Artykuł metodologiczny

Generacja jednostek motorycznych człowieka z funkcjonalnymi połączeniami nerwowo-mięśniowymi w urządzeniach mikroprzepływowych

7.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62959

⸱

7 września 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosciences, Experimental Neurology, and Leuven Brain Institute, KU Leuven - University of Leuven, 2VIB Bio Imaging Core, KU Leuven - University of Leuven, 3Department of Development and Regeneration, Stem Cell and Developmental Biology, KU Leuven - University of Leuven, 4Department of Neurology, University Hospitals Leuven

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy metodę generowania ludzkich jednostek motorycznych w komercyjnie dostępnych urządzeniach mikroprzepływowych poprzez kokulturację ludzkich indukowanych pluripotencjalnych neuronów ruchowych pochodzących z komórek macierzystych z ludzkimi pierwotnymi miotubami pochodzącymi z mezoangioblastów, co prowadzi do powstania funkcjonalnie aktywnych połączeń nerwowo-mięśniowych.

Streszczenie

Połączenia nerwowo-mięśniowe (NMJ) to wyspecjalizowane synapsy między aksonem dolnego neuronu ruchowego a mięśniem, ułatwiające włączenie skurczu mięśni. W zaburzeniach neuronu ruchowego, takich jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS) i rdzeniowy zanik mięśni (SMA), NMJ ulegają zwyrodnieniu, powodując zanik mięśni i postępujący paraliż. Mechanizm leżący u podstaw zwyrodnienia NMJ jest nieznany, głównie z powodu braku przekładalnych modeli badawczych. Badanie to miało na celu stworzenie wszechstronnego i powtarzalnego modelu in vitro ludzkiej jednostki motorycznej z funkcjonalnymi NMJ. W związku z tym neurony ruchowe pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) i ludzkie pierwotne miorurki pochodzące z mezoangioblastów (MAB) były hodowane wspólnie w dostępnych na rynku urządzeniach mikroprzepływowych. Zastosowanie płynnie izolowanych mikrokompartmentów pozwala na utrzymanie mikrośrodowisk specyficznych dla komórek, umożliwiając jednocześnie kontakt między komórkami przez mikrorowki. Stosując gradient chemotaktyczny i wolumetryczny, stymulowano wzrost neuronów ruchowych przez mikrorowki promujące interakcję miotubową i tworzenie NMJ. Te NMJ zidentyfikowano immunocytochemicznie poprzez kolokalizację markera presynaptycznego neuronu ruchowego synaptofizyny (SYP) i markera postsynaptycznego receptora acetylocholiny (AChR) α-bungarotoksyny (Btx) na mięśniówkach i scharakteryzowano morfologicznie za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Funkcjonalność NMJ potwierdzono poprzez pomiar odpowiedzi wapnia w miotubach po depolaryzacji neuronów ruchowych. Jednostka motoryczna wygenerowana przy użyciu standardowych urządzeń mikroprzepływowych i technologii komórek macierzystych może pomóc w przyszłych badaniach koncentrujących się na NMJ w zdrowiu i chorobie.

Wprowadzenie

NMJ ułatwiają komunikację między dolnymi neuronami ruchowymi rdzenia kręgowego a włóknami mięśni szkieletowych poprzez uwalnianie neuroprzekaźników1. W zaburzeniach neuronu ruchowego, takich jak ALS i SMA, NMJ ulegają degeneracji, co powoduje zakłócenia w komunikacji z mięśniami2,3,4,5,6,7. Powoduje to, że pacjenci stopniowo tracą funkcję mięśni, co powoduje, że są przykuci do wózka inwalidzkiego i ostatecznie zależni od podtrzymywania życia przez układ oddechowy z powodu postępującego zaniku ważnych grup mięśni, takich jak przepona. Dokładne mechanizmy odpowiedzialne za tę głęboką utratę NMJ w tych zaburzeniach nie są znane. Przeprowadzono wiele badań na transgenicznych modelach zwierzęcych, które dały nam pewien wgląd w patogenezę zwyrodnienia NMJ5,6,8,9,10,11. Jednak, aby w pełni zrozumieć patologię i przeciwdziałać odnerwieniu, ważne jest, aby mieć ludzki system, który umożliwia pełną dostępność.

Tutaj protokół opisuje stosunkowo prosty sposób generowania ludzkich NMJ poprzez kokulturację neuronów ruchowych pochodzących z hiPSC i ludzkich pierwotnych myotubek pochodzących z MAB za pomocą dostępnych na rynku urządzeń mikroprzepływowych. Zastosowanie mikrofluidyki do polaryzacji i płynnej izolacji somy i aksonów neuronów jest znane od czasu pierwszego opisu komór 'Campenot' 12 pod koniec lat siedemdziesiątych. Od tego czasu wyprodukowano więcej projektów mikroprzepływowych, w tym opcje komercyjne. Urządzenia używane w tym protokole zawierają dwie komory, a każda komora składa się z dwóch studzienek połączonych kanałem13. Dwie komory są lustrzane i połączone kilkoma mikrorowkami. Te mikrorowki mają rozmiar, który ułatwia wzrost neurytu, zachowując jednocześnie izolację płynów między dwoma przedziałami poprzez kapilarne ciśnienie hydrostatyczne13,14. Za pomocą tego systemu możliwe jest hodowanie neuronów ruchowych w jednym przedziale i komórek mięśniowych w drugim, każda w specyficznym pożywce hodowlanej, jednocześnie ułatwiając fizyczne połączenie poprzez neuryty przechodzące przez mikrorowki i angażujące się w komórki mięśniowe. Model ten zapewnia w pełni dostępny i adaptowalny system in vitro ludzkiej jednostki motorycznej, który może być wykorzystany do badania wczesnej patologii NMJ w chorobach takich jak ALS i SMA.

Protokół

Od wszystkich uczestników, którzy przekazali swoje próbki do generowania iPSC i pozyskiwania MAB, uzyskano pisemną świadomą zgodę. Procedura została zatwierdzona przez komisję etyki medycznej Szpitala Uniwersyteckiego w Leuven (n° S5732-ML11268) oraz przez główną brytyjską komisję etyki badań w ramach projektu StemBANCC. Wszystkie odczynniki i sprzęt użyte w tym protokole wymieniono w Tabeli materiałów i powinny być one sterylne. Pożywki należy ogrzać do temperatury pokojowej (RT) przed użyciem, chyba że wskazano inaczej. Przegląd protokołu kokultury znajduje się w Rysunku 1.

1. Różnicowanie progenitorów neuronów ruchowych z iPSC

  1. Postępować zgodnie z protokołem różnicowania neuronów ruchowych15, zaadaptowanym z wcześniejszego badania16, aż do uzyskania stanu neuralnych progenitorów (NPCs) w 10. dniu. Zgodnie z harmonogramem protokołu, różnicowanie rozpoczyna się w poniedziałek (dzień 0), co skutkuje uzyskaniem NPCs w 10. dniu w czwartek.
  2. Kriokonserwować NPCs z 10. dnia w zamienniku surowicy knock-out z dodatkiem 10% dimetylosulfotlenku (DMSO) przy gęstości od 2 x 106 do 4 x 106 komórek na fiolkę.
    OSTROŻNIE: DMSO jest toksyczny: należy z nim pracować w dygestorium, stosując środki ochrony indywidualnej.
    UWAGA: Przewiduje się, że po rozmrożeniu żywe pozostanie około 50% NPCs z 10. dnia. Należy przerwać protokół różnicowania neuronów ruchowych na etapie „10. dnia NPC” i kriokonserwować NPCs, aby wygenerować ich dużą liczbę, którą można zbankować i wykorzystać później, co skraca całkowity czas trwania protokołu kokultury z 28 do 19 dni.

2. Wytwarzanie i utrzymanie ludzkich MAB

UWAGA: MAB to naczyniowe mezenchymalne komórki macierzyste, które w tym przypadku zostały pobrane z biopsji otrzymanych od zdrowego dawcy w wieku 58 lat. Dostępne są alternatywne źródła komercyjne. Poniżej krótko wyjaśniono protokół pozyskiwania MAB. Po dalsze informacje należy odwołać się do szczegółowego protokołu17. Wszystkie pożywki dla MAB powinny zostać podgrzane do 37 °C przed użyciem.

  1. Rozdrobnij tkankę z biopsji i inkubuj na naczyniach 6 cm pokrytych kolagenem (ze skóry cielęcej) w pożywce wzrostowej (Tabela 1) przez 2 tygodnie. Wymieniaj pożywkę co 4 dni.
    1. Aby przygotować powłokę kolagenową, rozpuść 100 mg kolagenu w 20 mL 0,1 M kwasu octowego. Kolagen rozpuszcza się powoli, dlatego mieszaninę należy umieścić na platformie kołyszącej na noc w temperaturze pokojowej (RT). Następnego dnia dopełnij objętość do 100 mL, dodając 80 mL ddH2O.
      OSTRZEŻENIE: Kwas octowy jest toksyczny; należy z nim pracować w dygestorium, stosując środki ochrony osobistej.
      UWAGA: Powłoka z kolagenu ze skóry cielęcej może być używana wielokrotnie (do 5 razy). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Pokryj całą powierzchnię naczynia lub kolby kolagenem, zamknij i inkubuj przez 20 min w temperaturze pokojowej pod przepływem laminarnym. Po 20 min odzyskaj kolagen do nowego pojemnika, zamknij puste naczynie/kolbę i pozostaw na 10 min w temperaturze pokojowej pod przepływem laminarnym.
    3. Przenieś naczynie/kolbę do inkubatora na nocną (lub co najmniej 6-godzinną) inkubację (37 °C, 5% CO2). Przed wysianiem komórek przemyj naczynie 5 razy fosforowym buforem solnym Dulbecco bez jonów wapnia i magnezu (DPBS).
  2. Po 14 dniach przeprowadź sortowanie FACS (fluorescencyjne sortowanie komórek aktywowane laserem) blastów mięśniowych (MABs) pod kątem ludzkiej fosfatazy alkalicznej17, a następnie kontynuuj ich ekspansję. Hoduj MABs w kolbach T75 pokrytych kolagenem w pożywce wzrostowej, wymieniając pożywkę co 2 dni (10 mL na kolbę).
  3. Kriokonserwuj, pasażuj lub wysiewaj MABs do urządzeń po osiągnięciu 70% konfluencji.
    UWAGA: MABs tracą swój potencjał miogenny z powodu spontanicznych fuzji podczas kontaktu komórka-komórka. Należy dopilnować, aby podczas ekspansji MABs nie przekroczyć 70% konfluencji. Jedna kolba T75 przy 70% konfluencji zawiera około 600 000-800 000 komórek, które można kriokonserwować w ilości 100 000 komórek na probówkę. Każda probówkę można później rozmrozić i wysiać do kolby T75 w celu ekspansji.
  4. Aby przeprowadzić pasaż MABs, delikatnie przemyj je raz 7 mL DPBS, a następnie inkubuj w 7 mL roztworu do dysocjacji MAB przez 3 min w temperaturze 37 °C w 5% CO2, aby zdysocjować komórki.
    1. Zneutralizuj roztwór do dysocjacji MAB za pomocą 7 mL pożywki wzrostowej, delikatnie zeskrob komórki i przenieś zawiesinę komórkową do probówki wirówki o pojemności 50 mL. Delikatnie przemyj kolbę dodatkowymi 5 mL pożywki wzrostowej, aby zebrać potencjalnie pozostałe MABs.
    2. Wiruj zawiesinę komórkową przez 3 min przy 300 x g, a następnie przenieś bezpośrednio do nowej pokrytej kolagenem kolby T75 do ekspansji, kriokonserwuj w zamienniku surowicy knock-out z 10% DMSO lub policz komórki w celu wysiania do urządzenia mikrofluidycznego.
      UWAGA: Pasaże wykonuje się 1-2 razy w tygodniu w celu ekspansji komórek, aż do maksymalnej liczby 13 pasaży. Po dysocjacji MABs w badaniu mikroskopowym mają kształt sferyczny i są duże.

3. Przygotowanie wstępnie zmontowanych urządzeń mikroprzepływowych - Dzień 9

UWAGA: Protokół został opracowany na podstawie instrukcji producenta urządzenia mikrofluidycznego do neuronów i dostosowany do stosowania zarówno urządzeń wstępnie zmontowanych, jak i silikonowych. W niniejszej procedurze urządzenia wstępnie zmontowane są wykorzystywane do immunocytochemii (ICC) oraz rejestracji przejściowych zmian stężenia wapnia w żywych komórkach, natomiast urządzenia silikonowe służą do badań SEM. Harmonogram protokołu jest zgodny z harmonogramem protokołu różnicowania neuronów ruchowych.

  1. Przygotuj urządzenia mikrofluidyczne dzień przed wysiewaniem komórek, ponieważ powlekanie wymaga inkubacji przez noc. Zgodnie z protokołem dla neuronów ruchowych będzie to środa. Do szalki Petriego o średnicy 10 cm wlej ~10 mL 70%-100% etanolu. Za pomocą pęsety przenieś urządzenie z pojemnika transportowego do szalki Petriego w celu sterylizacji.
  2. Zanurz urządzenie w etanolu na 10 s, a następnie za pomocą pęsety przenieś je na arkusz papieru, aby wyschło na powietrzu w laminarnym przepływie powietrza przez ~30 min. Odwróć urządzenie kilka razy, aby obie strony mogły wyschnąć. Po wyschnięciu urządzenia przenieś każdą sztukę pęsetą do oddzielnej szalki Petriego o średnicy 10 cm w celu łatwiejszej obsługi
    OSTRZEŻENIE: Etanol jest toksyczny; należy z nim pracować w dygestorium, stosując środki ochrony osobistej
  3. Powlecz urządzenie poli-L-ornityną (PLO) (100 µg/mL) w DPBS i inkubuj w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 3 h.
    1. Używając pipety P200, nanieś 100 µL PLO w DPBS do górnej studzienki tak blisko otworu kanału, jak to możliwe, i obserwuj przepływ cieczy z górnej studzienki przez kanał do studzienki dolnej. Następnie dodaj 100 µL PLO w DPBS do studzienki dolnej.
    2. Powtórz czynność po drugiej stronie mikrowcień i zakończ, dodając 100 µL po jednej stronie urządzenia, aby stworzyć gradient objętości między dwiema lustrzanymi stronami urządzenia w celu powleczenia mikrowcień (np. strona prawa 200 µL, strona lewa 300 µL). Po 3 h przemyj urządzenie 3x przez 5 min za pomocą DPBS. W razie potrzeby użyj systemu ssącego.
      UWAGA: Należy upewnić się, aby na żadnym etapie powlekania lub hodowli komórek nie powstały pęcherzyki powietrza w kanałach. Nawet małe pęcherzyki zwiększą swoją objętość w krótkim czasie, co uniemożliwi powlekanie, wysiew komórek lub przepływ pożywki przez kanał. Jeśli podczas powlekania ciecz zatrzyma się w kanale, wprowadź roztwór PLO bezpośrednio do kanału z obu stron. Jeśli pęcherzyki nadal występują, użyj 200 µL DPBS do przepłukania kanału i powtórz proces powlekania zgodnie z opisem w krokach 3.3.1-3.3.2. Jeśli pęcherzyki pojawią się po wysiewaniu komórek, odzyskanie urządzenia jest niemożliwe, ponieważ przepłukanie kanału uszkodzi komórki.
  4. Powlecz urządzenie lamininą (20 µg/mL) w pożywce Neurobasal i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2. Postępuj zgodnie z tymi samymi instrukcjami dotyczącymi powlekania PLO z kroków 3.3.1-3.3.2.
  5. Następnego dnia, używając pipety P200, umieść końcówkę w studzience przeciwległej do otworu kanału, aby usunąć powłokę z lamininy ze studzienek. Dodaj DPBS do wszystkich studzienek i pozostaw urządzenia z DPBS w laminarnym przepływie powietrza w temperaturze pokojowej do czasu wysiewania komórek.
    ​UWAGA: Od tego momentu ważne jest, aby nie usuwać cieczy (powłoki lamininy, DPBS, pożywki, roztworu do fiksacji itp.) bezpośrednio z kanałów, ponieważ może to spowodować powstanie pęcherzyków powietrza. Zawsze sprawdzaj urządzenia pod mikroskopem przed wysiewaniem komórek.

4. Przygotowanie silikonowych urządzeń mikroprzepływowych - Dzień 9

  1. Przygotuj silikonowe urządzenia mikroprzepływowe dzień przed wysiewaniem komórek, ponieważ powlekanie wymaga inkubacji przez noc. Zgodnie z protokołem dla neuronów ruchowych będzie to środa.
    1. Do 10 cm płytki Petri wlej ~10 mL 70%-100% etanolu. Za pomocą pęsety przenieś urządzenie z opakowania transportowego do płytki Petri w celu sterylizacji. Zanurz urządzenie w etanolu na 10 s, a następnie przenieś pęsetą do dołka w płytce 6-dołkowej, aby wyschło na powietrzu w laminarnym przepływie powietrza przez ~30 min. Ustaw urządzenie na boku, aby wszystkie strony mogły wyschnąć.
    2. Dotnij arkusze SEM do rozmiaru urządzenia (pozostawiając kilka mm z każdej strony). Powtórz sterylizację zgodnie z opisem w kroku 4.1.1. Następnie przenieś pęsetą do 10 cm płytki Petri w celu wysuszenia. W jednej płytce zmieszczą się dwa-trzy arkusze SEM.
  2. Powlek urządzenia i arkusze SEM przy użyciu PLO (100 µg/mL) w DPBS i inkubuj w 37 °C, 5% CO2 przez 3 h.
    1. Do każdego urządzenia w płytce 6-dołkowej dodaj 1 mL roztworu PLO w DPBS na dołek. Upewnij się, że urządzenie unosi się na powierzchni roztworu PLO stroną z kanałem i mikrowrowCountami skierowaną w dół, w stronę cieczy. Do 10 cm płytki Petri dodaj 10 mL PLO w DPBS i za pomocą pęsety dociśnij arkusze SEM do cieczy.
      UWAGA: Arkusze SEM zazwyczaj będą unosić się na powierzchni roztworu powlekającego. Przed złożeniem urządzenia i arkusza obróć arkusz SEM tak, aby powierzchnia, która miała kontakt z PLO, stykała się z powierzchnią kanału i mikrowrowCountów urządzenia.
    2. Po 3 h przemyj urządzenie i arkusze SEM 2x przez 5 min za pomocą DPBS, a następnie przemyj ponownie przez 5 min sterylną wodą. W razie potrzeby użyj systemu ssącego. Przenieś każdy arkusz SEM do osobnej 10 cm płytki Petri, aby ułatwić manipulację.
      UWAGA: Zarówno urządzenia, jak i arkusze SEM muszą być całkowicie suche przed montażem. Końcowe płukanie sterylną wodą usuwa potencjalne kryształy soli z DPBS, które w przeciwnym razie mogłyby utrudnić montaż.
  3. Pracuj pod mikroskopem w laminarnym przepływie powietrza. Za pomocą pęsety zamontuj urządzenie silikonowe stroną z kanałem i mikrowrowCountami do dołu pod kątem 90° na arkuszu SEM, upewniając się, że wszystkie krawędzie są wyrównane. Lekko dociśnij urządzenie, aby upewnić się, że uszczelnione są nie tylko krawędzie zewnętrzne, ale także obszary wokół dołków, kanałów i mikrowrowCountów.
    UWAGA: Obszary złączone będą wydawać się szare, natomiast te jeszcze niezamontowane pozostaną przezroczyste pod mikroskopem. Upewnij się, że wszystkie obszary są dobrze uszczelnione i nie zawierają pęcherzyków powietrza, aby zapobiec odczepieniu się urządzenia podczas hodowli. W przypadku zanieczyszczeń lub kryształów soli blokujących montaż, ponownie przemyj arkusz SEM i urządzenie w sterylnej wodzie i wysusz przed ponowną próbą montażu. Jeśli mikrowrowCounty wydają się zdeformowane z powodu zbyt silnego nacisku na urządzenie, całkowicie zdejmij urządzenie z arkusza SEM i spróbuj zamontować je ponownie. Zachowaj ostrożność podczas powlekania i wymiany mediów po zamontowaniu urządzenia.
  4. Pracuj pod mikroskopem w laminarnym przepływie powietrza. Powlek urządzenie lamininą (20 µg/mL) w medium Neurobasal i inkubuj przez noc w 37 °C, 5% CO2.
    UWAGA: Inkubacja przez noc utwardza silikonowe urządzenie i dodatkowo uszczelnia je na arkuszu SEM.
    1. Użyj pipety P200, aby dodać 100 µL roztworu lamininy do górnego dołka, jak najbliżej otworu kanału, i obserwuj przepływ cieczy z górnego dołka przez kanał do dolnego dołka. Sprawdź, czy nie ma wycieków wokół dołka i kanału.
    2. Następnie dodaj 100 µL roztworu lamininy do dolnego dołka i sprawdź pod kątem wycieków. Powtórz czynność po drugiej stronie mikrowrowCountów i zakończ dodaniem dodatkowych 100 µL po jednej stronie urządzenia, aby stworzyć gradient objętości między dwiema lustrzanymi stronami urządzenia w celu powlekania mikrowrowCountów (np. prawa strona 200 µL, lewa strona 300 µL).
      UWAGA: W przypadku wycieku usuń powłokę z lamininy, rozmontuj urządzenie i arkusze SEM, a następnie przemyj oba elementy w sterylnej wodzie. Pozostaw do wyschnięcia i powtórz od kroku 4.3.
    3. Następnego dnia usuń powłokę z dołków za pomocą pipety P200, umieszczając końcówkę w dołku naprzeciwko otworu kanału. Do wszystkich dołków dodaj DPBS i pozostaw urządzenia z DPBS w laminarnym przepływie powietrza w RT do wysiewania komórek.
      UWAGA: Od tego momentu nie usuwaj cieczy (powłoki z lamininy, DPBS, mediów, roztworu fiksacyjnego itp.) bezpośrednio z kanałów, ponieważ może to spowodować powstanie pęcherzyków powietrza. Zawsze sprawdzaj urządzenia pod mikroskopem przed wysiewaniem komórek.

5. Wysiewanie NPC w urządzeniach mikroprzepływowych – Dzień 10

UWAGA: Zgodnie z protokołem różnicowania neuronów ruchowych15, wysiewanie NPC w 10. dniu odbywa się w czwartek.

  1. Należy użyć świeżo dysocjowanych NPC z 10. dnia15 lub rozmrozić 1-2 ampułki zbankowanych NPC na każde 10 mL pożywki do neuronów ruchowych z 10. dnia (Tabela 2 i Tabela 3) z roztworem inhibitora ROCK (10 µL/mL), a następnie odwirować zawiesinę komórkową przy 100 x g przez 4 min.
  2. Osad komórkowy należy resuspendować w 500-1000 µL pożywki do neuronów ruchowych z 10. dnia z roztworem inhibitora ROCK (10 µL/mL) i policzyć żywe komórki wybraną metodą liczenia.
    UWAGA: Zgodnie z dalszymi instrukcjami, należy upewnić się, że NPC zostały resuspendowane w odpowiedniej ilości pożywki, aby uzyskać optymalną objętość siewu.
  3. Za pomocą pipety P200 usunąć DPBS z dwóch dołków po jednej stronie mikrorowków w urządzeniu i zasiać 250 000 NPC na urządzenie w 60-100 µL pożywki do neuronów ruchowych z 10. dnia.
    1. W górnym prawym dołku zasiać 30-50 µL zawiesiny komórkowej (125 000 komórek) blisko otworu kanału pod kątem 45° i delikatnie przeciągnąć pozostałą ciecz końcówką pipety wzdłuż dna dołka w stronę jego środka.
    2. Odczekać kilka sekund, aby zawiesina komórkowa przepłynęła przez kanał, a następnie powtórzyć tę czynność w dolnym dołku (125 000 komórek w 30-50 µL). Za pomocą pisaka oznaczyć stronę z zasianymi komórkami jako „NPC” lub odpowiednio, aby ułatwić orientację urządzenia bez użycia mikroskopu.
    3. Inkubować urządzenie w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 przez 5 min, aby umożliwić przytwierdzenie komórek, a następnie uzupełnić dwa zasiane dołki dodatkową pożywką do neuronów ruchowych z 10. dnia (łącznie 200 µL/dołek) i ponownie inkubować w 37 °C, 5% CO2.
      UWAGA: Każdy dołek może pomieścić 200 µL. Siew komórek do obu dołków oraz kanałów zapewnia stabilną strukturę hodowli, zmniejszając ryzyko odczepienia komórek podczas wymiany pożywki. Możliwe jest zasianie mniejszej liczby komórek tylko w kanale, jednak sprawi to, że hodowla będzie bardziej podatna na prądy objętościowe w kanałach podczas każdej wymiany pożywki.
  4. Za pomocą pipety P200 usunąć DPBS z dwóch dołków po drugiej stronie mikrorowków, przeciwległych do świeżo zasianych NPC. Dodać 200 µL/dołek pożywki do neuronów ruchowych z 10. dnia i odczekać kilka sekund między dołkiem górnym a dolnym, aby pożywka mogła przepłynąć przez kanał. Następnie dodać 6 mL DPBS na każdą szalkę 10 cm wokół urządzenia, aby zapobiec odparowaniu pożywki podczas inkubacji.
    UWAGA: W razie potrzeby należy dodać dodatkowy DPBS wokół urządzenia w trakcie okresu hodowli.
  5. Przeprowadzić pełną wymianę pożywki do neuronów ruchowych w obu przedziałach urządzenia w 11. dniu (piątek), 14. dniu (poniedziałek) i 16. dniu (środa) (Tabela 2 i Tabela 3). W dniu wymiany pożywki dodać świeże suplementy do pożywki.
    UWAGA: Od tego momentu wszystkie wymiany pożywki należy przeprowadzać za pomocą pipety P200. Końcówkę pipety zawsze należy umieszczać z dala od kanału, przy krawędzi dołka, i nie wolno usuwać cieczy bezpośrednio z kanału. Należy uważać, aby nie odczepić urządzeń silikonowych. Usuwanie i dodawanie pożywki powinno odbywać się powoli, aby zapobiec odczepieniu komórek.
    1. Ostrożnie usunąć całą pożywkę z obu dołków z NPC, umieszczając końcówkę pipety P200 przy dolnej krawędzi ścianki dołka przeciwległej do otworu kanału. Powoli dodać 50-100 µL świeżej pożywki do neuronów ruchowych do górnego dołka, umieszczając końcówkę pipety P200 przy górnej krawędzi ścianki dołka przeciwległej do otworu kanału.
    2. Odczekać kilka sekund, aby pożywka przepłynęła przez kanał, zanim doda się 50-100 µL pożywki do neuronów ruchowych do dolnego dołka. Powtarzać ten proces ostrożnie, aż oba dołki będą zawierać 200 µL/dołek. Powtórzyć to samo po stronie bez komórek.

6. Wysiewanie MAB w urządzeniach mikroprzepływowych - Dzień 17

  1. Na około 7 dni przed wysianiem MAB do urządzeń mikroprzepływowych (dzień 10 różnicowania neuronów ruchowych) rozmrozić MAB i wysiać je w pożywce wzrostowej (Tabela 1) do kolby T75 pokrytej kolagenem, aby umożliwić wystarczającą ekspansję komórek. Patrz sekcja 2.
  2. W 17. dniu różnicowania neuronów ruchowych (czwartek) zdysocjować MAB zgodnie z opisem w kroku 2.4, resuspender osad komórkowy w ~500 µL pożywki wzrostowej i policzyć żywe komórki wybraną metodą liczenia.
    UWAGA: Zgodnie z poniższymi instrukcjami, należy upewnić się, że MAB zostały zresuspendowane w odpowiedniej ilości pożywki, aby uzyskać optymalną objętość wysiewu.
  3. Usunąć pożywkę do neuronów ruchowych z nieobsianej strony mikrowgłębień w urządzeniu za pomocą pipety P200, delikatnie przemyć DPBS i wysiać 200 000 MAB na każde urządzenie w 60-100 µL pożywki wzrostowej.
    1. W prawym górnym dołku wysiać 30-50 µL zawiesiny komórkowej (100 000 komórek) blisko otworu kanału pod kątem 45° i delikatnie przeciągnąć pozostałą ciecz końcówką pipety wzdłuż dna dołka w stronę jego centrum. Odczekać kilka sekund, aby umożliwić przepływ komórek przez kanał, a następnie powtórzyć czynność w dolnym dołku (100 000 komórek w 30-50 µL).
    2. Inkubować urządzenie w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 5 min, aby umożliwić przyleganie komórek, a następnie uzupełnić dwa świeżo obsiane MAB dołki dodatkową pożywką wzrostową (łącznie 200 µL/dołek). Inkubować ponownie w 37 °C, 5% CO2.
      ​UWAGA: W 17. dniu nie jest wymagana wymiana pożywki po stronie neuronów ruchowych urządzenia. Wymiana pożywki w 17. dniu, zgodnie z wcześniej opublikowaną metodą różnicowania neuronów ruchowych15, jest zamiast tego przeprowadzana w 18. dniu (piątek).

7. Wdrożenie gradientu objętościowego i chemotaktycznego w celu promowania wzrostu neurytów neuronów ruchowych w kierunku komory MAB

  1. W 18. dniu przeprowadź całkowitą wymianę pożywki po stronie neuronów ruchowych, stosując pożywkę dla neuronów ruchowych z 18. dnia (200 µL/studzienkę). Postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi wymiany pożywki opisanymi w krokach 5.5.1-5.5.2. Rozpocznij różnicowanie MAB w przedziale MAB urządzenia (Tabela 2 i Tabela 4).
    1. Ostrożnie przemyj przedziały MAB raz przy użyciu DPBS przed dodaniem podgrzanej pożywki do różnicowania MAB (Tabela 4) uzupełnionej o 0,01 µg/mL ludzkiej agryny (200 µL/studzienkę).
      UWAGA: Komórki MAB będą się łączyć i tworzyć wielojądrzaste prężykowce w ciągu jednego tygodnia.
  2. W 21. dniu, zgodnie z protokołem różnicowania neuronów ruchowych (poniedziałek), wprowadź gradient chemotaktyczny i wolumetryczny (Tabela 2 i Tabela 3).
    1. Do przedziału z prężykowcami (wcześniej zdefiniowanego jako przedział MAB) dodaj 200 µL/studzienkę podstawowej pożywki dla neuronów ruchowych z 30 ng/mL czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego (BDNF), czynnika neurotroficznego linii komórek glejowych (GDNF) i czynnika neurotroficznego rzęskowego (CNTF), ludzkiej agryny (0,01 µg/mL) oraz lamininy (20 µg/mL). Do przedziału z neuronami ruchowymi dodaj podstawową pożywkę dla neuronów ruchowych (100 µL/studzienkę) bez czynników wzrostu.
  3. Powtarzaj krok 7.2 co drugi dzień aż do 28. dnia różnicowania neuronów ruchowych. W weekendy wymiana pożywek nie jest wymagana.

Schemat procesu różnicowania neuronów; analiza rozwoju neuronów ruchowych; metoda gradientu chemotaktycznego.
Rysunek 1: Schematyczny przegląd protokołu jednostki ruchowej w urządzeniach mikroprzepływowych. Harmonogram różnicowania i przegląd kokultury od dnia 0 do dnia 28 zgodnie z harmonogramem protokołu różnicowania neuronów ruchowych22. Różnicowanie neuronów ruchowych z iPSC jest inicjowane w dniu 0 i przeprowadzane zgodnie z wcześniejszym opisem przez kolejne 10 dni15. W dniu 9 urządzenie jest sterylizowane i powlekane PLO-lamininą. MAB są rozmrażane w celu ekspansji w kolbach T75. W dniu 10 neurony ruchowe-NPC są wysiewane do obu studni oraz kanału jednej komory (jasnoszara) urządzenia, gdzie ich różnicowanie w neurony ruchowe jest kontynuowane przez tydzień. MAB są wysiewane do obu studni oraz kanału przeciwległej komory (ciemnoszara) w dniu 17. W dniu 18 rozpoczyna się różnicowanie MAB w miotuby. W dniu 21 ustanawiany jest gradient wolumetryczny i chemotaktyczny w celu promowania polaryzacji neurytów neuronów ruchowych poprzez mikrowycięcia urządzenia. Komora neuronów ruchowych otrzymała 100 µL/studnię podstawowej pożywki dla neuronów ruchowych bez czynników wzrostu (komora jasnozielona), natomiast komora miotub otrzymała 200 µL/studnię podstawowej pożywki dla neuronów ruchowych z 30 ng/mL czynników wzrostu (komora ciemnozielona) (Tabela 2 i Tabela 3). Hodowla jest kontynuowana z gradientem wolumetrycznym i chemotaktycznym przez kolejne 7 dni aż do analizy w dniu 28. Obrazy w jasnym polu pokazują morfologię komórek w dniu 0, dniu 11, dniu 18 i dniu 28 hodowanych w wcześniej zmontowanych urządzeniach mikroprzepływowych. Pasek skali, 100 µm. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Stoklund Dittlau, K. et al.18. Ilustracje komórek zostały zmodyfikowane na podstawie Smart Server medical Art22. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

8. Fixacja i ICC

UWAGA: Wszystkie kroki należy wykonywać ostrożnie, aby zapobiec odklejeniu się kultur neuronalnych. Podczas poniższych etapów nie należy usuwać cieczy z kanałów.

  1. Przeprowadzenie fiksacji w dygestorium lub pod laminarnym przepływem powietrza: Przed fiksacją należy ostrożnie przemyć wszystkie dołki w urządzeniu raz za pomocą DPBS. Utwierdzić próbki, stosując 4 % paraformaldehydu (PFA) w DPBS przez 15-20 min w temperaturze pokojowej (RT) pod laminarnym przepływem powietrza (100 µL/dołek).
    UWAGA: PFA jest toksyczne: należy z nim pracować w dygestorium, stosując środki ochrony osobistej.
    1. Ostrożnie dodać 100 µL do górnego dołka urządzenia i odczekać kilka sekund, aby roztwór fiksacyjny przepłynął przez kanał, a następnie dodać 100 µL do dolnego dołka. Powtórzyć czynność po drugiej stronie. Po inkubacji usunąć roztwór PFA i delikatnie przemyć 3x przez 5 min za pomocą DPBS. Pozostawić w 200 µL/dołek DPBS do przechowywania i szczelnie zamknąć szalkę Petriego o średnicy 10 cm parafilmem, aby przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu przeprowadzenia eksperymentu ICC.
      UWAGA: Należy dopilnować, aby urządzenia nie wyschły podczas przechowywania.
  2. W pierwszym dniu procedury ICC inkubować komórki z roztworem permeabilizującym (100 µL/dołek) składającym się z 0,1% Triton X-100 w DPBS przez 20 min w RT. Usunąć roztwór permeabilizujący i dodać 5% normalnego surowicy osła w roztworze 0,1% Triton X-100/DPBS (100 µL/dołek) na 30 min w RT.
  3. Usunąć roztwór 5% normalnej surowicy osła i inkubować urządzenia z przeciwciałami pierwotnymi (Tabela materiałów) w 2% normalnej surowicy osła w roztworze 0,1% Triton X-100/DPBS przez noc w temperaturze 4 °C.
    1. Zastosować gradient objętości. Dodać 100 µL/dołek roztworu przeciwciał po jednej stronie mikrowżobień oraz 150 µL/dołek po drugiej stronie (łącznie 500 µL na urządzenie).
      UWAGA: Można zastosować różne przeciwciała po obu stronach mikrowżobień. W takim przypadku nie należy stosować gradientu objętości przeciwciał pierwotnych lub wtórnych w obrębie mikrowżobień, aby zachować izolację płynową między przedziałami. Neuryty w mikrowżobieniach nie zostaną zabarwione bez zastosowania gradientu.
  4. Następnego dnia (dzień 2 procedury ICC) usunąć przeciwciała pierwotne i ostrożnie przemyć urządzenie 3x przez 5 min roztworem 0,1% Triton X-100/DPBS.
    UWAGA: W przypadku kultur łatwo odklejających się, trzykrotne płukanie przez 5 min można zastąpić jednokrotnym płukaniem przez 30 min.
  5. Od tego momentu pracować w ciemności, ponieważ przeciwciała wtórne (Tabela materiałów) są światłoczułe. Inkubować komórki z przeciwciałami wtórnymi w 2% normalnej surowicy osła w roztworze 0,1% Triton X-100/DPBS przez 1 h w RT. Zastosować gradient objętości zgodnie z opisem w kroku 8.3.1. Po inkubacji usunąć przeciwciała wtórne i przemyć 3x przez 5 min za pomocą DPBS.
  6. Zbarwić DNA jądrowe za pomocą DAPI w DPBS (100 µL/dołek) przez 20 min w RT, a następnie przemyć 3-4x przez 5 min roztworem 0,1% Triton X-100/DPBS. Usunąć roztwór 0,1% Triton X-100/DPBS ze wszystkich dołków i pozwolić kulturze wyschnąć przez kilka sekund przed dodaniem jednej kropli fluorescencyjnego medium montażowego do każdego dołka w celu zabezpieczenia próbki.
    UWAGA: Urządzenia należy trzymać w pozycji poziomej przez co najmniej 24 h, aby medium montażowe stężało. Po 24 h urządzenia można przechowywać w kasecie na preparaty w temperaturze 4 °C.
  7. Wykonać obrazowanie w stosach z (z-stacks) przy użyciu mikroskopu odwróconego.
    1. W celu obrazowania połączeń neuromięśniowych (NMJ) należy użyć obiektywu 40x, aby zlokalizować miotuby znakowane przeciwciałem przeciwko miotubom (Tabela materiałów), a następnie wykonać rejestrację w stosach z, aby zapewnić obrazowanie tkanki neuronalnej i miotub. Wykonać wiele ujęć w przypadku, gdy miotuba jest zbyt duża, by zmieścić się w jednej klatce.
    2. Do kwantyfikacji NMJ należy ręcznie policzyć liczbę kolokalizacji między neuronalnym markerem presynaptycznym a markerem AChR w każdym stosie z. Znormalizować liczbę kolokalizacji do liczby miotub obecnych w stosie z.

9. Fixacja i przygotowanie urządzenia do SEM

UWAGA: Podczas wymiany cieczy zawsze pozostawiaj niewielką ilość płynu przykrywającego hodowlę, aby zapobiec zapadnięciu się komórek. Niniejszy protokół wykorzystuje substancje silnie toksyczne; podczas całego procesu wymagane jest stosowanie środków ochrony osobistej oraz praca w dygestorium.

  1. Fiksacja i demontaż: Przygotować świeży 2,5% glutaraldehyd (GA) w 0,1 M buforze kakodylanu sodu (pH 7,6), przefiltrować za pomocą 0.2 µm przefiltrować i podgrzać do 37 °C.
    OSTRZEŻENIE: GA i kakodilian sodu są toksyczne: należy z nimi pracować w dygestorium, stosując środki ochrony osobistej.
    1. Starannie przemyj urządzenie raz przy użyciu DPBS, aby usunąć pożywkę i szczątki komórkowe, a następnie przeprowadź prefiksację roztworem GA przez 15 min w temperaturze pokojowej.
    2. Za pomocą skalpela ostrożnie wytnij arkusz do SEM wzdłuż obrysu urządzenia, stabilizując urządzenie pęsetą. Podczas wycinania należy uważać, aby nie oddzielić urządzenia od arkusza. Przenieś urządzenie wraz z arkuszem SEM za pomocą pęsety do szalki Petriego o średnicy 3 cm, a następnie umieść szalkę 3 cm w szalce 10 cm w celu łatwiejszej manipulacji.
    3. Po 15 minutach prefiksacji ostrożnie wyjmij urządzenie z arkusza SEM za pomocą pęsety. Odczep urządzenie w jednym narożniku i powoli usuwaj je po przekątnej w kierunku przeciwległego narożnika. Obserwuj odrywanie się komórek od urządzenia.
    4. Dodać dodatkowy roztwór GA, aby pokryć całą płytkę SEM w naczyniu o średnicy 3 cm, i kontynuować fiksację przez łącznie 2 h w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 °C.
      UWAGA: Delikatnie wsuń pęsetą arkusz do SEM pod roztwór GA, unikając kontaktu z powierzchniami pokrytymi komórkami.
  2. Następnie należy postępować zgodnie ze standardowym protokołem SEM. W skrócie: inkubować w czwartotlenku osmu, a następnie odwadniać za pomocą serii rozcieńczeń etanolu. Umieścić arkusz SEM w uchwycie do szkiełek nakrywkowych w celu przeprowadzenia suszenia w punkcie krytycznym, a następnie zamontować na podstawkach z naklejkami węglowymi i poddać napylaniu. Do obrazowania należy użyć skaningowego mikroskopu elektronowego przy napięciu przyspieszającym 5 kV i odległości roboczej 7 mm.

10. Ocena funkcjonalności NMJ z wykorzystaniem obrazowania wapnia w żywych komórkach

  1. Przygotowanie urządzeń: Wymień pożywkę w komorze z miotubami na 200 µL/dołek podstawowej pożywki dla neuronów ruchowych z 18. dnia z dodatkiem 30 ng/mL BDNF, GDNF i CNTF oraz w komorze z neuronami ruchowymi na 200 µL/dołek podstawowej pożywki dla neuronów ruchowych bez czynników wzrostu (Tabela 2 i Tabela 3).
    1. Dodaj barwnik Fluo-4 AM rozpuszczony w rozpuszczalniku do barwnika Fluo-4 do komory z miotubami do uzyskania stężenia końcowego 5 µM i inkubuj urządzenie w ciemności w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 25 min. Podczas inkubacji urządzenia rozcieńcz chlorek potasu w podstawowej pożywce dla neuronów ruchowych bez czynników wzrostu do stężenia końcowego 450 mM.
      UWAGA: Fluo-4 AM jest wskaźnikiem wapnia, który wykazuje wzrost fluorescencji po związaniu wapnia. Od tego momentu pracuj w ciemności, ponieważ barwnik jest światłoczuły.
    2. Po 25 min wymień pożywkę w komorze z miotubami na 200 µL/dołek podstawowej pożywki dla neuronów ruchowych z 18. dnia z dodatkiem 30 ng/mL BDNF, GDNF i CNTF oraz w komorze z neuronami ruchowymi na 100 µL/dołek podstawowej pożywki dla neuronów ruchowych bez czynników wzrostu, aby ponownie ustanowić gradient chemotaktyczny i wolumetryczny.
    3. Aby zablokować złącza neuromięśniowe (NMJs), uzupełnij pożywkę w komorze z miotubami 19 µM tubokuraryny chlorowodorianu pięciowodnego, konkurencyjnego antagonisty AChR.
      OSTRZEŻENIE: Tubokuraryna chlorowodorianu pięciowodnego jest toksyczna: należy z niej korzystać pod wyciągiem z użyciem środków ochrony osobistej.
  2. Wykonaj pomiary przy użyciu odwróconego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w inkubator ustawiony na 37 °C, 5% CO2.
    1. Za pomocą obiektywu 10x wykorzystaj kanał pola jasnego, aby zlokalizować miotuby w komorze z miotubami. Dostosuj moc lasera, wzmocnienie (gain) i offset dla kanału 488 do poziomu, w którym fluorescencja Fluo-4 zaznacza poszczególne miotuby.
      UWAGA: Reprezentatywne wyniki uzyskano, ustawiając suwaki w ustawieniach A1 oprogramowania na moc lasera 5%, wzmocnienie 60 (HV) i offset 0.
  3. Ustaw czas rejestracji na 1 min z interwałami 1 s. Rejestruj przez 5-10 s w celu uzyskania linii bazowej, a następnie natychmiast stymuluj neurony ruchowe roztworem chlorku potasu.
    1. Po 5-10 s od rozpoczęcia rejestracji powoli dodaj 25 µL roztworu chlorku potasu do jednego dołka w komorze z neuronami ruchowymi, aby osiągnąć stężenie końcowe 50 mM.
      UWAGA: Unikaj zbyt szybkiego dodawania roztworu chlorku potasu, ponieważ spowoduje to powstanie fali w kanale, co wywoła artefakty w zapisie.
  4. Zarejestruj komorę z miotubami podczas stymulacji neuronów ruchowych dwukrotnie z 2-minutową przerwą, a następnie wykonaj bezpośrednią stymulację komory z miotubami 25 µL roztworu chlorku potasu, aby ocenić bezpośrednią aktywność miotub niezależnie od depolaryzacji neuronów ruchowych.
  5. W celu przeprowadzenia analizy ilościowej ręcznie obrysuj każdą miotubę za pomocą oprogramowania do rejestracji i przeanalizuj intensywność fluorescencji Fluo-4 w 1-minutowym okresie czasu. Aby określić wzrost napływu wapnia, odejmij średnią wartość bazową (tj. średnią z pierwszych 10 s przed stymulacją chlorkiem potasu) od wartości szczytowej po stymulacji chlorkiem potasu. Reprezentatywne wyniki uzyskano za pomocą narzędzia Time Measurement w oprogramowaniu.

Wyniki

Generowanie połączeń nerwowo-mięśniowych w urządzeniach mikroprzepływowych
W celu wygenerowania ludzkiej jednostki motorycznej z funkcjonalnymi połączeniami nerwowo-mięśniowymi (NMJs) w komercyjnie dostępnych urządzeniach mikroprzepływowych wykorzystano ludzkie neurony ruchowe pochodzące z iPSC oraz ludzkie miotuby pochodzące z MAB. Jakość materiału komórkowego wyjściowego jest istotna, a w szczególności zdolność MAB do fuzji w miotuby jest kluczowa dla pomyślnego wyniku tego protokołu. MAB są łatwe w hodowli. Należy jednak ocenić zdolność do fuzji każdej partii przed ich zastosowaniem w urządzeniach mikroprzepływowych (Rysunek uzupełniający 1A,B)18. Partie, które nie wykazują tworzenia miotub po 10 dniach różnicowania, nie powinny być używane. Wskaźnik fuzji na Rysunku uzupełniającym 1B określono obliczając procent jąder w obrębie miotub wykazujących obecność każdego markera miotuby w stosunku do całkowitej liczby jąder na obrazie. Stwierdzono, że wskaźnik fuzji na poziomie około 8% był wystarczający dla naszej kokultury w celu wygenerowania NMJs.

Zawsze istotne jest rozpoczynanie różnicowania neuronów ruchowych z czystej hodowli iPSC. Im czystszy materiał wyjściowy, tym czystszy wynik. Protokół różnicowania neuronów ruchowych pozwala na uzyskanie hodowli neuronów ruchowych, w których odsetek komórek wykazujących dodatnią reakcję na markery neuronów ruchowych wynosi zazwyczaj od 85% do 95% (Rycina dodatkowa 1C,D)18Pozostałe komórki to zazwyczaj niezróżnicowane komórki prekursorowe, które w niektórych przypadkach ulegają intensywnej proliferacji, co może negatywnie wpływać na jakość hodowli. Aby uzyskać najlepsze wyniki zgodnie z niniejszym protokołem, przed wprowadzeniem do urządzenia neuronów ruchowych z NPC w 10. dniu należy ocenić wydajność różnicowania neuronów ruchowych. Dodatkowo w 11. dniu można przeprowadzić kontrolę jakości NPC, aby ocenić ekspresję markera NPC Olig2 (Rycina dodatkowa 1E,F).

Początkowo neurony ruchowe-NPC oraz MABy były wysiewane w tym samym punkcie czasowym, w dniu 10. W tej wersji różnicowanie MAB zainicjowano w dniu 11. Objętość i gradient czynników wzrostu zastosowane w dniu 14 pozwoliły nam ocenić tworzenie się NMJ w dniu 21, co skróciło protokół o jeden tydzień. Co ciekawe, za pomocą ICC mogliśmy zaobserwować charakterystyczne tworzenie się NMJ (Rycina uzupełniająca 2A). Jednakże na tym etapie różnicowania neuronów ruchowych nie udało nam się uzyskać funkcjonalnego sygnału wyjściowego podczas rejestracji poziomu wapnia w żywych komórkach (dane nieprzedstawione). Stwierdzono, że neurony ruchowe nie były jeszcze wystarczająco dojrzałe, aby utworzyć funkcjonalne połączenia w obrębie złącza neuromięśniowego (NMJ) z miotubami, mimo że morfologia NMJ wydawała się obiecująca. Jest to zgodne z naszymi wcześniejszymi obserwacjami, według których spontaniczne potencjały czynnościowe w neuronach ruchowych, rejestrowane za pomocą elektrofizjologicznej analizy patch-clamp, pojawiają się dopiero w 35. dniu różnicowania neuronów ruchowych.15.

Dodatkowo podjęto próbę wydłużenia procesu dojrzewania neuronów ruchowych, a także trwałości kokultury, poprzez dojrzewanie neuronów ruchowych w urządzeniu przez 2 tygodnie (dzień 24) przed wysianiem MAB. Niestety zaobserwowano dużą ilość spontanicznych przekroczeń neuritów neuronów ruchowych przez mikrowgłębienia, co doprowadziło do zahamowania przylegania MAB (Rycina uzupełniająca 2B). Ze względu na brak formowania się miotub w kanale, nie udało nam się zidentyfikować połączeń nerwowo-mięśniowych (NMJ) w 36. dniu, w związku z czym zastosowano protokół 28-dniowy (Rycina 1).

Identyfikacja, kwantyfikacja i charakterystyka morfologiczna połączeń neuromięśniowych (NMJ) in vitro
Po zastosowaniu 28-dniowego protokołu (Rysunek 1) możliwe było uzyskanie w pełni funkcjonalnych NMJ. Zarówno in vivo, jak i in vitro, NMJ charakteryzuje się immunohisto- lub immunocytochemicznie poprzez ko-lokalizację markera presynaptycznego i postsynaptycznego. W niniejszym badaniu zastosowano kombinację ciężkiego łańcucha neurofilamentów (NEFH) oraz SYP jako zestaw markerów presynaptycznych, co pozwoliło na śledzenie pojedynczego neurytu od somy neuronu ruchowego do najbardziej dystalnego wypustki. Po stronie mięśnia jako marker postsynaptyczny dla AChR szeroko stosuje się Btx, który został wykorzystany również w tym badaniu. Suplementacja agryną i lamininą wspomaga klastrowanie AChR w sarkolemie19,20,21, co ułatwia identyfikację AChR in vitro i analogicznie zwiększa liczbę obecnych AChR oraz NMJ18.

Aby zidentyfikować i obliczyć liczbę połączeń nerwowo-mięśniowych (NMJ) w sposób obiektywny, każda miotuba jest rozpoznawana na podstawie pozytywności na ciężkie łańcuchy miozyny (MyHC), a następnie obrazowana w stosach z (z-stacks) przy powiększeniu 40x przy użyciu odwróconego mikroskopu konfokalnego. W przypadku bardzo długich miotub pozyskano wiele stosów z. Podczas analizy obrazów liczbę kolokalizacji NEFH/SYP i Btx zliczono ręcznie w każdym stosie z, a następnie liczbę kolokalizacji znormalizowano do liczby miotub obecnych w stosie z (Rysunek 2A-C)18. Nie wszystkie miotuby posiadają NMJ, co widać w ilościowym określeniu unerwionych miotub (Rysunek 2D). W związku z tym istotne jest zastosowanie obiektywnego podejścia do rejestracji, w którym obrazowane są wszystkie miotuby, niezależnie od obecności Btx.

W tym systemie in vitro możliwe jest zidentyfikowanie dwóch typów morfologii. NMJ występują albo jako NMJ z pojedynczym punktem kontaktu, gdzie neuryt styka się z klastrem AChR w jednym punkcie interakcji, albo jako NMJ z wieloma punktami kontaktu, gdzie neuryt rozgałęzia się i wchodzi w interakcję z klastrem AChR na większej powierzchni. Te dwie morfologie można zidentyfikować zarówno immunocytochemicznie (Rysunek 2A)18, jak i za pomocą SEM (Rysunek 2B)18, a także można je poddać kwantyfikacji (Rysunek 2C)18. Ogólnie rzecz biorąc, wiele punktów kontaktu sprzyja szerszemu połączeniu poprzez rozległe zanurzenie w mięśniu, co wskazuje na bardziej dojrzałe formowanie się NMJ. W przeciwieństwie do nich, NMJ z pojedynczym punktem kontaktu są uważane za mniej dojrzałe ze względu na wczesny etap rozwoju hodowli.

Ocena funkcjonalna in vitro złącza neuromięśniowe
Aby ocenić funkcjonalność połączeń neuromięśniowych (NMJ), zastosowano rejestrację przejściowych zmian poziomu wapnia w żywych komórkach (Rysunek 3)18Wykorzystując system izolacji płynowej w urządzeniach mikroprzepływowych, stronę ciała neuronów ruchowych stymulowano wysokim stężeniem (50 mM) chlorku potasu, jednocześnie rejestrując napływ wapnia do miotub, które obciążono barwnikiem Fluo-4 wrażliwym na wapń (Rysunek 3A). Niemal natychmiast po aktywacji neuronów ruchowych zaobserwowano napływ wapnia do miotub w formie charakterystycznej fali, co potwierdza funkcjonalne połączenie między neuritem neuronu ruchowego a miotubą (Rycina 3A-C)18Nie zaobserwowano ani spontanicznych fal wapniowych, ani spontanicznych skurczów miotubek, choć odnotowano skurcz miotubek po bezpośredniej stymulacji chlorkiem potasu. Specyficzność połączenia potwierdzono dodatkowo poprzez dodanie do przedziału z miotubkami konkurencyjnego antagonisty AChR, pięciowodnego chlorowodorku tubokuraryny (DTC) (Rysunek 3A), co doprowadziło do zahamowania napływu wapnia (Rysunek 3C). Efekt ten potwierdził, że połączenie między neuronami ruchowymi a miotubami doprowadziło do powstania w pełni funkcjonalnych złącza neuromięśniowych (NMJ). Aby ocenić liczbę aktywnych miotub poprzez stymulację NMJ, przedział z miotubami stymulowano bezpośrednio chlorkiem potasu w celu ustalenia całkowitej liczby aktywnych miotub w tym przedziale. Około 70% miotub było aktywnych podczas stymulacji neuronów ruchowych z wykorzystaniem chlorku potasu (Rysunek 3D)18.

Wyniki te potwierdzają optymalną formację, liczbę, morfologię i funkcjonalność połączeń neuromięśniowych (NMJ) uzyskaną poprzez kokulturę neuronów ruchowych pochodzących z iPSC oraz miotub pochodzących z MAB w ramach 28-dniowego protokołu.

Ilościowa ocena złączy nerwowo-mięśniowych (NMJ); obrazy mikroskopowe, schematy i wykresy słupkowe.
Rycina 2: Tworzenie NMJ w urządzeniach mikroprzepływowych. (A) Mikrografie konfokalne tworzenia NMJ w zmontowanych urządzeniach mikroprzepływowych w 28. dniu. NMJ zidentyfikowano poprzez kolokalizację (groty strzałek) markerów presynaptycznych (NEFH i SYP) oraz postsynaptycznego markera AChR (Btx) na myotubach barwionych na MyHC. NMJ zidentyfikowano morfologicznie poprzez utworzenie pojedynczych lub wielu punktów styku między neurytami a skupiskami AChR. DAPI barwi jądra komórkowe. Pasek skali, 25 µm. Wstawka przedstawia powiększenie NMJ. Pasek skali wstawki, 10 µm. (B) SEM morfologii NMJ w silikonowych urządzeniach mikroprzepływowych w 28. dniu. Groty strzałek wskazują wniknięcie neurytu w myotubę. Pasek skali, 2 µm. Wstawka przedstawia powiększenie NMJ. Pasek skali wstawki, 1 µm. (C) Ilościowa ocena całkowitej liczby NMJ na myotubę, a także liczby NMJ z pojedynczymi i wielokrotnymi punktami styku na myotubę. Wykres przedstawiono jako średnia ± błąd standardowy średniej z czterech powtórzeń biologicznych. Istotność statystyczną określono testem Mann-Whitneya, gdzie * p < 0.05. (D) Ilościowa ocena procentowego udziału uniwatorowanych myotub. Wykres przedstawiono jako średnia ± błąd standardowy średniej z czterech powtórzeń biologicznych. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Stoklund Dittlau, K. et al.18. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Eksperyment pobudzenia neuronalnego; schemat, mikroskopia fluorescencyjna, wykres funkcjonalności NMJ, wykrès kołowy.
Rysunek 3: Potwierdzenie funkcjonalności NMJ. (A) Schematyczny rysunek rejestracji przejściowego poziomu wapnia w żywych komórkach w celu oceny funkcjonalności NMJ w zmontowanych urządzeniach mikroprzepływowych w 28. dniu, przed i po blokowaniu NMJ tubokurariną (DTC)22. Neurony ruchowe w przedziale jasnozielonym są stymulowane 50 mM chlorkiem potasu (KCl), co wywołuje wewnątrzkomórkową odpowiedź neuronów ruchowych poprzez neuryty. Powoduje to napływ wapnia (Ca2+) do miotubul, które zostały znakowane barwnikiem Fluo-4 wrażliwym na wapń (przedział ciemnozielony). (B) Mikrografie fluorescencyjne Fluo-4 przedstawiające stan przed stymulacją, szczyt intensywności oraz stan po stymulacji miotubuli, obrazujące falę wzrostu wewnątrzkomórkowego wapnia po stymulacji neuronów ruchowych KCl. Wstawka przedstawia powiększenie unerwionej aktywnej miotubuli. Paski skali, 100 µm. Pasek skali wstawki, 200 µm. (C) Reprezentatywne krzywe napływu wapnia w miotubulach po stymulacji neuronów ruchowych KCl (strzałka), potwierdzające funkcjonalność NMJ. Miotubule 1-3 wykazują charakterystyczne krzywe wapnia wynikające z unerwienia neuron ruchowy-miotubula, natomiast miotubule A-C DTC przedstawiają krzywe po zablokowaniu NMJ za pomocą DTC. (D) Stosunek aktywnych miotubul stymulowanych przez neurony ruchowe do całkowitej liczby aktywnych miotubul. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie Stoklund Dittlau, K. et al.18. Ilustracje komórek zostały zmodyfikowane na podstawie Smart Server medical Art22. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina pomocnicza 1: Weryfikacja neuronów ruchowych, indeks fuzji MAB i kontrola jakości NPC.(A) Obrazy konfokalne miotub pochodnych z MAB 10 dni po rozpoczęciu różnicowania. Miotuby są znakowane markerami miotub: desminą, MyHC, miogeniną (MyoG) i tytyną. Jądra są barwione DAPI. Pasek skali, 100 µm. (B) Ilościowe oznaczenie indeksu fuzji MAB 10 dni po rozpoczęciu różnicowania. Po głodzeniu MAB łączą się w wielojądrowe miotuby, w których określono pozytywność markerów miotub (AB+). Wykres przedstawia średnią ± standardowy błąd średniej z trzech powtórzeń biologicznych. (C) Obrazy konfokalne neuronów ruchowych pochodnych z iPSC w 28. dniu różnicowania, znakowane markerami neuronów ruchowych NEFH, cholinową acetylotransferazą (ChAT) i Islet-1 oraz pan-neuronalnym markerem βIII-tubuliny (Tubulin). Jądra są barwione DAPI. Paski skali, 75 µm. (D) Ilościowe oznaczenie liczby komórek pozytywnych pod kątem markerów neuronów ruchowych i pan-neuronalnych (AB+). Wykres przedstawia średnią ± standardowy błąd średniej z trzech powtórzeń biologicznych. (E) Obrazy konfokalne NPC pochodnych z iPSC w 11. dniu różnicowania w neurony ruchowe, znakowane markerem NPC Olig2 oraz pan-neuronalnym markerem βIII-tubuliny (Tubulin). Jądra są barwione DAPI. Paski skali, 50 µm. (F) Ilościowe oznaczenie liczby NPC pozytywnych pod kątem Olig2 i βIII-tubuliny (AB+). Wykres przedstawia średnią ± standardowy błąd średniej z trzech powtórzeń biologicznych. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Stoklund Dittlau, K. et al.18. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina dodatkowa 2: Optymalizacja protokołu kokultury (A) Obrazy konfokalne tworzenia połączeń neuromięśniowych (NMJ) w 21. dniu różnicowania neuronów ruchowych, gdy MABs zostały wysiane w tym samym punkcie czasowym co NPCs w 10. dniu. NMJs zidentyfikowano poprzez ko-lokalizację (groty strzałek) markerów presynaptycznych (NEFH i SYP) oraz postsynaptycznego markera AChR (Btx) na miotubach barwionych na MyHC. Pasek skali (lewo), 10 µm. Pasek skali (prawo), 5 µm. (B) Obraz w jasnym polu kanału miotub w 24. dniu, przedstawiający spontaniczne przekraczanie miotub przez neurony ruchowe i neurity, co hamuje przywieranie MABs. Pasek skali, 100 µm. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

OdczynnikStężenie roztworu zapasuStężenie końcowe
IMDM1x80%
Płytkowa surowica cielęca15%
Penicylina/streptomycyna5000 U/ml0.5%
L-glutamina50x1%
Pirowinian sodu100 mM1%
Aminokwasy nieessentialne100x1%
insulina, transferyna, selen100x1%
bFGF (dodany świeży)50 μg/mL5 ng/ml

Tabela 1: Pożywka wzrostowa MAB. Pożywka może być przechowywana przez 2 tygodnie w temperaturze 4 °C. bFGF jest dodawany świeżo w dniu użycia.

OdczynnikStężenie roztworu roboczegoStężenie końcowe
DMEM/F1250%
Pożywka Neurobasal50%
Penicylina/Streptomycyna5000 U/ml1%
L-glutamina50x0.5 %
suplement N-2100x1%
B-27 bez witaminy A50x2%
β-merkaptoetanol50 mM0.1%
Kwas askorbinowy200 μM0.5 μM

Tabela 2: Podłoże podstawowe dla neuronów ruchowych. Podłoże może być przechowywane przez 4 tygodnie w temperaturze 4 °C.

DzieńOdczynnikStężenie roztworu zapasuStężenie końcowePrzedział
Dzień 10/11Agonista białka Smoothened10 mM500 nMOba
Kwas retinowy1 mM0.1 μM
DAPT100 mM10 μM
BDNF0,1 mg/ml10 ng/mL
GDNF0,1 mg/ml10 ng/mL
Dzień 14DAPT100 mM20 μMOba
BDNF0,1 mg/ml10 ng/mL
GDNF0,1 mg/ml10 ng/mL
Dzień 16DAPT100 mM20 μMOba
BDNF0,1 mg/ml10 ng/mL
GDNF0,1 mg/ml10 ng/ml
CNTF0,1 mg/ml10 ng/mL
Dzień 18BDNF0,1 mg/ml10 ng/mLNeuron ruchowy
GDNF0,1 mg/ml10 ng/ml
CNTF0,1 mg/ml10 ng/ml
Dzień 21+BDNF0,1 mg/ml30 ng/mLMiotubula
GDNF0,1 mg/ml30 ng/mL
CNTF0,1 mg/ml30 ng/ml
Agryna50 μg/mL0,01 μg/mL
Laminina1 mg/ml20 μg/mL
Dzień 21+Brak suplementówNeuron ruchowy

Tabela 3: Suplementy do pożywki dla neuronów ruchowych. Suplementy są dodawane na świeżo w dniu użycia do podstawowej pożywki dla neuronów ruchowych.

DzieńOdczynnikStężenie roztworu zapasowegoStężenie końcowePrzegroda
Dzień 18DMEM/F1297%MAB
Piwczan sodu100 mM1%
Surowica konia2%
Agryna50 μg/mL0.01 μg/mL

Tabela 4: Pożywka do różnicowania MAB. Pożywka może być przechowywana przez 2 tygodnie w temperaturze 4 °C. Agrinę dodaje się na świeżo w dniu użycia.

Dyskusja

Protokół opisuje stosunkowo łatwą w użyciu metodę, która generuje ludzkie jednostki motoryczne z funkcjonalnymi NMJ w dostępnych na rynku urządzeniach mikroprzepływowych w czasie krótszym niż 30 dni. Opisano, w jaki sposób NMJ mogą być oceniane morfologicznie za pomocą standardowych technik, takich jak ICC i SEM, oraz funkcjonalnie za pomocą zapisów wapnia z żywych komórek.

Dużą zaletą tego protokołu jest zastosowanie technologii komórek macierzystych. Pozwala to na pełną zdolność adaptacji, w której NMJ mogą być oceniane zarówno pod względem zdrowia, jak i choroby, niezależnie od profilu dawcy. Model okazał się już skuteczny i korzystny w badaniach nad ALS, gdzie zidentyfikowaliśmy upośledzenia w przeroscie, odrastaniu i liczbie neurytów jako nowe fenotypy spowodowane mutacjami w genie FUS 18. Dzięki temu modelowi możliwe jest rozszerzenie badań o sporadyczne postacie ALS, których etiologia jest nieznana, poprzez wykorzystanie iPSC od sporadycznych pacjentów z ALS. Daje to przewagę nad tradycyjnymi modelami zwierzęcymi, które opierają się na transgenicznej nadekspresji zmutowanych genów w celu podsumowania choroby człowieka23,24. Ponadto, nasz w pełni ludzki system pozwala na potencjalną rekapitulację specyficznej dla człowieka fizjologii i choroby. Poprzednie badania wykazały różnice między morfologią NMJ gryzoni i ludzi25, co sugeruje, że należy zachować ostrożność podczas stosowania gryzoni w celu rozwiązania patologii NMJ u ludzi. Chociaż system ten jest stosunkowo prostą konfiguracją in vitro, której brakuje złożoności modelu in vivo, udało się wykazać, że morfologia NMJ wyświetlana w urządzeniach mikroprzepływowych przypominała NMJ u ludzi po amputacji25. Co więcej, model ten pozwala na ocenę NMJ podczas powstawania i dojrzewania NMJ, potencjalnie ujawniając wczesne fenotypy choroby, które są nieobecne, niezidentyfikowane lub przeoczone w ludzkich próbkach pośmiertnych.

MAB zapewniają ważną opcję generowania miotubek, chociaż ich ograniczona przeżywalność wynosząca 10 dni jest wadą systemu. Przetrwanie miotubki zależy od ich przyczepienia się do powierzchni, która jest prawdopodobnie zagrożona przez spontaniczne skurcze włókien mięśniowych. Po ponad 10 dniach większość miotubek odłączy się, co sprawi, że kultura NMJ stanie się bezużyteczna. Idealnie byłoby, gdyby miorurki były również generowane z iPSC. Jednak obecne protokoły okazały się trudne do odtworzenia26 ze względu na zmienność indeksu fuzji 27,28,29,30.

Dzięki zastosowaniu dostępnych na rynku urządzeń mikroprzepływowych wygenerowaliśmy ustandaryzowany system, który jest w pełni dostępny. Istnieją inne modele NMJ 31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42. Jednak zazwyczaj opierają się one na pojedynczych komorach, które nie mają podziału na przedziały i izolacji płynnej między typami komórek, lub na niestandardowych naczyniach hodowlanych, co obniża dostępność, a potencjalnie także odtwarzalność. Urządzenia mikroprzepływowe wykorzystywane w tym protokole można zakupić z mikrorowkami o różnych długościach, co pozwala na dalsze analizy, takie jak transport aksonalny43,44 lub badania aksotomii 18,45,46. Płynowa izolacja między przedziałami dodatkowo umożliwia dzielenie na przedziały leczenia farmakologicznego neuronów ruchowych lub mięśniówek, co może być korzystne w rozwoju terapii. Pojawiło się więcej firm specjalizujących się w mikrofluidyce, co otworzyło się na duży wybór konstrukcji i funkcji urządzeń, co jeszcze bardziej promuje dostępność badań in vitro.

Podsumowując, opracowaliśmy protokół zapewniający niezawodną, wszechstronną i łatwą metodę hodowli ludzkich jednostek motorycznych za pomocą funkcjonalnych NMJ.

Oświadczenia

L.V.D.B. posiada patent na stosowanie inhibitorów HDAC w chorobie Charcota-Marie-Tootha (US-2013227717-A1), jest naukowym współzałożycielem Augustine Therapeutics i członkiem jej naukowej rady doradczej. Pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują Nikky Corthout i Sebastianowi Munckowi z LiMoNe, Research Group Molecular Neurobiology (VIB-KU Leuven) za ich porady dotyczące zapisów fluorescencji przejściowej wapnia w żywych komórkach. Badania były wspierane przez Komisję Fulbrighta w Belgii i Luksemburgu, KU Leuven (C1 i Fundusz "Opening the Future"), VIB, Agencję ds. Innowacji Nauki i Technologii (IWT; SBO-iPSCAF), "Fundusz Badań Naukowych Flandrii" (FWO-Vlaanderen), Target ALS, ALS Liga België (Lekarstwo na ALS), rząd belgijski (Międzyuniwersytecki Program Przyciągania Biegunów P7/16 zainicjowany przez belgijski Federalny Urząd Polityki Naukowej), Fundacja Thierry'ego Latrana oraz "Association Belge contre les Maladies neuro-Musculaires" (ABMM). T.V. i J.B. są wspierani przez stypendia doktoranckie przyznawane przez FWO-Vlaanderen.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
α-bungarotoxin (Btx) Alexa fluor 555Thermo Fisher ScientificB35451Przeciwciało (1:1000)
Kwas octowyCHEM-Lab NVCL00.0116.1000Składnik powlekający. H226, H314. Arkusz P280
Aclar 33C (arkusz SEM)Nauki o mikroskopii elektronowej50425-25Grubość: 7,8 mil
Agrin (rekombinowane białko ludzkie)R& D systems6624-AG-050Suplement medialny
Alexa fluor IgG (H+L) 488 osioł-anty królikThermo Fisher ScientificPrzeciwciało A21206(1:1000)
Alexa fluor IgG (H+L) 555 osioł-kozaThermo Fisher ScientificA21432Przeciwciało (1:1000)
Alexa fluor IgG (H+L) 555 osioł-anty myszThermo Fisher ScientificA31570Przeciwciało (1:1000)
Alexa fluor IgG (H+L) 647 osioł-anty myszThermo Fisher ScientificA31571Przeciwciało (1:1000)
Kwas askorbinowySigmaA4403Składnik podłoża
i beta; III-tubulina (Tubulina)Abcamab7751Przeciwciało (1:500)
β-merkaptoetanolSkładnik Thermo Fisher Scientific31350010Media. H317. P280.
B-27 bez witaminy AThermo Fisher Scientific12587-010Składnik pożywki
BDNF (czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego)Peprotech450-02BCzynnik wzrostu
bFGF (rekombinowany ludzki podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów)Peprotech100-18BCzynnik wzrostu
Acetylotransferaza choliny (ChAT)Przeciwciało Milliporeab144P(1:500)
Kolagen ze skóry cielęcejThermo Fisher Scientific17104019Składnik powlekający
CNTF (rzęskowy czynnik neurotroficzny)Peprotech450-13BCzynnik wzrostu
DAPI Nucblue Live Cell Stain ReadyProbesodczynnik Thermo Fisher ScientificR37605Składnik immunocytochemiczny
DAPTTocris Bioscience2634Suplement medialny
Przeciwciało DesminAbcam Ab15200(1:200)
DMEM/F12Thermo Fisher Scientific11330032Składnik podłoża
DMSOSigmaD2650-100MLSkładnik kriokonserwacji. H315, H319, H335. P280.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) firmy DulbeccoThermoFisher Scientific14190250bez wapnia, bez magnezu
EtanolVWR20.821.296Sterylizacja. H225. P280
Płodowa surowica bydlęcaThermo Fisher Scientific10270106Składnik podłoża
Fluo-4 AM barwnik z żywych komórekThermo Fisher ScientificF14201Barwnik do obrazowania wapnia
Fluorescencyjne podłoże montażoweDakoS3023Składnik immunocytochemiczny
GDNF (czynnik neurotroficzny pochodzący z linii komórek glejowych)Peprotech450-10BCzynnik wzrostu
Aldehyd glutarowyAgar ScientificR1020Składnik utrwalający. EUH071, H301, H314, H317, H330, H334, H410. P280.
Surowica dla koniThermo Fisher Scientific16050122Składnik podłoża
Ludzka fosfataza alkalicznaR& Systemy DMAB1448Oprogramowanie
obrazowaniaIH IKG
IMDMTHERMO FISHER Scientific12440053Składnik podłoża
Insulina transferyna selenThermo Fisher Scientific41400045Składnik podłoża
Przeciwciało Islet-1Milliporeab4326(1:400)
Wymiana surowicy nokautującejThermo Fisher Scientific10828-028Składnik do kriokonserwacji
Laminin z błony podstawnej mięsaka mysiego Engelbreth-Holm-SwarmSigmaL2020-1MGSkładnik powłoki i suplement podłoża
Mikroskop konfokalny Leica SP8 DMI8Mikroskopia konfokalnaLeica
L-glutaminaThermo Fisher Scientific25030-024Składnik medialny
Myogenin (MyoG)AbcamAb124800Przeciwciało (1:500)
ciężki miozyny (MyHC)Własne, przeciwciało SCIL(1:20)
Suplement N-2Thermo Fisher Scientific17502-048Składnik podłoża
Podłoże neuropodstawoweThermo Fisher Scientific21103049Powłoka i składnik podłoża
Ciężki łańcuch neurofilamentu (NEFH)AbcamPrzeciwciało AB8135(1:1000)
Mikroskop konfokalny Nikon A1RNikonMikroskopia obrazowania wapnia z żywych komórek
Oprogramowanie NIS-Elements AR 4.30.02NikonAnaliza obrazowania wapnia z żywych komórek
Aminokwasy endogenneThermo Fisher Scientific11140050Składnik podłoża
Normalna surowica osłaSigmaD9663-10MLSkładnik immunocytochemiczny
Olig2IBL18953Przeciwciało (1:1000)
Parafilm MSigmaP7793-1EASprzęt do przechowywania
ParaformaldehydThermo Fisher Scientific28908Składnik utrwalający. H302, H312, H315, H317, H319, H332, H335, H341, H350. P280.
Penicylina/Streptomycyna (5000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15070063Składnik podłoża
szalka Petriego (3 cm)nunc153066Średnica: 3 cm
szalka Petriego (10 cm)Sarstedt833.902Średnica: 10 cm
Płytka (6-dołkowa)Cellstar Greiner bio-one657160Płytka hodowlana
Pluronic F-127Thermo Fisher ScientificP3000MPRozpuszczalnik barwnikowy Fluo-4
Poli-L-ornityna (PLO)SigmaP3655-100MGSkładnik powlekający
Chlorek potasuCHEM-Lab NVCL00.1133.1000Odczynnik do obrazowania wapnia
Kwas retinowySigmaR2625Suplement mediów. H302, H315, H360FD, H410. P280.
RevitaCell suplementThermo Fisher ScientificA2644501roztwór inhibitora ROCK
Wygładzony agonistaMerch Millipore566660Suplement medialny
Bufor kakodylanu soduSigmaC0250Składnik utrwalający. H301, H331, H350, H410. P280.
Pirogronian soduLife Technologies11360-070Składnik pożywki
Synaptofizyna (SYP)Sygnalizacja komórkowaPrzeciwciało 5461S(1:1000)
Kolba T75Płytka hodowlanaSigmaCLS3276
tytynyPrzeciwciało Hybridoma Bank9D10(1:300)
Triton X-100SigmaT8787-250MLSkładnik immunocytochemiczny. H302, H315, H318, H319, H410, H411. P280
TrypLE expressThermo Fisher Scientific12605010roztwór dysocjacyjny MAB
Chlorowodorek tubocyryryny pentahydratSigmaT2379-100GBloker receptora acetylocholiny. H301. P280.
Wstępnie zmontowane urządzenie mikroprzepływowe XonaChipsXona MicrofluidicsXC150Długość mikrorowka: 150 μ m
Xona Silikonowe urządzenie mikrofluidyczneXona MicrofluidicsSND75Długość mikrorowka: 75 μ mln
do przeciwciał Analiza ICCŁańcuch : Badaniarozwojowe

Bibliografia

  1. Plomp, J. J. Neuromuscular junction physiology and pathophysiology. Myasthenia Gravis and Related Disorders. Kaminski, H. J., Kusner, L. L. , Springer International Publishing. 1-12 (2018).
  2. Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The 'dying-back' phenomenon of motor neurons in ALS. Journal of Molecular Neuroscience. 43 (3), 470-477 (2010).
  3. Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Neuromuscular synaptic vulnerability in motor neuron disease: Amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy. Neuropathology and Applied Neurobiology. 36 (2), 133-156 (2010).
  4. Rowland, L. P., Shneider, N. A. Amyotrophic lateral sclerosis. The New England Journal of Medicine. 344 (22), 1688-1700 (2001).
  5. Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: Evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185 (2), 232-240 (2004).
  6. Martineau, É, Di Polo, A., Van de Velde, C., Robitaille, R. Dynamic neuromuscular remodeling precedes motor-unit loss in a mouse model of ALS. eLife. 7, 41973(2018).
  7. Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy. Disease Models and Mechanisms. 4 (4), 457-467 (2011).
  8. Nair, G., et al. Diffusion tensor imaging reveals regional differences in the cervical spinal cord in amyotrophic lateral sclerosis. NeuroImage. 53 (2), 576-583 (2010).
  9. So, E., et al. Mitochondrial abnormalities and disruption of the neuromuscular junction precede the clinical phenotype and motor neuron loss in hFUSWT transgenic mice. Human Molecular Genetics. 27 (3), 463-474 (2018).
  10. Tallon, C., Russell, K. A., Sakhalkar, S., Andrapallayal, N., Farah, M. H. Length-dependent axo-terminal degeneration at the neuromuscular synapses of type II muscle in SOD1 mice. Neuroscience. 312, 179-189 (2016).
  11. Walker, A. K., et al. Functional recovery in new mouse models of ALS/FTLD after clearance of pathological cytoplasmic TDP-43. Acta Neuropathologica. 130 (5), 643-660 (2015).
  12. Campenot, R. B. Local control of neurite development by nerve growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4516-4519 (1977).
  13. Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
  14. Taylor, A. M., et al. Microfluidic multicompartment device for neuroscience research. Langmuir. 19 (5), 1551-1556 (2003).
  15. Guo, W., et al. HDAC6 inhibition reverses axonal transport defects in motor neurons derived from FUS-ALS patients. Nature Communications. 8 (1), 861(2017).
  16. Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature Biotechnology. 33 (1), 89-96 (2014).
  17. Giacomazzi, G., et al. Isolation of mesoangioblasts: A subset of pericytes with myogenic potential. Pericytes: Methods and Protocols. Péault, B. M. , Springer, US. 155-167 (2021).
  18. Stoklund Dittlau, K., et al. Human motor units in microfluidic devices are impaired by FUS mutations and improved by HDAC6 inhibition. Stem Cell Reports. , (2021).
  19. Afshar Bakooshli, M., et al. A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction. eLife. 8, 44530(2019).
  20. Burkin, D. J., Kim, J. E., Gu, M., Kaufman, S. J. Laminin and alpha 7 beta 1 integrin regulate agrin-induced clustering of acetylcholine receptors. Journal of Cell Science. 113 (16), 2877-2886 (2000).
  21. Zhang, B. G. X., et al. Combination of agrin and laminin increase acetylcholine receptor clustering and enhance functional neuromuscular junction formation In vitro. Developmental Neurobiology. 76 (5), 551-565 (2016).
  22. Smart Servier Medical Art. , Available from: https://smart.servier.com/ (2021).
  23. Morrice, J. R., Gregory-Evans, C. Y., Shaw, C. A. Animal models of amyotrophic lateral sclerosis: A comparison of model validity. Neural Regeneration Research. 13 (12), 2050-2054 (2018).
  24. Greek, R., Hansen, L. A. Questions regarding the predictive value of one evolved complex adaptive system for a second: Exemplified by the SOD1 mouse. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 113 (2), 231-253 (2013).
  25. Jones, R. A., et al. Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
  26. Jiwlawat, N., Lynch, E., Jeffrey, J., Van Dyke, J. M., Suzuki, M. Current progress and challenges for skeletal muscle differentiation from human pluripotent stem cells using transgene-free approaches. Stem Cells International. , 6241681(2018).
  27. Chal, J., et al. Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).
  28. vander Wal, E., et al. Large-scale expansion of human iPSC-derived skeletal muscle cells for disease modeling and cell-based therapeutic strategies. Stem Cell Reports. 10 (6), 1975-1990 (2018).
  29. Choi, I. Y., et al. Concordant but varied phenotypes among duchenne muscular dystrophy patient-specific myoblasts derived using a human iPSC-based model. Cell Reports. 15 (10), 2301-2312 (2016).
  30. Choi, I. Y., Lim, H. T., Che, Y. H., Lee, G., Kim, Y. J. Inhibition of the combinatorial signaling of transforming growth factor-beta and NOTCH promotes myotube formation progenitor cells. Cells. 10 (7), 1649(2021).
  31. Demestre, M., et al. Formation and characterisation of neuromuscular junctions between hiPSC derived motoneurons and myotubes. Stem Cell Research. 15 (2), 328-336 (2015).
  32. Guo, X., Gonzalez, M., Stancescu, M., Vandenburgh, H. H., Hickman, J. J. Neuromuscular junction formation between human stem cell-derived motoneurons and human skeletal muscle in a defined system. Biomaterials. 32 (36), 9602-9611 (2011).
  33. Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128 (6), 1241-1252 (2015).
  34. Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
  35. Lin, C. Y., et al. IPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), 124299(2019).
  36. Puttonen, K. A., et al. Generation of functional neuromuscular junctions from human pluripotent stem cell lines. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 473(2015).
  37. Umbach, J. A., Adams, K. L., Gundersen, C. B., Novitch, B. G. Functional neuromuscular junctions formed by embryonic stem cell-derived motor neurons. PLoS ONE. 7, 36049(2012).
  38. Bellmann, J., et al. A customizable microfluidic platform for medium-throughput modeling of neuromuscular circuits. Biomaterials. 225, 119537(2019).
  39. Mills, R., et al. Neurturin is a PGC-1α1-controlled myokine that promotes motor neuron recruitment and neuromuscular junction formation. Molecular Metabolism. 7, 12-22 (2018).
  40. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. 4 (10), (2018).
  41. Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose-response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
  42. Southam, K. A., King, A. E., Blizzard, C. A., McCormack, G. H., Dickson, T. C. Microfluidic primary culture model of the lower motor neuron-neuromuscular junction circuit. Journal of Neuroscience Methods. 218 (2), 164-169 (2013).
  43. Naumann, M., et al. Impaired DNA damage response signaling by FUS-NLS mutations leads to neurodegeneration and FUS aggregate formation. Nature Communications. 9 (1), 335(2018).
  44. Altman, T., Maimon, R., Ionescu, A., Pery, T. G., Perlson, E. Axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system. Journal of Visualized Experiments. (159), e60993(2020).
  45. Nijssen, J., Aguila, J., Hoogstraaten, R., Kee, N., Hedlund, E. Axon-seq decodes the motor axon transcriptome and its modulation in response to ALS. Stem Cell Reports. 11 (6), 1565-1578 (2018).
  46. Melamed, Z., et al. Premature polyadenylation-mediated loss of stathmin-2 is a hallmark of TDP-43-dependent neurodegeneration. Nature Neuroscience. 22 (2), 180-190 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Choroby neuron w ruchowychtechnologia kom rek macierzystychludzkie miotubyr nicowanie neuron w ruchowychobrazowanie wapniamarker synaptofizynyreceptor acetylocholiny
Generacja jednostek motorycznych człowieka z funkcjonalnymi połączeniami nerwowo-mięśniowymi w urządzeniach mikroprzepływowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.