Kriosekcja strefy podwyściółkowej dorosłego osobnika w celu dokładnej i głębokiej ilościowej analizy proteomu

Ponieważ neurogeneza jest ograniczona w mózgu dorosłego, różne strategie naprawy ośrodkowego układu nerwowego znacznie skorzystałyby na lepszym zrozumieniu podstaw wymiany neuronów u dorosłych. Gryzonie pomogły nam zrozumieć podstawowe mechanizmy neurogenezy poporodowej, chociaż należy zauważyć, że neurogeneza dorosłych jest w dużym stopniu zależna od gatunku. U myszy istnieją trzy nisze dorosłych nerwowych komórek macierzystych (NSC). Podwzgórze jest niszą NSC dla dorosłych o potencjale neurogennym^1,2, podczas gdy ciągła neurogeneza dorosłych jest głównie ograniczona do hipokampa³ i SSE bocznych ścian komór bocznych^4,5,6. SSE jest największym regionem rozrodczym zawierającym NSC (komórki typu B), które przekształcają się w neuroblasty (komórki typu A) za pośrednictwem komórek progenitorowych wzmacniających tranzyt (komórki typu C). SSE zawiera 20-35% komórek typu B, 1-15% komórek typu C, 1-30% komórek typu A i 25-50% komórek wyściółki⁷. SSE charakteryzuje się złożoną mikroarchitekturą, z komórkami śródbłonka, komórkami mikrogleju i komórkami wyściółki znajdującymi się w niszy komórek macierzystych i wpływającymi na nią^8,9,10. Chociaż neurony są rzadkie w SSE, aksony emanujące z odległych źródeł, takich jak prążkowie, brzuszny obszar nakrywki lub podwzgórze, docierają i wpływają na komórki typu B⁴. Unikalną cechą tej niszy komórek macierzystych jest oddzielenie miejsca proliferacji od miejsca różnicowania. Po proliferacji neuronalne komórki progenitorowe migrują na kilka milimetrów z SSE do opuszki węchowej, gdzie ostatecznie różnicują się w neurony i integrują się z istniejącymi wcześniej obwodami neuronalnymi. Badania nad wewnętrznymi programami komórkowymi związanymi z neurogenezą dostarczyły już wiedzy ważnej dla eksperymentalnych terapeutycznych strategii przeprogramowania i przeszczepiania komórek^{15,16,17,18,19,20}. Jednak sygnały zewnętrzne komórki również regulują neurogenezę, a środowisko tkankowe może determinować neurogenny los komórek macierzystych^{11,12,14,21,22,23}. W związku z tym kluczowe znaczenie ma badanie mikrośrodowiska nisz neurogennych i jego interakcji z komórkami macierzystymi.

Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) i inne wydzielane białka stanowią dużą część mikrośrodowiska. Do dokładnej identyfikacji i kwantyfikacji podejście proteomiczne jest lepiej odpowiednie niż podejście transkryptomiczne do określenia składu ECM ze względu na niską korelację między transkryptomem a poziomami białka dla ECM^24,25. Ponadto istnieją istotne dowody na to, że niszowe regulatory w SSE nie są wytwarzane wyłącznie przez komórki zasiedlające samą niszę. Bardziej odległe miejsca, takie jak splot naczyniówkowy, wydzielają sygnały modulacyjne przekazywane do komórek macierzystych za pośrednictwem płynu mózgowo-rdzeniowego^22,23. Badanie proteomu niszowego może pomóc w identyfikacji regulatorów niszowych obecnych w nisze niezależnie od ich miejsca produkcji, biorąc pod uwagę, że znaczna część mikrośrodowiska zewnątrzkomórkowego jest składana przez białka.

Aby pobrać mysią strefę komorową do bezstronnej analizy proteomicznej, wymagana jest metoda o wysokiej precyzji, polegająca na uchwyceniu cienkiej wstęgi przykomorowej o grubości ok. 50 μm zawierającej komórki macierzyste, z wyłączeniem tkanki sąsiedniego prążkowia. Co więcej, zaburzenia tkanek podczas sekcji muszą być zminimalizowane w celu analizy mikrośrodowiska zewnątrzkomórkowego, ponieważ rozpuszczalne białka, w tym czynniki wzrostu lub cytokiny, mogą być łatwo wypłukiwane. Chociaż możliwa jest analiza widm masowych utrwalonej tkanki, wymagany środek, taki jak paraformaldehyd, zmniejszy głębokość identyfikacji białka i może wprowadzić modyfikacje potranslacyjne. Powszechna selekcja SSE, np. w celu pobrania komórek do analizy sortowania komórek aktywowanej fluorescencją, usuwa całą SSE za pomocą nożyczek²⁶. Ta standardowa sekcja jest szybka przy minimalnych zaburzeniach tkanek. Nie można jednak uniknąć zanieczyszczenia prążkowia próbek. I odwrotnie, LCM ma wyjątkową zaletę w postaci doskonałej precyzji precyzji sekcji. Jednak LCM może powodować zaburzenia tkanek, na przykład z powodu barwienia tła lub denaturacji białek spowodowanej laserem. Aby połączyć mocne strony rozwarstwienia całego układu i LCM, opracowano nowatorską metodę kompatybilną ze stwardnieniem rozsianym, zwaną kriosekcją (CSD) (Rysunek 1A-D). CSD umożliwia ekstrakcję SSE i rozwarstwienie SSE przyśrodkowych ścian komór bocznych (MEZ), które są idealnym, w większości nieneurogennym regionem kontrolnym dla SSE (patrz protokół). Niszowy proteom uzyskany w wyniku połączenia CSD i najnowocześniejszych metod MS okazał się przydatny do charakterystyki i identyfikacji nowych regulatorów w tej niszy dla dorosłych NSC²⁵. W związku z tym metoda ta będzie przydatna do określenia składu białkowego tkanek SSE.

Wszystkie procedury eksperymentalne w tym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Niemiec i Unii Europejskiej i zostały zatwierdzone przez instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz rząd Górnej Bawarii (Regierung von Oberbayern). Do eksperymentów wykorzystano tylko samce myszy C57Bl6 w wieku 8-10 tygodni.

1. Przygotowanie mózgu myszy (~ 15 min na mysz)

1. Przygotuj pożywkę preparacyjną, dodając 5 ml 1 M HEPES (końcowe stężenie 10 mM) do 500 ml 1x Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS).
   UWAGA: Czas przechowywania pożywki preparacyjnej (+4 °C) nie powinien przekraczać 2 tygodni.
2. Poświęć myszy przez zwichnięcie szyjki macicy i ostrożnie przeprowadź sekcję mózgu.
   UWAGA: Podczas badania ECM zaleca się, aby tkanka była niezmodyfikowana. Zwichnięcie szyjki macicy sprawia, że czas rozwarstwienia jest jak najkrótszy, zapobiegając w ten sposób w jak największym stopniu autotrawieniu enzymatycznemu po śmierci. Jeśli usunięcie krwi ma kluczowe znaczenie dla pytania badawczego, po prostu wykonaj transfuzję myszy za pomocą soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przed usunięciem mózgu.
3. Wyodrębnij mózg przez ręczną sekcję i umieść go w naczyniu hodowlanym zawierającym lodowato pożywkę do preparacji (Rysunek 1B - 1).
   UWAGA: Trzymaj mózgi w podłożu preparacyjnym na lodzie przez cały czas sekcji.
4. Usuń opuszkę węchową (OB) za pomocą skalpela (Ryc. 1B - 2) za pomocą prostego cięcia koronalnego między OB a przednim biegunem kory.
5. Usuń przedni biegun kory za pomocą skalpela, używając cięcia koronalnego, aby boczne komory były widoczne w płaszczyźnie koronalnej (Rysunek 1B - 3).
   UWAGA: Upewnij się, że cięcie koronalne jest wykonane ~5 mm rostralnie od skrzyżowania wzrokowego; w przeciwnym razie część rostralna SSE/MEZ zostanie utracona.
6. Za pomocą nożyczek otwórz obie boczne komory od góry, zaczynając od odcinka strzałkowego od powierzchni kory do światła komory, i wydłuż to cięcie w kształcie litery C zgodnie ze zgięciem komory (Rysunek 1B - 4).
7. Połącz końce ogonowe lewego i prawego nacięcia strzałkowego za pomocą dodatkowego cięcia koronalnego nożyczkami.
   UWAGA: Trzy nacięcia tworzą teraz trapez i ułatwią usunięcie kory i ciała modzelowatego w następnym kroku.
8. Usuń korę i ciało modzelowate pokrywające komory boczne za pomocą kleszczy (Rysunek 1B - 5). Następnie usuń korę i ciało modzelowate, które pokrywają ściany przyśrodkowej komory. Tutaj wykonaj dodatkowe nacięcia, jeśli tkanka jest przyczepiona do ścian komory przyśrodkowej, lub po prostu podnieś korę i ciało modzelowate nożyczkami, aby usunąć tkankę.
9. Ostrożnie rozłóż ściany komór za pomocą kleszczy (Rysunek 1B - 6). Usuń splot naczyniówkowy za pomocą kleszczy.
   UWAGA: Całkowite usunięcie splotu naczyniówkowego jest ważne, aby uniknąć zakłóceń w następujących etapach sekcji i uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia próbek z SSE/MEZ.
10. Umieść mózg na szklanym szkiełku i umieść szklane szkiełko na suchym lodzie, aby zamrozić mózg. Utrzymuj ściany komór w konfiguracji otwartej.
    UWAGA: Należy zapewnić wystarczającą odległość między bocznymi i przyśrodkowymi ścianami komory, aby ułatwić precyzyjną i wyłączną sekcję SEZ i MEZ. Jeśli tkanka skurczy się z powrotem do zamkniętej konfiguracji, użyj kleszczy, aby przymocować ścianki w żądanej pozycji podczas zamrażania. Unikanie uszkodzeń SSE/MEZ. Spróbuj przyłożyć minimalną siłę, głównie na górną krawędź otwartych komór.

2. Podział przygotowanego mózgu (~ 15 min na mysz)

1. Wytnij odcinki koronalne mózgu o grubości 50-100 μm do końca komory bocznej za pomocą kriostatu i zamontuj skrawki na szkiełkach podstawowych. Upewnij się, że mózg jest przymocowany do płytki mocującej kriostat w tyłomózgowiu za pomocą pożywki OCT i że żaden OCT nie styka się z przodomózgowiem, zwłaszcza w komorach.
   UWAGA: Pożywka OCT będzie zakłócać pomiary MS. Jeśli jednak tkanka zostanie wykorzystana do testu na przeciwciała, nie ma potrzeby wykluczania pożywki OCT. Nie zaleca się stosowania szkiełek z szkła powlekanego. Szkiełka powlekane wywierają zbyt dużą siłę adhezyjną na tkankę, utrudniając w ten sposób przemieszczanie się próbki tkanki z szkiełek do probówki mikrowirówkowej w kolejnych krokach.

3. Sekcja z wolnej ręki wycinków mózgu (~ 30 min na mysz)

1. Umieść szkiełka podstawowe z wycinkami mózgu na suchym lodzie pod mikroskopem preparacyjnym (Rysunek 1C - 1).
2. Przygotuj probówki do mikrowirówek na suchym lodzie i upewnij się, że probówki pozostają na suchym lodzie przez co najmniej 1 minutę, aby były wystarczająco zimne przed przeniesieniem próbki.
   UWAGA: Używaj probówek do mikrowirówek wysokiej jakości, ponieważ niektóre probówki niskiej jakości mogą zrzucać plastik na kolejnych etapach trawienia tkanek związanych z pomiarami MS.
3. Podnieś plastry z suchego lodu na 15-30 s, aby uzyskać krótkie, niepełne rozmrożenie i sprawić, że zwarta mielina prążkowia będzie widoczna jako gęste białe kropki.
   UWAGA: Zlokalizowanie granicy między SSE a prążkowiem staje się wykonalne (Rysunek 1C - 2, patrz Rysunek 2A dla wykluczenia mieliny i porównania z metodą wholemount). Jeśli rozmrażanie trwa zbyt długo, proces ten można przyspieszyć, naciskając palec pokryty rękawicą na przeciwną stronę szkiełka podstawowego. Jednak ten manewr należy ćwiczyć, ponieważ łatwo dochodzi do nadmiernego rozmrażania.
4. Oddzielić SSE za pomocą wstępnie schłodzonego skalpela od sąsiedniego prążkowia (Rysunek 1C,D).
5. Przenieś SSE jako cały kawałek lub podzielony na 2-4 części do probówki mikrowirówkowej za pomocą krawędzi schłodzonego skalpela. Jeżeli tkanka ma być wykorzystana do innego rodzaju analizy niż stwardnienie rozsiane, należy przenieść próbkę tkanki do odpowiedniego pojemnika (np. płytki 96-dołkowej).
   UWAGA: Przecięcie całkowicie zamrożonej tkanki może doprowadzić do jej szybkiego oderwania się i odpadnięcia ze szkiełka. Przecięcie całkowicie rozmrożonej tkanki prowadzi do rozpadu tkanki. Upewnij się, że tkanka nie jest ani całkowicie zamrożona, ani całkowicie rozmrożona.

Podczas wykonywania powyższych kroków, próbki tkanek w probówkach do mikrowirówek są gotowe i kompatybilne z przygotowaniem próbki MS. Po przygotowaniu próbki uzyskaliśmy ~5-7 μg peptydów na próbkę SSE lub MEZ na mysz. Jednak ostateczne ilości peptydów mogą zależeć od metody przygotowania SM. W poniższych porównaniach proteomu głębokość identyfikacji białek i kwantyfikacji (500-1000 białek na próbkę) została zwiększona poprzez obliczeniowe dopasowanie widm peptydów do bibliotek widm peptydowych utworzonych dla każdego regionu tkanki25,27. Warto zauważyć, że bezstratna metoda nanofrakcjonowania zastosowana tutaj do tworzenia bibliotek widm peptydowych nie jest obecnie dostępna na rynku. Surowe dane MS zostały przeanalizowane za pomocą oprogramowania MaxQuant28, osiągając dokładność masy w zakresie części na miliard29. Środowisko Max Quant umożliwia dopasowywanie między przebiegami MS. Obfitość białka określono ilościowo za pomocą algorytmu kwantyfikacji bez znaczników30. Barwienie immunohistochemiczne przeprowadzono na świeżo zamrożonych tkankach i przeprowadzono zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami25 (patrz Tabela Materiałów).

Sekcja kriogeniczna<br /> Pełne SSE i MEZ dorosłych myszy (n = 4) uzyskano przy użyciu CSD (patrz Rysunek 1 i protokół). Korę somatosensoryczną (Cx) wycięto nożyczkami chirurgicznymi. Dodatkowe 4 myszy zostały wypreparowane w ten sam sposób; Jednak wypreparowana tkanka została połączona w jedną próbkę na region, aby utworzyć bibliotekę proteomu (10 923 zidentyfikowanych białek) w celu zwiększonej identyfikacji białek i kwantyfikacji w poszczególnych próbkach25. W czterech pojedynczych próbkach (średnia ± SD) oznaczono ilościowo 6 673 ± 317,4 białek w SSE i 6 747 ± 37,7 w MEZ. Wszystkie dane proteomiczne MS zostały zdeponowane w konsorcjum ProteomeXchange za pośrednictwem repozytorium partnerskiego PRIDE31, a numer dostępu dla zgłoszonych tutaj proteomów to ProteomeXchange: PXD016632 (http://proteomecentral.proteomexchange.org).

Porównanie do pełnej sekcji wierzchowców
Sekcja Wholemount została przeprowadzona zgodnie ze standardowym protokołem26. Analiza metodą wholemount wykazała podobną liczbę białek (około 6 000 dla SSE i 6 000 dla Cx, n = 4 na grupę) w porównaniu do CSD25. Jednym z zamierzonych usprawnień wynikających z zastosowania CSD na terenie SSE, zamiast protokołu pełnej sekcji, jest zmniejszenie potencjalnego zanieczyszczenia prążkowia. W próbkach SSE zanieczyszczonych tkanką z innego regionu wykryte białka kandydujące nie mogą być przypisane do regionu, ponieważ znaczne wzbogacenie może wynikać z obszaru zainteresowania i substancji zanieczyszczającej. Immunohistochemicznie, dodatnie, bogate w mielinę wewnętrzne kapsułki prążkowia związane z glikoproteiną mieliny (MAG) zidentyfikowano w próbkach całościowych, ale rzadko w próbkach CSD (Figura 2A). Zanieczyszczenie prążkowia w całych próbkach można potwierdzić, identyfikując wzbogacenie białek mieliny w SSE w porównaniu z próbkami istoty szarej (GM) kory somatosensorycznej (Cx) (Rysunek 2B). Zauważ, że duże części Cx GM, zwłaszcza górne warstwy Cx, są niezmielinizowane32.

Ponieważ duże wiązki włókien przechodzą przez prążkowie, zanieczyszczenie tym regionem spowodowało wzbogacenie białek mieliny w porównaniu do Cx. Białkami mieliny stosowanymi jako markery zanieczyszczenia prążkowia w próbkach SSE były zasadowe białko mieliny (MBP), glikoproteina związana z mieliną (MAG), białko proteolipidowe 1 (Plp1) i 2',3'-cykliczny nukleotyd 3'-fosfodiesterazy (Cnp). Wszystkie białka markerów mielinowych zostały znacznie wzbogacone w SSE w porównaniu z Cx. I odwrotnie, porównania dla czterech białek markerów mielinowych w zestawie danych CSD nie przyniosły istotnych różnic przy porównaniu SEZ z Cx (Figura 2B). Dane proteomiczne klasy striatum33 potwierdzają hipotezę, że wzbogacenie białek mieliny w próbkach SSE z rozbioru całego rostoku było spowodowane zanieczyszczeniem tkanką prążkowia. W związku z tym CSD w dużej mierze zapobiegał zanieczyszczeniu przez tkankę prążkowia (bogatą w zwartą mielinę) w porównaniu z rozwarstwieniem całościowym.

Bezstronna analiza proteomu niezdysocjowanej tkanki może ujawnić interesujące białka zewnątrzkomórkowe. Dzięki ulepszonej sekcji za pomocą CSD, białka związane z zewnątrzkomórkami zostały znacznie wzbogacone w próbkach w porównaniu z próbkami całymi (Rysunek 2C, test wzbogacania adnotacji). CSD i rozwarstwienie całościowe wykazują porównywalne wzbogacenie terminów ontologii genów (GO) "egzosom pęcherzykowy zewnątrzkomórkowy" i "część regionu zewnątrzkomórkowego". Jednak termin GO "związany z matrysomem" jest nieco bardziej wzbogacony w CSD niż w rozbiorze całkowitym. W związku z tym enzym wiążący krzyżowo ECM i niedawno odkryty regulator neurogenezy transglutaminaza-2 (Tgm2) okazały się wzbogacone w SSE w porównaniu z Cx przy użyciu klasy CSD25. Natomiast nie stwierdzono różnicy między próbkami SSE i Cx uzyskanymi metodą rozbioru całego wierzchu (Rysunek 2D). Dane proteomiczne prążkowia33 wspierają hipotezę, że wykrycie regulatora neurogenezy Tgm2 przez całkowite rozwarstwienie było utrudnione przez zanieczyszczenie tkanką prążkowia. W związku z tym, ogólnie rzecz biorąc, kriosekcja jest udanym, ale także niezbędnym ulepszeniem standardowej sekcji do analizy proteomu specyficznej dla niszy.

Porównanie do mikroskopii laserowej
Przednią połowę SSE i MEZ 3 dorosłych myszy uzyskano dla LCM (Rysunek 3A). Ogólnie rzecz biorąc, metoda LCM ma pewne wady, szczególnie w odniesieniu do zaburzeń tkanek i wydajności. Aby uwidocznić obszar zainteresowania pod mikroskopem preparacyjnym, konieczne jest barwienie tła, potencjalnie zmywające małe lub rozpuszczalne białka będące przedmiotem zainteresowania, np. czynniki wzrostu, cytokiny lub regulatory ECM, takie jak enzymy. Co więcej, szkiełka spędzają różny czas w temperaturze pokojowej podczas usuwania laserowego. Co więcej, sam laser może denaturować interesujące nas białka.

CSD ma znaczną przewagę nad LCM pod względem czasu i wysiłku niezbędnego do przeprowadzenia sekcji: krok 1 protokołu musi być wykonany podobnie zarówno dla CSD, jak i LCM; bez tego kroku ściany komór pozostają przylegające, co utrudnia rozdzielenie próbek MEZ i SSE. Biorąc pod uwagę, że przekroje CSD (100 μm) są 6-7 razy grubsze niż maksymalna grubość34 przekrojów LCM (15 μm), krok 2 (przekrój mózgu) i krok 3 (usunięcie MEZ i SSE z każdej sekcji koronalnej) zajmie co najmniej 6-7 razy więcej czasu dla LCM. Niezbędne barwienie tła i ustawienie mikroskopu laserowego pochłonie dodatkowy czas. W tym przypadku pozyskanie 50% SSE i MEZ 3 zwierząt przez LCM zajęło trzy razy więcej czasu w porównaniu do 100% SSE i MEZ wynoszących 4 zwierzęta przez CSD, co stanowi ośmiokrotną przewagę prędkości CSD. Podsumowując, LCM nie tylko wymaga znacznego dodatkowego wysiłku, ale tkanka jest również poddawana znacznie dłuższemu okresowi manipulacji i zmian temperatury, które mogą zagrozić dynamice i wiarygodności danych generowanych przez późniejszą analizę.

Wyniki MS CSD zostały porównane z wynikami mikrodysekcji laserowej (LCM). Oba zestawy danych dopasowano do biblioteki proteomicznej wygenerowanej przez łączenie próbek CSD. Średnio LCM dał 3 441 ± 270,0 i 3 613 ± 238,7 pojedynczych białek odpowiednio w SSE i strefie przyśrodkowej komory (Figura 3B). Biorąc pod uwagę niezwykłą różnicę w identyfikacji białka, analiza głównych składowych (PCA) wykazała wyraźną separację zgodnie z metodą rozbioru (składnik 1: 62,7%, nie pokazano). Komponent 2 wykazał największą separację dla SSE i MEZ spośród próbek LCM (8,5%, Rysunek 3C). Komponent 3 również wydaje się oddzielać LCM i CSD; Różnica ta może jednak wynikać z różnic opartych na metodzie, a nie z liczby zidentyfikowanych białek (6,4%). Niemniej jednak, ogólna separacja regionalna pozostała uderzająco wyraźna dla danych z kriodysekcji i znacznie lepsza niż dla LCM. Ta rozbieżność w dynamice danych może wynikać z różnych czasów spędzonych przez próbki w temperaturze pokojowej podczas sekcji laserowej lub większej podatności małych tkanek na zmienność w późniejszych protokołach proteomicznych i pomiarach spektrometrii mas.

Aby wyszukać różnice w profilu proteomu ECM, przeprowadzono test wzbogacania adnotacji 2D między CSD a LCM dla SSE i MEZ (Rysunek 3D). Obliczanie względnego wzbogacenia warunków GO między próbkami LCM i CSD pozwala na porównanie względnej dynamiki proteomu klastrów białek ECM między obiema metodami, pomimo nierównej ilości tkanki i różnic w protokole sekcji. Wykresy ujawniają dobrą korelację między LCM a CSD. Adnotacje "część regionu zewnątrzkomórkowego" i "organelle związane z błoną zewnątrzkomórkową" są podobnie wzbogacone zarówno w metodach, jak i regionach. W związku z tym wydaje się, że zwiększone zapotrzebowanie czasowe LCM nie jest kompensowane przez stosunkowo wyższą wrażliwość na białka związane z ECM. Zamiast tego CSD zapewnia bardziej solidną identyfikację/kwantyfikację podczas porównywania danych próbki dla neurogenezy i białek ECM związanych z SEZ: Tgm2, Trombospondin-4 (Thbs4), S100a6 i Tenacin-C (Tnc) (Rysunek 3E). W przypadku TnC, mimo że określono ilościowo we wszystkich próbach, tylko CSD wykazał wzbogacenie dla SSE w porównaniu z MEZ. Niemniej jednak, białka błony podstawowej związane z SSE Nidogen-1 (Nid1), podjednostka beta-2 Lamininy (Lamb2) i białko rdzeniowe proteoglikanu siarczanu heparanu specyficzne dla błony podstawnej (Hspg2)35 wykazały jeszcze silniejsze wzbogacenie w SSE (w porównaniu z MEZ) w próbkach LCM niż w próbkach CSD (nie pokazano). W związku z tym CSD może dostarczyć próbki tkanek, które zapewniają dokładny i głęboki proteom ilościowy do charakterystyki SSE w rozsądnych ramach czasowych, bez obaw o naruszenie integralności tkanek lub utratę białka.

Statystyki
Testy statystyczne, testy wzbogacania adnotacji 2D i PCA zostały przeprowadzone w środowisku Perseus. Białka włączono do analizy, jeśli wykryto prawidłową wartość dla każdej metody w co najmniej jednej próbce. Liczebność białek i porównania liczbowe zostały zwizualizowane za pomocą oprogramowania do analizy danych (patrz tabela materiałów). Do porównań białek zastosowano opartą na permutacjach kontrolę wskaźnika fałszywych odkryć (FDR) (FDR ustawiono na 0,05, 250 randomizacji). W przypadku testów wzbogacania adnotacji 2D36, wyświetlane warunki GO są znacznie wzbogacone (FDR został ustawiony na 0,02 przy użyciu metody kontroli FDR Benjaminiego-Hochberga).

Rysunek 1: Metoda kriosekcji. (A) Przegląd obszaru zainteresowania: komora boczna z neurogenną SSE i nieneurogenną MEZ. Neuroblasty barwione immunologicznie za pomocą Dcx. (B) Stopniowe usuwanie OB, bieguna przedniego, kory i ciała modzelowatego powyżej komór i splotu naczyniówkowego: 1. umieszczenie w podłożu preparacyjnym, 2. usunięcie OB, 3. usunięcie przedniego bieguna kory, 4. strzałkowe nacięcia wierzchołka komory, 5. usunięcie wierzchołka komory, 6. Rozprzestrzenianie się ścian komór. (C) 100 μm wycinki koronalne świeżo zamrożonego mózgu myszy, (1.) przed i (2.) po usunięciu ścian komór za pomocą lodowatego skalpela. Podziałka = 4 mm (D) Zabarwienie odcinka czołowego komory bocznej (GFAP: zielony; DAPI: niebieski), przedstawiający SSE i MEZ podzielone na CSD. Podziałka = 300 μm (A), 200 μm (D). Skróty: CSD = kriosekcja rozwarstwienia; SSE = strefa podwyściółkowa; MEZ = strefa wyściółki przyśrodkowej; Dcx = Podwójna kortyna; OB = opuszka węchowa; GFAP = kwaśne białko fibrylarne glejowe; DAPI = 4′,6-diamidyn-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Wyższa precyzja precyzji przy kriosekcji w porównaniu do sekcji całkowitego. (A) Obraz immunohistochemiczny próbki SSE uzyskanej metodą rozwarstwienia całego (po lewej). Włączenie bogatej w mielinę tkanki prążkowia jest wizualizowane przez barwienie na MAG (zielony). Barwienie SSE wyciętego za pomocą CSD (po prawej). W CSD prawie cała mielina prążkowia (barwienie na tle MAG, kolor zielony) jest wyłączona ze wstęgi próbki. Jądra wizualizowano za pomocą DAPI (kolor niebieski). (B) Porównanie wzbogacenia markerów mielinowych w SSE vs. Cx z wholemount (MBP: p = 0,0074; MAG: p = 0,0016; Plp1: p = 0,0011; CNP: p = 0,0029) i CSD (MBP: p = 0,0667; MAG: p = 0,0236; Plp1: p = 0,3420; CNP: p = 0,1842). (C) Test wzbogacania adnotacji 2D porównujący całą SSE z próbkami CSD-SSE. Terminy GO przestrzeń pozakomórkowa i związane z Matrisomem są bardziej wzbogacone w danych CSD niż w danych całych. (D) Obfitość białka regulatora NSC Tgm225 wykreślona dla pełnej sekcji i CSD. Tgm2 jest znacznie wzbogacony w SSE w porównaniu do Cx w CSD (CSD: p = 0,0029; Całość: p = 0,1775). Dla B i D: Jako odniesienie, dane proteomu z Sharma et al.33 z pomiarami prążkowia i kory wykreślonymi dla odpowiednich białek wyświetlanych w próbkach wholemount i CSD. Podziałka = 200 μm (A). Skróty: CSD = kriosekcja rozwarstwienia; SSE = strefa podwyściółkowa; MAG = glikoproteina związana z mieliną; Cx = kora somatosensoryczna; MBP = podstawowe białko mieliny; Plp1 = białko proteolipidowe 1; CNP = 3'-fosfodiesteraza 2',3'-cyklicznego nukleotydu; GO = ontologia genów; NSC = nerwowa komórka macierzysta; Tgm2 = tranglutaminaza 2; DAPI = 4′,6-diamidyn-2-fenyloindol; LFQ = oznaczanie ilościowe bez etykiety. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Lepsza kwantyfikacja białek zewnątrzkomórkowych za pomocą kriosekcji-rozwarstwienia w porównaniu do LCM. (A) Barwienie kresylofioletowe komory bocznej przed i po laserowym przechwyceniu SSE i MEZ (po lewej). Dla porównania, nacięcie CSD SSE i MEZ (po prawej). Podziałka = 150 μm. (B) Porównanie liczby wykrytych białek w próbkach SSE i MEZ z CSD i LCM. Dane przedstawiono jako średnią ± SD. (C) Analiza głównych składowych próbek SSE i MEZ porównująca CSD i LCM (składowa 2: 8,5% wariancji; składowa 3: 6,4%). (D) Wzbogacanie adnotacji 2D w sekcji kriogenicznej i laserowej MEZ (na górze) i SSE (na dole). Terminy GO organelle zewnątrzkomórkowe i część obszaru zewnątrzkomórkowego są znacznie wzbogacone (czerwone kropki). (E) Liczebność zewnątrzkomórkowych białek markerowych związanych z SSE w SSE i MEZ dla LCM (Tnc: p = 0,3789) i próbek CSD (Tgm2: p = 0,2940; S100a6: p = 0,0218; THBS4: p = 0,3941; Tnc: p = 0,0004). Skróty: CSD = kriosekcja rozwarstwienia; LCM = mikrodysekcja wychwytywania laserowego; SSE = strefa podwyściółkowa; MEZ = strefa wyściółki przyśrodkowej; GO = ontologia genów; Tnc = Tenacyna-C; Tgm2 = transglutaminaza 2; S100a6 = S100 białko wiążące wapń A6; THBS4 = trombospondyna-4; LFQ = oznaczanie ilościowe bez etykiety. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów