Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Testy oparte na chemiluminescencji do wykrywania tlenku azotu i jego pochodnych z autooksydacji i związków nitrozowanych

4.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63107

⸱

16 lutego 2022

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesia, Critical Care and Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Massachusetts General Hospital, 3Harvard Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokoły wykrywania tlenku azotu i jego biologicznie istotnych pochodnych za pomocą testów opartych na chemiluminescencji o wysokiej czułości.

Streszczenie

Aktywność tlenku azotu (NO) in vivo to połączone wyniki jego bezpośrednich efektów, działania jego pochodnych generowanych przez autooksydację NO oraz efektów związków nitrozowanych. Pomiar metabolitów NO jest niezbędny do badania aktywności NO zarówno na poziomie naczyniowym, jak i w innych tkankach, szczególnie w warunkach eksperymentalnych, w których podawany jest egzogenny NO. Testy chemiluminescencyjne oparte na ozonie umożliwiają precyzyjne pomiary metabolitów NO i NO zarówno w płynach (w tym w osoczu, homogenatach tkankowych, kulturach komórkowych), jak i mieszaninach gazów (np. w wydychanym powietrzu). NO reaguje z ozonem, wytwarzając dwutlenek azotu w stanie wzbudzonym. Wynikająca z tego emisja światła umożliwia fotodetekcję i generowanie sygnału elektrycznego odzwierciedlającego zawartość NO w próbce. Podwielokrotności z tej samej próbki można wykorzystać do pomiaru specyficznych metabolitów NO, takich jak azotany, azotyny, S-nitrozotiole i kompleksy żelazo-nitrozyl. Ponadto NO zużywane przez hemoglobinę bezkomórkową jest również oznaczane ilościowo za pomocą analizy chemiluminescencyjnej. Przedstawiono ilustrację wszystkich tych technik.

Wprowadzenie

Od czasu, gdy Salvador Moncada oraz laureaci Nagrody Nobla Robert Furchgott, Louis Ignarro i Ferid Murad zidentyfikowali tlenek azotu (NO) jako wcześniej znany czynnik rozkurczowy pochodzenia śródbłonkowego (EDRF), ustanowiono centralną rolę NO w kilku kluczowych mechanizmach obejmujących biologię naczyniową, neuronauki, metabolizm oraz odpowiedź gospodarza1,2,3,4,5,6,7. Egzogenne podawanie gazowego NO stało się uznaną metodą leczenia niewydolności oddechowej spowodowanej nadciśnieniem płucnym u noworodków8. Badano również zastosowanie tlenku azotu w gazie w leczeniu zakażeń wirusem RSV (wirusem RSV), malarii i innych chorób zakaźnych, uszkodzeń reperfuzyjnych oraz w zapobieganiu ostremu uszkodzeniu nerek u pacjentów poddawanych operacjom kardiochirurgicznym9,10,11,12. Potrzeba precyzyjnych technik pomiarowych do oceny poziomów NO, jego metabolitów oraz białek i związków docelowych wynika zarówno z badań mechanistycznych, jak i interwencyjnych.

Ze względu na wysoką reaktywność, NO może wchodzić w różne reakcje w zależności od macierzy biologicznej, w której jest produkowane i/lub uwalniane. W obecności hemoglobiny (Hb) lub innych oksyhemoprotein, NO ulega niemal całkowitemu utlenieniu do azotynów (NO2-).

2NO + O2 → 2NO2

NO2 + NO → N2O3

N2O3 + H2O → NO2- + H+

NO najpierw ulega autooksydacji w obecności tlenu cząsteczkowego (O2), w wyniku czego powstaje dwutlenek azotu (NO2), który następnie reaguje z samym NO2, tworząc trutlenek diazotu (N2O3). Jedna cząsteczka N2O3 reaguje z wodą (H2O), tworząc dwie cząsteczki NO2- oraz proton (H+)13. W krwi pełnej14,15 NO i NO2- są szybko przekształcane w azotan (NO3-), ponieważ cząsteczki te intensywnie reagują z utlenionymi grupami hemowymi Hb [Hb-Fe2+-O2 lub oksyhemoglobiną (oxyHb)], prowadząc do powstania NO3-. Reakcja ta jest powiązana z przejściem grupy hemowej w stan żelazowy [Hb-Fe3+ lub methemoglobinę (metHb)]:

Hb-Fe2+-O2 + NO → Hb-Fe3+ + NO3-

Bariera z czerwonych krwinek (RBC) oraz przestrzeń bezpośrednio sąsiadująca z śródbłonkiem są głównymi czynnikami ograniczającymi tę reakcję i pozwalającymi niewielkiej części NO uwalnianego przez śródbłonek działać jako EDRF16,17. W rzeczywistości wiadomo, że wolna hemoglobina (Hb) w krążeniu zaburza wazodylatację w warunkach eksperymentalnych i klinicznych17,18. Wewnątrz RBC, w zależności od natlenienia i stężenia NO2-, część NO reaguje z deoksyhemoglobiną (Hb-Fe2+), tworząc hemoglobinę żelazo-nitrozylową (Hb-Fe2+-NO lub HbNO):

Hb-Fe2+ + NO → Hb-Fe2+-NO

W krwince czerwonej (RBC)15,17, NO2- może tworzyć Hb-Fe3+ poprzez redukcję Hb-Fe2+, co prowadzi do uwolnienia NO, które z kolei wiąże (preferencyjnie) Hb-Fe2+-O2 lub Hb-Fe2+.

Proces generowania pochodnych NO nie powinien być rozpatrywany jako ściśle jednokierunkowy, ponieważ NO może być regenerowane z NO2- oraz NO3- w różnych tkankach i przez różne enzymy (np. przez bakterie jelitowe lub wewnątrz mitochondriów, szczególnie w warunkach hipoksji)19,20.

Zmienna ilość produkowanego (lub podawanego) NO prowadzi do wtórnego powstawania S-nitrozotioli, głównie poprzez transnitrozację tioli z N2O3 w obecności nukleofila, co tworzy pośredni donor NO+ (Nuc-NO+-NO2-):

N2O3 + RS- → RS-NO + NO2-

Inną możliwością generowania S-nitrozotioli jest nitrosylacja utlenionych tioli (reakcja NO z utlenionym tiolem):

RS• + NO → RS-NO

Ten mechanizm oraz bezpośrednie utlenianie grup tiolowych przez NO2 mogą zachodzić jedynie w bardzo specyficznych warunkach, które zostały opisane w innym opracowaniu21. S-nitrozotiolami są zarówno małe cząsteczki, takie jak S-nitrozoglutathione, jak i duże białka zawierające grupy tiolowe. S-nitrozohemoglobina (S-NO-Hb) powstaje w wyniku nitrozowania grupy tiolowej konserwowanego resztu cysteiny w łańcuchu β (β93C)22.

Generowanie i metabolizm S-nitrozotioli stanowią część istotnych mechanizmów regulacyjnych. Przykłady obejmują regulację glutationu, kaspaz, N-metylu-D-asparaginianu (NMDA) oraz receptorów rjanodynowych23,24,25,26,27,28. Nitrozowana albumina (S-nitrozoalbumina), wcześniej uważana za główny mediator biologii NO in vivo, wydaje się być transporterem NO/NO+ pozbawionym specyficznej dodatkowej aktywności biologicznej29.

Podczas pomiaru stężenia NO i jego pochodnych w konkretnej próbce biologicznej w obrębie macierzy biologicznej, istotne jest uwzględnienie takich charakterystyk jak kwasowość, natlenienie, temperatura oraz obecność odczynników. Przykładami są podawane egzogenne donory NO, a w stanie ostrego stanu zapalnego nadtlenek wodoru (H2O2) reagujący z NO2 , co prowadzi do generowania nadmiernego stężenia wolnych rodników, takich jak nadtlenek azotkowy (ONOO-)21. Poza zastosowaną metodą analityczną, fundamentalna jest przedanalityczna faza przygotowania i przechowywania próbek. Należy przewidzieć, rozważyć i zablokować reakcje następcze, które nie odzwierciedlają aktywności NO in vivo. Trafnym przykładem jest niestabilność S-NO-Hb, co wymaga specjalnego opracowania próbek krwi, gdy są one przeznaczone do pomiaru22.

Analizy oparte na chemiluminescencji stanowią złoty standard w wykrywaniu poziomów NO oraz jego głównych metabolitów [NO2-, NO3-, S-NO i kompleksów żelazo-nitrozylnych (Fe-NO)] w dowolnym płynie biologicznym, w tym w homogenatach tkanek30,31. Metody te opierają się na detektorze chemiluminescencyjnym (CLD), który jest urządzeniem umożliwiającym zajście reakcji NO z ozonem (O3), w wyniku której powstaje NO2 w stanie wzbudzonym (NO2•). Relaksacja NO2• powoduje emisję fotonu światła, który jest wykrywany przez fotopowielacz, generując sygnał elektryczny wprost proporcjonalny do zawartości NO w pobranej mieszaninie gazów32. Przedstawiono uproszczony schemat CLD.

Schemat detekcji chemiluminescencyjnej przedstawiający reakcje NO i O₃; układ z fotopowielaczem.
Rycina 1: Uproszczony schemat detektora chemiluminescencyjnego do tlenku azotu(II). Detekcja tlenku azotu (NO) oparta na chemiluminescencji polega na stechiometrycznym generowaniu jednego fotonu na każdą cząsteczkę gazowego NO wprowadzoną do detektora chemiluminescencyjnego (CLD). Reakcja chemiluminescencyjna zachodzi w specjalnej komorze zasilanej ozonem (O3) z wewnętrznego generatora, w której utrzymywane jest podciśnienie dzięki połączeniu z zewnętrzną pompą, co umożliwia ciągły i stały dopływ gazu próbnego. Generowanie O3 wymaga tlenu cząsteczkowego (O2), który jest dostarczany z dedykowanej butli z O2 podłączonej do CLD (inni producenci oferują detektory CLD pracujące z powietrzem otoczenia). W komorze reakcyjnej każda cząsteczka gazu NO zawarta w pobranej próbce reaguje z tlenem, tworząc jedną cząsteczkę dwutlenku azotu w stanie wzbudzonym (NO2*). Powracając do stanu podstawowego, każda cząsteczka NO2* emituje jeden foton, który jest wykrywany przez fotopowielacz (PMT) znajdujący się obok komory reakcyjnej. PMT wraz z powiązanym wzmacniaczem i jednostką centralną generuje sygnał proporcjonalny do liczby fotonów oraz liczby cząsteczek NO w komorze reakcyjnej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wlot próbkowy CLD można podłączyć do układu szklanego zawierającego komorę reakcyjną dla próbek ciekłych. Układ jest stale płukany gazem obojętnym, takim jak azot, hel lub argon, który przenosi NO z komory reakcyjnej do CLD. Próbki w fazie ciekłej są wstrzykiwane przez specjalną membranę do naczynia płuczącego.

Schemat chemicznego systemu gazowego, przedstawiający naczynie przepłukujące, pułapkę z NaOH i układ przepływu gazu.
Rysunek 2: Budowa naczynia przepłukującego do detekcji tlenku azotu w oparciu o chemiluminescencję Naczynie przepłukujące (po prawej) umożliwia detekcję gazowego tlenku azotu (NO) lub każdego innego związku, który może zostać łatwo przekształcony w gaz NO po uwolnieniu z reagentu w fazie ciekłej. Wlot gazu obojętnego jest połączony ze źródłem (butlą) gazu obojętnego, takiego jak argon, ksenon lub azot cząsteczkowy (N2). Zawór iglicowy (otwierany w lewo) służy do kontroli ciśnienia w naczyniu przepłukującym i może zostać całkowicie usunięty w celu oczyszczenia naczynia. Port wtryskowy jest przykryty nakrętką z membraną do wstrzykiwania próbek. Membrana powinna być często wymieniana. Komora reakcyjna jest otoczona płaszczem grzewczym, który jest podłączony do kąpieli wodnej w celu przeprowadzenia analizy VCl3 w HCl. Wylot naczynia przepłukującego jest połączony z detektorem chemiluminescencyjnym (CLD) lub pułapką z NaOH (wymaganą przy analizach VCl3 w HCl). Aby opróżnić zawartość komory reakcyjnej, należy najpierw zamknąć kurki przy wlocie gazu obojętnego i wylocie naczynia przepłukującego, zamknąć zawór iglicowy, zdjąć nakrętkę z portu wtryskowego, a na koniec otworzyć kurek spustowy. Pułapkę z NaOH (po lewej) należy umieścić w linii między naczyniem przepłukującym a CLD w przypadku przeprowadzania analizy VCl3 w HCl ze względu na korozyjność HCl. Połączenie z CLD zawsze wymaga zastosowania filtra dielektrycznego o intensywnym polu (IFD) umieszczonego pomiędzy CLD a wylotem naczynia przepłukującego (lub pułapką z NaOH, jeśli jest stosowana). Filtr IFD usuwa cząsteczki przenoszone przez powietrze i zapobiega przedostawaniu się cieczy przez naczynie przepłukujące. PTFE = politetrafluoroetylen. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

W konsekwencji każdy związek, który może zostać przekształcony w NO w wyniku specyficznej i kontrolowanej reakcji chemicznej, może zostać wykryty z wysoką czułością w dowolnym płynie biologicznym oraz homogenacie tkankowym24. Bezpośredni pomiar NO w fazie gazowej za pomocą chemiluminescencji jest przeprowadzany zarówno w warunkach eksperymentalnych, jak i klinicznych. Techniki te są szeroko opisane w innych publikacjach33,34,35. Pomiar NO2-, S-nitrozotioli, białek S-nitrozowanych oraz kompleksów Fe-NO można przeprowadzić poprzez dodanie próbek do mieszaniny reakcyjnej z trijodkiem (I3-), który stechiometrycznie uwalnia gaz NO z wszystkich tych związków:

I3- → I2 + I-

2NO2− +2I− +4H+ → 2NO + I2 +2H2O

I3− + 2RS-NO → 3I− + RSSR + 2NO+

2NO+ + 2I− → 2NO + I2

podczas gdy I3- nie reaguje z NO3-15. Precyzyjne pomiary każdego związku są możliwe dzięki wstępnej obróbce alikwotów próbek zakwaszonym sulfanilamidem (AS) z dodatkiem lub bez dodatku chlorku rtutnego (HgCl2). W szczególności obróbka za pomocą AS usuwa całą zawartość NO2-. W konsekwencji zawartość NO mierzona metodą CLD odzwierciedla jedynie sumę stężeń S-NO i Fe-NO. Wstrzyknięcie HgCl2 do alikwotu próbki przed wstrzyknięciem AS powoduje uwalnianie NO2- z S-NO. Obróbka za pomocą AS (prowadząca do usunięcia NO2-) zapewnia, że mierzona zawartość NO odzwierciedla jedynie stężenie Fe-NO. Seria odejmowań między poszczególnymi pomiarami pozwala obliczyć dokładne stężenie trzech pochodnych NO22.

Diagram równowagi statycznej; metoda analizy chemicznej; schemat procesu; analiza NO2−, S-NOs, Fe-NOs.
Rysunek 3: Etapy przygotowania próbek do analizy chemiluminescencyjnej I3- w kwasie octowym. Przedstawiono sekwencyjne etapy przygotowania do analizy chemiluminescencyjnej I3- w kwasie octowym. Wymagane jest użycie probówek do wirowania chroniących przed światłem. Probówki 1, 2 i 3 są wykorzystywane do przygotowania analizy. Kolejna alikwota próbki (probówka 4) jest niezbędna do analizy VCl3 w HCl, jeśli wymagany jest pomiar azotanów (NO3-). Etapy są oznaczone numerami w kolorze czerwonym. Napełnij wstępnie (Krok 1), zgodnie z instrukcją, buforem fosforanowym (PBS) lub HgCl2 przed dodaniem objętości próbki. Dodaj objętość próbki (2) zgodnie z instrukcją, wymieszaj w wortexie i inkubuj przez 2 min w temperaturze pokojowej (RT). Dodaj (3) PBS lub zakwaszony sulfanilamid (AS) zgodnie z instrukcją, wymieszaj w wortexie i inkubuj przez 3 min w RT. Przeprowadź analizę (4). Stężenie zmierzone podczas analizy jest sumą stężeń związków wymienionych pod każdą probówką. Probówka numer 1 pozwoli na pomiar azotynów (NO2-), S-nitrozotioli (S-NO) i kompleksów żelazo-nitrozylowych (Fe-NOs) jako pojedynczego sygnału. Do pomiaru azotanów (NO3-) próbki należy poddać obu analizom: I3- w kwasie octowym oraz VCl3 w HCl, a wartość uzyskaną z probówki 1 należy odjąć od wartości uzyskanej z probówki 4. *sugerowane ilości do analizy Hb w celu oznaczenia pozostałych NO2-, S-nitrozhemoglobiny i żelazo-nitrozylu-hemoglobiny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Do pomiaru NO3- stosuje się chlorek wanadu(III) (VCl3) w kwasie solnym (HCl) w celu konwersji NO3- do NO w naczyniu płukania, aby umożliwić stechiometryczny pomiar NO3- za pomocą detekcji chemiluminescencyjnej (CLD):

2 NO3-+ 3V+3 + 2H2O → 2NO + 3VO2+ + 4H+

Aby uzyskać wystarczająco szybką konwersję, reakcję należy przeprowadzić w temperaturze 90-95 °C. Redukcja NO3- do NO2- jest sprzężona z redukcją NO2- do NO przez HCl. Metal wanadu również redukuje S-NO, uwalniając ich grupę NO22,36. Końcowe stężenie uzyskane metodą CLD z użyciem VCl3 w HCl odzwierciedla sumaryczne stężenie NO3-, NO2 oraz innych związków nitrozowanych. Odjęcie tej wartości od stężenia otrzymanego za pomocą CLD z I3- pozwala na obliczenie stężenia NO3-36,37 (Rysunek 3).

W teście zużycia NO ciągłe uwalnianie NO w naczyniu płuczącym przez donory NO, takie jak (Z)-1-[2-(2-aminoetylo)-N-(2-ammonioetylo)amino]diazen-1-ium-1,2-diolat (DETA-NONOate), generuje stabilny sygnał umożliwiający ilościowe oznaczenie wolnej od komórek oxyHb w wstrzykniętych próbkach. Ilość NO zużyta w naczyniu płuczącym pozostaje w relacji stechiometrycznej z ilością oxyHb w próbce.38.

Przedstawiono protokoły pomiaru NO2-, NO3-, S-nitrozotioli, kompleksów żelazo-nitrozyl oraz zużycia NO przez bezkomórkową Hb w próbkach osocza. Badania nad NO w środowisku RBC wymagają specjalnej obróbki próbek, a następnie zastosowania chromatografii wykluczającej w celu pomiaru niezwykle niestabilnych S-NO-Hb i Hb-NO, połączone z oznaczeniem całkowitego stężenia Hb15,22. Przygotowanie próbek jest kluczowe dla poprawnego przeprowadzenia pomiaru. Obecność NO2- w H2O oraz uwalnianie NO2- podczas analizy mogą prowadzić do pomiaru sztucznie zawyżonych stężeń pochodnych NO, takich jak S-NO-Hb14,39. Przedstawiono również istotne aspekty przygotowania próbek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedury wskazane w tym protokole są zgodne z komisją rewizyjną Massachusetts General Hospital. Próbki krwi, które zostały użyte, zostały pobrane podczas poprzedniego badania i zostały pozbawione elementów pozwalających na identyfikację dla obecnego celu18.

UWAGA: Zobacz instrukcje producenta, aby uzyskać szczegółowe wskazówki dotyczące optymalnych połączeń między rurkami a naczyniami szklanymi składającymi się na naczynie czyszczące, mycie i ogólną konserwację. Połączenia muszą być mocne i starannie wykonane, aby nie uszkodzić szkła. Zidentyfikuj elementy szklanego naczynia do przeczyszczania: przewód wlotowy gazu, naczynie odpowietrzające z płaszczem grzewczym i skraplaczem, syfon gazowy wodorotlenku sodu (NaOH), przewód połączeniowy między naczyniem przewietrzającym a bełkotką, przewód wylotowy gazu ze zbiornika przepłukującego (do CLD) wyposażony w filtr dielektryczny o intensywnym polu (IFD). Przewód filtrujący IFD między naczyniem odpowietrzającym a wlotem próbki CLD musi być na swoim miejscu za każdym razem, gdy mierzone są metabolity NO w postaci ciekłej (osocze, hodowle komórkowe, homogenaty tkankowe) (wszystkie testy przedstawione w protokole). Przygotowanie próbki zależy od analizowanego płynu lub tkanki oraz od interesujących związków. Ważne aspekty fazy przedanalitycznej omówiono w sekcjach 1 i 2. Szczegółowe etapy przygotowania do określonych testów są zawarte w sekcjach 3-5. Sekcje 6-8 mają zastosowanie do wszystkich testów.

1. Przygotowanie dedykowanych odczynników

UWAGA: Aby uzyskać więcej informacji, zapoznaj się z poprzednimi publikacjami15,22.

  1. Przygotować 5% (290 mM) zakwaszony roztwór sulfanilamidu (AS) do usunięcia NO2- przez rozpuszczenie 500 mg sulfanilamidu w 10 ml 1N HCl. To rozwiązanie jest stabilne przez wiele miesięcy.
  2. Przygotować 50 mM roztwór chlorku rtęci (HgCl2) do uwolnienia NO2- z S-NO, rozpuszczając 67,9 mg HgCl2 w 5 ml PBS. Chronić roztwór podstawowy przed światłem.
  3. Przygotować roztwór blokujący NO2- z 800 mM żelazocyjankiem [K3Fe (CN)6] w celu utlenienia Hb razem ze 100 mM N-etylomaleimidem (NEM) w celu zablokowania grup tiolowych i (OPCJONALNIE) 10% roztworem glikolu nonylofenylopolietylenowego (Nonidet p-40) w celu rozpuszczenia błon krwinek czerwonych.
    1. DodaćK3Fe(CN)6 do wody dejonizowanej i destylowanej (ddH2O, 263,5 g proszku na litr) do uzyskania końcowego stężenia 800 mM.
    2. Dodać NEM do roztworu 800 mMK 3Fe(CN)6 w ddH2O (12,5 g proszku na litr, aby uzyskać stężenie 100 mM) i wymieszać roztwór, aby rozpuścić wszystkie kryształy.
    3. Dodać jedną część 10% NP-40 do dziewięciu części 800 mM NEM K3Fe(CN)6 100 mM roztworu NEM (111 ml na litr) i dobrze wymieszać (obowiązkowy etap analizy krwi pełnej).
  4. Przygotować roztwór stabilizacyjny S-NO-Hb zawierający 12 mM K3Fe(CN)6, 10 mM NEM, 100 μM kwasu dietylenotriaminopentaoctowego (DTPA, do chelatacji metali) i 1% detergentu Nonidet p-40 z ich roztworów podstawowych.
    1. Przygotować 200 mM roztwór NEM, dodając kryształy NEM do PBS (25 mg/ml, np. 250 mg w 10 ml PBS) i mieszać roztwór, aż wszystkie kryształy się rozpuszczą (do wykonania w dniu doświadczenia).
    2. Przygotować roztwór o stężeniu 800 mMK 3Fe(CN)6, dodając K3Fe(CN)6 do ddH2O (263,5 mg/ml np. 1,32 g w 5 ml ddH2O, aby uzyskać końcowe stężenie 800 mM) (do wykonania w dniu doświadczenia).
    3. Przygotować 10 mM roztwór podstawowy DTPA, dodając 786 mg DTPA do 200 ml ddH2O i dostosować pH do 7,0 za pomocą 5N NaOH, aby w pełni rozpuścić DTPA.
    4. Dodać 5 ml 200 mM roztworu NEM, 1,5 ml roztworu 800 mM K3Fe(CN)6 i 1 ml roztworu podstawowego DTPA do 81,5 ml PBS o pH 7,2, a na koniec dodać 11 ml 10% NP-40, aby doprowadzić końcową objętość do 100 ml.

2. Pobieranie próbek

UWAGA: Aby uzyskać więcej informacji na temat kolekcji próbek, zapoznaj się z poprzednio opublikowanymi pracami15,22,40.

  1. Pobranie krwi pełnej
    1. Zbierz krew do probówek pokrytych heparyną, preferując naczynie żylne nad tętniczym (chyba że jest to wyraźnie wymagane) i preferując umieszczenie cewnika zamiast nakłucia żyły (jeśli to możliwe) za pomocą cewnika lub igły o wadze co najmniej 20 G lub większej, aby zminimalizować hemolizę.
    2. Natychmiast dodać roztwór blokujący NO2- (1 część roztworu na 4 części krwi pełnej), przetworzyć (sekcja 3 lub 4) lub zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  2. Zbieranie osocza i czerwonych krwinek (RBC)
    1. Zebrać krew do probówek powlekanych heparyną, preferując krew żylną nad tętniczą (chyba że jest to wyraźnie wymagane) i igieł o wadze co najmniej 20 G lub większej, aby zminimalizować hemolizę i natychmiast odwirować przez 5 minut przy 4000 x g w temperaturze 4 °C.
    2. Zmieszać supernatant (osocze) z roztworem blokującym NO2 (1 część roztworu na 4 części supernatantu) w nowej probówce i przeprowadzić proces (sekcje 3 lub 4) lub zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Do testu zużycia NO nie można użyć roztworu blokującego NO2-. Test można wykonać bez wstępnej obróbki osocza.
    3. Zawiesić osad RBC od dołu do nowej probówki wstępnie napełnionej roztworem stabilizującym S-NO (patrz krok 1.4) (1 ml osadu na 9 ml roztworu) i inkubować przez 5 minut.
    4. Przepuścić lizat RBC w kolumnie zaklejającej z polimerem G-25 Sephadex, który został uprzednio przepłukany ddH2O do chromatografii wykluczającej
    5. Zbierz frakcję Hb do przetworzenia (sekcja 4) i zmierz stężenie Hb za pomocą odczynnika Drabkina (pomiar Hb patrz wcześniej opublikowana praca22).
      UWAGA: Aby przygotować i pobrać próbkę określonej tkanki/narządu, zidentyfikuj jej wnękę i chirurgicznie ją wyizoluj. Naciąć żyłę, przebić tętnicę i wstrzyknąć heparynizowaną sól fizjologiczną (10 U/ml) przez tętnicę. Wytnij tkankę, gdy sól fizjologiczna zacznie cofać się do nacięcia żylnego. Homogenizować tkankę za pomocą homogenizatora mechanicznego, dodając 1 część roztworu blokującego NO2- do 4 części homogenizowanej tkanki.

3. VCl3 w przygotowaniu testu HCl

UWAGA: Aby uzyskać więcej informacji na temat VCl3 w przygotowaniu testu HCl, zapoznaj się z poprzednio opublikowanymi pracami37,41.

UWAGA: CLD zostanie uszkodzony, jeśli pułapka NaOH nie zostanie prawidłowo umieszczona podczas wykonywania tego testu. Wynika to z korozyjności HCl.

  1. Przygotować roztwory wzorcowe NO3- dla krzywej wzorcowej
    1. Rozpuścić 85 mgNaNO3 w 10 ml ddH2O, aby otrzymać 0,1 M NaNO3- (roztwór ten pozostaje stabilny przez kilka tygodni).
    2. Użyć roztworu podstawowego do przygotowania wzorców przez rozcieńczenie w ddH2O w celu uzyskania stężeń 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 200 μMNaNO3 w celu wykonania krzywej kalibracyjnej dla próbek osocza lub moczu (w przypadku pracy z hodowlami komórkowymi należy stosować niższe stężenia).
  2. Przygotować roztwór nasyconyVCl 3 (chlorek wanadu) do redukcji NO3- w naczyniu przewietrzającym
    UWAGA: Reakcja wody i VCl3 jest egzotermiczna. Zwróć uwagę na wysoką temperaturę szkła podczas dodawania kwasu i płukania szkła pod koniec eksperymentu.
    1. Rozpuścić 1,6 g VCl3 w 200 ml 1 M HCl, najpierw dodając VCl3 do czystej kolby, a następnie dodając 200 ml 1 M HCl.
    2. Przefiltruj próżniowo roztwór przez bibułę filtracyjną (taką jak bibuła filtracyjna 11 μm, ale można użyć dowolnej bibuły filtracyjnej).
      UWAGA: Przefiltrowany roztwór powinien zmienić kolor na jasnoniebieski, podczas gdy niefiltrowany roztwór VCl3 jest brązowy z powodu nierozpuszczonych cząstek.
    3. Nasycony roztwór należy przykryć folią aluminiową lub taśmą z politetrafluoroetylenu (PTFE), ponieważ związek ten jest wrażliwy na światło.
  3. Przygotować łaźnię z wodą obiegową
    1. Podłączyć urządzenie do kąpieli wodnej z cyrkulacyjną wodą do płaszcza wodnego naczynia przewietrzającego. Upewnij się, że linie są suche przed gruntowaniem.
    2. Rozpocząć kąpiel wodną w temperaturze 95 °C i sprawdzić, czy nie ma wycieków na przewodach wodnych, nakładając (nieprzylegające) ręczniki papierowe wokół przewodów.
  4. Ustawianie syfonu gazowego
    1. Sprawdź, czy tuleja z PTFE bełkotki jest na swoim miejscu i czy nie jest uszkodzona.
    2. Otwórz bełkotkę gazową i wstrzyknij 15 ml 1 M NaOH do podstawy bełkotki.
    3. Zmień położenie bełkotki gazowej i szczelnie uszczelnij połączenie, dociskając dolną część do góry i lekko skręcając obie części. Brak możliwości obrócenia górnej części bełkotki bez użycia siły wskazuje na prawidłowe uszczelnienie.
    4. Podłączyć wylot naczynia przepłukującego do wlotu syfonu gazu.

4. I3- w przygotowaniu do oznaczania kwasu octowego

UWAGA: Aby uzyskać więcej informacji na temat I3- w przygotowaniu do oznaczania kwasu octowego, zapoznaj się z poprzednio opublikowanymi pracami15,22,38,41,42.

  1. Przygotować krzywą wzorcową dla NO2-
    1. Przygotować roztwór podstawowy, rozpuszczając 69 mg azotynu sodu (NaNO2) w 10 ml ddH2O, aby otrzymać 100 mM roztworu. To rozwiązanie jest stabilne, jeśli jest przechowywane w hermetycznym pojemniku, schłodzone i chronione przed światłem.
    2. Seryjnie rozcieńczyć roztwór podstawowy w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml wstępnie napełnionej 900 μl ddH2O: Dodać 100 μl roztworu podstawowego do pierwszej probówki wirówkowej, wymieszać, oznaczyć etykietą i użyć 100 μl probówki do drugiej probówki, a następnie powtórzyć, uzyskując 10 mM, 1 mM, a następnie 100 μM.
    3. Następnie rozcieńczyć ddH2O, aby otrzymać 50 μM, 25 μM, 10 μM, 1 μM i 500 nM podwielokrotności NaNO2, które mają być użyte w krzywej kalibracyjnej.
  2. Przygotuj kwas octowy I3- do naczynia oczyszczającego (może być przechowywany w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 tydzień)22
    1. Dodać 2 g jodku potasu (KI) i 1,3 g jodu (I2) do 40 ml ddH2O i 140 ml kwasu octowego.
    2. Dokładnie wymieszaj, mieszając mieszaninę przez co najmniej 30 minut.
  3. Przygotować próbki do oznaczania różnicowego NO2-, S-nitrozotioli (S-NO-Hb, jeśli Hb jest zbierany) i kompleksów żelazo-nitrozyl (Hb-NO, jeśli Hb jest pobierany) (Rysunek 3)
    1. Podzielić każdą próbkę na 3 podwielokrotności po 270 μl (900 μl Hb w przypadku pomiaru S-NO-Hb i Hb-NO) w kontrolowanych przed światłem probówkach do mikrowirówek, z których 2 są wstępnie napełnione 30 μl 1x PBS (100 μL w przypadku pomiaru S-NO-Hb i Hb-NO), a trzecia probówka zawiera 30 μL HgCl2 (100 μL w przypadku pomiaru S-NO-Hb i Hb-NO), wirować i inkubować w temperaturze RT przez 2 minuty (Rysunek 3).
    2. Dodać 30 μL 5% AS do próbki z HgCl2 w celu pomiaru Fe-NO, (100 μL dla Hb-NO) i do próbki z dodatkiem PBS w celu pomiaru S-NOs i Fe-NOs (100 μL dla S-NO-Hb i Hb-NO) i dodać 30 μL PBS do trzeciej, już wstępnie wypełnionej 1x PBS, aby zmierzyć NO2-, S-NO i Fe-NO (100 μl dla pozostałości NO2- z kolekcji Hb, S-NO i Hb-NO). Wiruj i inkubuj w temperaturze RT przez 3 minuty (Rysunek 3).

5. BRAK zużycia przez konfigurację Hb bez komórek

UWAGA: Aby uzyskać więcej informacji, zapoznaj się z poprzednio opublikowaną klasą work38.

  1. Przygotować wzorcowe roztwory oxyHb z oczyszczonego roztworu podstawowego Hb o znanym stężeniu
    1. Roztwór podstawowy należy rozcieńczyć seryjnie do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml przez dodanieddH 2O, aby otrzymać roztwory, które zostaną użyte do krzywej kalibracyjnej: 62 μM, 50 μM, 25 μM, 12,5 μM, 6,25 μM, 3,125 μM, 1,56 μM.
  2. Przygotować roztwór DETA-NONOate
    1. Dodać 10 mg DETA-NOate do 610 μL 10 μM NaOH o pH 7,4 PBS, aby wytworzyć 100 mM DETA-NOate i trzymać go na lodzie.

6. Uruchom detektor chemiluminescencji (CLD) i przygotuj naczynie do oczyszczania

UWAGA: Aby uzyskać informacje na temat przygotowania naczynia do oczyszczania, zapoznaj się z poprzednio opublikowanym workiem43.

  1. Sprawdź główne połączenia do i z CLD
    1. Podłącz przewód tlenowy do CLD i otwórz butlę tlenu pod ciśnieniem uzgodnionym z producentem CLD.
    2. Upewnij się, że przewód filtra dielektrycznego pola intensywnego (IFD) jest podłączony do CLD, ale nie do naczynia przepłukującego lub syfonu NaOH
  2. Uruchamianie CLD
    1. Na interfejsie CLD uruchom program detekcji do oznaczania fazy ciekłej.
    2. Sprawdź, czy dopływ tlenu jest odpowiedni. W takim przypadku CLD pomyślnie rozpocznie pobieranie próbek od swojego wlotu i zasygnalizuje wykrycie sygnałem w miliwoltach (0-5 mV). W przeciwnym razie CLD wyda negatywny sygnał diagnostyczny.
  3. Przygotować naczynie płuczące
    1. Zamknij naczynie odpowietrzające na wszystkich trzech portach: całkowicie przykręć zawór iglicowy w prawo, zamknij kran wlotowy i wylotowy.
    2. Zdjąć nakrętkę z naczynia przepłukującego i dodać do komory reakcyjnej wystarczającą ilość odczynnika specyficznego dla planowanego oznaczenia (tabela 1), tak aby igła strzykawki używana do wstrzykiwania próbek mogła dotrzeć do kolumny płynu.
    3. Sprawdzić, czy istnieje stabilna pożądana linia bazowa (Tabela 1).
  4. Uruchom przepływ gazu płuczącego
    1. Upewnij się, że zbiornik gazu obojętnego (np. N2) jest wyposażony w dwustopniowy reduktor i połącz zbiornik gazu obojętnego z wlotem gazu do zbiornika.
    2. Otwórz gaz o ciśnieniu wylotowym na regulatorze 1-5 psi, otwórz wlot naczynia odpowietrzającego i powoli otwórz zawór iglicowy naczynia odpowietrzającego, aby umożliwić dopływ gazu. Sprawdzić, czy w naczyniu do oczyszczania nie ma bulgotania.
  5. Dostosuj przepływ gazu
    1. Zapisać ciśnienie w kuwecie zmierzone przez CLD za pomocą przewodu filtra IFD do pobierania próbek powietrza z otoczenia.
    2. Ponownie założyć korek na naczynie przewietrzającym, podłączyć przewód filtra IFD do naczynia odpowietrzającego (lub do pułapki NaOH w teścieVCl 3 w HCl) i otworzyć wylot naczynia przedmuchującego.
    3. Użyj zaworu iglicowego, aby osiągnąć to samo ciśnienie ogniwa na poziomie CLD, które jest rejestrowane w otaczającym powietrzu.

7. Eksperyment

UWAGA: Aby uzyskać więcej szczegółów na temat eksperymentu, zapoznaj się z poprzednio opublikowanym workiem43.

  1. Uruchom program akwizycji sygnału chemiluminescencji
    1. Podłącz port szeregowy CLD do portu szeregowego komputera, w którym zainstalowano program akwizycyjny.
    2. Uruchom program do analizy.
    3. Kliknij Pobierz, wybierz folder, w którym chcesz zapisać plik .data, wpisz nazwę pliku i kliknij Zapisz.
      UWAGA: Zwróć uwagę na ustawiony czas pracy na ekranie, ponieważ nagrywanie zatrzymuje się automatycznie po upływie ustawionego czasu. W razie potrzeby zaprogramowany czas pracy można wydłużyć.
  2. Przygotowanie do wielokrotnych wstrzyknięć próbki
    1. Dostosuj skalę napięcia na ekranie, aby mieć kontrolę nad docelową linią bazową, klikając przyciski Minimum i/lub Maksimum, a następnie wprowadzając żądaną wartość.
    2. Mieć probówkę o pojemności 20 lub 50 ml wypełnioną ddH2O, aby przepłukać strzykawkę między próbkami.
    3. Miej pod ręką pudełko delikatnych chusteczek do zadań.
  3. Wtrysk próbki
    UWAGA: Zacznij od roztworów wzorcowych dla krzywej kalibracyjnej (wstrzyknąć z próbek o najmniejszym stężeniu do najbardziej stężonych), a następnie przejdź do próbek doświadczalnych (rozważ zrobienie tego w duplikatach lub trzech egzemplarzach).
    1. Przepłukać strzykawkę co najmniej dwa razy lub więcej dawką ddH2O przed pobraniem każdej próbki (i po każdym wstrzyknięciu) i za każdym razem sprawdzić niezakłócony wyrzut wody za pomocą wycieraczki roboczej.
    2. Włożyć strzykawkę do probówki z próbką, trzymając zarówno strzykawkę, jak i probówkę w bliskiej odległości, pociągnąć tłok do żądanej objętości, upewniając się, że nie zostały uwięzione pęcherzyki powietrza i/lub niehomogenizowane części stałe.
    3. Oczyścić końcówkę strzykawki za pomocą wycieraczki zadaniowej, a następnie włożyć strzykawkę do nasadki przegrody w porcie iniekcji i wstrzyknąć po sprawdzeniu, czy końcówka strzykawki znajduje się w fazie ciekłej w komorze reakcyjnej.
  4. Zaznacz wstrzyknięcie w oprogramowaniu i poczekaj
    1. Sprawdź, czy wstrzyknięcie powoduje zmianę sygnału w górę (rysunek uzupełniający 1) (w dół w zużyciu NO za pomocą bezkomórkowego testu Hb) i wpisz nazwę próbki, klikając szare pole w obszarze Nazwy próbek, a następnie kliknij Oznacz wstrzyknięcie.
      UWAGA: Podejrzewać niedrożność strzykawki, jeśli wstrzyknięcie próbki nie generuje sygnału.
    2. Poczekaj, aż sygnał elektryczny ponownie dotrze do linii bazowej (zwykle trwa to 3-4 minuty). Ten czas można wykorzystać do wykonania kroku 7.3.1.
  5. Powtórzyć wszystkie czynności wskazane w krokach 7.3 i 7.4 w trakcie i po każdym wstrzyknięciu, aż do końca doświadczenia. Pamiętaj, aby pobrać próbkę roztworu konserwującego (jeśli jest używany)
  6. Zatrzymywanie eksperymentu
    1. Kliknij STOP, aby przerwać akwizycję sygnału, zatrzymaj CLD i wyłącz łaźnię wodną (jeśli NIE jest mierzone3-).
    2. Przerwij dopływ gazu, otwórz zawór iglicowy, zdejmij korek z naczynia odpowietrzającego, umieść pojemnik na odpady pod odpływem i otwórz kran spustowy.
      UWAGA: Jeśli eksperyment wymaga akwizycji danych przez okres dłuższy niż 60 minut, konieczne jest ponowne uruchomienie akwizycji po 60 minutach działania (powtórz krok 7.1.3) i utworzenie nowego pliku.

8. Pomiary i obliczenia

UWAGA: Pomiary i obliczenia są wykonywane w trybie offline i mogą być wykonywane w innym czasie.

  1. Uruchom program akwizycji chemiluminescencji do analizy danych w trybie offline
    1. Uruchom program i kliknij Proces.
    2. Wybierz plik eksperymentu, a następnie kliknij Otwórz.
  2. Oblicz obszar pod krzywą dla każdej administracji
    1. Oprogramowanie automatycznie tworzy na ekranie wykresy linii bazowej (rysunek uzupełniający 2A, pozioma żółta linia) i oś piku każdej fali generowanej przez każde podanie próbki (pionowe żółte linie): sprawdź ich prawidłowe położenie (lub dostosuj, klikając każdą linię i przesuwając ją myszą lub strzałkami) i kliknij Próg OK (rysunek uzupełniający 2B).
      UWAGA: W teście pomiaru Hb bez komórek zużycie NO oprogramowanie zazwyczaj nie jest w stanie prawidłowo uchwycić kształtu fali wygenerowanego przez wstrzyknięcie próbki. Powiększając każdy przebieg, operator może łatwo wspomóc oprogramowanie w obliczeniach powierzchni (rysunek uzupełniający 2).
    2. Oprogramowanie automatycznie tworzy wykres początku (pionowa zielona linia) i końca (pionowa czerwona linia) każdego piku spowodowanego każdym podaniem próbki: sprawdź ich prawidłowe położenie (lub dostosuj, klikając każdą linię i przesuwając ją myszą lub strzałkami) i kliknij Zintegruj (Rysunek uzupełniający 2C).
      UWAGA: Niektóre obszary w śladzie mogą być w tym momencie błędnie zdefiniowane jako iniekcje, a niektóre piki mogą być automatycznie liczone dwukrotnie. Oba błędy można ponownie zidentyfikować i usunąć w kroku 8.2.2
    3. Oprogramowanie automatycznie dopasowuje każdy obszar sygnału po wstrzyknięciu zaznaczonym podczas eksperymentu i przypisaną mu nazwę: nawiguj po każdym piku (oznaczonym żółtą pionową linią) z przypisaną nazwą, klikając na Następny szczyt i Poprzedni szczyt, a następnie kliknij przycisk Wszystko OK, aby ostatecznie uzyskać obliczenia dla wszystkich obszarów na ekranie.
    4. W celu poprawienia wszystkich błędów w nazewnictwie lub dopasowaniu popełnionych przez użytkownika lub program, należy w razie potrzeby użyć przycisków wskazanych w Pliku Uzupełniającym 1.
  3. Przenieś wartości krzywej kalibracyjnej do arkusza kalkulacyjnego i wygeneruj równanie regresji liniowej (rysunek uzupełniający 3)
    1. Przenieś dane z programu CLD do nowego arkusza kalkulacyjnego za pomocą kopiuj-wklej. Uporządkuj dwie kolumny w arkuszu danych jako Stężenie próbki i Powierzchnia pod krzywą, a następnie dodaj dopasowaną wartość zero w obu kolumnach.
    2. Zaznacz dwie kolumny, kliknij pozycję Wstaw > punktowe, a następnie w menu Projekt wykresu wybierz opcję Dodaj element wykresu > linię trendu > liniową.
    3. Kliknij prawym przyciskiem myszy wygenerowaną linię trendu, kliknij Formatuj linię trendu, a następnie kliknij opcje Wyświetl równania na wykresie i Wyświetl wartość R-kwadrat na wykresie w menu Formatuj linię trendu, aby uzyskać proste równanie kalibracji liniowej.
  4. Przenieść obliczoną powierzchnię każdej próbki, aby obliczyć jej stężenie (rysunek uzupełniający 3)
    1. Raportuj każdą wartość w arkuszu kalkulacyjnym. W następnej kolumnie należy zastosować równanie otrzymane z kroku 8.3.3 w celu uzyskania stężenia każdej wstrzykniętej próbki, gdzie y jest stężeniem (wartość nowej kolumny), a x jest obszarem pod krzywą zmierzoną po wstrzyknięciu.
      UWAGA: Pamiętaj, aby wziąć pod uwagę stężenie zmierzone w roztworze konserwującym (jeśli jest stosowane) i odpowiednio odjąć wartości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Analizę zużycia NO przez bezkomórkową Hb zastosowano w próbkach zawierających znane stężenia bezkomórkowej oxyHb (Rysunek 4). Ponieważ jeden hem oxyHb stechiometrycznie uwalnia jedną cząsteczkę NO w tym teście, oczyszczona bezkomórkowa oxyHb służy do zbudowania krzywej kalibracyjnej dla analizy (Rysunek uzupełniający 3).

Zależność dawka-odpowiedź między wolną hemoglobiną Hb (mierzoną za pomocą testu kolorymetrycznego) a zużyciem NO u pacjentów po ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ze względu na wysoką czułość, testy oparte na chemiluminescencji do oznaczania NO i związków pokrewnych mają wysokie ryzyko zanieczyszczenia NO2- . Każdy odczynnik (zwłaszcza roztwór blokujący NO2) i rozcieńczalnik (w tym ddH2O) użyty w doświadczeniu powinien zostać przetestowany pod kątem zawartości NO2- w celu skorygowania sygnału tła. Azotyny są niezwykle reaktywne z okresem półtrwania we krwi pełnej około 10 minut i szybko wytwarzają NO...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

L.B. otrzymuje wsparcie płacowe od K23 HL128882/NHLBI NIH jako główny badacz za swoją pracę nad hemolizą i tlenkiem azotu. LB otrzymuje granty z "Fast Grants for COVID-19 research" w Mercatus Center of George Mason University oraz od iNO Therapeutics LLC. B.Y. B.Y. jest wspierany przez granty z NHLBI/#R21HL130956 i DOD/The Geneva Foundation (W81XWH-19-S-CCC1, Log DM190244). B.Y. otrzymał patenty w MGH na elektryczne wytwarzanie tlenku azotu.

L.B. i B.Y. złożyli wniosek patentowy na brak podawania w chorobie COVID-19 Numer wniosku PCT: PCT/US2021/036269 złożonego 7 czerwca 2021 r. RWC otrzymuje wsparcie płacowe od Unitaid jako główny badacz w zakresie rozwoju technologii mającej na celu zdecentralizowaną diagnostykę gruźlicy u dzieci znajdujących się w środowiskach o niskich zasobach.

Podziękowania

Protokoły opisane w tym manuskrypcie były możliwe dzięki skumulowanemu wkładowi poprzednich współpracowników laboratorium Dr. Warrena Zapola Anestezjologii w Intensywnej Terapii, Oddziału Anestezjologii w Massachusetts General Hospital. Doceniamy wkład dr Akito Nakagawy, Francesco Zadka, Emanuele Vasseny, Chong Lei, Yasuko Nagasaki, Ester Spagnolli i Emanuele Rezoagli.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas octowySigma45754500 ml - płyn
Emulsja przeciwpieniąca BSigmaA5757250 ml - płyn
DETA NONOateCayman8212010 mg
Gibco DPBS (1x) bez wapnia, bez magnezuThermoFisher14190144500 ml
Kwas solny 37% (1 M)Sigma258148500 ml - płynny
JodSAFC207772100 g - stały
KimwipesKimtech34155
Od>czynnik ACS Mercury (II) Chloride 99,5%Sigma215465100 g - stały (rozpuścić w wodzie)
System oczyszczania wody Mili-QMillipore
Model 705 RN 50 μ Strzykawka LHamilton80530Strzykawka mikrolitrowa
Model 802 N 25 μ L StrzykawkaHamilton84854Mikrolitrowa strzykawka
N-etylomaleimidSigma426025 g - Analizator krystalicznego
tlenku azotu + oprogramowanie w pakiecie - Naczynie odpowietrzająceZysenseNOA 280iDetektor chemiluminescencji
Nonidet p-40  (NP-40)ThermoFisher8512510% - 500 ml
Odczynnik ACS heksacyjanożelazianu (III) potasu≥ 99%Sigma244023100 g -
odczynnik ACS w proszku> 99%Sigma221945100 g - stały
kryształ azotynu potasu. Do analizy EMSURE ACSSupelco105067250 g - krystaliczny
PowerGen 125Fisher Scientific14-359-251Homogenizator mechaniczny
RV3 Dwustopniowa rotacyjna pompa łopatkowaPompaA65201906- W zestawie z analizatorem
Heparyna sodowa - BD Hemogard CloBD BiosciencesBD36787175 jednostek USP
Odczynnik ACS bezwodny wodorotlenek sodu ≥ 97%Sigma7954291 kg - granulki
Azotan sodu Odczynnik ACS ≥ 99%Sigma221341500 g - proszek
Azotyn sodu ≥ 99%SigmaS2252500 g - krystaliczny
Sulfanilamid ≥ 98%SigmaS9251100 g - stały
Chlorek wanadu (III)Sigma11239325 g - stały - Uwaga (egzotermiczny)
Bibuła filtracyjna Whatman 1SigmaWHA10010155
próżniowa Edwards

Bibliografia

  1. Palmer, R. M. J., Ferrige, A. G., Moncada, S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature. 327 (6122), 524-526 (1987).
  2. Furchgott, R. F. The discovery of endothelium-derived relaxing factor and its importance in the identification of nitric oxide. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 276 (14), 1186(1996).
  3. Ignarro, L. J., Buga, G. M., Byrns, R. E., Wood, K. S., Chaudhuri, G. Endothelium-derived relaxing factor and nitric oxide possess identical pharmacologic properties as relaxants of bovine arterial and venous smooth muscle. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 246 (1), 218-226 (1998).
  4. Arnold, W. P., Mittal, C. K., Katsuki, S., Murad, F. Nitric oxide activates guanylate cyclase and increases guanosine 3':5'-cyclic monophosphate levels in various tissue preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (8), 3203-3207 (1977).
  5. Hayashida, K., et al. Depletion of vascular nitric oxide contributes to poor outcomes after cardiac arrest. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (10), 1288-1290 (2019).
  6. Ignarro, L. J. Inhaled NO and COVID-19. British Journal of Pharmacology. 177 (16), 3848-3849 (2020).
  7. Gantner, B. N., LaFond, K. M., Bonini, M. G. Nitric oxide in cellular adaptation and disease. Redox Biology. 34, 101550(2020).
  8. Clark, R. H., et al. Low-dose nitric oxide therapy for persistent pulmonary hypertension of the newborn. New England Journal of Medicine. 342 (7), 469-474 (2000).
  9. Goldbart, A., et al. Inhaled nitric oxide therapy in acute bronchiolitis: A multicenter randomized clinical trial. Scientific Reports. 10 (1), (2020).
  10. Bangirana, P., et al. Inhaled nitric oxide and cognition in pediatric severe malaria: A randomized double-blind placebo controlled trial. PloS One. 13 (1), 0191550(2018).
  11. Jiang, S., Dandu, C., Geng, X. Clinical application of nitric oxide in ischemia and reperfusion injury: A literature review. Brain Circulation. 6 (4), 248-253 (2020).
  12. Lei, C., et al. Nitric oxide decreases acute kidney injury and stage 3 chronic kidney disease after cardiac surgery. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 198 (10), 1279-1287 (2018).
  13. Kelm, M. Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochimica et Biophysica Acta. 1411 (2-3), 273-289 (1999).
  14. Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radical Biology and Medicine. 43 (5), 645-657 (2007).
  15. Macarthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. Measurement of circulating nitrite and S-nitrosothiols by reductive chemiluminescence. Journal of Chromatography B. 851 (1-2), 93-105 (2007).
  16. Helms, C., Kim-Shapiro, D. B. Hemoglobin-mediated nitric oxide signaling. Free Radical Biology and Medicine. 61, 464-472 (2013).
  17. Kim-Shapiro, D. B., Schechter, A. N., Gladwin, M. T. Unraveling the reactions of nitric oxide, nitrite, and hemoglobin in physiology and therapeutics. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (4), 697-705 (2006).
  18. Rezoagli, E., et al. Pulmonary and systemic vascular resistances after cardiopulmonary bypass: role of hemolysis. Journal of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 31 (2), 505-515 (2017).
  19. Shiva, S. Nitrite: A physiological store of nitric oxide and modulator of mitochondrial function. Redox Biology. 1 (1), 40-44 (2013).
  20. Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).
  21. Heinrich, T. A., Da Silva, R. S., Miranda, K. M., Switzer, C. H., Wink, D. A., Fukuto, J. M. Biological nitric oxide signalling: chemistry and terminology. British Journal of Pharmacology. 169 (7), 1417-1429 (2013).
  22. Yang, B. K., Vivas, E. X., Reiter, C. D., Gladwin, M. T. Methodologies for the sensitive and specific measurement of s -nitrosothiols, iron-nitrosyls, and nitrite in biological samples. Free Radical Research. 37 (1), 1-10 (2003).
  23. Hayashida, K., et al. Improvement in outcomes after cardiac arrest and resuscitation by inhibition of s-nitrosoglutathione reductase. Circulation. 139 (6), 815-827 (2019).
  24. Rodríguez-Ortigosa, C. M., et al. Biliary secretion of S-nitrosoglutathione is involved in the hypercholeresis induced by ursodeoxycholic acid in the normal rat. Hepatology. 52 (2), Baltimore, Md. 667-677 (2010).
  25. Mitchell, D. A., Marletta, M. A. Thioredoxin catalyzes the S-nitrosation of the caspase-3 active site cysteine. Nature Chemical Biology. 1 (3), 154-158 (2005).
  26. Mannick, J. B., et al. Fas-induced caspase denitrosylation. Science. 284 (5414), New York, NY. 651-654 (1999).
  27. Choi, Y. -B., et al. Molecular basis of NMDA receptor-coupled ion channel modulation by S-nitrosylation. Nature Neuroscience. 3 (1), 15-21 (2000).
  28. Eu, J. P., Sun, J., Xu, L., Stamler, J. S., Meissner, G. The skeletal muscle calcium release channel: Coupled O2 sensor and NO signaling functions. Cell. 102 (4), 499-509 (2000).
  29. Stamler, J. S., et al. Nitric oxide circulates in mammalian plasma primarily as an S-nitroso adduct of serum albumin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (16), 7674-7677 (1992).
  30. Dunham, A. J., Barkley, R. M., Sievers, R. E. Aqueous nitrite ion determination by selective reduction and gas phase nitric oxide chemiluminescence. Analytical Chemistry. 67 (1), 220-224 (1995).
  31. Hogg, N., Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Detection of Nitric Oxide and Peroxynitrite in Biological Systems: A State-of-the-Art Review. Nitric Oxide (Third Edition). Ignarro, L. J., Freeman, B. A. , Academic Press. Chapter 3 23-44 (2017).
  32. Gudem, M., Hazra, A. Mechanism of the chemiluminescent reaction between nitric oxide and ozone. The Journal of Physical Chemistry A. 123 (4), 715-722 (2019).
  33. Ishibe, Y., Liu, R., Hirosawa, J., Kawamura, K., Yamasaki, K., Saito, N. Exhaled nitric oxide level decreases after cardiopulmonary bypass in adult patients. Critical Care Medicine. 28 (12), 3823-3827 (2000).
  34. American Thoracic Society, European Respiratory Society. ATS/ERS recommendations for standardized procedures for the online and offline measurement of exhaled lower respiratory nitric oxide and nasal nitric oxide, 2005. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 171 (8), 912-930 (2005).
  35. Cuthbertson, B. H., Stott, S. A., Webster, N. R. Exhaled nitric oxide as a marker of lung injury in coronary artery bypass surgery. British Journal of Anaesthesia. 89 (2), 247-250 (2002).
  36. Ewing, J. F., Janero, D. R. Specific S-nitrosothiol (thionitrite) quantification as solution nitrite after vanadium(III) reduction and ozone-chemiluminescent detection. Free Radical Biology and Medicine. 25 (4-5), 621-628 (1998).
  37. Braman, R. S., Hendrix, S. A. Nanogram nitrite and nitrate determination in environmental and biological materials by vanadium(III) reduction with chemiluminescence detection. Analytical Chemistry. 61 (24), 2715-2718 (1989).
  38. Wang, X., et al. Biological activity of nitric oxide in the plasmatic compartment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11477-11482 (2004).
  39. Bryan, N. S., Rassaf, T., Rodriguez, J., Feelisch, M. Bound NO in human red blood cells: fact or artifact. Nitric Oxide. 10 (4), 221-228 (2004).
  40. Kida, K., Shirozu, K., Yu, B., Mandeville, J. B., Bloch, K. D., Ichinose, F. Beneficial effects of nitric oxide on outcomes after cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation in hypothermia-treated mice. Anesthesiology. 120 (4), 880-889 (2014).
  41. Gladwin, M. T., et al. S-Nitrosohemoglobin is unstable in the reductive erythrocyte environment and lacks O2/NO-linked allosteric function. The Journal of Biological Chemistry. 277 (31), 27818-27828 (2002).
  42. Feelisch, M., et al. and heme-nitros(yl)ation in biological tissues and fluids: implications for the fate of NO in vivo. The FASEB Journal. 16 (13), 1775-1785 (2002).
  43. Liu, T., et al. L-NAME releases nitric oxide and potentiates subsequent nitroglycerin-mediated vasodilation. Redox Biology. 26, 101238(2019).
  44. Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring nitrite and nitrate, metabolites in the nitric oxide pathway, in biological materials using the chemiluminescence method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54879(2016).
  45. Keefer, L. K., Nims, R. W., Davies, K. M., Wink, D. A. 34;NONOates" (1-substituted diazen-1-ium-1,2-diolates) as nitric oxide donors: Convenient nitric oxide dosage forms. Methods in Enzymology. , Academic Press. 281-293 (1996).
  46. Nagababu, E., Rifkind, J. M. Measurement of plasma nitrite by chemiluminescence without interference of S-, N-nitroso and nitrated species. Free Radical Biology and Medicine. 42 (8), 1146-1154 (2007).
  47. Doctor, A., et al. Hemoglobin conformation couples erythrocyte S-nitrosothiol content to O2 gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (16), 5709-5714 (2005).
  48. Zhang, Y., Keszler, A., Broniowska, K. A., Hogg, N. Characterization and application of the biotin-switch assay for the identification of S-nitrosated proteins. Free Radical Biology and Medicine. 38 (7), 874-881 (2005).
  49. Davies, I. R., Zhang, X. Nitric Oxide Selective Electrodes. Methods in enzymology. Poole, R. K. , Academic Press. Chapter 5 63-95 (2008).
  50. Saito, J., et al. Comparison of fractional exhaled nitric oxide levels measured by different analyzers produced by different manufacturers. Journal of Asthma. 57 (11), 1216-1226 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza chemiluminescencyjnadetekcja tlenku azotumetabolity tlenku azotuchemiluminescencja ozonowawolna hemoglobinapomiar azotyn wpomiar azotan wdetekcja S nitrozotiolikompleksy elazo nitrozylowe
Testy oparte na chemiluminescencji do wykrywania tlenku azotu i jego pochodnych z autooksydacji i związków nitrozowanych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.