Zautomatyzowana dwuwymiarowa analiza czasoprzestrzenna mobilnych jednocząsteczkowych sond FRET

Summary

Ten artykuł przedstawia metodę analizy czasoprzestrzennej mobilnych, jednocząsteczkowych sond opartych na transferze energii rezonansu Förstera (smFRET) przy użyciu szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej. Nowo opracowany zestaw narzędzi programowych umożliwia wyznaczanie śladów czasowych smFRET poruszających się sond, w tym prawidłowej wydajności FRET i pozycji molekularnych, jako funkcji czasu.

Abstract

Jednocząsteczkowy transfer energii rezonansu Förstera (smFRET) to wszechstronna technika raportowania odległości w zakresie od sub-nanometra do nanometra. Został wykorzystany w szerokim zakresie eksperymentów biofizycznych i biologii molekularnej, w tym w pomiarze sił molekularnych, charakterystyce dynamiki konformacyjnej biomolekuł, obserwacji wewnątrzkomórkowej kolokalizacji białek oraz określaniu czasów interakcji receptor-ligand. W konfiguracji mikroskopii szerokokątnej eksperymenty są zwykle wykonywane przy użyciu sond unieruchomionych powierzchniowo. W artykule przedstawiono metodę łączącą śledzenie pojedynczych cząsteczek ze wzbudzeniem naprzemiennym (ALEX) eksperymenty smFRET, pozwalająca na uzyskanie śladów czasowych smFRET związanych z powierzchnią, ale ruchomych sond w błonach plazmatycznych lub dwuwarstwach lipidowych na podłożu szklanym. Do analizy zarejestrowanych danych opracowano zautomatyzowany zbiór oprogramowania typu open source, które wspiera (i) lokalizację sygnałów fluorescencyjnych, (ii) śledzenie pojedynczych cząstek, (iii) określanie wielkości związanych z FRET, w tym współczynników korekcyjnych, (iv) rygorystyczną weryfikację śladów smFRET oraz (v) intuicyjną prezentację wyników. Wygenerowane dane mogą być wygodnie wykorzystane jako dane wejściowe do dalszej eksploracji za pomocą specjalistycznego oprogramowania, np. do oceny zachowania dyfuzyjnego sond lub badania przejść FRET.

Introduction

Transfer energii rezonansu Förstera (FRET) był głównym motorem badań molekularnych biologicznych i biofizycznych, ponieważ pozwala badać procesy w rozdzielczości sub-nanometrowej. Ponieważ efektywność transferu energii między fluoroforami donorowymi i akceptorowymi silnie zależy od odległości między barwnikami w zakresie od subnanometra do nanometra, został on skutecznie wykorzystany jako linijka spektroskopowa do badania statycznej i dynamicznej konformacji biomolekuł^1,2,3,4. Ponadto zjawisko FRET jest szeroko stosowane do badań kolokalizacji białek związanych z błoną i wewnątrzkomórkowych na poziomie masowym^5,6. W ciągu ostatnich dwóch dekad metoda została zaadaptowana do monitorowania zdarzeń smFRET⁷, co przyczyniło się do znacznego zwiększenia rozdzielczości czasowej i przestrzennej oraz rozwiązało nawet rzadkie subpopulacje w heterogenicznych próbkach. Wyposażeni w te techniki, uzyskali unikalny wgląd w dynamikę maszynerii molekularnej, takiej jak szybkość przetwarzania transkryptu polimerazy RNA II⁸, szybkość replikacji polimeraz DNA^9,10, szybkość translokacji nukleosomów¹¹, szybkość splicingu i zatrzymania transkryptu złożonych spliceosomów¹², aktywność subpopulacji rybosomalnych¹³ oraz prędkość chodzenia Kinesin Motors¹⁴, żeby wymienić tylko kilka. Czas trwania interakcji receptor-ligand¹⁵ i siły molekularne^{16 zostały określone ilościowo}.

Badania smFRET oparte na intensywności zazwyczaj polegają na emisji uwrażliwionej do pomiaru efektywności FRET: rozdzielacz wiązki na ścieżce emisji przestrzennie rozdziela światło pochodzące z fluoroforów donorowych i akceptorowych po wzbudzeniu donora, co pozwala na ilościowe określenie intensywności poszczególnych fluorescencji. Wydajność można następnie obliczyć jako ułamek fotonów wyemitowanych przez akceptor w odniesieniu do całkowitej liczby fotonów¹⁷. Ponadto, wzbudzenie akceptora po wzbudzeniu dawcy (ALEX) pozwala na pomiar stechiometrii zdarzeń FRET, pomagając w rozróżnieniu między prawdziwymi sygnałami o niskiej wartości FRET od sygnałów pochodzących np. z sond z fotobielonym akceptorem fluorofor¹⁸.

Eksperymenty z pojedynczymi cząsteczkami FRET są zwykle przeprowadzane na jeden z dwóch sposobów. Najpierw mały obszar w objętości próbki jest oświetlany za pomocą mikroskopu konfokalnego. Pojedyncze cząsteczki sondy w roztworze są wzbudzane, gdy zdarzy się, że dyfundują w objętości ogniskowej. Dzięki tej technice można stosować szybkie detektory zliczające fotony, umożliwiające uzyskanie rozdzielczości w czasie poniżej mikrosekundy. Po drugie, sondy są specjalnie unieruchomione na powierzchniach i monitorowane za pomocą mikroskopii szerokokątnej, często przy użyciu konfiguracji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIR) w celu zminimalizowania fluorescencji tła. Unieruchomienie sondy pozwala na znacznie dłuższy czas rejestracji niż przy użyciu pierwszego podejścia. Ponadto większe pole widzenia pozwala na równoległe monitorowanie wielu sond. Potrzeba aparatu sprawia, że ta metoda jest powolna w porównaniu z opisaną powyżej. Rozdzielczość czasowa jest ograniczona do zakresu od milisekundy do sekundy.

Jeśli wymagane są długie ślady czasowe, np. do badania dynamicznych procesów w skali od milisekundy do sekundy, pierwsza metoda nie ma zastosowania, ponieważ wybuchy fluorescencji są zazwyczaj zbyt krótkie. Drugie podejście zawodzi, gdy unieruchomienie nie jest możliwe, np. w eksperymentach z żywymi komórkami, w których sondy dyfundują w błonie komórkowej. Ponadto zaobserwowano, że systemy modeli biologicznych mogą znacznie różnić swoją reakcję w zależności od ruchliwości powierzchni, z którą się styka¹⁶.

Chociaż w przeszłości przeprowadzano eksperymenty połączone z satelitami smFRET i śledzeniem pojedynczych cząstek, rejestrujące mobilne sondy FRET¹⁹, nie ma publicznie dostępnego oprogramowania do oceny danych. To skłoniło do opracowania nowej platformy analitycznej, która pozwala na określenie wielu właściwości mobilnych sond fluorescencyjnych, w tym wydajności smFRET i stechiometrii, pozycji z dokładnością subpikselową oraz intensywności fluorescencji w funkcji czasu. Metody filtrowania powstałych śladów poprzez badanie stopniowego bielenia, odległości od najbliższego sąsiada, intensywności emisji i innych cech zostały ustalone wyłącznie w celu wybrania prawidłowo zsyntetyzowanych i funkcjonalnych cząsteczek z pojedynczą sondą. Oprogramowanie obsługuje również techniki eksperymentalne i analityczne uzgodnione niedawno w badaniu wielolaboratoryjnym w celu uzyskania wiarygodnych, ilościowych danych smFRET ¹⁷. W szczególności wdrożenie jest zgodne z zatwierdzonymi procedurami obliczania wydajności FRET i stechiometrii. Intensywności fluorescencji po wzbudzeniu donora w kanale emisji donorowej I_DD i akceptorowym kanale emisji I_DA wykorzystuje się do obliczenia pozornej wydajności FRET E_przy użyciu korektora (1).

(1)

Za pomocą intensywności fluorescencji w kanale emisyjnym akceptora po wzbudzeniu akceptora I_AA, pozorna stechiometria jest obliczana za pomocą Eq (2).

(2)

Wydajność FRET E i stechiometria S mogą być uzyskane z _aplikacji E i aplikacji S, biorąc pod uwagę cztery współczynniki korekcyjne.

α opisuje wyciek fluorescencji donorowej do kanału emisyjnego donorowego i może być określony za pomocą próbki zawierającej tylko fluorofory donorowe lub poprzez analizę części trajektorii, w których akceptor został wybielony. δ koryguje bezpośrednie wzbudzenie akceptora przez źródło światła wzbudzającego donor i może być mierzony przy użyciu próbki zawierającej tylko fluorofory akceptorowe lub poprzez analizę części trajektorii, w których dawca został wybielony.

.

γ skaluje I_DD, aby skorygować rozbieżne wydajności wykrywania w kanałach emisyjnych donorowych i akceptorowych oraz różne wydajności kwantowe fluoroforów. Współczynnik ten można obliczyć, analizując wzrost intensywności dawcy po bieleniu akceptora w trajektoriach o wysokiej wydajności FRET²⁰ lub badając próbkę z wieloma dyskretnymi stanami FRET.

β skaluje I_AA, aby skorygować rozbieżne efektywności wzbudzenia dawcy i akceptora. Jeśli γ został określony za pomocą analizy bielenia akceptora, można β obliczyć na podstawie próbki o znanym stosunku dawców do akceptorów²¹. W przeciwnym razie wielostanowa próbka FRET również daje β.

Razem, poprawki pozwalają na obliczenie skorygowanej wydajności FRET za pomocą korektora (3).

(3)

i poprawiona stechiometria za pomocą korektora (4).

(4)

Idealnie, poprawiona stechiometria dla stosunku dawców do akceptorów 1:1 daje S = 0,5. W praktyce zmniejszony stosunek sygnału do szumu powoduje rozrzut zmierzonych wartości S, co utrudnia rozróżnienie między sygnałami tylko od dawcy (S = 1) i sygnałami tylko od akceptora (S = 0). Uzyskane w ten sposób ślady czasowe można wykorzystać jako dane wejściowe do bardziej szczegółowej analizy trajektorii pojedynczych cząsteczek w celu uzyskania informacji, takich jak czasoprzestrzenne profile sił¹⁶, ruchliwość zdarzeń pojedynczej cząsteczki²², lub kinetyka przejścia między różnymi stanami¹.

Poniższy protokół opisuje parametry eksperymentalne i procedury eksperymentów śledzenia smFRET, a także zasadę działania analizy danych przy użyciu nowo opracowanego pakietu oprogramowania. Do pozyskiwania danych doświadczalnych zaleca się stosowanie zestawu mikroskopowego spełniającego następujące wymagania: i) zdolność wykrywania emisji pojedynczych cząsteczek barwnika; ii) oświetlenie szerokokątne: w szczególności w przypadku eksperymentów z żywymi komórkami zalecana jest konfiguracja całkowitego wewnętrznego odbicia (TIR^23,24,25); iii) przestrzenna separacja światła emisyjnego w zależności od długości fali, tak aby fluorescencja donorowa i akceptorowa była rzutowana na różne obszary tego samego chipa kamery²⁵ lub różnych kamer; iv) modulacja źródeł światła do wzbudzenia donorowego i akceptorowego z milisekundową precyzją, np. za pomocą laserów modulowalnych bezpośrednio lub modulacji za pomocą modulatorów akustyczno-optycznych. Pozwala to na oświetlenie stroboskopowe w celu zminimalizowania fotowybielania fluoroforów, a także naprzemienne wzbudzenie w celu wyznaczenia stechiometrii; v) wyjście jednego pliku na zarejestrowaną sekwencję obrazów w formacie, który może być odczytany przez pakiet PIMS Python²⁶. W szczególności obsługiwane są wielostronicowe pliki TIFF.

Protocol

1. Wymagania wstępne dotyczące oprogramowania

1. Zainstaluj dystrybucję języka Python miniconda²⁷ (minimalna wymagana wersja języka Python: 3.7).
2. Otwórz wiersz polecenia Anaconda w menu Start systemu Windows lub otwórz terminal i uruchom polecenie conda activate, jeśli używasz systemu Linux lub macOS.
3. Włącz repozytorium pakietów conda-forge obsługiwane przez społeczność²⁸, wykonując następujące polecenia:
   conda config --add channels conda-forge
   conda config --set channel_priority strict
   conda update --all
4. Zainstaluj wymagane pakiety Pythona, wykonując:
   conda install opencv trackpy lmfit ipympl scikit-learn pyqt sdt-python jupyterlab
5. Zapoznaj się z JupyterLab, interfejsem użytkownika oprogramowania analitycznego (patrz dokumentacja oprogramowania²⁹).
6. Zainstaluj system kontroli wersji git, który będzie później używany do pobierania i aktualizowania oprogramowania analitycznego. Jeśli używasz systemu Linux, użyj oprogramowania do zarządzania pakietami dystrybucji, aby pobrać i zaktualizować. W przeciwnym razie wykonaj:
   conda install git
7. Opcjonalnie zainstaluj pakiet przyczepki języka Python, aby wyświetlić zestawy danych po krokach filtrowania podczas analizy:
   Przyczepka instalacji Conda

2. Pomiar próbek

Rysunek 1: Akwizycja obrazu. (A) Sekwencja wzbudzenia. Po zarejestrowaniu opcjonalnego obrazu komórki obciążonej barwnikiem za pomocą lasera o długości fali 405 nm, dawca i akceptor są wzbudzani naprzemiennie i wielokrotnie przez czas oświetlenia_{przy użyciu} odpowiednio laserów o długości fali 532 nm i 640 nm. Czas _pomiędzy wzbudzeniem dawcy i akceptora musi być wystarczająco długi, aby umożliwić odczytanie obrazu przez kamerę. _Opóźnienie czasu t można wykorzystać do dostosowania liczby klatek na sekundę akwizycji, a tym samym przedziału czasu obserwacji przed fotowybielaniem. Ten panel został zmodyfikowany z ¹⁶. (B) Znaczniki odniesienia są używane do obliczania przekształceń współrzędnych między dwoma kanałami emisyjnymi. Pasujący powiernicy są oznaczeni kolorem. Należy zarejestrować kilka przesuniętych obrazów, aby zapewnić pokrycie całego pola widzenia. (C) Profile laserowe do korekcji płaskiego pola są rejestrowane przy użyciu gęsto oznakowanej próbki. Profil akceptora jest rejestrowany i poddawany fotowybielaniu, a następnie pozyskiwany jest profil dawcy. Należy wykonać wiele zdjęć w różnych obszarach próbki, uśrednić je i wygładzić, aby złagodzić wpływ niedoskonałości próbki (np. jasnego punktu w środkowej części obrazu). (D) Mapa korekcyjna pola płaskiego p(x,y) obliczona na podstawie 20 profili lasera zarejestrowanych zgodnie z opisem w C. Skróty: FRET = transfer energii rezonansu Förstera; Im_DD = obraz emisji dawcy po wzbudzeniu dawcy; Im_DA = obraz emisyjny akceptora po wzbudzeniu dawcy; Im_AA = obraz emisyjny akceptora po wzbudzeniu dawcy. Podziałka = 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. W przypadku korzystania z kamery EMCCD (EMCCD) z urządzeniem zwielokrotniającym ładunek, włącz wzmocnienie EM, aby obserwować sygnały jednocząsteczkowe przy wysokim stosunku sygnału do szumu (patrz instrukcje producenta).
2. Sekwencja wzbudzenia (zobacz Rysunek 1A, aby uzyskać więcej informacji).
   1. Opcjonalnie nagraj obraz do segmentacji, aby ograniczyć analizę danych do określonych regionów w polu widzenia. Na przykład, wzbudz komórki obciążone Fura-2 za pomocą lasera 405 nm i przechwyć ich emisję około 510 nm, aby ocenić tylko sondy znajdujące się w interfejsach między komórkami i obsługiwanymi dwuwarstwami lipidowymi (SLB). W związku z tym poczekaj, aż czas t_r pozwoli na odczyt z kamery.
      UWAGA: W kamerach EMCCD wartość_zależy od liczby linii w wybranym obszarze zainteresowania (ROI). Dlatego wybór małego zwrotu z inwestycji może być korzystny, ponieważ zmniejsza opóźnienie między klatkami i rozmiar rejestrowanych danych. Dodatkowo włączenie trybu transferu klatek pozwala na dalsze zmniejszenie t_r.
   2. Na przemian wielokrotnie pobudzaj fluorofory dawcy i akceptora.
      1. Pobudź dawcę przez krótki czas oświetlenia (5-10 ms jest zwykle wystarczająco krótkie, aby uniknąć rozmycia ruchu), jednocześnie uruchamiając kamerę.
      2. Poczekaj, aż czas będzie mógł pozwolić na odczyt z kamery.
      3. Wzbudz akceptor podczas wyzwalania kamery.
      4. Poczekaj na _opóźnienie czasowe.
         UWAGA: Musi być dłuższy niż t_r, aby umożliwić odczyt przez kamerę, ale w przeciwnym razie można go wybrać dowolnie. Musi on równoważyć wymagania dotyczące rozdzielczości czasowej i długości trasy.
      5. Powtórz kroki 2.2.2.1-2.2.2.4. Wybierz liczbę powtórzeń, która ma być wystarczająco duża, aby zapewnić fotowybielanie co najmniej jednego fluoroforu na sondę w polu widzenia, co pozwala na krokową analizę fotowybielania w celu odróżnienia sygnałów jednocząsteczkowych od agregatów.
         UWAGA: Wybór odpowiednich intensywności lasera wzbudzającego i wzbudzającego zwykle wymaga pewnych eksperymentów: im dłuższe czasy oświetlenia i im wyższe intensywności lasera, tym lepszy jest stosunek sygnału do szumu w wynikowych obrazach, ale tym krótsze są wynikowe ślady czasowe.
3. Nagraj wystarczającą liczbę filmów dla każdej próbki.

3. Dodatkowe pomiary do określenia współczynników korygujących

1. Nagraj serię losowo rozmieszczonych znaczników odniesienia widocznych w obu kanałach emisyjnych w celu rejestracji obrazu (tj. znalezienia transformacji, która odwzorowuje współrzędne kanału emisyjnego dawcy na kanał emisyjny akceptora i odwrotnie). Zobacz Rysunek 1B.
   UWAGA: Rejestracja obrazu jest wykonywana przez oprogramowanie; Patrz krok 6.1.4.
2. Zmierz profil intensywności zarówno dla źródeł światła wzbudzenia donorowego, jak i akceptorowego w celu korekcji pola płaskiego (tj. korekcji niejednorodnego wzbudzenia w całym polu widzenia). W tym celu należy przygotować próbkę z sondami FRET o dużej gęstości i najpierw uzyskać obraz po wzbudzeniu akceptorowym, a następnie fotowybielać akceptor, a następnie rejestrować obraz po wzbudzeniu dawcy. Aby zwiększyć stabilność, powtórz kilka razy w różnych regionach próbki. Zobacz Rysunek 1C,D. Alternatywnie, należy zarejestrować próbkę ozdobioną tylko cząsteczką donorową i drugą próbkę ozdobioną tylko fluoroforami akceptorowymi.
   UWAGA: Korekcja płaskiego pola jest wykonywana przez oprogramowanie analityczne; Patrz krok 8.1.2.
3. Zapisać jednocząsteczkową próbkę (jak w sekcji 2) sondy bez fluoroforu akceptorowego w celu określenia emisji donorowej przeciekającej do kanału akceptorowego.
   UWAGA: Wyciek dawcy można również obliczyć na podstawie rzeczywistych śladów czasu sond po wybielaniu akceptora. Jeśli zarejestrowana zostanie wystarczająca liczba takich zdarzeń, nie jest konieczne wykonywanie dodatkowych pomiarów. Obie opcje są obsługiwane przez oprogramowanie analityczne; patrz Informacje uzupełniające, sekcja 3.15.
4. Pozyskanie nagrań sondy bez fluoroforu donorowego w celu ilościowego określenia bezpośredniego wzbudzenia akceptora przez źródło światła wzbudzenia donora.
   UWAGA: Bezpośrednie wzbudzenie akceptora można również wyprowadzić z rzeczywistych śladów czasowych sond po wybielaniu dawcy. Jeśli zarejestrowana zostanie wystarczająca liczba takich zdarzeń, nie jest konieczne wykonywanie dodatkowych pomiarów. Obie opcje są obsługiwane przez oprogramowanie analityczne; patrz Informacje uzupełniające, sekcja 3.15.
5. Zarejestrować próbkę pojedynczej cząsteczki o dwóch różnych wydajnościach FRET, aby skorygować różną skuteczność wykrywania kanałów emisyjnych donorowych i akceptorowych oraz różną wydajność kwantową barwników.
   UWAGA: Takimi próbkami mogą być na przykład połączenia Hollidaya ¹, które wahają się między dwiema konformacjami, lub pręciki DNA, które mają pary FRET przyczepione w różnych, dobrze zdefiniowanych odległościach. Jeśli sondy charakteryzują się wysoką i wystarczająco stałą wydajnością FRET, korekcję można również obliczyć na podstawie zdarzeń bielenia akceptora na podstawie śladów czasowych sond, w którym to przypadku nie są konieczne żadne dodatkowe pomiary. Obie opcje są obsługiwane przez oprogramowanie analityczne; patrz Informacje uzupełniające, sekcja 3.15.

4. Algorytmy lokalizacji pojedynczych cząsteczek

UWAGA: Kilka etapów analizy wymaga lokalizacji pojedynczej cząsteczki. Wybierz pomiędzy algorytmem dopasowania Gaussa³⁰ i obliczeniami środka masy³¹, w zależności od gęstości sygnału, tła i stosunku sygnału do szumu.

1. Aby wykonać dopasowanie gaussowskie, należy wybrać algorytm 3D-DAOSTORM³⁰ za pomocą odpowiednich interfejsów użytkownika.
   UWAGA: 3D-DAOSTORM jest przeznaczony do rozróżniania równych sygnałów z funkcjami nakładania się punktów. Chociaż jest to ogólnie zaleta, wiąże się z pewnym zastrzeżeniem: pojedyncze, jasne sygnały są czasami identyfikowane jako dwa sąsiadujące, co może zmylić algorytm śledzenia i spowodować wykrycie dwóch krótkich trajektorii zamiast jednej długiej.
   Ustaw następujące parametry (aby uzyskać szczegółowe informacje, zobacz dokumentację biblioteki sdt-python³², która zawiera implementację algorytmu).
   1. promień: Ustaw początkową wartość σ funkcji dopasowania gaussowskiego w pikselach w zależności od efektywnego rozmiaru piksela.
   2. próg: Ustaw minimalną amplitudę (tj. najjaśniejszą wartość piksela, skorygowaną o szacowane lokalne tło) dla dopasowania maksimum intensywności lokalnej.
      UWAGA: Próg jest prawdopodobnie najważniejszym parametrem. Jeśli jest ustawiony zbyt nisko, szum może być uważany za sygnał fluorescencyjny, a jasne sygnały mogą być wyposażone w dwa Gaussa. Jeśli jest ustawiony zbyt wysoko, przyciemnione sygnały nie są odpowiednie.
   3. model: Ustaw wartość 2d, aby dopasować do kołowych gaussianów.
      UWAGA: Inne modele nie mają zastosowania do danych smFRET.
   4. znajdź filtr: Zastosuj filtr przed znalezieniem lokalnych maksimów, aby zredukować szum, co jest przydatne w sytuacjach niskiego stosunku sygnału do szumu. Może to być i) tożsamość: brak filtra; ii) Crocker-Grier: filtr pasmowoprzepustowy z algorytmu Crockera-Griera^31,33; lub iii) Gaussowskie: rozmycie gaussowskie z σ ustawianym przez parametr sigma.
      UWAGA: W przypadku Crockera-Griera parametr feat. size powinien być w przybliżeniu równy promieniowi funkcji rozrzutu punktowego w pixels.
      UWAGA: Dopasowywanie odbywa się przy użyciu niefiltrowanych danych surowych.
   5. minimalna odległość: Dopasuj dwa sygnały prospektywne oddalone od siebie o mniej niż minutową odległość pikseli pojedynczym gaussowskim.
      UWAGA: Może to pomóc w wyżej wymienionym scenariuszu, w którym jasny sygnał jest błędnie wykrywany jako dwa sąsiednie sygnały.
   6. Zakres rozmiarów: Wybierz minimalną i maksymalną σ pasowań, aby usunąć detekcje z fałszywych sygnałów spowodowanych szumem.
2. Wybierz algorytm Crockera-Griera za pomocą odpowiednich interfejsów użytkownika, aby wykonać obliczenia środka masy (udoskonalony algorytm³¹ w oparciu o pomysł Crockera i Griera³³).
   UWAGA: Ten algorytm jest bardzo niezawodny nawet w scenariuszach o niskim stosunku sygnału do szumu oraz w radzeniu sobie z sygnałami o różnych natężeniach, ale nie może dokładnie dopasować cząsteczek z funkcjami rozprzestrzeniania się punktów nakładających się.
   1. promień: Ustaw promień (w pikselach) dysku wystarczająco dużego, aby zawierał całą funkcję rozproszenia punktów.
   2. młócenie sygnału: Ustaw minimalną amplitudę (najjaśniejszy piksel powyżej szacowanego tła) dla lokalnego maksimum intensywności, które ma być analizowane.
      UWAGA: Jeśli jest ustawiony zbyt nisko, szum może być uznany za sygnał fluorescencyjny. Jeśli jest ustawiony zbyt wysoko, przyciemnione sygnały nie są odpowiednie.
   3. mass thresh.: Ustaw minimalną całkowitą intensywność (sumę wartości pikseli skorygowanych w tle) sygnału, który ma być analizowany.
      UWAGA: Obowiązują te same względy, co powyżej.

5. Inicjalizacja oprogramowania

1. Pobierz skrypty analizy. W wierszu polecenia programu Anaconda przejdź do folderu, w którym chcesz zapisać analizę (za pomocą polecenia cd) i wykonać
   git clone https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis.git folderu docelowego
   1. Zastąp folder docelowy opisową nazwą, taką jak 2021-06-14_Force-FRET-experiment.
      UWAGA: Oprogramowanie analityczne znajdzie się w tym folderze; Upewnij się wcześniej, że ten folder nie istnieje. Zaleca się pobranie kopii skryptów analizy dla każdego eksperymentu. W ten sposób możliwe jest późniejsze przejrzenie analizy, przypomnienie sobie użytych parametrów i wprowadzenie zmian.
2. Kopiowanie notesów Jupyter (01. Śledzenie.ipynb, 02. Analiza.ipynb, 03. Plots.ipynb) do nowo utworzonego folderu (zwanego dalej folderem głównym). Jeśli korzystasz z oprogramowania po raz pierwszy, pobierz je z podfolderu notess w folderze głównym.
   UWAGA: Jeśli podobne zestawy danych zostały już przeanalizowane, skopiowanie notesów z poprzedniego eksperymentu może być wygodną opcją, ponieważ parametry mogły się zmienić tylko nieznacznie.
3. Uruchom serwer JupyterLab, wykonując następujące polecenie w wierszu polecenia Anaconda, aby otworzyć okno przeglądarki internetowej wyświetlające JupyterLab.
   Jupyter Lab
   UWAGA: Przeglądarka jest tylko interfejsem, podczas gdy proces uruchomiony w wierszu polecenia Anaconda wykonuje rzeczywistą pracę. W konsekwencji zamknięcie okna przeglądarki ma tylko minimalny efekt; Sesję można przywrócić, uzyskując dostęp do http://localhost:8888. Jednak przerwanie procesu JupyterLab w monicie lub zamknięcie monitu spowoduje zakończenie analizy, co prowadzi do utraty niezapisanej pracy.
4. W oknie przeglądarki JupyterLab użyj lewego panelu, aby przejść do folderu głównego. Kliknij dwukrotnie 01. Tracking.ipynb, aby uruchomić pierwszy notebook. Po uruchomieniu poszukaj nowej karty, która wyświetla pola, tak zwane komórki, kodu Pythona.
   UWAGA: Wszystkie notesy Jupyter zawierają komentarze opisujące funkcjonalność każdej komórki kodu. Dodatkowo, dokumentacja dla każdego wywołania metody może być wyświetlana poprzez umieszczenie kursora tekstowego bezpośrednio przed otwarciem ( i naciśnięcie Shift+Tab.
5. Zobacz Rysunek 2, aby zapoznać się z przeglądem procesu analizy danych.

Rysunek 2: Przegląd typowego potoku analizy. Należy pamiętać, że etapy filtrowania podlegają adaptacji zgodnie z projektem eksperymentalnym. Ten rysunek został zmodyfikowany z ¹⁶. Skrót: FRET = transfer energii rezonansu Förstera. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

UWAGA: Przykładowe dane do wypróbowania oprogramowania można pobrać ze strony https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis/releases/tag/example_files

6. Lokalizacja, śledzenie i analiza intensywności fluorescencji pojedynczych cząsteczek (01. Śledzenie.ipynb).

1. Użyj przycisku 01. Notatnik Tracking.ipynb Jupyter do niezawodnej analizy wartości intensywności fluorescencji sygnałów jednocząsteczkowych, który jest dostosowany do precyzyjnej kwantyfikacji, szczególnie słabych sygnałów często występujących w pomiarach FRET (np. z powodu niskich sygnałów donorowych przy zdarzeniach o wysokim FRET i odwrotnie).
   UWAGA: W tym celu zaimplementowano bezpośrednią integrację intensywności pikseli w danych surowych z korekcją dla lokalnego tła. Zrzuty ekranu przedstawiające każdy krok analizy i opis parametrów wywołania funkcji znajdują się w informacjach uzupełniających.
   1. Określ sekwencję oświetlenia, aby umożliwić wybór ramek wzbudzenia donorowego i akceptorowego, a także ramek do segmentacji obrazu z zarejestrowanych sekwencji obrazu.
      UWAGA: Ponieważ oprogramowanie umożliwia przetwarzanie danych zarejestrowanych za pomocą dowolnych protokołów oświetlenia, konieczne jest wskazanie, która klatka w sekwencji obrazu została uzyskana podczas wzbudzania jakiego rodzaju fluoroforu; patrz Informacje uzupełniające, sekcja 1.2, krok 3. Numery klatek oryginalnej sekwencji obrazów są zachowywane.
   2. Opisywanie i ładowanie zestawów danych. Analizuj wiele zestawów danych jednocześnie, pod warunkiem, że zostały one zarejestrowane przy użyciu tych samych ustawień oświetlenia. Przypisz identyfikator i wzorzec, który pasuje do odpowiednich nazw plików sekwencji obrazów do każdego zestawu danych. Ponadto można zdefiniować określone zestawy danych do celów specjalnych, takich jak nagrania markerów odniesienia do rejestracji obrazu, profile światła wzbudzenia do korekcji płaskiego pola oraz opcjonalnie próbki tylko dla dawcy i tylko dla akceptora w celu określenia współczynników korekcyjnych.
   3. Wybierz kanały emisji w obrazach RAW, jeśli oba kanały zostały nagrane za pomocą jednej kamery. W tym celu należy użyć odpowiedniego widżetu graficznego, aby wybrać odpowiednie regiony dla emisji donorowej i akceptorowej.
   4. Zlokalizuj znaczniki odniesienia w obu kanałach emisyjnych i wykonaj rejestrację obrazu. Użyj dostarczonego interfejsu użytkownika, aby znaleźć odpowiednie parametry algorytmu lokalizacji zarówno dla kanału emisji dawcy, jak i akceptora. Zobacz sekcję 4, aby uzyskać informacje na temat obsługiwanych algorytmów lokalizacji.
      UWAGA: Losowo rozmieszczone markery referencyjne można zidentyfikować w kanałach emisyjnych na podstawie rozkładu przestrzennego ich najbliższych sąsiadów (Rysunek 1B). Niestandardowa implementacja algorytmu zaproponowanego dla mikroskopii selektywnego oświetlenia płaszczyznowego³⁴ w bibliotece sdt-python automatycznie dopasowuje pozycję każdego markera w kanale emisyjnym dawcy do pozycji w kanale emisyjnym akceptora. Transformacja T odwzorowująca współrzędne kanału emisyjnego donora na współrzędne kanału emisyjnego akceptora jest znajdowana za pomocą liniowego dopasowania metodą najmniejszych kwadratów transformacji afinicznej do pozycji znaczników³⁵. RANSAC służy do uwzględniania wartości odstających, takich jak nieprawidłowo dopasowane pozycje z poprzedniego kroku.
   5. Lokalizuj sondy FRET niezależnie po wzbudzeniu donora i akceptora we wszystkich ramkach i scalaj wyniki w jedną tabelę, która zawiera oryginalny numer ramki, współrzędne 2-wymiarowe i identyfikator odnoszący się do pliku obrazu źródłowego.
      UWAGA: W tym celu oprogramowanie udostępnia interfejsy użytkownika umożliwiające znalezienie odpowiednich opcji dla algorytmu lokalizacji.
      1. Lokalizuj sondy FRET po wzbudzeniu donora w sumie obrazów uzyskanych z emisji donorowej Im_DD i emisji akceptorowej Im_DA, które prawie nie zależą od wydajności FRET. Więcej informacji na temat opcji algorytmu lokalizacji znajduje się w sekcji 4.
         UWAGA: Każdy obraz sumy jest obliczany przez przekształcenie Im_DD przy użyciu transformacji T uzyskanej wcześniej z rejestracji obrazu i dodanej pikselowo do Im_DA.
      2. Lokalizuj sondy po wzbudzeniu akceptora w akceptowalnym kanale emisyjnym Im_AA (szczegółowe informacje na temat algorytmów lokalizacji znajdują się w sekcji 4).
   6. Wykonaj śledzenie i pomiar intensywności fluorescencji.

Rysunek 3: Pomiar intensywności pojedynczej cząsteczki. (A) Dla fluoroforu znajdującego się na pomarańczowym pikselu, jego nieskorygowana intensywność I_uncorr jest określana przez zsumowanie intensywności wszystkich pikseli w dysku (żółte i pomarańczowe piksele) wystarczająco dużego, aby pokryć wszystkie piksele, na które wpływa sygnał: . Lokalne tło jest obliczane jako średnia pikseli w pierścieniu (niebieskie piksele) wokół dysku: , gdzie n_pierścieni to liczba pikseli w pierścieniu. Intensywność fluorescencji I jest wynikiem odjęcia tła od nieskorygowanego natężenia, I = I_uncorr - b × n_dysku, gdzie n_dysk to liczba pikseli w dysku. Promień okręgu jest określany za pomocą parametru feat_radius metody śledzenia. Szerokość pierścienia jest określona przez parametr bg_frame. Jeśli funkcja rozproszenia punktowego jednego sygnału nakłada się na pierścień tła innego sygnału (panel dolny), dotknięte nim piksele (kolor czerwony) są wykluczane z lokalnej analizy tła. Jeśli dwie funkcje rozrzutu punktowego nakładają się na siebie, intensywności fluorescencji nie można wiarygodnie obliczyć i dlatego są one odrzucane. (B, C) Symulacje pokazują, że zastosowanie rozmycia gaussowskiego z odchyleniem standardowym wynoszącym 1 piksel poprawia stosunek sygnału do szumu do współczynnika bliskiego 2 przy niskich intensywnościach fluorescencji (B) i nie wprowadza prawie żadnego błędu (nieznaczne niedoszacowanie poniżej 1%, (C))¹⁶. Co więcej, błąd względny (tj. (I_mierzy - I_prawda)/I_prawda, gdzie I_prawda jest prawdą podstawową, a I_miary jest wynikiem analizy) jest stały w całym zakresie intensywności i dlatego znosi się dla wielkości ratiometrycznych, takich jak sprawność FRET i stechiometrie. Wszystkie wykresy są oparte na wcześniej opublikowanych pracach¹⁶. Skróty: SNR = stosunek sygnału do szumu; FRET = transfer energii rezonansu Förstera. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Wybierz odpowiednie opcje dla algorytmu trackpy³⁶ używanego do łączenia lokalizacji sondy FRET w trajektorie. W szczególności ustaw maksymalną odległość wyszukiwania od jednej klatki do drugiej oraz liczbę kolejnych klatek, dla których sygnał może pozostać niewykryty, co może nastąpić z powodu wybielania lub pominiętych lokalizacji.
   UWAGA: Luki te są wypełniane poprzez interpolację między poprzednimi i następującymi pozycjami. Te interpolowane pozycje są oznaczone i używane dopiero później do odczytu wartości intensywności, ale nie do analizy dyfuzji. Ścieżki są analizowane w układzie współrzędnych akceptorowego kanału emisyjnego. Do analizy intensywności fluorescencji (krok 6.1.6.2) ścieżki są dodatkowo przekształcane do układu współrzędnych kanału emisyjnego donorowego za pomocą odwrotnej transformacji ^T-1 uzyskanej przez rejestrację obrazu (patrz krok 6.1.4).
2. Wybierz opcje algorytmu obliczania intensywności fluorescencji (patrz Rysunek 3A, aby uzyskać szczegółowe informacje). Określ i) promień dysku, który po wyśrodkowaniu na pozycji sygnału zawiera wszystkie piksele, na które ten sygnał ma wpływ, oraz ii) szerokość pierścienia wokół każdego dysku używanego do określenia lokalnego tła.
   UWAGA: Aby zredukować szum w uzyskanych pomiarach intensywności, do obrazów nanoszone jest rozmycie gaussowskie z odchyleniem standardowym 1 piksela (Rysunek 3B,C).

7. Funkcja oprogramowania analitycznego służy do przetwarzania pomocniczych danych obrazu z sekwencji obrazów.
   1. Wyodrębnij dodatkowe obrazy zarejestrowane w celu ułatwienia segmentacji (patrz krok 2.2.1, oznaczony literą s w sekwencji wzbudzenia (patrz Informacje uzupełniające, sekcja 1.2, krok 3).
   2. Określić profile światła wzbudzenia donorowego i akceptorowego w całym polu widzenia na podstawie obrazów zarejestrowanych na gęsto oznakowanej próbce (patrz krok 3.2).
      UWAGA: Średnia piksel po pikselu jest obliczana na podstawie obrazów w celu obliczenia profili światła. Linia bazowa kamery jest odejmowana. Obrazy są rozmyte za pomocą filtra Gaussa w celu zmniejszenia efektów spowodowanych zanieczyszczeniami próbki. Na koniec wynikowe obrazy są dzielone pikselowo przez ich maksymalną wartość, aby uzyskać profil p(x,y) odwzorowujący współrzędne na interwał [0,1].

7. Wizualizacja trajektorii FRET (opcjonalnie)

1. Użyj aplikacji inspector, aby wyświetlić ślady pojedynczych cząsteczek w surowych danych obrazu oraz odpowiadające im intensywności fluorescencji oraz pozorną wydajność FRET i stechiometrie.
   UWAGA: Jest to cenne narzędzie do oceny poprawności wybranych parametrów oraz ręcznego akceptowania lub odrzucania poszczególnych śladów czasowych. Zobacz Informacje uzupełniające, aby uzyskać zrzut ekranu i szczegółowe informacje o użyciu.

8. Analiza i filtrowanie danych dotyczących pojedynczych cząsteczek (02. Analiza.ipynb)

1. Użyj przycisku 02. Notatnik Analysis.ipynb Jupyter do analizy i filtrowania danych dotyczących pojedynczych cząsteczek uzyskanych za pomocą 01. Notatnik Tracking.ipynb. Zapoznaj się z poniższymi krokami, aby zapoznać się z typowym potokiem analizy.
   UWAGA: Różne pytania naukowe i projekty eksperymentalne mogą wymagać dostosowania ustawień. Korzystanie z notatników Jupyter umożliwia łatwą adaptację poprzez pomijanie, przestawianie i zmienianie kroków analizy. Aby zapoznać się ze zrzutami ekranu każdego kroku analizy i opisem parametrów wywołania funkcji, zapoznaj się z informacjami uzupełniającymi.
   1. Wykonaj początkowe kroki filtrowania.
      1. Odrzuć sygnały z funkcjami nakładania się punktów, ponieważ trudno jest wiarygodnie określić ich intensywność fluorescencji.
      2. W przypadku niejednorodnego oświetlenia należy akceptować tylko sygnały znajdujące się w dobrze oświetlonych obszarach w polu widzenia, aby zapewnić dobry stosunek sygnału do szumu.
      3. W przypadku badania wewnątrzcząsteczkowego FRET, ogranicz analizę do tych trajektorii, które występują od początku sekwencji obrazu, aby upewnić się, że wszystkie etapy bielenia są rejestrowane i mogą być prawidłowo ocenione później podczas krokowej analizy fotowybielania.
         UWAGA: Podczas wykonywania eksperymentów z międzycząsteczkowymi sondami FRET, w których fluorofory donorowe i akceptorowe nie są częścią wstępnie uformowanego kompleksu, ograniczenie analizy do początkowo prezentowanych trajektorii może nie być wykonalne.
   2. Wykonać korekcję płaskiego pola, która wykorzystuje profile wzbudzenia źródła światła uzyskane w kroku 6.1.7.2 w celu odwrócenia zależnych od położenia zmian intensywności fluorescencji spowodowanych niejednorodnym oświetleniem.
      UWAGA: Intensywność fluorescencji I(x,y) sondy w pozycji (x,y) jest korygowana za pomocą ; patrz Rysunek 1C,D.
   3. Oblicz _pozorną wydajność FRET E app (tj. część energii przekazanej z fluoroforu donorowego do fluoroforu akceptorowego) i pozorną stechiometrię S_app (tj. liczbę fluoroforów donorowych podzieloną przez całkowitą liczbę fluoroforów w miejscu ograniczonym dyfrakcją).
      UWAGA: Wykreślając E w stosunku do S dla każdego punktu danych, można odróżnić zmiany w zmierzonej wydajności FRET spowodowane zmianą odległości donor-akceptor od zmian spowodowanych zmianami stechiometrii¹⁸. Pozwala to na rozróżnienie między E = 0 ze względu na separację barwnika od E = 0 ze względu na brak aktywnego akceptora. Wykresy E-S są wykorzystywane w całej analizie jako narzędzie do oceny jakości; zobacz Rysunek 4 jako przykład.
   4. Wykonaj krokową analizę fotowybielania w celu rozróżnienia między pojedynczymi sondami molekularnymi a agregatami. Wybierz, aby zaakceptować jedną z następujących opcji.
      UWAGA: W tym celu oprogramowanie analityczne stosuje niestandardową implementację³² algorytmu wykrywania punktów zmian PELT³⁷ oddzielnie do intensywności fluorescencji po wzbudzeniu donora (I_DD + I_DA) i wzbudzeniu akceptora (I_AA).
      1. Wybierz opcję 1, w której akceptor fluoroforowy wybiela się w jednym kroku, podczas gdy dawca nie wykazuje częściowego wybielania (tj. nie ma etapu wybielania do niezerowej intensywności).
         UWAGA: Ta opcja dodatkowo odrzuca trajektorie, w których dawca wybiela się przed akceptorem w jednym kroku. Opcja 1 jest preferowanym wyborem w przypadku wysokich wskaźników fotowybielania akceptora.
      2. Wybierz opcję 2, w której dawca wybiela w jednym kroku, podczas gdy nie ma częściowego wybielania akceptora.
         UWAGA: Ta opcja dodatkowo odrzuca trajektorie, w których dawca wybiela się za akceptorem w jednym kroku. Wariant 2 jest preferowanym wyborem w przypadku wysokich wskaźników fotowybielania przez dawców.
      3. Wybierz opcję 3, w której fluorofor wybiela się w jednym kroku, podczas gdy drugi nie wybiela częściowo.
         UWAGA: Wariant 3 zapewnia większą elastyczność niż warianty 1 i 2 i byłby sugerowaną preferencją w odniesieniu do analizy danych.
      4. Wybierz opcję 4, w której fluorofory dawcy i akceptora wykazują jednoetapowe fotowybielanie lub brak fotowybielania w ogóle.
         UWAGA: Opcja 4 jest preferowana w przypadku niskich wskaźników fotowybielania.
   5. Oblicz współczynniki korekcyjne dla wycieku emisji donora do kanału akceptora α, bezpośredniego wzbudzenia akceptora δ, skuteczności wykrywania γ i sprawności wzbudzenia β¹⁷.
   6. Użyj współczynników korekcyjnych, aby obliczyć sprawność FRET E z _aplikacji pozornej sprawności E i stechiometrię S z _pozornej stechiometrii S.
   7. Wykonaj dalsze kroki filtrowania. W każdej trajektorii należy wybrać tylko punkty danych sprzed pierwszego zdarzenia wybielania. Ponadto akceptuj tylko trajektorie, w których co najmniej 75% punktów danych spełnia 0,35 < S < 0,6, aby ograniczyć analizę do sond jednocząsteczkowych (liczby można regulować).
      UWAGA: Górna i dolna granica dla powinna być wybrana zgodnie z rozprzestrzenianiem się populacji będącej przedmiotem zainteresowania w porównaniu z populacjami, które mają być wyłączone z analizy (np. populacje tylko dawcy i tylko akceptanta). Z doświadczenia wynika, że 0,35 < S < 0,6 okazały się dobrym wyborem w wielu sytuacjach eksperymentalnych.
   8. Segmentację obrazu należy przeprowadzić za pomocą globalnych lub adaptacyjnych metod progowania³⁵ na odpowiednich obrazach pomocniczych (patrz kroki 2.2.1 i 6.1.7), aby ograniczyć analizę do odrębnych obszarów w polu widzenia.
      UWAGA: Pozwala to na przykład na wyłączną ocenę sond znajdujących się na granicy faz komórka-SLB lub na strukturze wzorcowej.

9. Wykreślanie wyników i dalsza analiza (03. Działka.ipynb)

UWAGA: Zapoznaj się z informacjami uzupełniającymi, aby zobaczyć zrzuty ekranu notatnika Jupyter i opis parametrów wywołania funkcji.

1. Utwórz wykresy E-S, aby sprawdzić, czy sygnały nieprawidłowej stechiometrii zostały prawidłowo zidentyfikowane i usunięte.
2. Wykreśl histogramy sprawności FRET, aby uzyskać dobrze ugruntowany przegląd rozkładów wydajności FRET. Pogrupuj histogramy, aby wygodnie porównać wyniki z różnych eksperymentów.
3. Dalsza ocena danych (np. analiza dyfuzji, konwersja wydajności FRET na siły w eksperymentach z użyciem czujników sił molekularnych lub analiza przejścia) w notatniku, korzystając z naukowych bibliotek Pythona.
   UWAGA: Dane można również eksportować w wielu formatach plików jako dane wejściowe do innego oprogramowania analitycznego.

Results

Z ścieżek smFRET można wydobyć różne informacje niskiego i wysokiego poziomu, w zależności od naukowego pytania eksperymentu. W tym miejscu przedstawiono przykłady potoków analitycznych z sondami analogowymi i cyfrowymi: odpowiednio czujnik siły molekularnej oparty na peptydach¹⁶ oraz sonda DNA ze stochastycznym przełączaniem jej konformacji³⁸. Zapoznaj się z Rysunek 5, aby zapoznać się z budową i zasadą działania tych sond.

Po wykonaniu algorytmów lokalizacji i śledzenia zgodnie z opisem w protokole, pakiet oferuje wiele narzędzi do wizualizacji danych w celu optymalizacji początkowych parametrów i kolejnych kroków filtrowania: (i) wizualizacja poszczególnych zdarzeń smFRET, (ii) opcjonalna segmentacja obrazu do analizy danych w określonych regionach zainteresowań, (iii) monitorowanie kroków filtrowania za pomocą wykresów wydajności FRET vs. stechiometrii (E-S). Wizualizacja danych dotyczących pojedynczej cząsteczki jest przedstawiona w Rysunek 6.

Na koniec, przefiltrowane zdarzenia FRET są reprezentowane przez wykres E-S i histogram efektywności FRET (Rysunek 4). Wykres E-S jest przydatnym narzędziem do optymalizacji wyżej wymienionych kroków filtrowania i badania wyniku końcowego. Częściowo wybielone lub niecałkowicie oznakowane czujniki FRET można wykluczyć na podstawie ich wartości stechiometrycznej. Parametry mobilności można badać, wykreślając pojedynczą ścieżkę trajektorii na wykresie x-y (Rysunek 6) lub wykresie przemieszczenia średniokwadratowego (MSD) (Rysunek 4). Pierwsza metoda jest szczególnie przydatna do rozróżniania zdarzeń ruchomych od unieruchomionych, podczas gdy druga służy do obliczania współczynnika dyfuzji.

Rysunek 4: Przykładowe wyniki. (A) Wydajność FRET jest wykreślana w funkcji stechiometrii (wykres ES) dla populacji czujnika siły molekularnej (lewy panel) zdobiącego dwuwarstwę lipidową na podłożu szklanym i odcedzonego przez komórkę T. Widoczna jest tylko jedna chmura populacyjna. Odpowiedni histogram sprawności FRET ilustruje różnicę między populacją czujników siły w obecności i braku komórek (panel środkowy). Nie można zaobserwować przesunięcia w kierunku niższych wydajności FRET populacji czujników w obecności limfocytów T, co wskazuje na niewielkie lub żadne rozciąganie modułu czujnika zależne od siły. Wykres MSD tych warunków eksperymentalnych potwierdza, że populacja czujników siły pod komórką T porusza się znacznie wolniej niż ich niezwiązane odpowiedniki (prawy panel). (B) Ta sama analiza została przeprowadzona z czujnikiem DNA ze złączem Hollidaya zdobiącym płynną dwuwarstwę lipidową na podłożu szklanym. Wykres E-S wyraźnie pokazuje dwie populacje, które są również widoczne na histogramie wydajności FRET. Wykres MSD wskazuje na obecność jednej szybko poruszającej się populacji czujników. Skróty: FRET = transfer energii rezonansu Förstera; MSD = przemieszczenie średniokwadratowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Budowa i zasada działania wewnątrzcząsteczkowych sond FRET. (A) Analogowy czujnik peptydowy do ilościowego oznaczania mechanicznych sił molekularnych. Fluorofory donorowe i akceptorowe są kowalencyjnie przyłączone do obu końców szkieletu peptydowego. Moduł czujnika jest specyficznie dla miejsca przyłączony do specyficznego liganda, który z kolei wiąże interesujący receptor powierzchniowy rezydujący w komórce (w tym przypadku fragment przeciwciała specyficznie rozpoznający łańcuch beta receptora limfocytów T). Po związaniu receptor-ligand wywierana jest siła, a moduł czujnika rozciąga się i ostatecznie cofa po rozszczepieniu wiązania. Ten panel został zmodyfikowany z ¹⁶. (B) Cyfrowy czujnik DNA do ilościowego oznaczania przejść FRET. Czujnik FRET składa się z czterech nici DNA tworzących złącze Holliday'a. Fluorofor donorowy i akceptorowy są kowalencyjnie połączone z dwiema niciami. Skrzyżowania Hollidaya często zmieniają swoją konformację w zależności od otaczających warunków buforowych. Stochastyczne przełączanie tych konformacji można monitorować poprzez ilościowe określenie wydajności FRET poszczególnych sond. Skróty: TCR = receptor limfocytów T; FRET = transfer energii rezonansu Förstera. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Przykłady lokalizacji i śledzenia sond FRET. (A) Wydajność FRET i stechiometria poszczególnych zdarzeń są obliczane poprzez ilościowe określenie intensywności fluoroforu donorowego po wzbudzeniu donora (D → D), fluoroforu akceptorowego po wzbudzeniu donora (D → A) i fluoroforu akceptorowego po wzbudzeniu akceptora (A → A). Filtrowanie najbliższego sąsiedztwa zapobiega odchyleniom wynikającym z nakładania się funkcji rozproszenia punktów bliskich emiterów. Segmentacja obrazu pozwala użytkownikowi wybrać określone zdarzenia smFRET zlokalizowane w obszarze zainteresowania (np. komórka lub mikrowzorzec). Jako przykład segmentacji obrazu, limfocyty T wybarwiono Furą-2 (pokazano po lewej stronie) i poddano progowaniu adaptacyjnemu w celu identyfikacji krawędzi komórek (pomarańczowa linia przerywana). Podziałka = 5 μm. (B) trajektorie smFRET przy użyciu czujnika siły molekularnej. Poszczególne trajektorie można wykreślić w płaszczyźnie x-y, wizualizując ich zachowanie dyfuzyjne i lokalizację (lewy panel). Co więcej, intensywność każdej trajektorii można wykreślić w czasie, aby zidentyfikować przejścia FRET lub etapy bielenia (środkowy panel pokazuje czerwoną trajektorię z lewego panelu). Uzyskana wydajność FRET i stechiometria mogą być wizualizowane w podobny sposób (prawy panel). (C) trajektorie smFRET przy użyciu czujnika DNA ze złączem Holliday. HBSS + 12 mM MgCl₂ zastosowano jako bufor podczas pomiarów. Oprócz pozornego etapu bielenia akceptora w pobliżu końca sekwencji w tych przykładach, można określić częstotliwość przejść FRET dla każdego czujnika. Złącza Hollidaya zmieniają swoją konformację z dużą częstotliwością, podczas gdy czujnik siły molekularnej nie wykazuje przejść FRET. Informacje te umożliwiają dostosowanie warunków eksperymentalnych, takich jak opóźnienie między klatkami, w celu zwiększenia lub zmniejszenia liczby obserwowanych przejść. Skróty: FRET = transfer energii rezonansu Förstera; smFRET = jednocząsteczkowy FRET; HBSS = zrównoważony roztwór soli Hanka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Informacje uzupełniające: Lokalizacja i śledzenie pojedynczych cząsteczek (01. Tracking.ipynb). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje proces automatycznego rejestrowania i analizy ilościowej danych smFRET pochodzących z ruchomych, ale powierzchniowo uwiązanych cząsteczek sondy. Uzupełnia on dwa dominujące podejścia do eksperymentów smFRET, obejmujące sondy unieruchomione powierzchniowo lub sondy dyfundujące w roztworze do i z objętości wzbudzenia konfokalnego¹⁷. Zapewnia prawidłową wydajność FRET i pozycje molekularne w funkcji czasu. Może być zatem wykorzystany jako dane wejściowe dla specjalistycznych programów analitycznych, np. do ilościowego określenia kinetyki przejścia¹, histogramów FRET³⁹ lub dyfuzji dwuwymiarowej²².

Oprogramowanie jest wydawane na wolnej licencji typu open source zatwierdzonej przez Open Source Initiative, która przyznaje użytkownikowi wieczyste prawo do bezpłatnego użytkowania, modyfikacji i redystrybucji. Github został wybrany jako platforma programistyczna i dystrybucyjna, aby maksymalnie ułatwić uzyskanie oprogramowania i udział w procesie rozwoju poprzez zgłaszanie błędów lub wnoszenie kodu⁴⁰. Napisane w Pythonie oprogramowanie nie jest zależne od zastrzeżonych komponentów. Wybór notebooków Jupyter jako interfejsów użytkownika ułatwia inspekcję danych na każdym etapie analizy i pozwala na dostosowanie i rozszerzenie potoku specjalnie dla danego systemu eksperymentalnego. Biblioteka sdt-python ³² służy jako podstawa i implementuje funkcje do oceny danych mikroskopii fluorescencyjnej, takich jak lokalizacja pojedynczych cząsteczek, analiza dyfuzji, analiza intensywności fluorescencji, rejestracja kanału koloru, analiza kolokalizacji i obsługa ROI.

Zasadniczo śledzenie pojedynczych cząstek może odbywać się w systemach jedno-, dwu- lub trójwymiarowych. W tym przypadku potok analizy pojedynczych cząsteczek został dostosowany do badania systemów mobilnych 2D. Wybór ten odzwierciedla dostępność prostych systemów, takich jak dwuwarstwy lipidowe z podparciem planarnym (SLB), do prezentacji mobilnych sond fluorescencyjnych. Takie dwuwarstwowe systemy lipidowe składają się zazwyczaj z dwóch lub więcej ugrupowań fosfolipidów, przy czym frakcja masowa określa kluczowe parametry fizykochemiczne SLB (takie jak faza i lepkość), a frakcja mniejsza zapewnia miejsca przyłączenia dla biomolekuł. Te miejsca przyłączenia mogą być biotynylowanymi fosfolipidami dla platform białkowych opartych na awidynie lub streptawidynie lub fosfolipidami sprzężonymi niklowo-NTA dla platform białkowych ze znacznikami histydyny⁴¹. Wybór odpowiedniej platformy do łączenia białek z SLB zależy od kwestii naukowej. Czytelnicy mogą zapoznać się z literaturą 16,38,42 w celu zapoznania się z przykładami skutecznie zastosowanych strategii. Gęstość sond w próbce powinna być wystarczająco niska, aby uniknąć nakładania się funkcji rozpraszania punktów; Zazwyczaj zaleca się mniej niż 0,1 cząsteczki na^μm2. Patrz sekcja dotycząca reprezentatywnych wyników (w szczególności rysunek 6), aby zapoznać się z przykładem przedstawiającym odpowiednią gęstość sondy. Metoda analizy ma również zastosowanie do pojedynczych znakowanych fluorescencyjnie cząsteczek białka dyfundujących w błonie plazmatycznej żywych komórek.

Jednym z krytycznych aspektów eksperymentów smFRET jest produkcja i charakterystyka samych sond FRET. Wybierając fluorofory dla pary FRET, ich promień Förstera powinien odpowiadać oczekiwanym odległościom między barwnikami⁴³. Preferowane są barwniki odporne na fotowybielanie, ponieważ dają długotrwałe ślady. Jednak w przypadku podwyższonych szybkości bielenia jeden gatunek fluoroforu można wykorzystać do rozpoznawania zdarzeń wieloemiterowych pochodzących z kolokalizowanych cząsteczek za pomocą krokowej analizy fotowybielania; Zobacz krok 8.1.4 w sekcji Protokół. Pary fluoroforów powinny być specyficznie i kowalencyjnie przyłączone do interesujących cząsteczek, tworząc wewnątrz- lub międzycząsteczkowe pary FRET.

Połączenie smFRET z innymi łatwo dostępnymi technikami może zwiększyć jego rozdzielczość przestrzenną poza granicę dyfrakcji (za pomocą STED⁴⁴). Przedstawiony tutaj algorytm śledzenia smFRET rozszerza zastosowanie tego podejścia do nowych ustawień eksperymentalnych i systemów modelowych. Obejmuje to badania (i) zmian kinetycznych w stechiometrii ruchomych biomolekuł, (ii) dynamicznej asocjacji ruchomych biomolekuł, (iii) szybkości reakcji enzymatycznych swobodnie dyfuzyjnych reagentów oraz (iv) kinetyki zmian konformacyjnych ruchomych biomolekuł. Pierwsze dwa przykłady wymagają układów modelowych, które pokazują, że międzycząsteczkowy FRET, tj. donor i akceptor są sprzężone z oddzielnymi jednostkami biomolekularnymi będącymi przedmiotem zainteresowania. Te ostatnie przykłady mogą wykorzystywać biosensory przenoszące donor i akceptor w tej samej jednostce molekularnej (wewnątrzcząsteczkowy FRET).

Wewnątrzcząsteczkowe czujniki oparte na fret mogą zapewnić wgląd w wewnętrzne zmiany konformacyjne biomolekuł 1,2,3,4, zmiany konformacyjne spowodowane obciążeniem endogennym lub siłą zewnętrzną (czujniki siły molekularnej ¹⁶) lub stężenia jonów w nanośrodowisku, takim jak wapń⁴⁵ i pH⁴⁶. W zależności od systemu modelowego i preferowanej platformy kotwiczącej, takie zdarzenia smFRET mogą być śledzone w 2D lub 3D: (i) planarne śledzenie zdarzeń smFRET można wykorzystać do ilościowego określenia czasów interakcji receptor-ligand w błonie plazmatycznej, asocjacji kaskad wzmocnienia sygnału zakotwiczonych w błonie oraz zmian stechiometrycznych receptorów powierzchniowych; (ii) śledzenie objętości zdarzeń smFRET może być stosowane dla dowolnych wewnątrz- lub międzycząsteczkowych sond FRET w żywych komórkach lub w systemach odtworzonych in vitro.

Metoda śledzenia smFRET została opracowana głównie z myślą o wewnątrzcząsteczkowych sondach FRET. Sondy te mają ustaloną i dobrze znaną liczbę znaczników fluorescencyjnych, co zostało wykorzystane do odrzucenia danych z aglomerowanych i nieprawidłowo zsyntetyzowanych (np. niekompletnie znakowanych) cząsteczek, a także z sond, w których jeden z fluoroforów został fotowybielany. Jednak dostosowując etapy filtrowania, metoda ta może być również stosowana do międzycząsteczkowych sond FRET. Na przykład, zamiast akceptować tylko cząsteczki z pojedynczym donorem i jednym akceptorem fluoroforu, można zbadać trajektorie przestrzenne barwników donorowych i akceptorowych oraz wybrać, na przykład, trajektorie współdyfuzji donor-akceptor.

Ponieważ algorytm 3D-DAOSTORM obsługuje określanie pozycji sygnału wzdłuż osi optycznej za pomocą astygmatyzmu dzięki cylindrycznej soczewce na ścieżce wiązki emisyjnej, eksperymenty 3D można łatwo zintegrować z potokiem analizy. W takim przypadku sygnał akceptora po wzbudzeniu akceptora posłużyłby do określenia stechiometrii i położenia osiowego. Oprogramowanie analityczne może być również wykorzystywane do oceny danych z eksperymentów z unieruchomionymi sondami, wykorzystując jego wysoki stopień automatyzacji i schematów filtrowania. W rzeczywistości zestawy danych wydajności smFRET ze złączy Hollidaya unieruchomionych na dwuwarstwach żelowych³⁸ zostały przeanalizowane przy użyciu wczesnej wersji oprogramowania.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-[(Kwas N-(5-amino-1-karboksypentylo)iminodiacet)sukcynylo] (sól niklu) (Ni-NTA-DOGS)	Avanti Polar Lipids	790404P
1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-fosfocholina (DOPC)	Avanti Polar Lipids	850375P
1-palmitoilo-2-oleoilo-glicero-3-fosfocholina (POPC)	Avanti Polar Lipids	850457P
α Obiektyw olejowy Plan-FLUAR 100x/1,45	Zeiss	000000-1084-514
Korpus mikroskopu Axio Observer	Filtr pasmowo-przepustowy Zeiss
Filtr pasmowo-przepustowy	Chroma Technology Corp	ET570/60m
Filtr pasmowo-przepustowy	Filtr emisyjny akceptora	Chroma Technology Corp	ET675/50m
Conda-forge	Conda-forge Społeczność		Repozytorium pakietów Pythona dla szkiełek nakrywkowych Anaconda/miniconda
60 mm x 24 mm #1.5	MENZEL
Lustro dichroiczne	Semrock Inc	FF640-FDi01-25&razy; 36	separacja emisji donorowej i akceptorowej
Lustro dichroiczne (poczwórne pasmo)	Semrock Inc	Di01-R405/488/532/635-25 razy; 36	separacja światła wzbudzenia i emisji
DPBS	Sigma-Aldrich	D8537
FCS	Sigma-Aldrich	F7524	do obrazowania analizy progów bufora
	Schü tz group na TU Wien		Pakiet Python do analizy danych smFRET; wersja 3
Fura-2 AM	Thermo Fisher Scientific	11524766
HBSS	Sigma-Aldrich	H8264	do bufora obrazowania
iBeam Smart 405-S Laser 405 nm	Toptica Photonics AG
iXon Ultra 897 Kamera EMCCD	Andor Technology Ltd
Komory Lab-Tek ( 8 dołków)	Thermo Fisher Scientific	177402PK	do przygotowania próbek i obrazowania
Laser Millenia Prime 532 nm	Spectra Physics
miniconda	Anaconda Inc.		Dystrybucja Pythona 3. Min. wersja: 3.7
Monowalentna streptawidyna (plazmidy do ekspresji bakterii)	Addgene	20860 & 20859
OBIS 640 nm	laser Coherent Inc	1185055
Optosplit II	Cairn Research
Ovalbumin	Sigma-Aldrich	A5253	do bufora obrazowania
Środek do czyszczenia	plazmyHarrick Plasma	PDC-002
sdt-python	Schü tz group na Uniwersytecie Technicznym w Wiedniu		Biblioteka Pythona do analizy danych; wersja 17
Zestaw rozmiarów koralików TetraSpek	Thermo Fisher Scientific	T14792	Losowo rozmieszczone, unieruchomione markery referencyjne do rejestracji obrazu
USC500TH Kąpiel ultradźwiękowa	VWR		do formowania SUV-ów