Artykuł metodologiczny

Zintegrowany zestaw narzędzi do analizy sygnałów komórkowych: sił, ruchu, morfologii i fluorescencji

DOI:

10.3791/63095

⸱

5 marca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Sciences, Pat Capps Covey College of Allied Health Professions, University of South Alabama, 2Department of Physiology and Cell Biology, College of Medicine, University of South Alabama, 3Center for Lung Biology, College of Medicine, University of South Alabama, 4William B. Burnsed Jr. Mechanical, Aerospace, and Biomedical Engineering Department, College of Engineering, University of South Alabama, 5Mitchell Cancer Institute, College of Medicine, University of South Alabama, 6Department of Chemical and Biomedical Engineering, West Virginia University, 7Department of Pharmacology, College of Medicine, University of South Alabama, 8Department of Physiology & Pharmacology, College of Osteopathic Medicine, Sam Houston State University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Platforma iTACS (Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals) automatyzuje proces jednoczesnego pomiaru szerokiej gamy sygnałów chemicznych i mechanicznych w przylegających komórkach. iTACS został zaprojektowany, aby ułatwić rozwój kierowany przez społeczność i umożliwić naukowcom korzystanie ze wszystkich funkcji platformy, niezależnie od ich wykształcenia.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ilościowa ocena sił i ruchu komórkowego znacznie się rozwinęła w ciągu ostatnich czterech dekad. Postępy te stworzyły ramy do badania wnikliwych procesów sygnalizacji mechanicznej w systemach hodowli komórkowych. Jednak dziedzina ta boryka się obecnie z trzema problemami: brakiem standaryzacji jakości pozyskiwanych danych, błędami technicznymi w analizie i wizualizacji danych, a co być może najważniejsze, technologia pozostaje w dużej mierze poza zasięgiem powszechnych laboratoriów biologii komórki. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowaliśmy nową platformę eksperymentalną - Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals (iTACS). iTACS składa się z dwóch komponentów: Modułu Akwizycji i Szkolenia (AcTrM) oraz Modułu Analizy i Wizualizacji (AnViM). AcTrM jest oparty na μManager - oprogramowaniu sterującym mikroskopem opartym na NIH-ImageJ - i ułatwia użytkownikom samodzielne szkolenie i automatyzację popularnych protokołów akwizycji obrazów. AnViM jest oparty na NIH-ImageJ i ułatwia przyjazną dla użytkownika automatyzację analizy danych oraz wnikliwą wizualizację wyników. Eksperymenty te polegają na hodowli przylegających komórek na hydrożelach, obrazowaniu markerów odniesienia osadzonych w hydrożelu, a na końcu wydobyciu z tych obrazów kompleksowej charakterystyki mechanicznej komórek. Obecnie iTACS umożliwia użytkownikowi analizowanie i śledzenie szerokiego zakresu właściwości, w tym morfologii, ruchu, sił cytoszkieletu oraz fluorescencji poszczególnych komórek i ich sąsiedniego regionu. Problem ze standaryzacją jakości został rozwiązany w AcTrM za pomocą referencyjnej techniki ponownego ustawiania ostrości sterowanej obrazem. Problemy techniczne związane z analizą danych zostały rozwiązane w AnViM za pomocą wielotorowej procedury segmentacji obrazu, przyjaznego dla użytkownika podejścia do identyfikacji warunków brzegowych oraz nowatorskiej wizualizacji danych opartej na właściwościach komórkowych. AcTrM został zaprojektowany, aby ułatwić prostą transformację podstawowych mikroskopów fluorescencyjnych w eksperymentalne urządzenia do mechaniki komórek, a AnViM jest wyposażony w narzędzia umożliwiające użytkownikom pomiar komórkowych sygnałów mechanicznych bez konieczności posiadania wiedzy inżynierskiej. iTACS będzie dostępny dla społeczności naukowej jako pakiet typu open source z możliwościami rozwoju kierowanymi przez społeczność.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powszechnie używane narzędzia do obrazowania optycznego i analizy danych wykorzystują technologie sprzętowe i programowe, które są prawie przestarzałe. Opóźnienie w translacji i wdrażaniu postępów w urządzeniach elektronicznych, podejściach obliczeniowych i analizie matematycznej do powszechnych eksperymentalnych narzędzi biologii komórki jest głównym ograniczeniem tempa wzrostu naszej wiedzy o fizjologii komórki. Obecnie naukowcy zajmujący się biologią komórkową uważają, że narzędzia biologii molekularnej są w zasięgu, ale narzędzia oparte na zasadach inżynierii są poza ich zasięgiem. Jednym z takich narzędzi opartych na zasadach inżynierii jest jednowarstwowa mikroskopia naprężeń (MSM)1,2. Chociaż MSM został zaadaptowany i przebadany w różnych laboratoriach na całym świecie, jego zastosowanie ogranicza się przede wszystkim do laboratoriów posiadających wiedzę inżynierską3,4,5,6,7,8,9.

NIH-ImageJ jest jednym z najpopularniejszych narzędzi open-source wśród badaczy biologii komórki10. Rozwój oparty na wkładzie społeczności użytkowników miał kluczowe znaczenie dla jego popularności11,12. ImageJ posiada funkcje, które pozwalają użytkownikom tworzyć aplikacje z mieszanką zaawansowanego języka programowania i uproszczonych podejść do skryptów. Funkcje te ułatwiają użytkownikom posiadającym podstawową wiedzę programistyczną wdrażanie, dostosowywanie i rozwijanie wszelkich nowych wkładów w oprogramowanie. Opierając się na tych cechach NIH-ImageJ, opracowaliśmy Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals (iTACS), który umożliwia tanią integrację pożądanych narzędzi sprzętowych i programowych w celu zautomatyzowania pomiaru szerokiej gamy sygnałów chemicznych i mechanicznych w przylegających komórkach11,12.

iTACS składa się z dwóch komponentów: Modułu Akwizycji i Szkolenia (AcTrM) oraz Modułu Analizy i Wizualizacji (AnViM). AcTrM jest zbudowany na μManager - aplikacji do akwizycji obrazów opartej na NIH-ImageJ - aby umożliwić użytkownikom konfigurowanie pomiarów poklatkowych tradycyjnych właściwości optycznych i różnych właściwości fizycznych przylegających komórek w wielu próbkach12. AcTrM ułatwia szkolenie użytkowników dzięki zwięzłym wskazówkom zawartym w interfejsie graficznym. Ponadto posiada nowatorską funkcję autofokusa opartego na obrazie referencyjnym, która została zaprojektowana w celu ułatwienia pomiarów sił fizycznych w czasie rzeczywistym i umożliwienia standaryzacji jakości pozyskiwanych danych.

AnViM jest zbudowany na wtyczkach ImageJ, przyspieszonym oprogramowaniu i skryptach obsługi plików, które umożliwiają użytkownikom ilościową ocenę ponad 50 właściwości, w tym kształtu komórki, rozmiaru, orientacji, prędkości i kierunku ruchu, trakcji wywieranych na macierz zewnątrzkomórkową (ECM) i na sąsiednie komórki, momentów kurczliwości i ścinania zarówno pojedynczych przylegających komórek, jak i ich sąsiedniego obszaru. AnViM ułatwia użytkownikom ilościowe określanie właściwości fizycznych komórek bez konieczności zagłębiania się w podstawowe podstawy techniczne11. Ponadto umożliwia analizę danych w trybie interaktywnym lub przetwarzania wsadowego. Generuje mapy cieplne ujawniające zmienność przestrzenną oraz wykresy przedstawiające czasową zmienność właściwości poszczególnych komórek.

W typowym eksperymencie, użytkownik hoduje komórki na elastycznym hydrożelu z odpowiednimi białkami macierzy zewnątrzkomórkowej na górnej powierzchni i dwoma rodzajami wbudowanych markerów fluorescencyjnych. Zasadniczo obrazy tych markerów fluorescencyjnych przed i po hodowli komórek są wystarczające do ilościowego określenia sił wewnątrz i wokół poszczególnych komórek2,13. AnViM mapuje te wyniki na poszczególne komórki przylegającego klastra i generuje wnikliwe obrazy i wykresy.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Próbki badane za pomocą platformy iTACS to komórki przyklejone do miękkiego podłoża. Protokół oceny sygnałów mechanicznych i chemicznych podzielony jest na dwie sekwencyjne części: Moduł Akwizycji i Szkolenia (AcTrM) oraz Moduł Analizy i Wizualizacji (AnViM).

1. Moduł Akwizycji i Szkolenia (AcTrM)

UWAGA: AcTrM automatyzuje proces pozyskiwania danych i samokształcenia użytkowników. Przed jakimkolwiek pozyskaniem danych należy przygotować miękkie podłoże zdolne do dostarczenia informacji niezbędnych do ilościowego określenia sił, jakie wywierają na niego komórki.

  1. Preparat hydrożelowy
    UWAGA: Celem jest przygotowanie modułu ścinania 1,250 Pa, grubości około 100 μm i hydrożelu poliakrylowomidowego (PAA) o średnicy 22 mm.
    1. Przygotuj roztwór poliakrylamidu, postępując zgodnie z metodą Yeunga i wsp., a następnie odlej hydrożele, postępując zgodnie z krokami opisanymi przez Trepat et al.14,15. Jednym z wyjątków od tej procedury jest to, że koraliki osadzone bezpośrednio pod komórkami mają średnicę 0,5 μm i emitują żółtą fluorescencję.
    2. Pomiń etap mocowania koralików 2 μm do szkła nakrywkowego, jeśli oczekuje się, że obszar oglądania będzie miał duży obszar wolny od komórek.
      UWAGA: Protokół przygotowania hydrożelu jest teraz dość dobrze ugruntowany w field16. W poniższym opisie kulki 0,5 μm są określane jako "koraliki górne", a kulki 2 μm są określane jako "koraliki dolne". Jednak dolne koraliki są opcjonalne, gdy obrazowany obszar zawiera duży obszar wolny od komórek. Górny wzór koralika z takiego obszaru wolnego od komórek będzie służył celowi wzoru dolnego koralika.
    3. Zamontuj hydrożel z osadzonymi kulkami fluorescencyjnymi na stoliku mikroskopu.
    4. Odczekaj 15-20 minut, aż temperatura płytki osiągnie stan ustalony.
      UWAGA: Górna powierzchnia płytki jest funkcjonalizowana białkami macierzy zewnątrzkomórkowej, ale komórki nie są jeszcze zasiane na hydrożelu.
  2. Akwizycja obrazu referencyjnego
    1. Część 1: Tworzenie listy pozycji
      UWAGA: Ręczne wprowadzanie w tym kroku obejmuje postępowanie zgodnie z instrukcjami AcTrM w celu wybrania lokalizacji o najlepszym rozkładzie ściegów. W tym kroku nie są używane żadne wcześniej utworzone pliki. Kluczowe nowe foldery utworzone w tym kroku to foldery 't0imgs', 'tnimgs' i 'textfiles', a utworzony plik zawiera plik z listą pozycji. Zobacz Rysunek 2, aby zapoznać się z wizualnym opisem następujących kroków, które prowadzą do tworzenia listy pozycji za pomocą AcTrM. Pokazany przykład pozyskuje dane przy 20-krotnym powiększeniu.
      1. Uruchom program μManager 2.0 — wersja beta.
      2. Uruchom AcTrM, klikając przycisk AcTrM.bsh w oknie Zasoby IMBL.
      3. W oknie zatytułowanym Define Acquisition Properties (Definiuj właściwości akwizycji) wybierz odpowiedni obiektyw, tolerancję dokładności odzyskiwania pozycji bocznej (tj. XY), rozmiar kroku operacji zgrubnego i wyrafinowanego ponownego ustawiania ostrości (tj. z) oraz wartość akceptowalnego współczynnika korelacji obrazu dla odzyskiwania ostrości.
        UWAGA: Dokładniejsza tolerancja przywracania pozycji bocznej spowolni odzyskiwanie pozycji, ale znaczna tolerancja będzie wymagała korekty pozycji podczas analizy danych i może powodować trudności w przywracaniu ostrości. Mniejszy rozmiar kroku spowolni operację ponownego ustawiania ostrości, ale bardzo duży rozmiar kroku może powodować szybki ruch z możliwością przegapienia ostrości.
      4. W oknie AcTrM - Krok 0 wybierz opcję Fresh Acquisition, aby utworzyć listę pozycji.
        UWAGA: Okno zatytułowane AcTrM - Krok 1 zawiera listę wszystkich kluczowych kolejnych kroków. Czynności te obejmują przesuwanie stołu montażowego, dostosowywanie fokusu i klikanie przycisków w aplikacji μManager. Te kroki pomagają w konstruowaniu listy pozycji odpowiednich do pozyskiwania danych.
      5. Kliknij na Live in Micromanager, aby wyświetlić próbki do ręcznej regulacji wymienione w oknie AcTrM - Krok 1.
      6. Postępuj zgodnie z instrukcjami wymienionymi w tym oknie.
      7. Teraz zdobądź obraz koralików. Wybierz odpowiedni kanał dla górnych koralików.
      8. Upewnij się, że spojrzysz również na dolne koraliki. W tym celu wybierz kanały dla dolnych ściegów. Widoczny jest rozmazany obraz dolnych koralików.
        UWAGA: Kanały można przełączać z menu rozwijanego ustawień wstępnych w głównym oknie programu μManager. Jeśli dolne koraliki są używane w eksperymencie, upewnij się, że są obecne w wybranej pozycji. Te koraliki będą rozmyte.
      9. Po wybraniu odpowiedniej pozycji kliknij na Oznacz w oknie Stage Position List (Lista pozycji etapu), aby zapisać pozycję.
        UWAGA: Najlepsza pozycja jest definiowana przez gęsty i równomierny rozkład górnych koralików osadzonych bezpośrednio pod górną powierzchnią (tj. górnych koralików) i co najmniej dwóch koralików przymocowanych do szkła nakrywkowego (tj. dolnych koralików) (rysunek uzupełniający S1). Odzyskiwanie ostrości jest szybsze, jeśli dolne koraliki pojawiają się jako duże, nieostre pierścienie. Jeśli jednak eksperymenty są wykonywane w jednej pozycji bez potrzeby ustawiania ostrości lub odzyskiwania pozycji bocznej, zignoruj instrukcje związane z obrazem dolnych koralików.
      10. Wykonaj kroki 6-9 opisane w Rysunek 2, aby dodać dodatkowe pozycje do listy.
        UWAGA: Wybierz kilka dodatkowych pozycji, aby runda eliminacji mogła pozwolić na najlepsze pozycje wybrane na talerzu.
    2. Część 2: Akwizycja obrazów referencyjnych
      UWAGA: Ten krok nie wymaga ręcznego wprowadzania. Wcześniej utworzone pliki kluczowe używane w tym kroku to m.in. "textfiles/*.pos". Kluczowe nowe pliki i foldery utworzone w tym kroku obejmują te znajdujące się w folderach 't0imgs' i 'tnimgs'. Zobacz Rysunek 3 i Rysunek uzupełniający S2, aby zapoznać się z wizualnym opisem następujących kroków, które kierują pozyskiwaniem obrazów referencyjnych za pomocą AcTrM. W oknie AcTrM - Krok 2 znajdują się również wszystkie kluczowe kroki.
      1. Postępując zgodnie z krokami wymienionymi w oknie AcTrM - Krok 2, dokonaj wyborów w oknie Akwizycja wielowymiarowa. Na przykład, aby wykonać długi czas poklatkowy, wskaż liczbę zdjęć do wykonania, wybierz pierwszy kanał jako kanał fazowy, a następnie wybierz następny dla górnych koralików, a następny dla dolnych koralików. Kliknij Zamknij w oknie Akwizycja wielowymiarowa, a następnie kliknij OK w oknie ActrM - Krok 2.
      2. W oknie AcTrM - Krok 3 wybierz, czy chcesz włączyć odzyskiwanie pozycji XYZ na podstawie obrazu referencyjnego. Wybór jest generalnie taki. Jeśli jednak obrazy są rejestrowane w jednej pozycji, bez miejsca na ostrość lub dryf sceny, wybór w oknie AcTrM - Krok 3 będzie Nie.
      3. W oknie AcTrM - Opcje odzyskiwania XYZ ustaw kanał dla przybliżonego odzyskiwania XYZ, czy wykonać udoskonalone odzyskiwanie XYZ, region i kanał dla udoskonalonego odzyskiwania XYZ oraz kierunek, w którym należy rozpocząć ponowne ustawianie ostrości (Rysunek uzupełniający S4). Po zakończeniu AcTrM pobierze obrazy referencyjne.
        UWAGA: Typowym wyborem dla kanału będzie dolny kanał koralików. Odzyskiwanie XYZ działa najlepiej, gdy jest przeprowadzane z pełnym obrazem w bieżącej implementacji. Obrazy referencyjne zazwyczaj zawierają obraz hydrożelu w świetle przechodzącym, obraz fluorescencyjny górnych kulek i fluorescencyjny obraz dolnych kulek. Zawartość każdego zestawu obrazów może się różnić w zależności od wyborów dokonanych w oknie Akwizycja wielowymiarowa. Mimo to oprogramowanie pobierze obraz referencyjny ustawiony w każdej pozycji określonej w Rysunek 2. Na końcu tego kroku w wybranym katalogu tworzone są trzy foldery: 't0imgs', 'tnimgs' i 'textfiles'. Folder 't0imgs' zawiera obrazy referencyjne w formacie rozpoznawanym przez μManager i używanym w kolejnych krokach; Folder 'tnimgs' zawiera oddzielne obrazy TIFF o nazwach plików 'c0_p0_t0.tif', 'c1_p0_t0.tif', itd. Tutaj "c" oznacza kanał, "p" oznacza pozycję, a "t" oznacza czas. Po tych literach znajdują się odpowiednio numer kanału, numer pozycji i numer ramki. Folder "textfiles" zawiera listę pozycji w formacie XML oraz opcje użytkownika dotyczące pozyskiwania i odzyskiwania pozycji.
  3. Wysiew i wzrost komórek
    UWAGA: Platforma iTACS jest na tyle elastyczna, że umożliwia dostosowanie się do protokołów przygotowania próbek stosowanych w powszechnej ocenie in vitro zachowania mechanicznego przylegających komórek, w tym komórek rzadkich, w pełni zlewających się monowarstw, testu tworzenia sieci oraz monowarstw z lub znacznymi przerwami.
    1. Hodowla mikronaczyniowych komórek śródbłonka płuc szczura do zbiegu w kolbie17,18.
    2. Odłącz komórki za pomocą trypsyny. Zawiesić komórki w pożywce hodowlanej zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej do stężenia 1 x 106 komórek/ml.
    3. Umieścić kroplę 5 μl zawieszonych komórek na częściowo suchej powierzchni hydrożelu i umieścić ją w inkubatorze do hodowli komórkowych.
      UWAGA: Po 2 dniach w pożywce hodowlanej zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej, komórki w tej kropelce tworzą zatłoczoną wyspę komórek1.
  4. Zautomatyzowana akwizycja obrazu dla pozostałej części eksperymentu
    UWAGA: Ręczne wprowadzanie danych na tym etapie obejmuje postępowanie zgodnie z instrukcjami AcTrM w celu wznowienia akwizycji obrazu. Kluczowe wcześniej utworzone pliki używane w tym kroku to 'textfiles/*.pos' i pliki obrazów dolnych ściegów w folderze 't0imgs'. Najważniejsze nowe pliki utworzone w tym kroku obejmują zaktualizowane pliki z listą pozycji i obrazy 'tnimgs/*_t*.tif'.
    1. Upewnij się, że system kontroli środowiska mikroskopu osiąga stabilne warunki hodowli tkankowej.
    2. Delikatnie zamontuj płytkę zawierającą hodowane komórki na stoliku mikroskopu.
    3. Odczekaj 15-20 minut, aż temperatura i wilgotność się ustabilizują.
      UWAGA: Zobacz Rysunek 4, aby zapoznać się z wizualnym opisem następujących kroków, które kierują pozyskiwaniem obrazów do pozostałego eksperymentu przy użyciu AcTrM.
    4. Uruchom program μManager 2.0 — wersja beta.
    5. Uruchom AcTrM, klikając przycisk AcTrM.bsh w oknie Zasoby IMBL.
      UWAGA: Zignoruj opcje dokonane w oknie Definiowanie właściwości pozyskiwania, ale użyj opcji dokonanych w poprzednim kroku.
    6. W oknie AcTrM - Krok 0 wybierz opcję Kontynuuj wstrzymane pobieranie.
    7. Wybierz powiększenie i katalog zidentyfikowany w oknie Akwizycja wielowymiarowa we wcześniejszym kroku, w którym zostały zapisane foldery danych ("t0imags", "tnimgs" i "textfiles").
      UWAGA: Tytuł okna prowadzi użytkownika do wyboru odpowiedniego katalogu.
    8. W oknie Zmiana położenia blachy wybierz opcje zmiany położenia blachy (trzy pozycje niewspółliniowe) wraz z kanałem używanym do zmiany położenia.
      UWAGA: Zapisane obrazy będą widoczne w aparacie. Jeśli nakładające się obrazy są wyświetlane jako obraz w kolorze czerwonym, zielonym i czarnym, wykonaj regulację ręczną.
    9. Kliknij Akceptuj, aby kontynuować pobieranie.
      UWAGA: Ten krok pozwala przezwyciężyć niewielkie przesunięcia wynikające z niepowtarzalności wyrównania płytki po ponownym zamontowaniu płytki na stoliku mikroskopu. Postępuj zgodnie z instrukcjami AcTrM, aby przyspieszyć wyrównanie w każdej z trzech pozycji, wyświetlając złożony obraz obrazu referencyjnego pokazany na czerwono (zwykle dolnych koralików) i obrazu aktualnie obserwowanego przez obiektyw pokazany na zielono. Zbliżenie koloru zielonego do czerwonego pozostawia oprogramowaniu mniej pracy. Gdy nakładanie się jest idealne, obraz kompozytowy jest żółto-. Wystarczająco blisko jest zazwyczaj, gdy te same dolne koraliki są widoczne zarówno na czerwonym, jak i zielonym obrazie, a odpowiadające im czerwone i zielone nieostre pierścienie stykają się ze sobą. Po zakończeniu zmiany położenia płyty, AcTrM przenosi stolik do każdej wybranej pozycji i odzyskuje pozycję XYZ, dopasowując obraz referencyjny do tego, co jest aktualnie widziane przez kamerę. Dopasowywana jest pierwsza pozycja boczna (XY), a następnie dopasowywana jest ostrość (Z). Po szorstkim powrocie do zdrowia następuje wyrafinowane odzyskiwanie pozycji i skupienia. Aktualizacje aktualnego stanu eksperymentu są wyświetlane na ekranie za pomocą czteroczęściowego okna pokazanego na rysunku uzupełniającym S3. Pozyskane obrazy są zapisywane w folderze 'tnimgs' po '*_t1.tif', '*_t2.tif', wskazując czas dla zestawu obrazów. Jeśli odzyskiwanie XYZ zidentyfikuje zaktualizowaną pozycję, generowana jest nowa lista pozycji, która jest zapisywana w folderze "textfiles".

2. Moduł Analizy i Wizualizacji (AnViM)

  1. Konfiguracja automatycznej analizy danych
    UWAGA: Ręczne wprowadzanie danych w tym kroku obejmuje określenie lokalizacji folderu 'tnimgs'. Kluczowe wcześniej utworzone pliki używane w tym kroku to 'tnimgs/*.tif'. Kluczowe nowe pliki i foldery utworzone w tym kroku obejmują folder "analysis" w tym samym folderze nadrzędnym co "tnimgs" oraz foldery dla każdej pozycji "analysis/p*". W ramach każdego 'analysis/p*' ten krok tworzy nowe pliki obrazów '*.tif' w folderach 'phs' i 'tny'. Obrazy te są przyciętymi i pozbawionymi dryfowania obrazami komórek i górnych koralików. Inne utworzone pliki to "analysis/analysisChoices.txt", który zawiera listę opcji analizy, "analysis/p*/skipAnalysis.txt", który zawiera listę przypadków, w których analiza została pominięta z powodu znacznego wcześniejszego dryfu, oraz "analysis/p*/part_shift_values_pixel_degree.dat", który zawiera listę szacowanych wartości dryftu. AnViM nie zmienia surowych danych w folderze "tnimgs". Zobacz Rysunek 5, aby zapoznać się z wizualnym opisem następujących kroków, które prowadzą do konfiguracji automatycznej analizy danych za pomocą AnViM.
    1. Uruchom oprogramowanie Fiji i wybierz pierwszą opcję z menu rozwijanego MSM oznaczoną jako MSM - przetwarzanie wstępne.
    2. Korzystając z okna dialogowego przeglądarki plików, wybierz folder zawierający folder 'tnimgs', który zawiera analizowane dane.
    3. Zdefiniuj kanał dla obrazów. Postępując zgodnie ze wskazówkami z rysunku uzupełniającego S5, zidentyfikuj numery kanałów obrazu komórek w świetle przechodzącym (obraz kontrastu fazowego komórek), obraz dolnych koralików i obraz górnych koralików. Następujące trzy pola wyboru ("Przenieś pliki do folderu pozycji", "Wykonaj dodatkową korektę ruchu sztywnego" i "Przytnij dane i zapisz w folderze pozycji") są zwykle zaznaczone. Na koniec zdefiniuj tolerancję odrzucania mocno przesuniętych danych, rozmiar pikseli i boki obrazu, w których przecinają się komórki.
    4. Odpowiedz na monit o zwiększenie jasności i kontrastu obrazów dolnych koralików, tak aby koraliki były wyraźnie widoczne. Dostosuj to za pomocą suwaka w menu i kliknij OK.
    5. Teraz wykonaj korektę pozycji, aby pozbyć się ewentualnych zmian. Po zakończeniu tworzony jest folder analizy.
      UWAGA: Poprawa kontrastu zazwyczaj nie jest potrzebna, ale ta opcja jest dostępna w przypadku eksperymentów, w których należy zminimalizować ekspozycję na lasery. Po dokonaniu tego wyboru AnViM kopiuje pliki z folderu "tnimgs" do folderu "analiza". Pliki odpowiadające każdej pozycji są zapisywane w folderach 'analiza/p0, analiza/p1' itd. W każdym z tych folderów pozycji, AnViM tworzy foldery 'cels', 'defs' i 'refs' zawierające odpowiednio oryginalny obraz światła przechodzącego, obrazy górnych kulek i dolnych kulek (Rysunek uzupełniający S6). Następnie AnViM analizuje sztywny ruch na obrazach dolnych koralików i tworzy folder "phs" zawierający skorygowany obraz komórek w świetle przechodzącym oraz folder "tny" zawierający zaktualizowane obrazy górnych kulek. Na koniec, wybory użytkownika dotyczące kanałów, operacji, tolerancji, rozmiaru pikseli i przekraczania granic są zapisywane w pliku "analysisChoices.txt" (rysunek uzupełniający S6).
  2. Kwantyfikacja deformacji hydrożelu i monowarstwy
    UWAGA: Ważne jest, aby pamiętać, że kwantyfikacja ruchu na podstawie sekwencji obrazów jest szybko rozwijającym się polem19. Technologia jest stale optymalizowana pod kątem takich cech, jak szybkość, dokładność, specyficzne cechy obrazów RAW i określone wzorce deformacji. W związku z tym jest prawdopodobne, że niektórzy użytkownicy mogą stosować inne podejście do kwantyfikacji deformacji niż przedstawione tutaj.
    1. Część 1: Kwantyfikacja deformacji hydrożelu
      UWAGA: Ręczne wprowadzanie danych w tym kroku obejmuje identyfikację katalogu danych i wybór rozdzielczości siatki. Kluczowe wcześniej utworzone pliki używane w tym kroku to 'p*/tny/*.tif'. Kluczowe nowe pliki utworzone w ten sposób obejmują 'p*/displacement/*_disp.dat', który zawiera listę wektorów przemieszczenia górnej powierzchni hydrożelu. Zobacz Rysunek 6 zawiera wizualny opis następujących kroków, aby włączyć, za pomocą AnViM, analizę prędkości obrazu cząstek na górnych obrazach koralików20.
      1. Uruchom oprogramowanie Fiji i z menu rozwijanego MSM wybierz MSM - Deformacja żelu.
      2. W tym miejscu wybierz opcję, która jest odpowiednia dla eksperymentu.
      3. Korzystając z okna dialogowego przeglądarki plików, wybierz katalog nadrzędny folderu "analiza" zawierającego analizowane dane.
      4. W oknie Parametry obliczania deformacji żelu wybierz odpowiedni rozmiar okna korelacji krzyżowej, poziom szumu i próg (rysunek uzupełniający S7)20.
        UWAGA: Wyniki są zapisywane w nowo utworzonym katalogu "przemieszczenie" w każdym folderze pozycji "analiza/p0, analiza/p1" itd. W tym miejscu przechowywane są wszystkie pliki wyjściowe
        5. .
    2. Część 2: Kwantyfikacja odkształceń monowarstwowych
      UWAGA: Ręczne wprowadzanie danych w tym kroku obejmuje identyfikację katalogu danych i wybór rozdzielczości siatki. Kluczowe wcześniej utworzone pliki używane w tym kroku to 'p*/tny/*.tif'. Kluczowe nowe pliki utworzone w tym systemie to 'p*/velocity/*_vel.dat', który wyświetla wektory ruchu komórek. Zobacz Rysunek 7 zawiera wizualny opis kroków, które należy wykonać, za pomocą AnViM, analizę prędkości obrazu cząstek na górnych koralikach images20. Procedura jest podobna do tej, która jest stosowana do ilościowego określania deformacji hydrożelu i wybiera MSM - Ruch komórkowy z menu rozwijanego MSM. Wyniki są zapisywane w nowo utworzonym katalogu "velocity" w każdym folderze pozycji "analysis/p0", "analysis/p1" itd.
  3. Kwantyfikacja siły komórka-ECM i komórka-komórka
    UWAGA: Ręczne wprowadzanie danych w tym kroku obejmuje identyfikację katalogu danych, wskazanie sztywności hydrożelu i reagowanie na monity o segmentację klastra komórkowego w celu wykrycia komórek z obszaru bezkomórkowego. Kluczowe wcześniej utworzone pliki używane w tym kroku to 'p*/displacement/*_disp.dat'. Najważniejsze nowe pliki utworzone na tym etapie obejmują: 'p*/traction/*_trac.dat', który zawiera listę sił wywieranych przez komórki na hydrożel; "p*/traction/*_domain.dat", który zawiera informacje o położeniu punktów siatki zawierających komórki; oraz pliki wejściowe 'p*/traction.in, p*/clusterInput.txt' i 'p*/prestress.in', które rejestrują wybory użytkownika dla tego kroku. Po pierwszej ilościowej ocenie komórka-ECM i sił komórka-komórka opracowano kilka wariantów tej techniki1,15. Wariacje koncentrują się na konkretnych przypadkach substratów, komórek, warunków eksperymentalnych lub narzędzi numerycznych7,8,21,22. Zobacz Rysunek 8, aby zapoznać się z wizualnym opisem za pomocą AnViM, mikroskopii trakcyjnej z transformacją Fouriera i analizy mikroskopii naprężeń jednowarstwowych na danych deformacji hydrożelu1,2,15.
    1. Uruchom oprogramowanie Fiji i z menu rozwijanego MSM wybierz MSM - Cell-ECM i Cell-Cell Forces (trzecia opcja z menu rozwijanego).
    2. Korzystając z okna dialogowego przeglądarki plików, wybierz katalog nadrzędny folderu 'analysis' zawierającego foldery 'tnimgs' i 'analysis' zawierające analizowane dane. Kliknij Wybierz.
    3. W oknie Parametry do obliczania sił komórkowych wprowadź moduł ścinania, grubość hydrożelu oraz przewidywany poziom hałasu. Wybierz przycisk OK. Dzięki temu może wykonywać trakcję za pomocą funkcji MATLAB.
      UWAGA: Po tych danych wejściowych AnViM oblicza siły komórka-ECM.
    4. Następnie wskaż, czy monowarstwa jest zlewna. Jeśli cały obraz komórki jest pokryty komórkami, odpowiedź brzmi Tak. W takim przypadku siły komórka-komórka zostaną obliczone w całej ramce. Z drugiej strony, jeśli część obrazu nie ma komórek, odpowiedź brzmi Nie. W takim przypadku postępuj zgodnie z instrukcjami AnViM, aby ułatwić segmentację regionu obrazu zawierającego komórki.
    5. Jeśli odpowiedź brzmi "nie", ręcznie narysuj wielokąt wokół obiektu niebędącego komórką, gdy oprogramowanie wyświetli monit, a następnie wybierz odpowiednią metodę segmentacji. Oprogramowanie poprosi o kolor (lub biały) komórek.
    6. Zaznacz opcję Wypełnij miejsca automatycznie w oprogramowaniu i kliknij OK.
      UWAGA: Etapy segmentacji monowarstwy niezlewającej się zostaną omówione w pierwszej części "Sekcji 2.4. Siły komórka-ECM są przechowywane w plikach '*_trac.dat' w nowo utworzonym katalogu 'traction' w każdym folderze pozycji, a dane wejściowe do oprogramowania do obliczania siły komórka-ECM są zapisywane w pliku 'traction.in' (rysunek uzupełniający S8). Siły komórka-komórka jest przechowywana w plikach "*_prestress.dat" w nowo utworzonym katalogu "naprężenie wstępne" w każdym folderze pozycji, a dane wejściowe do oprogramowania do obliczania siły komórka-komórka jest zapisywana w pliku "prestress.in" (rysunek uzupełniający S9).
  4. Mapowanie wartości punktów siatki na poszczególne komórki
    UWAGA: Jednym z obecnych celów iTACS jest wprowadzenie prostego podejścia do interpretacji mierzonych sygnałów mechanicznych w terenie. Takie podejście jest korzystne do badania interakcji mechanicznych między sąsiednimi komórkami klastra18. Ogólnie rzecz biorąc, właściwości określone do tej pory ilościowo znajdują się w regularnie rozmieszczonych punktach siatki w całym klastrze komórkowym. Dane te identyfikują medianę, średnią i odchylenie standardowe wybranych właściwości w granicach morfologicznych poszczególnych komórek i przypisują je jako właściwości fizyczne/sygnały komórkowe. Spośród nich odchylenie standardowe służy do wskazania zmienności, różnica między średnią a medianą służy do wskazania charakteru rozkładu, a wartość mediany służy do wskazania ogólnego stanu komórek dla wybranych właściwości.
    1. Część 1: Segmentacja regionu obrazu, który zawiera komórki
      UWAGA: Ręczne wprowadzanie danych w tym kroku obejmuje identyfikację katalogu danych i reagowanie na monity o segmentację w celu wykrycia komórek z obszaru bez komórek. Klucz wcześniej utworzonych plików używanych w tym kroku to 'p*/phs/*.tif'. Najważniejsze nowe pliki utworzone w tym kroku to 'p*/phs/bwImages/*.tif', które są obrazami binarnymi oddzielającymi regiony komórek od regionów bez komórek, 'p*/phs/textResults/frameNum_percentHealed.txt', które wyświetlają procentowy obszar obrazu pokryty przez komórki w każdym wystąpieniu, oraz 'p*/clusterInput.txt', który rejestruje wybory użytkownika wprowadzone w interfejsie AcTrM. Zobacz Rysunek 9, aby zapoznać się z wizualnym opisem następujących kroków, aby podzielić obszar obrazu zawierający komórki. Ta część musi zostać wykonana przed obliczeniem sił komórka-komórka. W takim przypadku kroki te nie muszą być powtarzane. Ponadto, jeśli te kroki są wykonywane przed obliczeniami siły między komórkami, nie są one wymagane na początku obliczeń siły.
      1. Uruchom oprogramowanie Fiji i z menu rozwijanego MSM wybierz opcję Segmentacja - Klaster komórkowy.
      2. Korzystając z okna dialogowego przeglądarki plików, wybierz katalog pozycji 'analiza/p0', 'analiza/p1' itd., który zawiera właściwości określone ilościowo w regularnie rozmieszczonych punktach siatki.
      3. Wskaż, czy monowarstwa jest konfluentna.
        UWAGA: Poniższe kroki są wywoływane tylko wtedy, gdy monowarstwa nie zlewa się. Postępuj zgodnie z instrukcjami AnViM, aby zastosować nowatorskie, wielotorowe podejście do identyfikacji regionów obrazu zawierających komórki. Proces ten składa się z czterech metod, z których każda podchodzi do segmentacji w inny sposób. Jedna lub wiele z tych metod stosowanych w połączeniu obejmuje szeroką gamę obrazów komórek. Dlatego wypróbuj różne podejścia, aby dowiedzieć się, która kombinacja najlepiej pasuje do ich danych.
      4. Dostosuj 'Współczynnik połączenia domeny' i 'Współczynnik rozmazu', aby uzyskać optymalną segmentację.
        UWAGA: "Czynnik rozmazu" sprawia, że regiony zawierające komórki są większe.
      5. Wskaż, czy komórki są czarne czy białe na obrazie binarnym.
      6. W oknie Wskazówki dotyczące czyszczenia obrazu obwiedni wybierz, czy obraz ma być czyszczony automatycznie, czy ręcznie.
        UWAGA: Niepożądanymi cechami obrazów są czarne plamy na pikselach zajmowanych przez komórki i białe plamy na pikselach odłączonych od klastra komórek, który ma być analizowany. Analizę można przeprowadzić tylko w regionach, które są połączone. W związku z tym wiele rozłączonych regionów musi być analizowanych oddzielnie.
    2. Część 2: Segmentacja poszczególnych komórek na obrazach
      UWAGA: Ręczne wprowadzanie danych w tym kroku obejmuje identyfikację katalogu danych i reagowanie na monity o segmentację w celu wykrycia poszczególnych komórek na obrazie. Kluczowe wcześniej utworzone pliki używane w tym kroku to 'p*/phs/*.tif' i 'p*/phs/bwImages/*.tif'. Najważniejsze nowe pliki to 'p*/phs/textResults/*.csv', które zawierają właściwości morfologiczne komórek. Zobacz Rysunek 10, aby zapoznać się z wizualnym opisem następujących kroków, aby podzielić poszczególne komórki monowarstwy.
      1. Uruchom oprogramowanie Fiji i z menu rozwijanego MSM wybierz opcję Segmentacja - Poszczególne komórki.
      2. Korzystając z okna dialogowego przeglądarki plików, wybierz katalog pozycji 'analiza/p0', 'analiza/p1' itd., który zawiera właściwości określone ilościowo w regularnie rozmieszczonych punktach siatki.
      3. W oknie Wybierz parametry wejściowe wskaż maksymalny współczynnik proporcji, wyeksponowanie stopnia wystania środka komórki w porównaniu z granicą komórki oraz dwa parametry rozmycia, które pomogą w wykrywaniu komórek (Rysunek uzupełniający S10).
      4. Na stosie obrazów dla każdej pozycji narysuj wielokąt na najmniejszej normalnej komórce. Służy to do obliczania powierzchni. Wszystko, co jest mniejsze niż to, nie będzie uważane przez oprogramowanie za komórkę.
      5. Następnie narysuj wielokąt wokół największej normalnej komórki i wskaż, czy środek komórki, czy interfejs komórka-komórka jest jaśniejszy.
        UWAGA: Następnie AnViM tworzy pliki 'phs/textResults/0001.csv', 'phs/textResults/0002.csv' itd. dla każdej ramki zawierającej informacje o komórkach w tej ramce. Na tym etapie plik ten zawiera informacje morfologiczne o komórkach, w tym obszar, środek ciężkości, obwód, orientację, okrągłość, współczynnik proporcji, zaokrąglenie, solidność, odległość od obszaru bez komórki. Jednostką długości w tych właściwościach są piksele, a kąt jest wyrażony w stopniach. Na koniec ten plik jest aktualizowany, aby zawierał intensywność pikseli komórkowych, ruch i siły w kolejnych krokach.
    3. Część 3: Mapowanie intensywności pikseli na komórkach
      UWAGA: Ręczne wprowadzanie danych w tym kroku obejmuje identyfikację katalogu danych oraz wybranie właściwości i parametrów mapowania. Kluczowe wcześniej utworzone pliki użyte w tym kroku to 'p*/phs/*.tif' (lub 'p*/fluo/*.tif ') i 'p*/phs/bwImages/*.tif'. Najważniejsze nowe pliki utworzone w tym kroku to 'p*/phs/textResults/*.csv', który zawiera listę właściwości morfologicznych komórek. Zobacz Rysunek 11, aby zapoznać się z wizualnym opisem następujących kroków, aby ocenić intensywność pikseli w obszarze objętym przez poszczególne komórki i ich sąsiedni region oraz zdefiniować je jako właściwości komórek.
      1. Uruchom oprogramowanie Fiji i z menu rozwijanego MSM wybierz opcję Mapuj na komórkach - Intensywności.
      2. Korzystając z okna dialogowego przeglądarki plików, wybierz katalog pozycji 'analiza/p0', 'analiza/p1' itd., który zawiera właściwości określone ilościowo w regularnie rozmieszczonych punktach siatki.
      3. Wybierz opcję Wykryj podział komórek lub Określ ilościowo fluorescencję komórkową po wyświetleniu monitu przez oprogramowanie. Określ rozmiar sąsiedniego regionu. Zaznacz zarówno pola Zbieranie właściwości sąsiedniego regionu, jak i Zbieranie właściwości komórek. Kliknij OK.
      4. W oknie Cel rejestrowania intensywności komórkowej wskaż, jaki typ obrazu ma być używany do mapowania intensywności, rozmiar sąsiedniego regionu oraz czy dane są zbierane dla poszczególnych komórek, czy obu komórek i ich sąsiednich regionów (rysunek uzupełniający S11).
        UWAGA: Mapowanie intensywności pikseli obrazu z kontrastem fazowym umożliwia wykrywanie zdarzeń podziału komórek. Mapowanie intensywności obrazu fluorescencyjnego umożliwi wykrycie fluktuacji w znakowanych fluorescencyjnie cząsteczkach cytoplazmatycznych. Dane wyjściowe powyższych kroków to średnia, mediana, odchylenie standardowe, minimalne i maksymalne wartości intensywności pikseli dla poszczególnych komórek. Liczby te są wprowadzane jako nowe kolumny w plikach 'phs/textResults/0001.csv', 'phs/textResults/0002.csv' itd.
    4. Część 4: Mapowanie sił i ruchu na komórkach
      UWAGA: Ręczne wprowadzanie danych w tym kroku obejmuje identyfikację katalogu danych oraz wybranie właściwości i parametrów mapowania. Kluczowe wcześniej utworzone pliki używane w tym kroku to 'p*/phs/textResults/*.csv', 'p*/velocity/*_vel.dat', 'p*/displacement/*_disp.dat', 'p*/traction/*_trac.dat', 'p*/prestress/*_prestress.dat' i 'p*/phs/bwImages/*.tif '. Na tym etapie nie są tworzone żadne nowe pliki. Zamiast tego nowe informacje (właściwości siły i ruchu komórkowego) są dodawane do plików 'p*/phs/textResults/*.csv '. Zobacz Rysunek 12 zawiera wizualny opis kroków, które należy wykonać, aby ocenić siły i ruch w obszarze objętym przez poszczególne komórki i ich sąsiadujący obszar oraz zdefiniować je jako właściwości komórek.
      1. Wybierz z menu rozwijanego MSM Mapa na komórkach - Dane ruchu/siły (rysunek uzupełniający S12).
      2. Następnie wykonaj czynności wymienione w kroku 2.4.3.
        UWAGA: Nowe kolumny są dodawane do plików 'phs/textResults/0001.csv', 'phs/textResults/0002.csv', itd. i zawierają średnią, medianę i odchylenie standardowe prędkości, orientację prędkości, średnie napięcie cytoszkieletu, anizotropię napięcia, energię odkształcenia w hydrożelu, orientację najwyższego napięcia i wielkość trakcji komórka-ECM (rysunek uzupełniający S13).
  5. Wizualizacja wyników
    1. Część 1: Śledzenie tożsamości komórkowych w całym eksperymencie
      UWAGA: Ręczne wprowadzanie danych w tym kroku obejmuje identyfikację katalogu danych i wybranie zmapowanych właściwości do wizualizacji. Kluczowe wcześniej utworzone pliki używane w tym kroku to 'p*/phs/textResults/*.csv'. Najważniejsze nowe pliki utworzone na tym etapie to "p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv", który zawiera ślad czasowy danych komórkowych. Zobacz Rysunek 13 aby zapoznać się z wizualnym opisem następujących kroków do śledzenia właściwości poszczególnych komórek przez cały czas trwania eksperymentu.
      1. Uruchom oprogramowanie Fiji i z menu rozwijanego MSM wybierz opcję Wyniki - Śledź dane.
      2. Korzystając z okna dialogowego przeglądarki plików, wybierz katalog pozycji "analiza/p0", "analiza/p1" itp., zawierający właściwości komórki, które mają być śledzone. Po zakończeniu kliknij Wybierz.
      3. W oknie Wybierz punkt początkowy śledzenia wybierz klatkę początkową do monitorowania oraz liczbę klatek jednocześnie śledzonych (Rysunek uzupełniający S14). Zawsze zaczynaj od klatki numer 2, ponieważ nie można określić prędkości dla klatki numer 1. Po zakończeniu kliknij OK.
      4. W oknie Sprawdź zmienne do utworzenia ścieżek wybierz zmienne, wpisując nazwy zmiennych lub zaznaczając terminy z pól wyboru (Rysunek uzupełniający S15). Następnie kliknij OK.
        UWAGA: Śledzenie generuje pliki "phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv", z których każda kolumna zawiera unikalny numer komórki, a każdy kolejny wiersz reprezentuje kolejne wystąpienie czasu.
    2. Część 2: Generowanie ścieżek czasowych ocenianych właściwości komórkowych
      UWAGA: Ręczne wprowadzanie danych w tym kroku obejmuje identyfikację katalogu danych i wybranie zmapowanych właściwości do wizualizacji. Kluczowe wcześniej utworzone pliki używane w tym kroku to 'p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv'. Najważniejsze nowe pliki utworzone na tym etapie to "p*/phs/trackedDataPlots/*.tif", które zawierają wykresy toru czasu oraz "p*/phs/trackedDataPlots/*.csv", które zawierają dane wykresu. Zobacz Rysunek 14, aby zapoznać się z wizualnym opisem następujących kroków w celu wygenerowania ścieżek czasowych ocenianych właściwości komórek.
      1. Uruchom oprogramowanie Fiji i z menu rozwijanego MSM wybierz opcję Wyniki - wykres.
      2. Korzystając z okna dialogowego przeglądarki plików, wybierz katalog pozycji "analiza/p0", "analiza/p1" itp., zawierający śledzone właściwości komórki, które mają zostać wykreślone.
      3. Wybierz, czy chcesz ograniczyć drukowanie do komórek z nieprzerwanymi ścieżkami, klikając przycisk Tak czy Nie.
        UWAGA: Ta opcja ignoruje komórki, których nie można było wykryć w jednym lub kilku wystąpieniach czasu.
      4. Wybierz liczbę zmiennych, które mają być jednocześnie wykreślone i kliknij OK.
        UWAGA: Obecnie AnViM pozwala na wyświetlanie maksymalnie trzech zmiennych na tym samym wykresie.
      5. Wybierz poszczególne zmienne do wykreślenia za pomocą menu rozwijanego.
        UWAGA: Wykonanie tych czynności powoduje utworzenie pliku w formacie TIFF (tagged image file format) oraz pliku danych rozdzielanego przecinkami w folderze "phs/trackedDataPlots/". Nazwa pliku składa się z nazw zmiennych oddzielonych znakiem podkreślenia i kończy się numerem komórki.
    3. Część 3: Generowanie map cieplnych ocenianych właściwości komórkowych
      UWAGA: Ręczne wprowadzanie danych w tym kroku obejmuje identyfikację katalogu danych i wybranie zmapowanych właściwości do wizualizacji. Kluczowe wcześniej utworzone pliki używane w tym kroku to 'p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv'. Najważniejsze nowe pliki wygenerowane w tym kroku to "p*/phs/segmentedImages/cellPropMaps/*.tif", które są mapami cieplnymi właściwości sieci komórkowej. Zobacz Rysunek 15 dla wizualnego opisu kroków do wygenerowania map cieplnych ocenianych właściwości komórek.
      1. Wybierz z menu rozwijanego MSM Wyniki - Obraz.
      2. Postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi w kroku 2.5.2.
        UWAGA: Dane wyjściowe są przechowywane jako pliki TIFF w folderze "phs/segmentedImages/cellPropMaps/". Nazwy plików to czas, numer instancji i nazwa zmiennej oddzielone podkreśleniem.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy tutaj dwa kluczowe wyjścia dla demonstrowanego przykładu. Pierwszym wyjściem jest ślad czasowy prędkości komórkowej i napięcia cytoszkieletu dla komórki numer 1 (Rysunek 16). Właściwości są wyświetlane na wspólnej osi pionowej, aby ułatwić wizualne skojarzenie między właściwościami, a oś pozioma wskazuje numer wystąpienia czasu. W tym eksperymencie kolejne klatki były rejestrowane w odstępie 15 minut. Drugim wyjściem jest tablica map cieplnych po 1 godzinie eksperymentu (Rysunek 17). Pokazane tutaj właściwości obejmują obszar rozsiewu, orientację, kołowość, prędkość, kierunek ruchu, maksymalną orientację napięcia, napięcie cytoszkieletu, trakcję substratu i anizotropię napięcia poszczególnych komórek.

figure-results-1
Rysunek 1: Struktura zestawu narzędzi integracyjnych do analizy sygnałów komórkowych (iTACS). Dwa kluczowe komponenty iTACS to Moduł Akwizycji i Szkolenia (AcTrM) oraz Moduł Analizy i Wizualizacji (AnViM). AcTrM może wykorzystywać różne techniki przygotowania hydrożelu, które obecnie istnieją, do przygotowania hydrożeli, które można mocno trzymać na stoliku mikroskopowym, dowolnego wysiewu komórek oraz protokołu wzrostu, który utrzymuje komórki w jednej płaszczyźnie ogniskowej. AnViM może wykorzystywać różne techniki do ilościowego określania deformacji hydrożelu i monowarstwy, sił komórka-ECM oraz sił komórka-komórka. Wszystkie te preferowane przez użytkownika elementy protokołu pomiaru siły mogą być umieszczone w iTACS i zostały oznaczone przerywanymi polami. Komponenty oznaczone za pomocą solidnych pudełek stanowią nowatorski wkład w technologię pomiaru siły komórkowej. Wizualizacja w AnViM koncentruje się na wartości mediany i zmienności właściwości w poszczególnych komórkach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Akwizycja obrazu referencyjnego - część 1. Etapy tworzenia listy pozycji za pomocą AcTrM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Akwizycja obrazu referencyjnego - część 2. Etapy uzyskiwania obrazów referencyjnych za pomocą AcTrM. Szczegółowe widoki kroków 2, 4 i 6 przedstawiono na rysunkach uzupełniających odpowiednio S2, S3 i S4. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Automatyczne pozyskiwanie obrazów dla pozostałego eksperymentu. Kroki wznawiania akwizycji obrazu w celu oceny zachowania komórek przy użyciu AcTrM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Konfiguracja automatycznej analizy danych. Kroki, które należy wykonać, aby rozpocząć automatyczną analizę obrazu za pomocą AnViM. Oprogramowanie rozpoznaje format obrazu używany przez AcTrM. Szczegółowy widok paneli w krokach 3 i 5 przedstawiono odpowiednio na rysunku uzupełniającym S5 i rysunku uzupełniającym S6. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Kwantyfikacja deformacji hydrożelu i monowarstwy - część 1. Kroki, które należy wykonać, za pośrednictwem AnViM, implementację prędkości obrazu cząstek Tseng, Q. et al., PNAS (2012)20 w celu ilościowego określenia deformacji górnej powierzchni hydrożelu. Użytkownicy mogą również wdrażać w AnViM inne podejścia do ilościowego określania deformacji hydrożelu. Szczegółowy widok kroku 3 przedstawiono na rysunku uzupełniającym S7. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Kwantyfikacja deformacji hydrożelu i monowarstwy - część 2. Kroki, które należy wykonać, za pośrednictwem AnViM, implementację prędkości obrazu cząstek Tseng, Q. et al., PNAS (2012)20 w celu ilościowego określenia lokalnego ruchu poszczególnych komórek. Użytkownicy mogą również wdrażać w AnViM inne podejścia do ilościowego określania ruchu komórkowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8: Kwantyfikacja sił komórka-ECM i komórka-komórka. Kroki do przeprowadzenia analizy obrazu w celu zaangażowania, za pomocą AnViM, implementacji mikroskopii trakcyjnej z transformacją Fouriera Trepata i wsp., Nature Physics (2009)15 w celu ilościowego określenia sił wywieranych przez komórki na hydrożel oraz implementacji Monolayer Stress Microscopy Tambe i wsp., Nature Materials (2011)1 do ilościowego określania sił w poszczególnych komórkach i między sąsiednimi komórkami. Użytkownicy mogą również wdrażać w AnViM inne podejścia do ilościowego określania siły komórka-ECM i komórka-komórka. Szczegółowy widok kroku 6 przedstawiono na rysunku uzupełniającym S8 i rysunku uzupełniającym S9. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rysunek 9: Mapowanie wartości punktów siatki na poszczególne komórki - część 1. Kroki segmentacji regionów obrazu zawierających komórki przy użyciu nowatorskiego, wielotorowego podejścia. Podejście to można wykorzystać do segmentacji obrazów kontrastu fazowego, jasnego pola lub fluorescencji komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-10
Rysunek 10: Mapowanie wartości punktów siatki na poszczególnych komórkach - część 2. Etapy segmentacji pojedynczych komórek monowarstwy przy użyciu nowatorskiego, wielotorowego podejścia opracowanego w AnViM. Podejście to można wykorzystać do segmentacji obrazów kontrastu fazowego, jasnego pola lub fluorescencji komórek. Szczegółowy widok kroku 2 przedstawiono na rysunku uzupełniającym S10. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-11
Rysunek 11: Mapowanie wartości punktów siatki na poszczególne komórki - część 3. Kroki oceny intensywności pikseli w regionie w poszczególnych komórkach i w sąsiednim regionie poszczególnych komórek przy użyciu AnViM. Oceniane natężenia obejmują natężenie światła przechodzącego i natężenie fluorescencji. Ta część odwzorowuje wartość mediany i odchylenie standardowe intensywności pikseli w poszczególnych komórkach i w sąsiednim regionie poszczególnych komórek. Szczegółowy widok kroku 2 przedstawiono na rysunku uzupełniającym S11. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-12
Rysunek 12: Mapowanie wartości punktów siatki na poszczególne komórki - część 4. Kroki oceny sił i właściwości ruchu punktów siatki w poszczególnych komórkach oraz w sąsiednim regionie poszczególnych komórek przy użyciu AnViM. Ta część odwzorowuje wartość mediany i odchylenie standardowe właściwości w poszczególnych komórkach oraz w sąsiednim regionie poszczególnych komórek. Szczegółowy widok etapów 2 i 3 przedstawiono na rysunku uzupełniającym S12 i rysunku uzupełniającym S13. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-13
Rysunek 13: Wizualizacja wyników - część 1. Kroki śledzenia właściwości poszczególnych komórek przez cały czas trwania eksperymentu przy użyciu AnViM. Szczegółowy widok etapów 2 i 3 przedstawiono na rysunku uzupełniającym S14 i rysunku uzupełniającym S15. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-14
Rysunek 14: Wizualizacja wyników - część 2. Kroki generowania śladów czasowych ocenianych właściwości za pomocą AnViM. Użytkownik ma możliwość wykreślenia do trzech właściwości na jednym wykresie. Ślady czasowe są generowane dla wszystkich komórek lub tylko dla tych komórek, dla których śledzenie zakończyło się powodzeniem w całym eksperymencie. Szczegółowy widok kroku 5 przedstawiono na rysunku uzupełniającym S16 i rysunku uzupełniającym S17. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-15
Rysunek 15: Wizualizacja wyników - część 3. Kroki generowania map cieplnych ocenianych nieruchomości za pomocą AnViM. Mapy skupień są generowane dla wszystkich klatek następujących po klatce początkowej i wszystkich wybranych właściwościach. Szczegółowy widok kroku 3 przedstawiono na rysunku uzupełniającym S18. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-16
Rysunek 16: Ślady czasowe dla komórki o identyfikatorze 1. Dwie wyświetlane właściwości to komórkowe napięcie cytoszkieletu ("avgtenMedian") i prędkość komórkowa ("speedMedian"). Zarówno napięcie cytoszkieletu komórkowego, jak i prędkość komórkowa są określane ilościowo jako mediana wartości w punktach siatki w komórkach. Dwie właściwości są wykreślane na tej samej osi z dowolnymi jednostkami w celu wizualizacji relacji między ocenianymi właściwościami. Dodatkowe nazwy zmiennych są wymienione w tabeli uzupełniającej S1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-17
Rysunek 17: Mapy cieplne właściwości poszczególnych komórek w analizowanej monowarstwie. Każda komórka jest kolorowana medianą wartości właściwości wskazanej w panelu. Tak więc głęboka czerwień oznacza maksymalną wartość komórkową w spektrum kolorów, a głęboki niebieski oznacza minimalną wartość komórkową w analizowanej monowarstwie. Jak opisano w Tambe et al., PLoS One (2013)2, komórki znajdujące się bliżej granicy mają siły mechaniczne, na które wpływają nieznane właściwości komórek znajdujących się poza obrazem. W związku z tym mapa cieplna jest generowana dla komórek oddalonych od granicy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek S1: Przykładowe obrazy górnego i dolnego koralika fluorescencyjnego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek S2: Szczegółowy widok kroku 2 z Rysunek 3. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek S3: Szczegółowy widok kroku 4 z Rysunek 3. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek S4 A: szczegółowy widok kroku 6 z Rysunek 3. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek S5: Szczegółowy widok kroku 3 z Rysunek 5. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek S6: Szczegółowy widok kroku 5 z Rysunek 5. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek S7: Szczegółowy widok kroku 3 z Rysunek 6. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek S8: Szczegółowy widok wyjścia siły komórka-ECM z kroku 6 z Rysunek 8. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek S9: Szczegółowy widok siły wyjściowej komórka-komórka kroku 6 z Rysunek 8. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek S10: Szczegółowy widok kroku 2 z Rysunek 10. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek S11: Szczegółowy widok kroku 2 z Rysunek 11. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek S12: Szczegółowy widok kroku 2 z Rysunek 12. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek S13: Szczegółowy widok danych wyjściowych kroku 3 z Rysunek 12. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek S14: Szczegółowy widok kroku 2 w Rysunek 13. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek S15: Szczegółowy widok kroku 3 z Rysunek 13. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek S16: Szczegółowy widok plików danych wygenerowanych w kroku 5 z Rysunek 14. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek S17: Szczegółowy widok wykresu wygenerowanego w kroku 5 z Rysunek 14. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek S18: Szczegółowy widok mapy cieplnej i pliku zawierającego zakres spektrum kolorów wygenerowany w kroku 4 od Rysunek 15. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela S1: Lista wybranych właściwości określonych ilościowo przez iTACS. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki przylegające wykorzystują zarówno sygnały mechaniczne, jak i chemiczne, aby przetrwać, rosnąć i funkcjonować. Szeroka gama oprogramowania mikroskopowego optymalizuje doświadczenie użytkownika w ocenie sygnałów chemicznych za pomocą obrazowania opartego na fluorescencji. Jednak ocena sygnałów mechanicznych obejmuje możliwości, które nie są dostępne w standardowym oprogramowaniu do mikroskopii. Co więcej, ocena sygnałów mechanicznych jest najbardziej efektywna, gdy akwizycja danych jest zintegrowana z analizą danych. Brak ujednoliconej platformy, która spełniałaby unikalne potrzeby mechanicznej oceny sygnałów, stanowi poważną lukę technologiczną w eksperymentalnej biologii komórki. Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals (iTACS) został zaprojektowany, aby wypełnić tę lukę. Dwa komponenty iTACS, AnViM i AcTrM, wyposażają użytkowników w niezbędne możliwości ilościowego określania właściwości komórkowych w czterech szerokich kategoriach: siły, ruch, morfologia i fluorescencja/jasność. We wszystkich tych kategoriach iTACS jest obecnie w stanie ujawnić ponad 50 unikalnych aspektów poszczególnych przylegających komórek. Aspekty te obejmują specyficzne właściwości każdej szerokiej kategorii, w tym ich reprezentatywną wartość i zmienność w całej komórce (tabela uzupełniająca S1). Na przykład w obrębie sił występują siły rozciągające w poprzek cytoszkieletu, anizotropia tego napięcia, orientacja maksymalnego napięcia i naprężenie ścinające na granicy komórka-ECM, które ma głęboki wpływ na zachowanie przylegających komórek 1,3,6.

Nowatorskie podejście do badania mechanicznego zachowania pojedynczych komórek monowarstwy
Poszczególne komórki monowarstwy są zaangażowane w wymianę sygnałów o charakterze chemicznym i mechanicznym3. Te dwa rodzaje sygnałów są przesyłane przez monowarstwę komórkową w różny sposób23. Jednak wiedza na temat mechanicznej transmisji sygnałów pozostaje w tyle za wiedzą na temat transmisji sygnałów chemicznych. Ta luka w wiedzy zbiega się z utrzymującym się brakiem prostych i intuicyjnych podejść do oceny komórkowych sygnałów mechanicznych. Opisane tutaj nowatorskie podejście do mapowania danych jest w stanie wypełnić tę lukę. Takie mapowanie ujawnia, że fluktuacja wewnętrznego napięcia cytoszkieletu w sąsiednim regionie komórki służy jako sygnały relaksacyjne, fluidyzacyjne i zakotwiczające, które regulują zmiany kształtu, rozmiaru i szybkości komórki18. Mapy właściwości sąsiednich regionów wykazują wzorce "podziału wielokomórkowego", w których komórki w obrębie podpodziału są wystawione na działanie stosunkowo jednolitego mikrośrodowiska, a komórki na granicy podziału są narażone na wyjątkowo niejednorodne mikrośrodowisko18.

Dostępność technologii pomiaru siły
Istnieje wiele protokołów do wytwarzania hydrożeli PAA, analizowania deformacji hydrożelu i ruchu komórkowego oraz ilościowego określania sił komórka-ECM i komórka-komórka 1,2,7,8,9,13,14,15,18,20,21,24,25, 26,27,28,29,30,31,32. Jednak te osiągnięcia pozostają poza zasięgiem powszechnych laboratoriów biologii komórki i ograniczają się do laboratoriów posiadających wiedzę inżynierską. Poprzez automatyzację technicznych aspektów tych podejść i zintegrowanie ich w ramach ujednoliconej i przyjaznej dla użytkownika platformy, celem iTACS jest sprawienie, aby ocena sygnałów mechanicznych stała się rutynową czynnością w eksperymentalnych badaniach i edukacji w dziedzinie biologii komórki.

ImageJ umożliwia użytkownikom tworzenie aplikacji przy użyciu podejść, które wymagałyby niewielkiego lub żadnego szkolenia11. iTACS jest w dużej mierze zbudowany przy użyciu prostych podejść skryptowych, aby ułatwić ciągły rozwój kierowany przez społeczność. Większość AcTrM jest programowana za pomocą skryptów BeanShell, a większość AnViM jest programowana za pomocą makr ImageJ. Te skrypty i wskazówki dotyczące implementowania tych funkcji w mikroskopie użytkownika są dostępne za pośrednictwem usługi GitHub (https://github.com/IntegrativeMechanobiologyLaboratory/iTACS).

Standaryzacja jakości pozyskiwanych obrazów
Chociaż techniki oparte na substratach elastycznych do ilościowego określania sił fizycznych w przylegających komórkach zostały opracowane i wdrożone w różnych laboratoriach, protokołowi nadal brakuje standaryzacji. Jednym z obszarów, który najbardziej wymaga standaryzacji, jest jakość pozyskanych obrazów górnych koralików (rysunek uzupełniający S1). Istotne problemy wynikają z dryfu ostrości w całym eksperymencie. Nasze nowatorskie podejście do ponownego ogniskowania oparte na obrazie referencyjnym sprawia, że takie ogniskowanie jest obiektywnym procesem. Parametry zdefiniowane w pierwszym kroku AcTrM narzucają niezbędne obiektywne limity jakości. Inne środki standaryzacji można zaprogramować w przyszłych wersjach AcTrM.

Szerokie zastosowanie iTACS
Oprócz ilościowego określenia wielu aspektów przylegających komórek, struktura iTACS ułatwia jej wykorzystanie w różnych protokołach eksperymentalnych i potrzebach. AcTrM umożliwia użytkownikowi samodzielną naukę pod kątem oprogramowania. Szybkie obrazowanie, wymagane na przykład przez jednoczesną ocenę cytoplazmatycznych wahań stężenia wapnia, jest obecnie ograniczone przez szybkość sprzętu do zmiany położenia i ponownego ustawiania ostrości i najlepiej jest wykonywać je w jednym miejscu na raz. Jednak obecna implementacja jest dobrze przygotowana do długotrwałego obrazowania, obrazowania przerywanego, w którym próbka nie może być zatrzymana na stoliku mikroskopowym przez cały czas trwania eksperymentu. Ponieważ obrazy referencyjne są pozyskiwane na początku eksperymentu, iTACS umożliwia obrazowanie sygnałów mechanicznych w czasie rzeczywistym, otwierając nowe możliwości w zastosowaniach przesiewowych leków. AnViM pozwala użytkownikom dostarczać wysoce techniczne informacje w sposób zrozumiały dla laika. Zdolność do ilościowego określenia szerokiego spektrum właściwości komórkowych i śledzenia ich w trakcie eksperymentu stanowi kluczowe zdolności potrzebne do odkrycia nowych mechanizmów komunikacji międzykomórkowej.

Dla przyszłego rozwoju iTACS zidentyfikowaliśmy cztery obszary, na których się skupiamy: (1) zwiększenie szybkości pozyskiwania i analizy danych, (2) wdrażanie podejść do oceny nowych sygnałów komórkowych13, (3) opracowanie warsztatów i modułów edukacyjnych na temat oceny sygnału komórkowego opartego na iTACS, (4) rozwój tanich rozwiązań automatyzacji.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.T.T. dziękuje pracownikom związanym z Centrum Biologii Płuc na Uniwersytecie Południowej Alabamy za stymulowanie dyskusji na temat potrzeb badawczych w zakresie eksperymentalnej biologii komórki. Dyskusje te odegrały kluczową rolę w zainicjowaniu rozwoju iTACS.

Ta praca była częściowo wspierana przez granty z National Institute of Health/National Heart Lung Blood Institute, P01 HL66299 i R37 HL60024 (Stevens), R01-HL118334 (Alvarez), F32-HL144040-01 (Xu), oraz z University of South Alabama poprzez Abraham Mitchell Cancer Research Fund (Singh, Palanki, Tambe), Research and Scholarly Development Grant (Tambe), Honors College i Summer Undergraduate Research Fellow (Nguyen).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki i składniki stosowane do przygotowania powierzchni szkła do powlekania hydrożelem
(3-aminopropylo)trimetoksysilan, 97%Aldrich chemia13822565
2% Bis RoztwórBio-rad1610142
3-(trimetoksysililo)propylometakrylan,98%Acros organics2530850
40% Roztwór akryloamiduBio-rad1610140
Szklane dno Naczynie 35 mm / płytki 6 lub 12 lub 24 dołkoweMatTek lub CellVis
Aldehyd glutarowy, klasa EM, 25%Polysciences1909100
Wodorotlenek soduSigma-aldrich1002074706
Odczynniki i składniki używane do przygotowania odpowiedniego hydrożelu
2% roztwór BisBio-rad1610142
40% roztwór akryloamiduBio-rad1610140
Nadsiarczan amonuBio-rad1610700
Szkiełka nakrywkoweMikroskopia elektronowa Nauki7222301
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (1M)Gibco14190136
Karboksylan FluoSpheres 0,2 μm, żółto-zielony(505/515)InvitrogenF8811
Karboksylan FluoSpheres 0,5 μm, czerwony(580/605)InvitrogenF8812
Karboksylan FluoSpheres 2,0 μm, czerwony(580/605)InvitrogenF8826
Rain-X
TEMEDBio-rad1610801
Odczynniki stosowane do powlekania macierzy zewnątrzkomórkowej hydrożelu
Rat TailCorning354236
HEPES(1M)Gibco15630080
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (1M)Gibco10010023
Sulfo-SANPAHCovaChem102568434
Mikroskop używany w obecnym badaniu
CameraHamamatsu Flash 4.0 LT sCMOS CameraC11440-42U
H117 ProScanTM StagesPrior Scientific Źródło
światła- Lambda DG4 i Lambda DG5Firma Sutter Instrument Mikroskop
Nikon eclipse TE2000-S550372
Uniwersalny sterownik automatyzacji mikroskopu ProScan IIIPrior Scientific
Inkubator Stagetopibidi11922
Napęd ostrości silnika krokowegoPrior Scientific
Collagen typu I

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
  2. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PloS One. 8 (2), 55172(2013).
  3. Das, T., et al. A molecular mechanotransduction pathway regulates collective migration of epithelial cells. Nature Cell Biology. 17 (3), 276-287 (2015).
  4. Vedula, S. R., et al. Mechanics of epithelial closure over non-adherent environments. Nature Communications. 6, 6111(2015).
  5. Lamason, R. L., et al. Rickettsia Sca4 reduces vinculin-mediated intercellular tension to promote spread. Cell. 167 (3), 670-683 (2016).
  6. Sunyer, R., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
  7. Dong, L., Oberai, A. A. Recovery of cellular traction in three-dimensional nonlinear hyperelastic matrices. Computer Methods in Applied Mechanics and Engineering. 314, 296-313 (2017).
  8. Nier, V., et al. Kalman inversion stress microscopy. Biophysical Journal. 115 (9), 1808-1816 (2018).
  9. Serrano, R., et al. Three-dimensional Monolayer Stress Microscopy. Biophysical Journal. 117 (1), 111-128 (2019).
  10. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of Image Analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  11. Schindelin, J., et al. Fiji - an Open Source platform for biological image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  12. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using microManager. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14, Unit14 20(2010).
  13. Patel, N. G., et al. Unleashing shear: Role of intercellular traction and cellular moments in collective cell migration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (2), 279-285 (2020).
  14. Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motility and the Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
  15. Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5, 426-430 (2009).
  16. Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Stricker, J., Winter, S. P., Gardel, M. L. Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), (2010).
  17. King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvascular Research. 67 (2), 139-151 (2004).
  18. Patel, G., et al. Mechanical signaling in a pulmonary microvascular endothelial cell monolayer. Biochemical and Biophysical Research Communications. 519 (2), 337-343 (2019).
  19. Kähler, C. J., et al. Main results of the 4th International PIV Challenge. Experiments in Fluids. 57 (6), 97(2016).
  20. Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1506-1511 (2012).
  21. Alvarez-Gonzalez, B., et al. Two-layer elastographic 3-D traction force microscopy. Scientific Reports. 7, 39315(2017).
  22. Makarchuk, S., Beyer, N., Gaiddon, C., Grange, W., Hebraud, P. Holographic traction force microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 3038(2018).
  23. Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
  24. Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method. Biophysical Journal. 70 (4), 2008-2022 (1996).
  25. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  26. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  27. Saez, A., et al. Traction forces exerted by epithelial cell sheets. Journal of Physics. Condensed Matter. 22 (19), 194119(2010).
  28. Deforet, M., et al. Automated velocity mapping of migrating cell populations (AVeMap). Nature Methods. 9 (11), 1081-1083 (2012).
  29. Polio, S. R., Smith, M. L. Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces. Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).
  30. Toyjanova, J., et al. 3D Viscoelastic traction force microscopy. Soft Matter. 10 (40), 8095-8106 (2014).
  31. Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. J., Trepat, X. Mapping forces and kinematics during collective cell migration. Methods in Cell Biology. 125, 309-330 (2015).
  32. Charrier, E. E., et al. A novel method to make viscoelastic polyacrylamide gels for cell culture and traction force microscopy. APL Bioengineering. 4 (3), 036104(2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Si y kom rkowemikroskopia napr e monowarstwysegmentacja obrazumikroskopia fluorescencyjnaobrazowanie hydro elinapi cie cytoszkieletuanaliza morfologii kom rekpomiar si y trakcyjnejledzenie ruchu kom rekwizualizacja danych

Powiązane artykuły