na rynku urządzeniach mikroprzepływowych w czasie krótszym niż 30 dni. Opisano, w jaki sposób NMJ mogą być oceniane morfologicznie za pomocą standardowych technik, takich jak ICC i SEM, oraz funkcjonalnie za pomocą zapisów wapnia z żywych komórek.

Dużą zaletą tego protokołu jest zastosowanie technologii komórek macierzystych. Pozwala to na pełną zdolność adaptacji, w której NMJ mogą być oceniane zarówno pod względem zdrowia, jak i choroby, niezależnie od profilu dawcy. Model okazał się już skuteczny i korzystny w badaniach nad ALS, gdzie zidentyfikowaliśmy upośledzenia w przeroscie, odrastaniu i liczbie neurytów jako nowe fenotypy spowodowane mutacjami w genie FUS 18. Dzięki temu modelowi możliwe jest rozszerzenie badań o sporadyczne postacie ALS, których etiologia jest nieznana, poprzez wykorzystanie iPSC od sporadycznych pacjentów z ALS. Daje to przewagę nad tradycyjnymi modelami zwierzęcymi, które opierają się na transgenicznej nadekspresji zmutowanych genów w celu podsumowania choroby człowieka23,24. Ponadto, nasz w pełni ludzki system pozwala na potencjalną rekapitulację specyficznej dla człowieka fizjologii i choroby. Poprzednie badania wykazały różnice między morfologią NMJ gryzoni i ludzi25, co sugeruje, że należy zachować ostrożność podczas stosowania gryzoni w celu rozwiązania patologii NMJ u ludzi. Chociaż system ten jest stosunkowo prostą konfiguracją in vitro, której brakuje złożoności modelu in vivo, udało się wykazać, że morfologia NMJ wyświetlana w urządzeniach mikroprzepływowych przypominała NMJ u ludzi po amputacji25. Co więcej, model ten pozwala na ocenę NMJ podczas powstawania i dojrzewania NMJ, potencjalnie ujawniając wczesne fenotypy choroby, które są nieobecne, niezidentyfikowane lub przeoczone w ludzkich próbkach pośmiertnych.

MAB zapewniają ważną opcję generowania miotubek, chociaż ich ograniczona przeżywalność wynosząca 10 dni jest wadą systemu. Przetrwanie miotubki zależy od ich przyczepienia się do powierzchni, która jest prawdopodobnie zagrożona przez spontaniczne skurcze włókien mięśniowych. Po ponad 10 dniach większość miotubek odłączy się, co sprawi, że kultura NMJ stanie się bezużyteczna. Idealnie byłoby, gdyby miorurki były również generowane z iPSC. Jednak obecne protokoły okazały się trudne do odtworzenia26 ze względu na zmienność indeksu fuzji 27,28,29,30.

Dzięki zastosowaniu dostępnych na rynku urządzeń mikroprzepływowych wygenerowaliśmy ustandaryzowany system, który jest w pełni dostępny. Istnieją inne modele NMJ 31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42. Jednak zazwyczaj opierają się one na pojedynczych komorach, które nie mają podziału na przedziały i izolacji płynnej między typami komórek, lub na niestandardowych naczyniach hodowlanych, co obniża dostępność, a potencjalnie także odtwarzalność. Urządzenia mikroprzepływowe wykorzystywane w tym protokole można zakupić z mikrorowkami o różnych długościach, co pozwala na dalsze analizy, takie jak transport aksonalny43,44 lub badania aksotomii 18,45,46. Płynowa izolacja między przedziałami dodatkowo umożliwia dzielenie na przedziały leczenia farmakologicznego neuronów ruchowych lub mięśniówek, co może być korzystne w rozwoju terapii. Pojawiło się więcej firm specjalizujących się w mikrofluidyce, co otworzyło się na duży wybór konstrukcji i funkcji urządzeń, co jeszcze bardziej promuje dostępność badań in vitro.

Podsumowując, opracowaliśmy protokół zapewniający niezawodną, wszechstronną i łatwą metodę hodowli ludzkich jednostek motorycznych za pomocą funkcjonalnych NMJ.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L.V.D.B. posiada patent na stosowanie inhibitorów HDAC w chorobie Charcota-Marie-Tootha (US-2013227717-A1), jest naukowym współzałożycielem Augustine Therapeutics i członkiem jej naukowej rady doradczej. Pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Nikky Corthout i Sebastianowi Munckowi z LiMoNe, Research Group Molecular Neurobiology (VIB-KU Leuven) za ich porady dotyczące zapisów fluorescencji przejściowej wapnia w żywych komórkach. Badania były wspierane przez Komisję Fulbrighta w Belgii i Luksemburgu, KU Leuven (C1 i Fundusz "Opening the Future"), VIB, Agencję ds. Innowacji Nauki i Technologii (IWT; SBO-iPSCAF), "Fundusz Badań Naukowych Flandrii" (FWO-Vlaanderen), Target ALS, ALS Liga België (Lekarstwo na ALS), rząd belgijski (Międzyuniwersytecki Program Przyciągania Biegunów P7/16 zainicjowany przez belgijski Federalny Urząd Polityki Naukowej), Fundacja Thierry'ego Latrana oraz "Association Belge contre les Maladies neuro-Musculaires" (ABMM). T.V. i J.B. są wspierani przez stypendia doktoranckie przyznawane przez FWO-Vlaanderen.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
α-bungarotoxin (Btx) Alexa fluor 555Thermo Fisher ScientificB35451Przeciwciało (1:1000)
Kwas octowyCHEM-Lab NVCL00.0116.1000Składnik powlekający. H226, H314. Arkusz P280
Aclar 33C (arkusz SEM)Nauki o mikroskopii elektronowej50425-25Grubość: 7,8 mil
Agrin (rekombinowane białko ludzkie)R& D systems6624-AG-050Suplement medialny
Alexa fluor IgG (H+L) 488 osioł-anty królikThermo Fisher ScientificPrzeciwciało A21206(1:1000)
Alexa fluor IgG (H+L) 555 osioł-kozaThermo Fisher ScientificA21432Przeciwciało (1:1000)
Alexa fluor IgG (H+L) 555 osioł-anty myszThermo Fisher ScientificA31570Przeciwciało (1:1000)
Alexa fluor IgG (H+L) 647 osioł-anty myszThermo Fisher ScientificA31571Przeciwciało (1:1000)
Kwas askorbinowySigmaA4403Składnik podłoża
i beta; III-tubulina (Tubulina)Abcamab7751Przeciwciało (1:500)
β-merkaptoetanolSkładnik Thermo Fisher Scientific31350010Media. H317. P280.
B-27 bez witaminy AThermo Fisher Scientific12587-010Składnik pożywki
BDNF (czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego)Peprotech450-02BCzynnik wzrostu
bFGF (rekombinowany ludzki podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów)Peprotech100-18BCzynnik wzrostu
Acetylotransferaza choliny (ChAT)Przeciwciało Milliporeab144P(1:500)
Kolagen ze skóry cielęcejThermo Fisher Scientific17104019Składnik powlekający
CNTF (rzęskowy czynnik neurotroficzny)Peprotech450-13BCzynnik wzrostu
DAPI Nucblue Live Cell Stain ReadyProbesodczynnik Thermo Fisher ScientificR37605Składnik immunocytochemiczny
DAPTTocris Bioscience2634Suplement medialny
Przeciwciało DesminAbcam Ab15200(1:200)
DMEM/F12Thermo Fisher Scientific11330032Składnik podłoża
DMSOSigmaD2650-100MLSkładnik kriokonserwacji. H315, H319, H335. P280.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) firmy DulbeccoThermoFisher Scientific14190250bez wapnia, bez magnezu
EtanolVWR20.821.296Sterylizacja. H225. P280
Płodowa surowica bydlęcaThermo Fisher Scientific10270106Składnik podłoża
Fluo-4 AM barwnik z żywych komórekThermo Fisher ScientificF14201Barwnik do obrazowania wapnia
Fluorescencyjne podłoże montażoweDakoS3023Składnik immunocytochemiczny
GDNF (czynnik neurotroficzny pochodzący z linii komórek glejowych)Peprotech450-10BCzynnik wzrostu
Aldehyd glutarowyAgar ScientificR1020Składnik utrwalający. EUH071, H301, H314, H317, H330, H334, H410. P280.
Surowica dla koniThermo Fisher Scientific16050122Składnik podłoża
Ludzka fosfataza alkalicznaR& Systemy DMAB1448Oprogramowanie
obrazowaniaIH IKG
IMDMTHERMO FISHER Scientific12440053Składnik podłoża
Insulina transferyna selenThermo Fisher Scientific41400045Składnik podłoża
Przeciwciało Islet-1Milliporeab4326(1:400)
Wymiana surowicy nokautującejThermo Fisher Scientific10828-028Składnik do kriokonserwacji
Laminin z błony podstawnej mięsaka mysiego Engelbreth-Holm-SwarmSigmaL2020-1MGSkładnik powłoki i suplement podłoża
Mikroskop konfokalny Leica SP8 DMI8Mikroskopia konfokalnaLeica
L-glutaminaThermo Fisher Scientific25030-024Składnik medialny
Myogenin (MyoG)AbcamAb124800Przeciwciało (1:500)
ciężki miozyny (MyHC)Własne, przeciwciało SCIL(1:20)
Suplement N-2Thermo Fisher Scientific17502-048Składnik podłoża
Podłoże neuropodstawoweThermo Fisher Scientific21103049Powłoka i składnik podłoża
Ciężki łańcuch neurofilamentu (NEFH)AbcamPrzeciwciało AB8135(1:1000)
Mikroskop konfokalny Nikon A1RNikonMikroskopia obrazowania wapnia z żywych komórek
Oprogramowanie NIS-Elements AR 4.30.02NikonAnaliza obrazowania wapnia z żywych komórek
Aminokwasy endogenneThermo Fisher Scientific11140050Składnik podłoża
Normalna surowica osłaSigmaD9663-10MLSkładnik immunocytochemiczny
Olig2IBL18953Przeciwciało (1:1000)
Parafilm MSigmaP7793-1EASprzęt do przechowywania
ParaformaldehydThermo Fisher Scientific28908Składnik utrwalający. H302, H312, H315, H317, H319, H332, H335, H341, H350. P280.
Penicylina/Streptomycyna (5000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15070063Składnik podłoża
szalka Petriego (3 cm)nunc153066Średnica: 3 cm
szalka Petriego (10 cm)Sarstedt833.902Średnica: 10 cm
Płytka (6-dołkowa)Cellstar Greiner bio-one657160Płytka hodowlana
Pluronic F-127Thermo Fisher ScientificP3000MPRozpuszczalnik barwnikowy Fluo-4
Poli-L-ornityna (PLO)SigmaP3655-100MGSkładnik powlekający
Chlorek potasuCHEM-Lab NVCL00.1133.1000Odczynnik do obrazowania wapnia
Kwas retinowySigmaR2625Suplement mediów. H302, H315, H360FD, H410. P280.
RevitaCell suplementThermo Fisher ScientificA2644501roztwór inhibitora ROCK
Wygładzony agonistaMerch Millipore566660Suplement medialny
Bufor kakodylanu soduSigmaC0250Składnik utrwalający. H301, H331, H350, H410. P280.
Pirogronian soduLife Technologies11360-070Składnik pożywki
Synaptofizyna (SYP)Sygnalizacja komórkowaPrzeciwciało 5461S(1:1000)
Kolba T75Płytka hodowlanaSigmaCLS3276
tytynyPrzeciwciało Hybridoma Bank9D10(1:300)
Triton X-100SigmaT8787-250MLSkładnik immunocytochemiczny. H302, H315, H318, H319, H410, H411. P280
TrypLE expressThermo Fisher Scientific12605010roztwór dysocjacyjny MAB
Chlorowodorek tubocyryryny pentahydratSigmaT2379-100GBloker receptora acetylocholiny. H301. P280.
Wstępnie zmontowane urządzenie mikroprzepływowe XonaChipsXona MicrofluidicsXC150Długość mikrorowka: 150 μ m
Xona Silikonowe urządzenie mikrofluidyczneXona MicrofluidicsSND75Długość mikrorowka: 75 μ mln
do przeciwciał Analiza ICCŁańcuch : Badaniarozwojowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Myasthenia Gravis and Related Disorders. Kaminski, H. J., Kusner, L. L. , Springer International Publishing. 1-12 (2018).">Plomp, J. J. Neuromuscular junction physiology and pathophysiology. Myasthenia Gravis and Related Disorders. Kaminski, H. J., Kusner, L. L. , Springer International Publishing. 1-12 (2018).
  2. The 'dying-back' phenomenon of motor neurons in ALS. Journal of Molecular Neuroscience. 43 (3), 470-477 (2010).">Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The 'dying-back' phenomenon of motor neurons in ALS. Journal of Molecular Neuroscience. 43 (3), 470-477 (2010).
  3. Neuromuscular synaptic vulnerability in motor neuron disease: Amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy. Neuropathology and Applied Neurobiology. 36 (2), 133-156 (2010).">Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Neuromuscular synaptic vulnerability in motor neuron disease: Amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy. Neuropathology and Applied Neurobiology. 36 (2), 133-156 (2010).
  4. Amyotrophic lateral sclerosis. The New England Journal of Medicine. 344 (22), 1688-1700 (2001).">Rowland, L. P., Shneider, N. A. Amyotrophic lateral sclerosis. The New England Journal of Medicine. 344 (22), 1688-1700 (2001).
  5. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: Evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185 (2), 232-240 (2004).">Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: Evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185 (2), 232-240 (2004).
  6. Dynamic neuromuscular remodeling precedes motor-unit loss in a mouse model of ALS. eLife. 7, 41973(2018).">Martineau, É, Di Polo, A., Van de Velde, C., Robitaille, R. Dynamic neuromuscular remodeling precedes motor-unit loss in a mouse model of ALS. eLife. 7, 41973(2018).
  7. The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy. Disease Models and Mechanisms. 4 (4), 457-467 (2011).">Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy. Disease Models and Mechanisms. 4 (4), 457-467 (2011).
  8. Diffusion tensor imaging reveals regional differences in the cervical spinal cord in amyotrophic lateral sclerosis. NeuroImage. 53 (2), 576-583 (2010).">Nair, G., et al. Diffusion tensor imaging reveals regional differences in the cervical spinal cord in amyotrophic lateral sclerosis. NeuroImage. 53 (2), 576-583 (2010).
  9. Mitochondrial abnormalities and disruption of the neuromuscular junction precede the clinical phenotype and motor neuron loss in hFUSWT transgenic mice. Human Molecular Genetics. 27 (3), 463-474 (2018).">So, E., et al. Mitochondrial abnormalities and disruption of the neuromuscular junction precede the clinical phenotype and motor neuron loss in hFUSWT transgenic mice. Human Molecular Genetics. 27 (3), 463-474 (2018).
  10. Length-dependent axo-terminal degeneration at the neuromuscular synapses of type II muscle in SOD1 mice. Neuroscience. 312, 179-189 (2016).">Tallon, C., Russell, K. A., Sakhalkar, S., Andrapallayal, N., Farah, M. H. Length-dependent axo-terminal degeneration at the neuromuscular synapses of type II muscle in SOD1 mice. Neuroscience. 312, 179-189 (2016).
  11. Functional recovery in new mouse models of ALS/FTLD after clearance of pathological cytoplasmic TDP-43. Acta Neuropathologica. 130 (5), 643-660 (2015).">Walker, A. K., et al. Functional recovery in new mouse models of ALS/FTLD after clearance of pathological cytoplasmic TDP-43. Acta Neuropathologica. 130 (5), 643-660 (2015).
  12. Local control of neurite development by nerve growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4516-4519 (1977).">Campenot, R. B. Local control of neurite development by nerve growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4516-4519 (1977).
  13. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).">Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
  14. Microfluidic multicompartment device for neuroscience research. Langmuir. 19 (5), 1551-1556 (2003).">Taylor, A. M., et al. Microfluidic multicompartment device for neuroscience research. Langmuir. 19 (5), 1551-1556 (2003).
  15. HDAC6 inhibition reverses axonal transport defects in motor neurons derived from FUS-ALS patients. Nature Communications. 8 (1), 861(2017).">Guo, W., et al. HDAC6 inhibition reverses axonal transport defects in motor neurons derived from FUS-ALS patients. Nature Communications. 8 (1), 861(2017).
  16. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature Biotechnology. 33 (1), 89-96 (2014).">Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature Biotechnology. 33 (1), 89-96 (2014).
  17. Pericytes: Methods and Protocols. Péault, B. M. , Springer, US. 155-167 (2021).">Giacomazzi, G., et al. Isolation of mesoangioblasts: A subset of pericytes with myogenic potential. Pericytes: Methods and Protocols. Péault, B. M. , Springer, US. 155-167 (2021).
  18. Human motor units in microfluidic devices are impaired by FUS mutations and improved by HDAC6 inhibition. Stem Cell Reports. , (2021).">Stoklund Dittlau, K., et al. Human motor units in microfluidic devices are impaired by FUS mutations and improved by HDAC6 inhibition. Stem Cell Reports. , (2021).
  19. A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction. eLife. 8, 44530(2019).">Afshar Bakooshli, M., et al. A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction. eLife. 8, 44530(2019).
  20. Laminin and alpha 7 beta 1 integrin regulate agrin-induced clustering of acetylcholine receptors. Journal of Cell Science. 113 (16), 2877-2886 (2000).">Burkin, D. J., Kim, J. E., Gu, M., Kaufman, S. J. Laminin and alpha 7 beta 1 integrin regulate agrin-induced clustering of acetylcholine receptors. Journal of Cell Science. 113 (16), 2877-2886 (2000).
  21. Combination of agrin and laminin increase acetylcholine receptor clustering and enhance functional neuromuscular junction formation In vitro. Developmental Neurobiology. 76 (5), 551-565 (2016).">Zhang, B. G. X., et al. Combination of agrin and laminin increase acetylcholine receptor clustering and enhance functional neuromuscular junction formation In vitro. Developmental Neurobiology. 76 (5), 551-565 (2016).
  22. https://smart.servier.com/ (2021).">Smart Servier Medical Art. , Available from: https://smart.servier.com/ (2021).
  23. Animal models of amyotrophic lateral sclerosis: A comparison of model validity. Neural Regeneration Research. 13 (12), 2050-2054 (2018).">Morrice, J. R., Gregory-Evans, C. Y., Shaw, C. A. Animal models of amyotrophic lateral sclerosis: A comparison of model validity. Neural Regeneration Research. 13 (12), 2050-2054 (2018).
  24. Questions regarding the predictive value of one evolved complex adaptive system for a second: Exemplified by the SOD1 mouse. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 113 (2), 231-253 (2013).">Greek, R., Hansen, L. A. Questions regarding the predictive value of one evolved complex adaptive system for a second: Exemplified by the SOD1 mouse. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 113 (2), 231-253 (2013).
  25. Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).">Jones, R. A., et al. Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
  26. Current progress and challenges for skeletal muscle differentiation from human pluripotent stem cells using transgene-free approaches. Stem Cells International. , 6241681(2018).">Jiwlawat, N., Lynch, E., Jeffrey, J., Van Dyke, J. M., Suzuki, M. Current progress and challenges for skeletal muscle differentiation from human pluripotent stem cells using transgene-free approaches. Stem Cells International. , 6241681(2018).
  27. Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).">Chal, J., et al. Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).
  28. Large-scale expansion of human iPSC-derived skeletal muscle cells for disease modeling and cell-based therapeutic strategies. Stem Cell Reports. 10 (6), 1975-1990 (2018).">vander Wal, E., et al. Large-scale expansion of human iPSC-derived skeletal muscle cells for disease modeling and cell-based therapeutic strategies. Stem Cell Reports. 10 (6), 1975-1990 (2018).
  29. Concordant but varied phenotypes among duchenne muscular dystrophy patient-specific myoblasts derived using a human iPSC-based model. Cell Reports. 15 (10), 2301-2312 (2016).">Choi, I. Y., et al. Concordant but varied phenotypes among duchenne muscular dystrophy patient-specific myoblasts derived using a human iPSC-based model. Cell Reports. 15 (10), 2301-2312 (2016).
  30. Inhibition of the combinatorial signaling of transforming growth factor-beta and NOTCH promotes myotube formation progenitor cells. Cells. 10 (7), 1649(2021).">Choi, I. Y., Lim, H. T., Che, Y. H., Lee, G., Kim, Y. J. Inhibition of the combinatorial signaling of transforming growth factor-beta and NOTCH promotes myotube formation progenitor cells. Cells. 10 (7), 1649(2021).
  31. Formation and characterisation of neuromuscular junctions between hiPSC derived motoneurons and myotubes. Stem Cell Research. 15 (2), 328-336 (2015).">Demestre, M., et al. Formation and characterisation of neuromuscular junctions between hiPSC derived motoneurons and myotubes. Stem Cell Research. 15 (2), 328-336 (2015).
  32. Neuromuscular junction formation between human stem cell-derived motoneurons and human skeletal muscle in a defined system. Biomaterials. 32 (36), 9602-9611 (2011).">Guo, X., Gonzalez, M., Stancescu, M., Vandenburgh, H. H., Hickman, J. J. Neuromuscular junction formation between human stem cell-derived motoneurons and human skeletal muscle in a defined system. Biomaterials. 32 (36), 9602-9611 (2011).
  33. A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128 (6), 1241-1252 (2015).">Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128 (6), 1241-1252 (2015).
  34. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).">Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
  35. IPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), 124299(2019).">Lin, C. Y., et al. IPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), 124299(2019).
  36. Generation of functional neuromuscular junctions from human pluripotent stem cell lines. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 473(2015).">Puttonen, K. A., et al. Generation of functional neuromuscular junctions from human pluripotent stem cell lines. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 473(2015).
  37. Functional neuromuscular junctions formed by embryonic stem cell-derived motor neurons. PLoS ONE. 7, 36049(2012).">Umbach, J. A., Adams, K. L., Gundersen, C. B., Novitch, B. G. Functional neuromuscular junctions formed by embryonic stem cell-derived motor neurons. PLoS ONE. 7, 36049(2012).
  38. A customizable microfluidic platform for medium-throughput modeling of neuromuscular circuits. Biomaterials. 225, 119537(2019).">Bellmann, J., et al. A customizable microfluidic platform for medium-throughput modeling of neuromuscular circuits. Biomaterials. 225, 119537(2019).
  39. Neurturin is a PGC-1α1-controlled myokine that promotes motor neuron recruitment and neuromuscular junction formation. Molecular Metabolism. 7, 12-22 (2018).">Mills, R., et al. Neurturin is a PGC-1α1-controlled myokine that promotes motor neuron recruitment and neuromuscular junction formation. Molecular Metabolism. 7, 12-22 (2018).
  40. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. 4 (10), (2018).">Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. 4 (10), (2018).
  41. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose-response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).">Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose-response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
  42. Microfluidic primary culture model of the lower motor neuron-neuromuscular junction circuit. Journal of Neuroscience Methods. 218 (2), 164-169 (2013).">Southam, K. A., King, A. E., Blizzard, C. A., McCormack, G. H., Dickson, T. C. Microfluidic primary culture model of the lower motor neuron-neuromuscular junction circuit. Journal of Neuroscience Methods. 218 (2), 164-169 (2013).
  43. Impaired DNA damage response signaling by FUS-NLS mutations leads to neurodegeneration and FUS aggregate formation. Nature Communications. 9 (1), 335(2018).">Naumann, M., et al. Impaired DNA damage response signaling by FUS-NLS mutations leads to neurodegeneration and FUS aggregate formation. Nature Communications. 9 (1), 335(2018).
  44. Axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system. Journal of Visualized Experiments. (159), e60993(2020).">Altman, T., Maimon, R., Ionescu, A., Pery, T. G., Perlson, E. Axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system. Journal of Visualized Experiments. (159), e60993(2020).
  45. Axon-seq decodes the motor axon transcriptome and its modulation in response to ALS. Stem Cell Reports. 11 (6), 1565-1578 (2018).">Nijssen, J., Aguila, J., Hoogstraaten, R., Kee, N., Hedlund, E. Axon-seq decodes the motor axon transcriptome and its modulation in response to ALS. Stem Cell Reports. 11 (6), 1565-1578 (2018).
  46. Premature polyadenylation-mediated loss of stathmin-2 is a hallmark of TDP-43-dependent neurodegeneration. Nature Neuroscience. 22 (2), 180-190 (2019).">Melamed, Z., et al. Premature polyadenylation-mediated loss of stathmin-2 is a hallmark of TDP-43-dependent neurodegeneration. Nature Neuroscience. 22 (2), 180-190 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Choroby neuron w ruchowychtechnologia kom rek macierzystychludzkie miotubyr nicowanie neuron w ruchowychobrazowanie wapniamarker synaptofizynyreceptor acetylocholiny

Powiązane artykuły