Ten artykuł przedstawia metodę analizy czasoprzestrzennej mobilnych, jednocząsteczkowych sond opartych na transferze energii rezonansu Förstera (smFRET) przy użyciu szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej. Nowo opracowany zestaw narzędzi programowych umożliwia wyznaczanie śladów czasowych smFRET poruszających się sond, w tym prawidłowej wydajności FRET i pozycji molekularnych, jako funkcji czasu.
Artykuł metodologiczny
Zautomatyzowana dwuwymiarowa analiza czasoprzestrzenna mobilnych jednocząsteczkowych sond FRET
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Jednocząsteczkowy transfer energii rezonansu Förstera (smFRET) to wszechstronna technika raportowania odległości w zakresie od sub-nanometra do nanometra. Został wykorzystany w szerokim zakresie eksperymentów biofizycznych i biologii molekularnej, w tym w pomiarze sił molekularnych, charakterystyce dynamiki konformacyjnej biomolekuł, obserwacji wewnątrzkomórkowej kolokalizacji białek oraz określaniu czasów interakcji receptor-ligand. W konfiguracji mikroskopii szerokokątnej eksperymenty są zwykle wykonywane przy użyciu sond unieruchomionych powierzchniowo. W artykule przedstawiono metodę łączącą śledzenie pojedynczych cząsteczek ze wzbudzeniem naprzemiennym (ALEX) eksperymenty smFRET, pozwalająca na uzyskanie śladów czasowych smFRET związanych z powierzchnią, ale ruchomych sond w błonach plazmatycznych lub dwuwarstwach lipidowych na podłożu szklanym. Do analizy zarejestrowanych danych opracowano zautomatyzowany zbiór oprogramowania typu open source, które wspiera (i) lokalizację sygnałów fluorescencyjnych, (ii) śledzenie pojedynczych cząstek, (iii) określanie wielkości związanych z FRET, w tym współczynników korekcyjnych, (iv) rygorystyczną weryfikację śladów smFRET oraz (v) intuicyjną prezentację wyników. Wygenerowane dane mogą być wygodnie wykorzystane jako dane wejściowe do dalszej eksploracji za pomocą specjalistycznego oprogramowania, np. do oceny zachowania dyfuzyjnego sond lub badania przejść FRET.
Wprowadzenie
Transfer energii przez rezonans Förstera (FRET) jest kluczowym narzędziem w badaniach biologii molekularnej i biofizyki, ponieważ umożliwia analizę procesów z rozdzielczością subnanometrową. Ponieważ wydajność transferu energii między fluoroforami donorem a akceptorem silnie zależy od odległości między barwnikami w zakresie od subnanometrów do nanometrów, metoda ta jest skutecznie wykorzystywana jako spektroskopowa linijka do badania statycznej i dynamicznej konformacji biomolekuł1,2,3,4. Dodatkowo zjawisko FRET jest szeroko stosowane w badaniach kolokalizacji białek związanych z błoną oraz białek wewnątrzkomórkowych w pomiarach zbiorczych5,6. W ciągu ostatnich dwóch dekad metodę tę przystosowano do monitorowania zdarzeń smFRET7, co pomogło znacząco zwiększyć rozdzielczość czasową i przestrzenną oraz pozwoliło na wyodrębnienie nawet rzadkich subpopulacji w próbkach heterogenicznych. Dzięki zastosowaniu tych technik uzyskano unikalny wgląd w dynamikę maszynerii molekularnej, m.in. w szybkość przetwarzania transkryptu przez polimerazę RNA II8, prędkość replikacji polimeraz DNA9,10, szybkość translokacji nukleosomów11, szybkość splicingu transkryptów i zatrzymywania się złożonych spliceosomów12, aktywność subpopulacji rybosomalnych13 oraz prędkość poruszania się silników kinezynowych14. Ilościowo określono również czas trwania oddziaływań receptor-ligand15 oraz siły molekularne16.
Badania smFRET oparte na intensywności zazwyczaj opierają się na emisji uwrażliwionej w celu pomiaru wydajności FRET: dzielnik wiązki w torze emisji rozdziela przestrzennie światło pochodzące od fluoroforów donora i akceptora po wzbudzeniu donora, co umożliwia ilościowe określenie poszczególnych intensywności fluorescencji. Wydajność można następnie obliczyć jako ułamek fotonów emitowanych przez akceptor w stosunku do całkowitej liczby fotonów17. Ponadto wzbudzanie akceptora po wzbudzeniu donora (ALEX) pozwala na pomiar stechiometrii zdarzeń FRET, co pomaga w odróżnieniu rzeczywistych sygnałów niskiego FRET od sygnałów wynikających np. z sond z fotowyblakłym fluoroforem akceptora18.
Eksperymenty smFRET są zazwyczaj przeprowadzane na jeden z dwóch sposobów. Po pierwsze, niewielki obszar objętości próbki jest oświetlany za pomocą mikroskopu konfokalnego. Pojedyncze cząsteczki sond w roztworze są wzbudzane w momencie, gdy dyfundują do objętości ogniskowej. W tej technice można zastosować szybkie detektory zliczające fotony, co umożliwia rozdzielczość czasową rzędu submikrosekund. Po drugie, sondy są specyficznie unieruchamiane na powierzchniach i monitorowane za pomocą mikroskopii szerokopolowej, często z wykorzystaniem konfiguracji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIR) w celu zminimalizowania fluorescencji tła. Unieruchomienie sond pozwala na znacznie dłuższy czas rejestracji niż w przypadku pierwszego podejścia. Dodatkowo większe pole widzenia umożliwia równoległe monitorowanie wielu sond. Konieczność użycia kamery sprawia, że metoda ta jest wolniejsza w porównaniu do opisanej powyżej. Rozdzielczość czasowa jest ograniczona do zakresu od milisekund do sekund.
Jeśli wymagane są długie ślady czasowe, np. do badania procesów dynamicznych w skali czasowej od milisekund do sekund, pierwsza metoda nie znajduje zastosowania, ponieważ rozbłyski fluorescencji są zazwyczaj zbyt krótkie. Drugie podejście zawodzi w przypadkach, gdy unieruchomienie nie jest możliwe, np. w eksperymentach na żywych komórkach z wykorzystaniem sond dyfundujących w obrębie błony komórkowej. Ponadto zaobserwowano, że biologiczne systemy modelowe mogą drastycznie zmieniać swoją odpowiedź w zależności od mobilności powierzchni kontaktu16.
Mimo że w przeszłości przeprowadzono eksperymenty łączące smFRET z śledzeniem pojedynczych cząsteczek przy użyciu mobilnych sond FRET19, nie istnieje publicznie dostępne oprogramowanie do analizy tych danych. Skłoniło to do opracowania nowej platformy analitycznej, która umożliwia określenie wielu właściwości mobilnych sond fluorescencyjnych, w tym wydajności smFRET i stechiometrii, pozycji z dokładnością subpikselową oraz natężeń fluorescencji jako funkcji czasu. Opracowano metody filtrowania otrzymanych śladów poprzez analizę stopniowego wybielania, odległości od najbliższego sąsiada, natężeń emisji i innych cech, aby wyselekcjonować wyłącznie prawidłowo zsyntetyzowane i funkcjonalne pojedyncze cząsteczki sond. Oprogramowanie wspiera również techniki eksperymentalne i analityczne, które zostały niedawno uzgodnione w badaniu wieloośrodkowym w celu uzyskania wiarygodnych, ilościowych danych smFRET17. W szczególności implementacja ta jest zgodna z walidowanymi procedurami obliczania wydajności FRET i stechiometrii. Natężenia fluorescencji po wzbudzeniu donora w kanale emisji donora IDD oraz w kanale emisji akceptora IDA są wykorzystywane do obliczenia pozornej wydajności FRET Eapp zgodnie z równaniem (1).
(1)
Wykorzystując intensywność fluorescencji w kanale emisji akceptora po wzbudzeniu akceptora IAA, oblicza się pozorną stechiometrię zgodnie z równaniem (2).
(2)
Wydajność FRET E oraz stechiometrię S można wyprowadzić z Eapp i Sapp, uwzględniając cztery współczynniki korekcyjne.
α opisuje przenikanie fluorescencji donora do kanału emisji akceptora i może być wyznaczone przy użyciu próbki zawierającej wyłącznie fluorofory donora lub poprzez analizę fragmentów trajektorii, w których akceptor został wybielony. δ koryguje bezpośrednie wzbudzenie akceptora przez źródło światła wzbudzającego donora i może być zmierzone przy użyciu próbki z samymi fluoroforami akceptora lub poprzez analizę fragmentów trajektorii, w których donor został wybielony.
.
γ skaluje IDD, aby skorygować rozbieżne wydajności detekcji w kanałach emisji donora i akceptora oraz różne wydajności kwantowe fluoroforów. Współczynnik ten można obliczyć poprzez analizę wzrostu intensywności donora po wybieleniu akceptora w trajektoriach o wysokiej wydajności FRET20 lub poprzez badanie próbki charakteryzującej się wieloma dyskretnymi stanami FRET.
β skaluje IAA, aby skorygować różnice w wydajności wzbudzenia donora i akceptora. Jeśli γ zostało wyznaczone za pomocą analizy wybielania akceptora, β można obliczyć na podstawie próbki o znanym stosunku donora do akceptora21. W przeciwnym razie β można uzyskać z próbki FRET w wielu stanach.
Wspólnie poprawki te umożliwiają obliczenie skorygowanej wydajności FRET przy użyciu równania (3).
(3)
or poprawioną stechiometrię przy użyciu równania (4).
(4)
W idealnych warunkach poprawiona stechiometria dla stosunku donora do akceptora 1:1 daje S = 0.5. W praktyce obniżony stosunek sygnału do szumu powoduje rozrzut mierzonych wartości S, co utrudnia odróżnienie ich od sygnałów pochodzących wyłącznie od donora (S = 1) i wyłącznie od akceptora (S = 0). Powstałe przebiegi czasowe mogą służyć jako dane wejściowe do bardziej szczegółowej analizy trajektorii pojedynczych cząsteczek w celu uzyskania informacji takich jak czasoprzestrzenne profile sił16, mobilność zdarzeń pojedynczych cząsteczek22 lub kinetyka przejść między różnymi stanami1.
Poniższy protokół opisuje parametry eksperymentalne i procedury dla eksperymentów śledzenia smFRET, a także zasadę działania analizy danych z wykorzystaniem nowo opracowanego pakietu oprogramowania. Do pozyskiwania danych eksperymentalnych zaleca się użycie zestawu mikroskopowego spełniającego następujące wymagania: i) zdolność do wykrywania emisji pojedynczych cząsteczek barwnika; ii) oświetlenie szerokopolowe: w szczególności dla eksperymentów na żywych komórkach zaleca się konfigurację całkowitego wewnętrznego odbicia (TIR23,24,25); iii) separacja przestrzenna światła emisji w zależności od długości fali, tak aby fluorescencja donora i akceptora była rzutowana na różne obszary tej samej matrycy kamery25 lub na różne kamery; iv) modulacja źródeł światła dla wzbudzenia donora i akceptora z precyzją milisekundową, np. przy użyciu laserów bezpośrednio modulowanych lub modulacji za pomocą modulatorów akustyczno-optycznych. Pozwala to na oświetlenie stroboskopowe w celu zminimalizowania fotobleachingu fluoroforów, a także na naprzemienne wzbudzanie w celu określenia stechiometrii; v) generowanie jednego pliku na zarejestrowaną sekwencję obrazów w formacie, który może być odczytany przez pakiet Python PIMS26. W szczególności obsługiwane są wielostronicowe pliki TIFF.
Protokół
1. Wymagania dotyczące oprogramowania
- Zainstaluj dystrybucję Pythona miniconda27 (minimalna wymagana wersja Pythona: 3.7).
- Otwórz wiersz poleceń Anaconda z menu Start w systemie Windows lub otwórz terminal i wykonaj polecenie conda activate w przypadku korzystania z systemu Linux lub macOS.
- Włącz repozytorium pakietów conda-forge utrzymywane przez społeczność28, wykonując następujące polecenia:
conda config --add channels conda-forge
conda config --set channel_priority strict
conda update --all - Zainstaluj wymagane pakiety Pythona, wykonując polecenie:
conda install opencv trackpy lmfit ipympl scikit-learn pyqt sdt-python jupyterlab - Zapoznaj się z JupyterLab, czyli interfejsem użytkownika oprogramowania analitycznego (patrz dokumentacja oprogramowania29).
- Zainstaluj system kontroli wersji git, który zostanie wykorzystany w dalszej części do pobierania i aktualizacji oprogramowania analitycznego. W przypadku korzystania z systemu Linux użyj menedżera pakietów danej dystrybucji do pobrania i aktualizacji. W przeciwnym razie wykonaj polecenie:
conda install git - Opcjonalnie zainstaluj pakiet Pythona sidecar, aby wyświetlać zestawy danych po etapach filtrowania podczas analizy:
conda install sidecar
2. Pomiar próbek
Rycina 1: Pozyskiwanie obrazów. (A) Sekwencja wzbudzenia. Po zarejestrowaniu opcjonalnego obrazu komórki obciążonej barwnikiem przy użyciu lasera 405 nm, donora i akceptora wzbudza się naprzemiennie i wielokrotnie przez czas oświetlenia till przy użyciu laserów 532 nm i 640 nm, odpowiednio. Czas tr między wzbudzeniem donora a akceptora musi być wystarczająco długi, aby umożliwić odczyt obrazu przez kamerę. Czas opóźnienia tdelay może być wykorzystany do regulacji częstotliwości klatek akwizycji, a tym samym czasu obserwacji przed fotoblaknięciem. Ten panel został zmodyfikowany z 16. (B) Markery fiducjalne są wykorzystywane do obliczania transformacji współrzędnych między dwoma kanałami emisji. Pasujące punkty fiducjalne są oznaczone kolorem. Należy zarejestrować kilka przesuniętych obrazów, aby upewnić się, że całe pole widzenia zostało objęte. (C) Profile laserowe do korekcji flatfield są rejestrowane przy użyciu gęsto znakowanej próbki. Profil akceptora jest rejestrowany i poddawany fotoblaknięciu, po czym następuje akwizycja profilu donora. Należy wykonać wiele obrazów w różnych obszarach próbki, uśrednić je i wygładzić, aby zminimalizować wpływ niedoskonałości próbki (np. jasny punkt w górnej części środka obrazu). (D) Mapa korekcji flatfield p(x,y) obliczona z 20 profili laserowych zarejestrowanych zgodnie z opisem w punkcie C. Skróty: FRET = Förster resonance energy transfer; ImDD = obraz emisji donora po wzbudzeniu donora; ImDA = obraz emisji akceptora po wzbudzeniu donora; ImAA = obraz emisji akceptora po wzbudzeniu akceptora. Paski skali = 5 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
- Podczas korzystania z kamery z urządzeniem sprzężonym ładunkowo z mnożeniem elektronów (EMCCD), należy włączyć wzmocnienie EM, aby obserwować sygnały pojedynczych cząsteczek przy wysokim stosunku sygnału do szumu (należy odnieść się do instrukcji producenta).
- Sekwencja wzbudzenia (szczegóły przedstawiono na Rysunku 1A).
- Opcjonalnie należy zarejestrować obraz do segmentacji, aby ograniczyć analizę danych do określonych obszarów w polu widzenia. Na przykład można wzbudzić komórki obciążone Fura-2 za pomocą lasera 405 nm i zarejestrować ich emisję w okolicach 510 nm, aby ocenić wyłącznie sondy zlokalizowane na granicach między komórkami a podłożowymi dwuwarstwami lipidowymi (SLBs). Następnie należy odczekać czas tr, aby umożliwić odczyt z kamery.
UWAGA: W kamerach EMCCD tr zależy od liczby linii w wybranym obszarze zainteresowania (ROI). Dlatego wybór małego ROI może być korzystny, ponieważ skraca opóźnienie między klatkami i zmniejsza rozmiar rejestrowanych danych. Dodatkowo włączenie trybu przeniesienia klatek pozwala na dalszą redukcję tr. - Naprzemiennie i wielokrotnie wzbudzać fluorofory donora i akceptora.
- Wzbudzać donor przez czas oświetlania till (5-10 ms jest zazwyczaj wystarczająco krótkim czasem, aby uniknąć rozmycia ruchu), jednocześnie wyzwalając kamerę.
- Odczekać czas tr, aby umożliwić odczyt z kamery.
- Wzbudzać akceptor, jednocześnie wyzwalając kamerę.
- Odczekać czas tdelay.
UWAGA: Musi być on dłuższy niż tr, aby umożliwić odczyt przez kamerę, ale w przeciwnym razie może być wybrany dowolnie. Powinien on równoważyć wymagania dotyczące rozdzielczości czasowej i długości śladu. - Powtórzyć kroki 2.2.2.1-2.2.2.4. Liczbę powtórzeń należy dobrać tak, aby była wystarczająco duża, by zapewnić fotowyblaknięcie co najmniej jednego fluoroforu na sondę w polu widzenia, co umożliwia analizę stopniowego fotowyblakania w celu odróżnienia sygnałów pojedynczych cząsteczek od agregatów.
UWAGA: Dobór odpowiedniego till oraz natężeń lasera wzbudzającego zazwyczaj wymaga przeprowadzenia serii prób: im dłuższe czasy oświetlania i wyższe natężenia lasera, tym lepszy jest stosunek sygnału do szumu w otrzymanych obrazach, ale krótsze są wynikowe ślady czasowe.
- Opcjonalnie należy zarejestrować obraz do segmentacji, aby ograniczyć analizę danych do określonych obszarów w polu widzenia. Na przykład można wzbudzić komórki obciążone Fura-2 za pomocą lasera 405 nm i zarejestrować ich emisję w okolicach 510 nm, aby ocenić wyłącznie sondy zlokalizowane na granicach między komórkami a podłożowymi dwuwarstwami lipidowymi (SLBs). Następnie należy odczekać czas tr, aby umożliwić odczyt z kamery.
- Zarejestrować wystarczającą liczbę filmów dla każdej próbki.
3. Dodatkowe pomiary w celu wyznaczenia współczynników korekcyjnych
- Zarejestruj serię losowo rozmieszczonych markerów fiducyjnych widocznych w obu kanałach emisji w celu rejestracji obrazów (tj. znalezienia transformacji, która odwzorowuje współrzędne kanału emisji donora na kanał emisji akceptora i odwrotnie). Patrz Rysunek 1B.
UWAGA: Rejestracja obrazów jest wykonywana przez oprogramowanie; patrz krok 6.1.4. - Zmierz profil intensywności dla źródeł światła wzbudzenia zarówno donora, jak i akceptora w celu korekcji płaskiego pola (tj. korekcji niejednorodnego wzbudzenia w polu widzenia). W tym celu przygotuj próbkę o wysokiej gęstości sond FRET i najpierw uzyskaj obraz po wzbudzeniu akceptora, a następnie przeprowadź fotobleaching akceptora i zarejestruj obraz po wzbudzeniu donora. Dla zwiększenia stabilności powtórz tę procedurę kilkakrotnie w różnych obszarach próbki. Patrz Rysunek 1C,D. Alternatywnie można zarejestrować próbkę znakowaną wyłącznie cząsteczką donora oraz drugą próbkę znakowaną wyłącznie fluoroforami akceptora.
UWAGA: Korekcja płaskiego pola jest wykonywana przez oprogramowanie analityczne; patrz krok 8.1.2. - Zarejestruj próbkę pojedynczych cząsteczek (jak w sekcji 2) sondy bez fluoroforu akceptora, aby określić przesączanie się emisji donora do kanału akceptora.
UWAGA: Przesączanie donora można również obliczyć z rzeczywistych przebiegów czasowych sond po bleachingu akceptora. Jeśli zarejestrowano wystarczającą liczbę takich zdarzeń, dodatkowy pomiar nie jest konieczny. Obie opcje są obsługiwane przez oprogramowanie analityczne; patrz Informacje uzupełniające, sekcja 3.15. - Uzyskaj zapisy sondy bez fluoroforu donora w celu kwantyfikacji bezpośredniego wzbudzenia akceptora przez źródło światła wzbudzenia donora.
UWAGA: Bezpośrednie wzbudzenie akceptora można również wyprowadzić z rzeczywistych przebiegów czasowych sond po bleachingu donora. Jeśli zarejestrowano wystarczającą liczbę takich zdarzeń, dodatkowy pomiar nie jest konieczny. Obie opcje są obsługiwane przez oprogramowanie analityczne; patrz Informacje uzupełniające, sekcja 3.15. - Zarejestruj próbkę pojedynczych cząsteczek charakteryzującą się dwiema różnymi wydajnościami FRET, aby skorygować różnice w wydajności detekcji kanałów emisji donora i akceptora oraz różnice w wydajnościach kwantowych barwników.
UWAGA: Takimi próbkami mogą być na przykład złącza Hollidaya1, które fluktuują między dwiema konformacjami, lub pręty DNA z parami FRET przyłączonymi w różnych, ściśle określonych odległościach. Jeśli sondy wykazują wysoką i wystarczająco stałą wydajność FRET, korekcję można również obliczyć z zdarzeń bleachingu akceptora w przebiegach czasowych sond, w takim przypadku dodatkowe pomiary nie są konieczne. Obie opcje są obsługiwane przez oprogramowanie analityczne; patrz Informacje uzupełniające, sekcja 3.15.
4. Algorytmy lokalizacji pojedynczych cząsteczek
UWAGA: Kilka etapów analizy wymaga lokalizacji pojedynczych cząsteczek. W zależności od gęstości sygnału, tła oraz stosunku sygnału do szumu, należy wybrać algorytm dopasowania Gaussa30 lub obliczanie środka masy31.
- Aby przeprowadzić dopasowanie gaussowskie, wybierz algorytm 3D-DAOSTORM30 za pomocą odpowiednich interfejsów użytkownika.
UWAGA: 3D-DAOSTORM został zaprojektowany w celu rozróżniania nawet sygnałów z nakładającymi się funkcjami rozproszenia punktu (PSF). Choć zazwyczaj jest to zaleta, wiąże się ona z pewnym zastrzeżeniem: pojedyncze, jasne sygnały są sporadycznie identyfikowane jako dwa sąsiadujące, co może wprowadzić w błąd algorytm śledzenia i doprowadzić do wykrycia dwóch krótkich trajektorii zamiast jednej długiej.
Ustaw następujące parametry (szczegóły znajdują się w dokumentacji biblioteki sdt-python32, która zawiera implementację algorytmu).- radius: Ustaw początkową wartość σ funkcji dopasowania gaussowskiego w pikselach, w zależności od efektywnego rozmiaru piksela.
- threshold: Ustaw minimalną amplitudę (tj. wartość najjaśniejszego piksela, skorygowaną o szacowane lokalne tło), aby lokalne maksimum intensywności zostało dopasowane.
UWAGA: Próg jest prawdopodobnie najważniejszym parametrem. Jeśli zostanie ustawiony zbyt nisko, szum może zostać uznany za sygnał fluorescencji, a jasne sygnały mogą zostać dopasowane za pomocą dwóch funkcji Gaussa. Jeśli zostanie ustawiony zbyt wysoko, słabe sygnały nie zostaną dopasowane. - model: Ustaw na 2d, aby dopasować kołowe funkcje Gaussa.
UWAGA: Pozostałe modele nie mają zastosowania do danych smFRET. - find filter: Zastosuj filtr przed wyszukiwaniem lokalnych maksimów w celu redukcji szumów, co jest pomocne w sytuacjach z niskim stosunkiem sygnału do szumu. Może to być: i) identity: brak filtra; ii) Crocker-Grier: filtr pasmowy z algorytmu Crockera-Griera31,33; lub iii) Gaussian: rozmycie gaussowskie z wartością σ określoną przez parametr sigma.
UWAGA: W przypadku algorytmu Crockera-Griera parametr feat. size powinien wynosić w przybliżeniu promień funkcji rozproszenia punktu w pikselach.
UWAGA: Dopasowanie jest wykonywane przy użyciu surowych, niefiltrowanych danych. - min. distance: Dopasuj dwa potencjalne sygnały oddalone od siebie o mniej niż min. distance pikseli za pomocą pojedynczej funkcji Gaussa.
UWAGA: Może to pomóc w opisanym wcześniej scenariuszu, w którym jasny sygnał jest błędnie wykrywany jako dwa sąsiadujące sygnały. - size range: Wybierz minimalne i maksymalne σ dopasowań, aby usunąć detekcje z fałszywych sygnałów wynikających z szumu.
- Wybierz algorytm Crocker-Grier za pomocą odpowiednich interfejsów użytkownika, aby przeprowadzić obliczenia środka masy (jest to udoskonalony algorytm31 oparty na koncepcji Crockera i Griera33).
UWAGA: Algorytm ten jest bardzo odporny nawet w scenariuszach z niskim stosunkiem sygnału do szumu oraz przy sygnałach o różnym zakresie intensywności, ale nie potrafi precyzyjnie dopasować cząsteczek z nakładającymi się funkcjami rozproszenia punktu.- radius: Ustaw promień (w pikselach) dysku wystarczająco dużego, aby pomieścił całą funkcję rozproszenia punktu.
- signal thresh.: Ustaw minimalną amplitudę (najjaśniejszy piksel powyżej szacowanego tła), aby lokalne maksimum intensywności zostało przeanalizowane.
UWAGA: Jeśli zostanie ustawiony zbyt nisko, szum może zostać uznany za sygnał fluorescencji. Jeśli zostanie ustawiony zbyt wysoko, słabe sygnały nie zostaną dopasowane. - mass thresh.: Ustaw minimalną całkowitą intensywność (sumę wartości pikseli skorygowanych o tło) sygnału do analizy.
UWAGA: Obowiązują te same rozważania, co powyżej.
5. Inicjalizacja oprogramowania
- Pobierz skrypty do analizy. W wierszu poleceń Anaconda przejdź do folderu, w którym chcesz zapisać analizę (używając polecenia cd) i wykonaj:
git clone https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis.git target folder- Zastąp target folder opisową nazwą, np. 2021-06-14_Force-FRET-experiment.
UWAGA: Oprogramowanie do analizy zostanie zapisane w tym folderze; upewnij się, że folder ten nie istnieje wcześniej. Zaleca się pobranie kopii skryptów do analizy dla każdego eksperymentu. W ten sposób możliwe jest późniejsze powrócenie do analizy, odtworzenie użytych parametrów i wprowadzenie zmian.
- Zastąp target folder opisową nazwą, np. 2021-06-14_Force-FRET-experiment.
- Skopiuj notatniki Jupyter (01. Tracking.ipynb, 02. Analysis.ipynb, 03. Plots.ipynb) do nowo utworzonego folderu (zwanego dalej folderem głównym). Jeśli jest to pierwsze użycie oprogramowania, pobierz je z podfolderu notebooks w folderze głównym.
UWAGA: Jeśli analizowano już podobne zestawy danych, wygodnym rozwiązaniem może być skopiowanie notatników z poprzedniego eksperymentu, ponieważ parametry mogły ulec jedynie niewielkim zmianom. - Uruchom serwer JupyterLab, wykonując następujące polecenie w wierszu poleceń Anaconda , aby otworzyć okno przeglądarki internetowej wyświetlające JupyterLab.
jupyter lab
UWAGA: Przeglądarka jest jedynie interfejsem, natomiast proces uruchomiony w wierszu poleceń Anaconda wykonuje właściwą pracę. W konsekwencji zamknięcie okna przeglądarki ma minimalny wpływ; sesję można przywrócić, wchodząc na stronę http://localhost:8888. Jednak przerwanie procesu JupyterLab w wierszu poleceń lub zamknięcie wiersza poleceń spowoduje zakończenie analizy, co doprowadzi do utraty niezapisanej pracy. - W oknie przeglądarki JupyterLab użyj lewego panelu, aby przejść do folderu głównego. Kliknij dwukrotnie 01. Tracking.ipynb, aby uruchomić pierwszy notatnik. Po uruchomieniu pojawi się nowa karta wyświetlająca pola, tzw. komórki, z kodem Python.
UWAGA: Wszystkie notatniki Jupyter zawierają komentarze opisujące funkcjonalność każdej komórki kodu. Dodatkowo dokumentację dla każdego wywołania metody można wyświetlić, ustawiając kursor tekstu bezpośrednio przed otwierającym nawiasem ( i naciskając Shift+Tab. - Przegląd procesu analizy danych przedstawiono na ryc. 2.
Rysunek 2: Przegląd typowego potoku analizy. Należy zauważyć, że etapy filtrowania podlegają adaptacji w zależności od projektu eksperymentalnego. Rysunek zmodyfikowany na podstawie 16. Skrót: FRET = Förster resonance energy transfer. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
UWAGA: Przykładowe dane do przetestowania oprogramowania można pobrać ze strony https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis/releases/tag/example_files
6. Lokalizacja, śledzenie i analiza intensywności fluorescencji pojedynczych cząsteczek (01. Tracking.ipynb).
- Użyj notatnika Jupyter 01. Tracking.ipynb do wiarygodnej analizy wartości intensywności fluorescencji sygnałów pojedynczych cząsteczek, który został dostosowany do precyzyjnej kwantyfikacji, w szczególności słabych sygnałów często występujących w pomiarach FRET (np. z powodu niskich sygnałów donora przy zdarzeniach o wysokiej wydajności FRET i odwrotnie).
UWAGA: W tym celu zaimplementowano bezpośrednią integrację intensywności pikseli w surowych danych z korekcją lokalnego tła. Zrzuty ekranu z każdego etapu analizy oraz opis parametrów wywołań funkcji znajdują się w Informacjach Uzupełniających (Supplemental Information).- Określ sekwencję oświetlenia, aby umożliwić wybór klatek wzbudzenia donora i akceptora, a także klatek do segmentacji obrazu z zarejestrowanych sekwencji obrazów.
UWAGA: Ponieważ oprogramowanie umożliwia przetwarzanie danych zarejestrowanych z dowolnymi protokołami oświetlenia, konieczne jest wskazanie, która klatka w sekwencji obrazów została pozyskana podczas wzbudzania danego typu fluoroforu; patrz Informacje Uzupełniające, sekcja 1.2, krok 3. Numery klatek oryginalnej sekwencji obrazów zostają zachowane. - Opisz i wczytaj zestawy danych. Analizuj wiele zestawów danych jednocześnie, pod warunkiem, że zostały one zarejestrowane przy tych samych ustawieniach oświetlenia. Przypisz identyfikator i wzorzec pasujący do nazw plików odpowiedniej sekwencji obrazów do każdego zestawu danych. Dodatkowo zdefiniuj specyficzne zestawy danych do celów specjalnych, takich jak nagrania markerów fiducjalnych do rejestracji obrazu, profile światła wzbudzenia do korekcji pola (flatfield correction) oraz opcjonalnie próbki zawierające tylko donor i tylko akceptor w celu wyznaczenia czynników korekcyjnych.
- Wybierz kanały emisji w surowych obrazach, jeśli oba kanały były rejestrowane za pomocą jednej kamery. W tym celu użyj odpowiedniego widżetu graficznego, aby zaznaczyć właściwe obszary emisji donora i akceptora.
- Zlokalizuj markery fiducjalne w obu kanałach emisji i przeprowadź rejestrację obrazu. Skorzystaj z dostarczonego interfejsu użytkownika, aby znaleźć odpowiednie parametry algorytmu lokalizacji dla kanałów emisji donora i akceptora. Informacje na temat obsługiwanych algorytmów lokalizacji znajdują się w sekcji 4.
UWAGA: Losowo rozmieszczone markery fiducjalne można zidentyfikować w kanałach emisji na podstawie przestrzennego rozmieszczenia ich najbliższych sąsiadów (Rysunek 1B). Własna implementacja algorytmu zaproponowanego dla mikroskopii z selektywnym oświetleniem płaszczyzny34 w bibliotece sdt-python automatycznie dopasowuje pozycję każdego markera w kanale emisji donora do pozycji w kanale emisji akceptora. Transformacja T mapująca współrzędne kanału emisji donora na współrzędne kanału emisji akceptora jest wyznaczana za pomocą liniowej metody najmniejszych kwadratów dopasowania transformacji afinicznej do pozycji markerów35. RANSAC jest wykorzystywany do uwzględnienia wartości odstających, takich jak błędnie dopasowane pozycje z poprzedniego kroku. - Zlokalizuj sondy FRET niezależnie przy wzbudzeniu donora i akceptora we wszystkich klatkach i połącz wyniki w jednej tabeli zawierającej oryginalny numer klatki, współrzędne 2-wymiarowe oraz identyfikator odnoszący się do źródłowego pliku obrazu.
UWAGA: W tym celu oprogramowanie udostępnia interfejsy użytkownika do znalezienia odpowiednich opcji dla algorytmu lokalizacji.- Zlokalizuj sondy FRET przy wzbudzeniu donora w sumie obrazów uzyskanych z emisji donora ImDD i emisji akceptora ImDA, która w niewielkim stopniu zależy od wydajności FRET. Informacje dotyczące opcji algorytmu lokalizacji znajdują się w sekcji 4.
UWAGA: Każdy obraz sumaryczny jest obliczany poprzez transformację ImDD za pomocą transformacji T uzyskanej wcześniej z rejestracji obrazu i dodanie jej piksel po pikselu do ImDA. - Zlokalizuj sondy przy wzbudzeniu akceptora w kanale emisji akceptora ImAA (szczegóły dotyczące algorytmów lokalizacji patrz w sekcji 4).
- Zlokalizuj sondy FRET przy wzbudzeniu donora w sumie obrazów uzyskanych z emisji donora ImDD i emisji akceptora ImDA, która w niewielkim stopniu zależy od wydajności FRET. Informacje dotyczące opcji algorytmu lokalizacji znajdują się w sekcji 4.
- Przeprowadź śledzenie (tracking) i pomiar intensywności fluorescencji.
- Określ sekwencję oświetlenia, aby umożliwić wybór klatek wzbudzenia donora i akceptora, a także klatek do segmentacji obrazu z zarejestrowanych sekwencji obrazów.
Rysunek 3: Pomiar intensywności pojedynczej cząsteczki. (A) Dla fluoroforu znajdującego się w pomarańczowym pikselu, jego niepoprawiona intensywność Iuncorr jest określana poprzez zsumowanie intensywności wszystkich pikseli w obrębie dysku (piksele żółte i pomarańczowe) wystarczająco dużego, aby objął wszystkie piksele pod wpływem sygnału: 
. Lokalne tło jest obliczane jako średnia z pikseli w pierścieniu (piksele niebieskie) wokół dysku: 
, gdzie nring to liczba pikseli w pierścieniu. Intensywność fluorescencji I jest wynikiem odjęcia tła od intensywności niepoprawionej, I = Iuncorr - b × ndisk, gdzie ndisk to liczba pikseli w dysku. Promień okręgu jest określany za pomocą parametru feat_radius metody śledzenia. Szerokość pierścienia jest podana przez parametr bg_frame. Jeśli funkcja rozproszenia punktu jednego sygnału nakłada się na pierścień tła innego (dolny panel), dotknięte piksele (czerwone) są wyłączone z analizy lokalnego tła. Jeśli dwie funkcje rozproszenia punktu nakładają się na siebie, intensywności fluorescencji nie mogą być obliczone wiarygodnie i zostają zatem odrzucone. (B, C) Symulacje pokazują, że zastosowanie rozmycia Gaussa z odchyleniem standardowym 1 piksela poprawia stosunek sygnału do szumu niemal dwukrotnie przy niskich intensywnościach fluorescencji (B) i nie wprowadza niemal żadnego błędu (nieznaczne niedoszacowanie poniżej 1%, (C))16. Ponadto błąd względny (tj. (Imeas - Itruth)/Itruth, gdzie Itruth to wartość rzeczywista, a Imeas to wynik analizy) jest stały w całym zakresie intensywności, a zatem znosi się w przypadku wielkości racjonalnych, takich jak efektywności i stechiometrie FRET. Wszystkie wykresy oparto na wcześniej opublikowanej pracy16. Skróty: SNR = stosunek sygnału do szumu; FRET = Förestrowy rezonansowy transfer energii. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
- Wybierz odpowiednie opcje dla algorytmu trackpy36 wykorzystywanego do łączenia lokalizacji sond FRET w trajektorie. W szczególności ustaw maksymalną odległość poszukiwania między kolejnymi klatkami oraz liczbę następujących po sobie klatek, w których sygnał może pozostać niewykryty, co może wynikać z blaknięcia lub pominięcia lokalizacji.
UWAGA: Luki te są uzupełniane poprzez interpolację między poprzednimi a następnymi pozycjami. Pozycje interpolowane są znakowane i wykorzystywane później wyłącznie do odczytu wartości intensywności, a nie do analizy dyfuzji. Trajektorie są analizowane w układzie współrzędnych kanału emisji akceptora. Do analizy intensywności fluorescencji (krok 6.1.6.2) trajektorie są dodatkowo przekształcane do układu współrzędnych kanału emisji donora przy użyciu transformacji odwrotnej T-1 uzyskanej poprzez rejestrację obrazów (patrz krok 6.1.4). - Wybierz opcje dla algorytmu obliczania intensywności fluorescencji (szczegóły patrz Rysunek 3A). Określ i) promień dysku, który po wycentrowaniu na pozycji sygnału zawiera wszystkie piksele pod wpływem tego sygnału oraz ii) szerokość pierścienia wokół każdego dysku, wykorzystywanego do wyznaczenia lokalnego tła.
UWAGA: Aby zredukować szum w uzyskanych pomiarach intensywności, do obrazów stosowane jest rozmycie Gaussa z odchyleniem standardowym wynoszącym 1 piksel (Rysunek 3B,C).
- Użyj funkcji oprogramowania analitycznego do przetworzenia pomocniczych danych obrazowych z sekwencji obrazów.
- Wyodrębnij dodatkowe obrazy zarejestrowane w celu ułatwienia segmentacji (patrz krok 2.2.1, oznaczone jako s w sekwencji wzbudzenia (patrz Informacje uzupełniające, sekcja 1.2, krok 3).
- Wyznacz profile światła wzbudzenia donora i akceptora w całym polu widzenia na podstawie obrazów zarejestrowanych na gęsto znakowanej próbce (patrz krok 3.2).
UWAGA: W celu obliczenia profili światła z obrazów obliczana jest średnia piksel po pikselu. Odjmowane jest tło kamery. Obrazy są rozmywane za pomocą filtra Gaussa w celu zredukowania efektów wynikających z zanieczyszczeń próbki. Na koniec otrzymane obrazy są dzielone pikselowo przez ich wartość maksymalną, aby uzyskać profil p(x,y) mapujący współrzędne na przedział [0,1].
7. Wizualizacja trajektorii FRET (opcjonalnie)
- Użyj aplikacji inspector, aby wyświetlić ścieżki pojedynczych cząsteczek w surowych danych obrazowych oraz odpowiadające im intensywności fluorescencji, pozorne wydajności FRET i stechiometrie.
UWAGA: Jest to cenne narzędzie do oceny poprawności wybranych parametrów oraz ręcznego akceptowania lub odrzucania poszczególnych przebiegów czasowych. Zrzut ekranu i szczegółowe informacje dotyczące użytkowania znajdują się w Informacjach uzupełniających (Supplemental Information).
8. Analiza i filtrowanie danych z pojedynczych cząsteczek (02. Analysis.ipynb)
- Do analizy i filtrowania danych pojedynczych cząsteczek uzyskanych za pomocą notatnika 01. Tracking.ipynb należy użyć notatnika 02. Analysis.ipynb Jupyter. Typowy schemat analizy przedstawiono w poniższych krokach.
UWAGA: Różne pytania badawcze i projekty eksperymentalne mogą wymagać dostosowania ustawień. Wykorzystanie notatników Jupyter umożliwia łatwą adaptację poprzez pomijanie, reorganizację i modyfikację etapów analizy. Zrzuty ekranu dla każdego kroku analizy oraz opis parametrów wywołań funkcji znajdują się w Informacjach uzupełniających (Supplemental Information).- Wykonaj wstępne kroki filtrowania.
- Odrzuć sygnały z nakładającymi się funkcjami rozproszenia punktu (PSF), ponieważ trudne jest wiarygodne określenie ich intensywności fluorescencji.
- W przypadku niejednorodnego oświetlenia akceptuj tylko sygnały znajdujące się w dobrze oświetlonych obszarach pola widzenia, aby zapewnić korzystny stosunek sygnału do szumu.
- W przypadku badania wewnątrzmolekularnego FRET ogranicz analizę do trajektorii obecnych od początku sekwencji obrazów, aby upewnić się, że wszystkie etapy blaknięcia zostały zarejestrowane i mogą zostać prawidłowo ocenione później podczas analizy stopniowego fotoblaknięcia.
UWAGA: Przy przeprowadzaniu eksperymentów z międzyminolekularnymi sondami FRET, w których fluorofory donora i akceptora nie są częścią wstępnie utworzonego kompleksu, ograniczenie analizy do trajektorii obecnych od początku może być niewykonalne.
- Wykonaj korekcję pola (flatfield correction), która wykorzystuje profile źródła światła wzbudzenia uzyskane w kroku 6.1.7.2, aby zniwelować zależne od pozycji zmienności intensywności fluorescencji spowodowane niejednorodnym oświetleniem.
UWAGA: Intensywność fluorescencji I(x,y) sondy w pozycji (x,y) jest korygowana za pomocą
; patrz Rysunek 1C,D. - Oblicz pozorną wydajność FRET Eapp (tj. ułamek energii przekazanej z fluoroforu donora do fluoroforu akceptora) oraz pozorną stechiometrię Sapp (tj. liczbę fluoroforów donora podzieloną przez całkowitą liczbę fluoroforów w plamce ograniczonej dyfrakcyjnie).
UWAGA: Wykreślając E w funkcji S dla każdego punktu danych, można odróżnić zmiany zmierzonych wydajności FRET wynikające ze zmiany odległości donor-akceptor od zmian wynikających ze zmiany stechiometrii18. Pozwala to na odróżnienie E = 0 z powodu separacji barwników od E = 0 z powodu braku aktywnego akceptora. Wykresy E-S są stosowane w całej analizie jako narzędzie do oceny jakości; przykład przedstawiono na Rysunku 4. - Wykonaj stopniową analizę fotoblaknięcia w celu odróżnienia sond pojedynczych cząsteczek od agregatów. Wybierz jedną z poniższych opcji.
UWAGA: W tym celu oprogramowanie analityczne stosuje niestandardową implementację32 algorytmu detekcji punktów zmiany PELT37 oddzielnie dla intensywności fluorescencji przy wzbudzeniu donora (IDD + IDA) i wzbudzeniu akceptora (IAA).- Wybierz opcję 1, w której fluorofor akceptora blaknie w jednym kroku, podczas gdy donor nie wykazuje częściowego blaknięcia (tj. nie ma kroku blaknięcia do intensywności różnej od zera).
UWAGA: Opcja ta odrzuca dodatkowo trajektorie, w których donor blaknie przed akceptorem w jednym kroku. Opcja 1 jest preferowanym wyborem w przypadku wysokich szybkości fotoblaknięcia akceptora. - Wybierz opcję 2, w której donor blaknie w jednym kroku, podczas gdy nie występuje częściowe blaknięcie akceptora.
UWAGA: Opcja ta odrzuca dodatkowo trajektorie, w których donor blaknie po akceptorze w jednym kroku. Opcja 2 jest preferowanym wyborem w przypadku wysokich szybkości fotoblaknięcia donora. - Wybierz opcję 3, w której dowolny fluorofor blaknie w jednym kroku, podczas gdy drugi nie blaknie częściowo.
UWAGA: Opcja 3 zapewnia większą elastyczność niż opcje 1 i 2 i byłaby sugerowanym wyborem do analizy danych. - Wybierz opcję 4, w której fluorofory donora i akceptora wykazują jednostopniowe fotoblaknięcie lub brak fotoblaknięcia.
UWAGA: Opcja 4 jest preferowana w przypadku niskich szybkości fotoblaknięcia.
- Wybierz opcję 1, w której fluorofor akceptora blaknie w jednym kroku, podczas gdy donor nie wykazuje częściowego blaknięcia (tj. nie ma kroku blaknięcia do intensywności różnej od zera).
- Oblicz czynniki korekcyjne dla przesączania emisji donora do kanału akceptora α, bezpośredniego wzbudzenia akceptora δ, wydajności detekcji γ oraz wydajności wzbudzenia β17.
- Użyj czynników korekcyjnych, aby obliczyć wydajność FRET E z wydajności pozornej Eapp oraz stechiometrię S z stechiometrii pozornej Sapp.
- Wykonaj kolejne kroki filtrowania. Wybierz tylko punkty danych sprzed pierwszego zdarzenia blaknięcia w każdej trajektorii. Dodatkowo akceptuj tylko trajektorie, w których co najmniej 75% punktów danych spełnia warunek 0.35 < S < 0.6, aby ograniczyć analizę do sond pojedynczych cząsteczek (wartości te można dostosować).
UWAGA: Górne i dolne granice należy dobrać zgodnie z rozkładem populacji interesującej w stosunku do populacji, które mają zostać wykluczone z analizy (np. populacje zawierające tylko donora lub tylko akceptora). Z doświadczenia wynika, że zakres 0.35 < S < 0.6 okazał się dobrym wyborem w wielu sytuacjach eksperymentalnych. - Wykonaj segmentację obrazu za pomocą globalnych lub adaptacyjnych metod progowania35 na odpowiednich obrazach pomocniczych (patrz kroki 2.2.1 i 6.1.7), aby ograniczyć analizę do określonych obszarów w polu widzenia.
UWAGA: Pozwala to na przykład na wyłączną ocenę sond zlokalizowanych na interfejsie komórka-SLB lub na strukturze wzorowanej.
- Wykonaj wstępne kroki filtrowania.
9. Wykresy wyników i dalsza analiza (03. Plot.ipynb)
UWAGA: Należy zapoznać się z Informacjami uzupełniającymi, aby zobaczyć zrzuty ekranu z notatnika Jupyter oraz opis parametrów wywołań funkcji.
- Utwórz wykresy E-S, aby zweryfikować, czy sygnały o nieprawidłowej stechiometrii zostały poprawnie zidentyfikowane i usunięte.
- Narysuj histogramy wydajności FRET, aby uzyskać rzetelny przegląd rozkładów wydajności FRET. Pogrupuj histogramy w celu wygodnego porównania wyników z różnych eksperymentów.
- Przeprowadź dalszą ewaluację danych (np. analizę dyfuzji, konwersję wydajności FRET na siły w eksperymentach z użyciem molekularnych czujników siły lub analizę przejść) w notatniku, wykorzystując naukowe biblioteki języka Python.
UWAGA: Dane można również eksportować do wielu formatów plików, aby posłużyły jako dane wejściowe dla innego oprogramowania analitycznego.
Wyniki
W zależności od pytania badawczego postawionego w eksperymencie, z przebiegów smFRET można wyodrębnić różnorodne informacje niskiego i wysokiego poziomu. Przedstawiono tutaj przykłady potoków analitycznych dla sond analogowych i cyfrowych: odpowiednio dla peptydowego molekularnego sensora siły16 oraz sondy DNA o stochastycznej zmianie konformacji38. Konstrukcję oraz zasadę działania tych sond przedstawiono na Rysunku 5.
Po wykonaniu algorytmów lokalizacji i śledzenia zgodnie z opisem w protokole, pakiet oferuje wiele narzędzi do wizualizacji danych w celu optymalizacji parametrów początkowych i kolejnych etapów filtrowania: (i) wizualizację pojedynczych zdarzeń smFRET, (ii) opcjonalną segmentację obrazu w celu analizy danych w określonych obszarach zainteresowania, (iii) monitorowanie etapów filtrowania za pomocą wykresów wydajności FRET względem stechiometrii (E-S). Wizualizacja danych z pojedynczych cząsteczek przedstawiona jest na Rysunku 6.
Na koniec przefiltrowane zdarzenia FRET są przedstawione na wykresie E-S oraz na histogramie wydajności FRET (Rysunek 4). Wykres E-S jest użytecznym narzędziem do optymalizacji wspomnianych kroków filtrowania oraz analizy końcowego wyniku. Częściowo wybielone lub niepełnie znakowane sensory FRET można wykluczyć na podstawie ich wartości stechiometrii. Parametry mobilności można badać poprzez wykreślenie ścieżki pojedynczej trajektorii na wykresie x-y (Rysunek 6) lub na wykresie średniego kwadratu przemieszczenia (MSD) (Rysunek 4). Pierwsza metoda jest szczególnie przydatna do odróżnienia zdarzeń mobilnych od unieruchomionych, natomiast druga służy do obliczenia współczynnika dyfuzji.
Rysunek 4: Przykładowe wyniki. (A) Wydajność FRET jest przedstawiona w funkcji stechiometrii (wykres E-S) dla populacji molekularnego czujnika siły (lewy panel) zdobiącego wspieraną na szkle dwuwarstwę lipidową i poddanego naprężeniom przez komórkę T. Widoczna jest tylko jedna chmura populacyjna. Odpowiedni histogram wydajności FRET obrazuje różnicę między populacją czujników siły w obecności i w nieobecności komórek (środkowy panel). Nie obserwuje się przesunięcia populacji czujników w stronę niższych wydajności FRET w obecności komórek T, co wskazuje na niewielkie lub brak zależnego od siły rozciągania modułu czujnika. Wykres MSD dla tych warunków eksperymentalnych potwierdza, że populacja czujników siły pod komórką T porusza się znacznie wolniej niż ich niepowiązane odpowiedniki (prawy panel). (B) Tą samą analizę przeprowadzono z wykorzystaniem sensora DNA z łącznikiem Holliday zdobiącego wspieraną na szkle płynną dwuwarstwę lipidową. Wykres E-S wyraźnie pokazuje dwie populacje, które są również widoczne na histogramie wydajności FRET. Wykres MSD wskazuje na obecność jednej szybko poruszającej się populacji czujników. Skróty: FRET = Förster resonance energy transfer; MSD = mean square displacement. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 5: Projekt i zasada działania wewnątrzmolekularnych sond FRET. (A) Analogowy sensor peptydowy do kwantyfikacji mechanicznych sił molekularnych. Fluorofory donora i akceptora są kowalencyjnie przyłączone do obu końców szkieletu peptydowego. Moduł sensora jest przyłączony w sposób specyficzny względem miejsca do konkretnego ligandu, który z kolei wiąże interesujący nas receptor powierzchniowy komórki (tutaj fragment przeciwciała specyficznie rozpoznający łańcuch beta receptora limfocytów T). Po związaniu receptora z ligandem wywierana jest siła, a moduł sensora rozciąga się i ostatecznie cofa po rozszczepieniu wiązania. Panel ten został zmodyfikowany na podstawie 16. (B) Cyfrowy sensor DNA do kwantyfikacji przejść FRET. Sensor FRET składa się z czterech nici DNA tworzących skrzyżowanie Hollidaya. Fluorofor donora i akceptora są kowalencyjnie przyłączone do dwóch nici. Skrzyżowania Hollidaya często zmieniają swoją konformację w zależności od warunków buforu w otoczeniu. Stochastyczne przełączanie tych konformacji można monitorować poprzez kwantyfikację wydajności FRET poszczególnych sond. Skróty: TCR = receptor limfocytów T; FRET = Förster resonance energy transfer. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 6: Przykłady lokalizacji i śledzenia sond FRET. (A) Wydajność FRET i stechiometria poszczególnych zdarzeń są obliczane poprzez kwantyfikację intensywności fluoroforu donora przy wzbudzeniu donora (D → D), fluoroforu akceptora przy wzbudzeniu donora (D → A) oraz fluoroforu akceptora przy wzbudzeniu akceptora (A → A). Filtrowanie najbliższych sąsiadów zapobiega błędom wynikającym z nakładania się funkcji rozproszenia punktowego (PSF) blisko położonych emiterów. Segmentacja obrazu pozwala użytkownikowi wybrać określone zdarzenia smFRET zlokalizowane w obszarze zainteresowania (np. w komórce lub mikrowzorcu). Jako przykład segmentacji obrazu, limfocyty T zostały zabarwione Fura-2 (widoczne po lewej stronie) i poddane adaptacyjnemu progowaniu w celu zidentyfikowania krawędzi komórek (pomarańczowa przerywana linia). Paski skali = 5 µm. (B) Trajektorie smFRET z użyciem molekularnego sensora siły. Pojedyncze trajektorie mogą być naniesione na płaszczyznę x-y, co pozwala na wizualizację ich zachowania dyfuzyjnego i lokalizacji (panel lewy). Ponadto intensywności każdej trajektorii mogą być przedstawione w funkcji czasu w celu zidentyfikowania przejść FRET lub etapów wybielania (panel środkowy pokazuje czerwoną trajektorię z panelu lewego). Wynikową wydajność FRET i stechiometrię można zwizualizować w podobny sposób (panel prawy). (C) Trajektorie smFRET z użyciem sensora DNA w formie skrzyżowania Hollidaya. Jako bufor podczas pomiarów zastosowano HBSS + 12 mM MgCl2. Poza widocznym etapem wybielania akceptora w pobliżu końca sekwencji w tych przykładach, można określić częstotliwość przejść FRET dla każdego sensora. Skrzyżowania Hollidaya zmieniają swoją konformację z wysoką częstotliwością, podczas gdy molekularny sensor siły nie wykazuje przejść FRET. Informacje te umożliwiają dostosowanie warunków eksperymentalnych, takich jak opóźnienie między klatkami, w celu zwiększenia lub zmniejszenia liczby obserwowanych przejść. Skróty: FRET = Förster resonance energy transfer; smFRET = single-molecule FRET; HBSS = Hank's balanced salt solution. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Informacje uzupełniające: Lokalizacja i śledzenie pojedynczych cząsteczek (01. Tracking.ipynb). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje proces automatycznego rejestrowania i analizy ilościowej danych smFRET pochodzących z ruchomych, ale powierzchniowo uwiązanych cząsteczek sondy. Uzupełnia on dwa dominujące podejścia do eksperymentów smFRET, obejmujące sondy unieruchomione powierzchniowo lub sondy dyfundujące w roztworze do i z objętości wzbudzenia konfokalnego17. Zapewnia prawidłową wydajność FRET i pozycje molekularne w funkcji czasu. Może być zatem wykorzystany jako dane wejściowe dla specjalistycznych programów analitycznych, np. do ilościowego określenia kinetyki przejścia1, histogramów FRET39 lub dyfuzji dwuwymiarowej22.
Oprogramowanie jest wydawane na wolnej licencji typu open source zatwierdzonej przez Open Source Initiative, która przyznaje użytkownikowi wieczyste prawo do bezpłatnego użytkowania, modyfikacji i redystrybucji. Github został wybrany jako platforma programistyczna i dystrybucyjna, aby maksymalnie ułatwić uzyskanie oprogramowania i udział w procesie rozwoju poprzez zgłaszanie błędów lub wnoszenie kodu40. Napisane w Pythonie oprogramowanie nie jest zależne od zastrzeżonych komponentów. Wybór notebooków Jupyter jako interfejsów użytkownika ułatwia inspekcję danych na każdym etapie analizy i pozwala na dostosowanie i rozszerzenie potoku specjalnie dla danego systemu eksperymentalnego. Biblioteka sdt-python 32 służy jako podstawa i implementuje funkcje do oceny danych mikroskopii fluorescencyjnej, takich jak lokalizacja pojedynczych cząsteczek, analiza dyfuzji, analiza intensywności fluorescencji, rejestracja kanału koloru, analiza kolokalizacji i obsługa ROI.
Zasadniczo śledzenie pojedynczych cząstek może odbywać się w systemach jedno-, dwu- lub trójwymiarowych. W tym przypadku potok analizy pojedynczych cząsteczek został dostosowany do badania systemów mobilnych 2D. Wybór ten odzwierciedla dostępność prostych systemów, takich jak dwuwarstwy lipidowe z podparciem planarnym (SLB), do prezentacji mobilnych sond fluorescencyjnych. Takie dwuwarstwowe systemy lipidowe składają się zazwyczaj z dwóch lub więcej ugrupowań fosfolipidów, przy czym frakcja masowa określa kluczowe parametry fizykochemiczne SLB (takie jak faza i lepkość), a frakcja mniejsza zapewnia miejsca przyłączenia dla biomolekuł. Te miejsca przyłączenia mogą być biotynylowanymi fosfolipidami dla platform białkowych opartych na awidynie lub streptawidynie lub fosfolipidami sprzężonymi niklowo-NTA dla platform białkowych ze znacznikami histydyny41. Wybór odpowiedniej platformy do łączenia białek z SLB zależy od kwestii naukowej. Czytelnicy mogą zapoznać się z literaturą 16,38,42 w celu zapoznania się z przykładami skutecznie zastosowanych strategii. Gęstość sond w próbce powinna być wystarczająco niska, aby uniknąć nakładania się funkcji rozpraszania punktów; Zazwyczaj zaleca się mniej niż 0,1 cząsteczki naμm2. Patrz sekcja dotycząca reprezentatywnych wyników (w szczególności rysunek 6), aby zapoznać się z przykładem przedstawiającym odpowiednią gęstość sondy. Metoda analizy ma również zastosowanie do pojedynczych znakowanych fluorescencyjnie cząsteczek białka dyfundujących w błonie plazmatycznej żywych komórek.
Jednym z krytycznych aspektów eksperymentów smFRET jest produkcja i charakterystyka samych sond FRET. Wybierając fluorofory dla pary FRET, ich promień Förstera powinien odpowiadać oczekiwanym odległościom między barwnikami43. Preferowane są barwniki odporne na fotowybielanie, ponieważ dają długotrwałe ślady. Jednak w przypadku podwyższonych szybkości bielenia jeden gatunek fluoroforu można wykorzystać do rozpoznawania zdarzeń wieloemiterowych pochodzących z kolokalizowanych cząsteczek za pomocą krokowej analizy fotowybielania; Zobacz krok 8.1.4 w sekcji Protokół. Pary fluoroforów powinny być specyficznie i kowalencyjnie przyłączone do interesujących cząsteczek, tworząc wewnątrz- lub międzycząsteczkowe pary FRET.
Połączenie smFRET z innymi łatwo dostępnymi technikami może zwiększyć jego rozdzielczość przestrzenną poza granicę dyfrakcji (za pomocą STED44). Przedstawiony tutaj algorytm śledzenia smFRET rozszerza zastosowanie tego podejścia do nowych ustawień eksperymentalnych i systemów modelowych. Obejmuje to badania (i) zmian kinetycznych w stechiometrii ruchomych biomolekuł, (ii) dynamicznej asocjacji ruchomych biomolekuł, (iii) szybkości reakcji enzymatycznych swobodnie dyfuzyjnych reagentów oraz (iv) kinetyki zmian konformacyjnych ruchomych biomolekuł. Pierwsze dwa przykłady wymagają układów modelowych, które pokazują, że międzycząsteczkowy FRET, tj. donor i akceptor są sprzężone z oddzielnymi jednostkami biomolekularnymi będącymi przedmiotem zainteresowania. Te ostatnie przykłady mogą wykorzystywać biosensory przenoszące donor i akceptor w tej samej jednostce molekularnej (wewnątrzcząsteczkowy FRET).
Wewnątrzcząsteczkowe czujniki oparte na fret mogą zapewnić wgląd w wewnętrzne zmiany konformacyjne biomolekuł 1,2,3,4, zmiany konformacyjne spowodowane obciążeniem endogennym lub siłą zewnętrzną (czujniki siły molekularnej 16) lub stężenia jonów w nanośrodowisku, takim jak wapń45 i pH46. W zależności od systemu modelowego i preferowanej platformy kotwiczącej, takie zdarzenia smFRET mogą być śledzone w 2D lub 3D: (i) planarne śledzenie zdarzeń smFRET można wykorzystać do ilościowego określenia czasów interakcji receptor-ligand w błonie plazmatycznej, asocjacji kaskad wzmocnienia sygnału zakotwiczonych w błonie oraz zmian stechiometrycznych receptorów powierzchniowych; (ii) śledzenie objętości zdarzeń smFRET może być stosowane dla dowolnych wewnątrz- lub międzycząsteczkowych sond FRET w żywych komórkach lub w systemach odtworzonych in vitro.
Metoda śledzenia smFRET została opracowana głównie z myślą o wewnątrzcząsteczkowych sondach FRET. Sondy te mają ustaloną i dobrze znaną liczbę znaczników fluorescencyjnych, co zostało wykorzystane do odrzucenia danych z aglomerowanych i nieprawidłowo zsyntetyzowanych (np. niekompletnie znakowanych) cząsteczek, a także z sond, w których jeden z fluoroforów został fotowybielany. Jednak dostosowując etapy filtrowania, metoda ta może być również stosowana do międzycząsteczkowych sond FRET. Na przykład, zamiast akceptować tylko cząsteczki z pojedynczym donorem i jednym akceptorem fluoroforu, można zbadać trajektorie przestrzenne barwników donorowych i akceptorowych oraz wybrać, na przykład, trajektorie współdyfuzji donor-akceptor.
Ponieważ algorytm 3D-DAOSTORM obsługuje określanie pozycji sygnału wzdłuż osi optycznej za pomocą astygmatyzmu dzięki cylindrycznej soczewce na ścieżce wiązki emisyjnej, eksperymenty 3D można łatwo zintegrować z potokiem analizy. W takim przypadku sygnał akceptora po wzbudzeniu akceptora posłużyłby do określenia stechiometrii i położenia osiowego. Oprogramowanie analityczne może być również wykorzystywane do oceny danych z eksperymentów z unieruchomionymi sondami, wykorzystując jego wysoki stopień automatyzacji i schematów filtrowania. W rzeczywistości zestawy danych wydajności smFRET ze złączy Hollidaya unieruchomionych na dwuwarstwach żelowych38 zostały przeanalizowane przy użyciu wczesnej wersji oprogramowania.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez projekty P30214-N36, P32307-B Austriackiego Funduszu Naukowego (FWF) oraz przez Wiedeński Fundusz Nauki i Technologii (WWTF) LS13-030.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-[(Kwas N-(5-amino-1-karboksypentylo)iminodiacet)sukcynylo] (sól niklu) (Ni-NTA-DOGS) | Avanti Polar Lipids | 790404P | |
| 1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-fosfocholina (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
| 1-palmitoilo-2-oleoilo-glicero-3-fosfocholina (POPC) | Avanti Polar Lipids | 850457P | |
| α Obiektyw olejowy Plan-FLUAR 100x/1,45 | Zeiss | 000000-1084-514 | |
| Korpus mikroskopu Axio Observer | Filtr pasmowo-przepustowy Zeiss | ||
| Filtr pasmowo-przepustowy | Chroma Technology Corp | ET570/60m | |
| Filtr pasmowo-przepustowy | Filtr emisyjny akceptora | Chroma Technology Corp | ET675/50m |
| Conda-forge | Conda-forge Społeczność | Repozytorium pakietów Pythona dla szkiełek nakrywkowych Anaconda/miniconda | |
| 60 mm x 24 mm #1.5 | MENZEL | ||
| Lustro dichroiczne | Semrock Inc | FF640-FDi01-25&razy; 36 | separacja emisji donorowej i akceptorowej |
| Lustro dichroiczne (poczwórne pasmo) | Semrock Inc | Di01-R405/488/532/635-25 razy; 36 | separacja światła wzbudzenia i emisji |
| DPBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| FCS | Sigma-Aldrich | F7524 | do obrazowania analizy progów bufora |
| Schü tz group na TU Wien | Pakiet Python do analizy danych smFRET; wersja 3 | ||
| Fura-2 AM | Thermo Fisher Scientific | 11524766 | |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H8264 | do bufora obrazowania |
| iBeam Smart 405-S Laser 405 nm | Toptica Photonics AG | ||
| iXon Ultra 897 Kamera EMCCD | Andor Technology Ltd | ||
| Komory Lab-Tek ( 8 dołków) | Thermo Fisher Scientific | 177402PK | do przygotowania próbek i obrazowania |
| Laser Millenia Prime 532 nm | Spectra Physics | ||
| miniconda | Anaconda Inc. | Dystrybucja Pythona 3. Min. wersja: 3.7 | |
| Monowalentna streptawidyna (plazmidy do ekspresji bakterii) | Addgene | 20860 & 20859 | |
| OBIS 640 nm | laser Coherent Inc | 1185055 | |
| Optosplit II | Cairn Research | ||
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A5253 | do bufora obrazowania |
| Środek do czyszczenia | plazmyHarrick Plasma | PDC-002 | |
| sdt-python | Schü tz group na Uniwersytecie Technicznym w Wiedniu | Biblioteka Pythona do analizy danych; wersja 17 | |
| Zestaw rozmiarów koralików TetraSpek | Thermo Fisher Scientific | T14792 | Losowo rozmieszczone, unieruchomione markery referencyjne do rejestracji obrazu |
| USC500TH Kąpiel ultradźwiękowa | VWR | do formowania SUV-ów |
Bibliografia
- McKinney, S. A., Déclais, A. -C., Lilley, D. M. J., Ha, T. Structural dynamics of individual holliday junctions. Nature Structural Biology. 10 (2), 93-97 (2002).
- Wang, S., Vafabakhsh, R., Borschel, W. F., Ha, T., Nichols, C. G. Structural dynamics of potassium-channel gating revealed by single-molecule FRET. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (1), 31-36 (2015).
- Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nature Methods. 14 (2), 174-180 (2016).
- Kilic, S., et al. Single-molecule FRET reveals multiscale chromatin dynamics modulated by HP1α. Nature Communications. 9 (1), 235(2018).
- Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47 (1), 819-846 (1978).
- Wu, P. G., Brand, L. Resonance energy transfer: Methods and applications. Analytical Biochemistry. 218 (1), 1-13 (1994).
- Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. Single-molecular förster resonance energy transfer measurement on structures and interactions of biomolecules. Micromachines. 12 (5), 492(2021).
- Malkusch, N., Dörfler, T., Nagy, J., Eilert, T., Michaelis, J. smFRET experiments of the RNA polymerase II transcription initiation complex. Methods. 120, 115-124 (2017).
- Lee, J. -B., et al. Single-molecule views of MutS on mismatched DNA. DNA repair. 20, 82-93 (2014).
- Phelps, C., Israels, B., Jose, D., Marsh, M. C., von Hippel, P. H., Marcus, A. H. Using microsecond single-molecule FRET to determine the assembly pathways of T4 ssDNA binding protein onto model DNA replication forks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), E3612-E3621 (2017).
- Deindl, S., Zhuang, X. Monitoring conformational dynamics with single-molecule fluorescence energy transfer: Applications in nucleosome remodeling. Methods in Enzymology. 513, 59-86 (2012).
- Crawford, D. J., Hoskins, A. A., Friedman, L. J., Gelles, J., Moore, M. J. Single-molecule colocalization FRET evidence that spliceosome activation precedes stable approach of 5' splice site and branch site. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6783-6788 (2013).
- Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations. Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).
- Mori, T., Vale, R. D., Tomishige, M. How kinesin waits between steps. Nature. 450 (7170), 750-754 (2007).
- Huppa, J. B., et al. TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity. Nature. 463 (7283), 963-967 (2010).
- Göhring, J., et al. Temporal analysis of T-cell receptor-imposed forces via quantitative single molecule FRET measurements. Nature Communications. 12 (1), 2502(2021).
- Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669(2018).
- Kapanidis, A. N., et al. Fluorescence-aided molecule sorting: Analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (24), 8936-8941 (2004).
- Sakon, J. J., Weninger, K. R. Detecting the conformation of individual proteins in live cells. Nature Methods. 7 (3), 203-205 (2010).
- McCann, J. J., Choi, U. B., Zheng, L., Weninger, K., Bowen, M. E. Optimizing methods to recover absolute FRET efficiency from immobilized single molecules. Biophysical Journal. 99 (3), 961-970 (2010).
- Lee, N. K., et al. Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation. Biophysical Journal. 88 (4), 2939-2953 (2005).
- Asher, W. B., et al. Single-molecule FRET imaging of GPCR dimers in living cells. Nature Methods. 18 (4), 397-405 (2021).
- Joo, C., Ha, T. Single-molecule FRET with total internal reflection microscopy. (12), Cold Spring Harbor. 1223-1237 (2012).
- Joo, C., Ha, T. Objective-type total internal reflection microscopy (excitation) for single-molecule FRET. Cold Spring Harbor Protocols. 11, 1189-1191 (2012).
- Joo, C., Ha, T. Objective-type total internal reflection microscopy (emission) for single-molecule FRET. Cold Spring Harbor Protocols. 11, 1192-1194 (2012).
- Allan, D. B., Caswell, T., van der Wel, C. M., Dimiduk, T. Soft-matter/pims: PIMS v0.5. , https://github.com/soft-matter/pims (2020).
- Anaconda Inc. Miniconda. , https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html (2021).
- conda-forge community. The conda-forge project: community-based software distribution built on the conda package format and ecosystem. , (2015).
- JupyterLab Contributors Notebooks - JupyterLab documentation. , https://jupyterlab.readthedocs.io/en/stable/user/notebook.html (2021).
- Babcock, H., Sigal, Y. M., Zhuang, X. A high-density 3D localization algorithm for stochastic optical reconstruction microscopy. Optical Nanoscopy. 1 (6), (2012).
- Gao, Y., Kilfoil, M. L. Accurate detection and complete tracking of large populations of features in three dimensions. Optics Express. 17 (6), 4685(2009).
- Schrangl, L. sdt-python: Python library for fluorescence microscopy data analysis (v17.1). , Zenodo. (2021).
- Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of digital video microscopy for colloidal studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nature Methods. 7 (6), 418-419 (2010).
- Bradski, G. The OpenCV library. Dr. Dobb's Journal: Software Tools for the Professional Programmer. 25 (11), 120-123 (2000).
- Allan, D. B., Caswell, T., Keim, N. C., van der Wel, C. M., Verweij, R. W. Soft-matter/trackpy: Trackpy v0.5.0. Zenodo. , 4682814(2021).
- Killick, R., Fearnhead, P., Eckley, I. A. Optimal detection of changepoints with a linear computational cost. Journal of the American Statistical Association. 107 (500), 1590-1598 (2012).
- Schrangl, L., Göhring, J., Schütz, G. J. Kinetic analysis of single molecule FRET transitions without trajectories. The Journal of Chemical Physics. 148 (12), 123328(2018).
- Santoso, Y., Torella, J. P., Kapanidis, A. N. Characterizing single-molecule FRET dynamics with probability distribution analysis. ChemPhysChem. 11 (10), 2209-2219 (2010).
- Schrangl, L. Single-molecule FRET analysis software (3.0). Zenodo. , (2021).
- Nye, J. A., Groves, J. T. Kinetic control of histidine-tagged protein surface density on supported lipid bilayers. Langmuir. 24 (8), 4145-4149 (2008).
- Platzer, R., et al. Unscrambling fluorophore blinking for comprehensive cluster detection via photoactivated localization microscopy. Nature Communications. 11 (1), 4993(2020).
- Johnson, I., Spence, M. The molecular probes handbook: A guide to fluorescent probes and labeling technologies. , Life Technologies Corporation. (2010).
- Szalai, A. M., et al. Super-resolution imaging of energy transfer by intensity-based STED-FRET. Nano Letters. 21 (5), 2296-2303 (2021).
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
- Zhai, B., Zhai, S., Hao, R., Xu, J., Liu, Z. A FRET-based two-photon probe for in vivo tracking of pH during a traumatic brain injury process. New Journal of Chemistry. 43 (43), 17018-17022 (2019).
Przedruki i uprawnienia
