Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja mysich komórek śródbłonka siatkówki do sekwencjonowania nowej generacji

3.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63133

⸱

11 października 2021

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, University of Virginia School of Medicine, 2Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine, 3Department of Cardiology, University of Virginia School of Medicine, 4Hematovascular Biology Center, University of Virginia School of Medicine, 5Yale Cardiovascular Research Center, Yale University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę izolacji mysich komórek śródbłonka siatkówki po urodzeniu, zoptymalizowanych pod kątem wydajności, czystości i żywotności komórek. Komórki te nadają się do sekwencjonowania nowej generacji.

Streszczenie

Ostatnie ulepszenia w sekwencjonowaniu nowej generacji poszerzyły wiedzę badaczy na temat biologii molekularnej i komórkowej, a kilka badań ujawniło nowe paradygmaty w biologii naczyniowej. Zastosowanie tych metod do modeli rozwoju naczyń krwionośnych wymaga optymalizacji technik izolacji komórek z tkanek embrionalnych i postnatalnych. Wydajność, żywotność i czystość komórek muszą być maksymalne, aby uzyskać dokładne i powtarzalne wyniki z metod sekwencjonowania nowej generacji. Model unaczynienia siatkówki noworodków myszy jest wykorzystywany przez naukowców do badania mechanizmów rozwoju naczyń krwionośnych. Naukowcy wykorzystali ten model do zbadania mechanizmów angiogenezy i specyfikacji losu tętniczo-żylnego podczas tworzenia i dojrzewania naczyń krwionośnych. Zastosowanie technik sekwencjonowania nowej generacji do badania modelu rozwoju naczyń krwionośnych siatkówki wymaga optymalizacji metody izolacji komórek śródbłonka siatkówki, która maksymalizuje wydajność, żywotność i czystość komórek. Protokół ten opisuje metodę izolacji, trawienia i oczyszczania tkanki siatkówki myszy za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Wyniki wskazują, że oczyszczona przez FACS populacja komórek śródbłonka CD31 + / CD45 jest wysoce wzbogacona o ekspresję genów komórek śródbłonka i nie wykazuje zmian w żywotności przez 60 minut po FACS. Uwzględniono reprezentatywne wyniki podejść do sekwencjonowania nowej generacji na komórkach śródbłonka wyizolowanych tą metodą, w tym sekwencjonowania masowego RNA i sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki, wykazując, że ta metoda izolacji komórek śródbłonka siatkówki jest kompatybilna z aplikacjami sekwencjonowania nowej generacji. Ta metoda izolacji komórek śródbłonka siatkówki pozwoli na zastosowanie zaawansowanych technik sekwencjonowania w celu ujawnienia nowych mechanizmów rozwoju naczyń krwionośnych.

Wprowadzenie

Wysoka przepustowość sekwencjonowania kwasów nukleinowych za pomocą metod sekwencjonowania nowej generacji znacznie poszerzyła wiedzę badaczy na temat biologii molekularnej i komórkowej. Te zaawansowane techniki obejmują sekwencjonowanie RNA całego transkryptomu, sekwencjonowanie DNA docelowych regionów w celu identyfikacji polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP), sekwencjonowanie DNA związanych czynników transkrypcyjnych w sekwencjonowaniu immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) lub otwarte regiony chromatyny w teście sekwencjonowania chromatyny dostępnej dla transpozazy (ATAC) oraz sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki1. W biologii naczyniowej postępy te pozwoliły naukowcom wyjaśnić skomplikowane mechanizmy rozwoju i choroby, a także rozróżnić wzorce ekspresji genów wzdłuż kontinuum różnych fenotypów2,3. Przyszłe eksperymenty mogą jeszcze bardziej zdefiniować złożone mechanizmy poprzez połączenie sekwencjonowania nowej generacji z ocenianymi modelami rozwoju naczyń krwionośnych, ale metody przygotowania próbek muszą być kompatybilne z zaawansowanymi technikami sekwencjonowania.

Jakość, dokładność i powtarzalność metod sekwencjonowania nowej generacji zależą od metody przygotowania próbki. Podczas izolowania podzbioru komórek lub generowania zawiesin pojedynczych komórek z tkanek, optymalne metody trawienia i oczyszczania są niezbędne do maksymalizacji liczby komórek, żywotności i czystości populacji komórek4,5. Wymaga to równowagi w metodzie trawienia: silne trawienie jest konieczne, aby uwolnić komórki z tkanki i uzyskać wystarczającą liczbę komórek do dalszych podejść, ale żywotność komórek będzie negatywnie naruszona, jeśli trawienie będzie zbyt silne6,7. Ponadto czystość populacji komórek jest niezbędna do uzyskania wiarygodnych wyników i dokładnej analizy danych, co można osiągnąć za pomocą FACS. Podkreśla to znaczenie optymalizacji metod izolacji komórek w celu zastosowania sekwencjonowania nowej generacji do ustalonych modeli rozwoju naczyń krwionośnych.

Dobrze scharakteryzowanym modelem do badania rozwoju naczyń krwionośnych jest mysi model rozwoju naczyniowego. Unaczynienie siatkówki myszy rozwija się po urodzeniu w dwuwymiarowym splocie powierzchownym, z początkowym angiogennym kiełkowaniem nerwu wzrokowego widocznym w dniu pourodzeniowym (P)3, przodem angiogennym z komórkami łodygi i wierzchołka oraz początkowym dojrzewaniem naczynia widocznym w P6 i dojrzewaniem splotu naczyniowego widocznym po P98,9. Podczas przebudowy początkowego splotu naczyniowego, komórki śródbłonka przechodzą specyfikację w kierunku fenotypów tętniczych, naczyń włosowatych i żylnych w różnych naczyniach, aby wytworzyć sieć krążenia10,11. Dlatego metoda ta pozwala naukowcom na wizualizację tworzenia się angiogennych splotów naczyniowych oraz specyfikacji i dojrzewania śródbłonka tętniczo-żylnego w różnych punktach czasowych podczas rozwoju9. Ponadto model ten zapewnia metodę badania wpływu transgenicznej manipulacji na angiogenezę i rozwój splotu naczyniowego, która została zastosowana do badania rozwoju naczyń, malformacji tętniczo-żylnych i neowaskularyzacji indukowanej tlenem12,13,14,15,16. Aby połączyć metody sekwencjonowania nowej generacji z modelem rozwoju naczyń krwionośnych siatkówki myszy, konieczny jest zoptymalizowany protokół izolacji komórek śródbłonka z tkanki siatkówki.

Ten protokół opisuje zoptymalizowaną metodę trawienia tkanki siatkówki od myszy w P6 w celu maksymalizacji wydajności, czystości i żywotności komórek. Tkanka siatkówki jest izolowana od myszy P6, trawiona przez 20 minut, barwiona immunologicznie dla CD31 i CD45 i oczyszczana przez FACS w celu wyizolowania jednokomórkowej zawiesiny komórek śródbłonka w ciągu około 2,5 godziny (Figura 1A). Stwierdzono, że te komórki śródbłonka zachowują wysoką żywotność przez 60 minut po izolacji17, co pozwala na przygotowanie biblioteki do metod sekwencjonowania nowej generacji. Ponadto przedstawiono reprezentatywne wyniki dla bramkowania FACS i wyników kontroli jakości z dwóch oddzielnych metod sekwencjonowania nowej generacji wykorzystujących ten protokół izolacji: sekwencjonowania RNA całego transkryptomu i sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki. Metoda ta pozwala na zastosowanie podejść sekwencjonowania nowej generacji w połączeniu z modelem unaczynienia siatkówki w celu wyjaśnienia nowych mechanizmów rozwoju naczyń krwionośnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach wymienione w niniejszym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komisje ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Yale oraz Uniwersytetu Wirginia.

1. Pozyskanie oczu myszy w celu izolacji siatkówki

  1. Przygotować 1x lodowaty PBS i dodać 500 μL do każdego dołka płytki 48-dołkowej.
  2. Uśmiercić noworodki myszy w szóstym dniu po urodzeniu (P6) zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi instytucjonalnymi. W tym doświadczeniu lęgi składające się z około 4-8 noworodków myszy są uśmiercane w dniu P6 poprzez inhalację izofluranem przez co najmniej trzy minuty po zatrzymaniu oddechu, a następnie poddawane dekapitacji.
  3. Wyjąć oczy z każdej z myszy. Odciąć skórę i błonę nad okiem, wykonując cięcie prostopadle do powieki za pomocą nożyczek sekcyjnych. Następnie użyć pincety, aby delikatnie nacisnąć obszar powyżej i poniżej oka, tak aby oko wysunęło się z oczodołu.
    1. Ostrożnie ucisnąć pincetą obszar pod okiem i przeciąć nerw wzrokowy, który utrzymuje oko w miejscu. Następnie umieścić każde oko w płytce 48-dołkowej w przygotowanym 1x lodowatym PBS do czasu zakończenia pobierania wszystkich próbek.
      UWAGA: Należy używać jednego dołka na mysz, umieszczając oba oczy z jednej myszy w tym samym dołku.

2. Izolacja tkanki siatkówki myszy

  1. Napełnij szalkę Petriego, wyłożoną na dnie podkładką do sekcji, 500 μL lodowatego 1x PBS, aby zanurzyć oczy, a następnie umieść ją pod mikroskopem sekcyjnym ustawionym na powiększenie 4.0x.
    1. Zawieś oczy w podkładce do sekcji, używając pipety transferowej z szeroką końcówką, aby nie uszkodzić tkanek.
      UWAGA: Upewnij się, że oczy są całkowicie przykryte PBS.
  2. Używając dwóch precyzyjnych pincet sekcyjnych, przytrzymaj nerw wzrokowy jedną z pincet dla stabilizacji, a drugą przebij otwór w komorze przedniej w miejscu połączenia rogówki i twardówki (Ryc. 1B). Rozdarcia wykonaj w okręgu, obejmując około 75% obwodu rogówki.
    1. Nadal trzymając nerw wzrokowy jedną z pincet, użyj drugiej pincety, aby delikatnie oddzielić twardówkę od tkanki siatkówki.
    2. Podobnie jak powyżej, użyj drugiej pincety, aby delikatnie oddzielić ciało szkliste od tkanki siatkówki.
    3. Ponownie, używając drugiej pincety, delikatnie usuń soczewkę i naczynia splotu hialoidalnego, które nie zostały usunięte wraz z ciałem szklistym. Aby to zrobić, wprowadź otwartą pincetę do wnętrza siatkówki, niemal dotykając jej, zamknij pincetę, aby chwycić soczewkę i naczynia splotu hialoidalnego, a następnie wyciągnij pincetę z siatkówki. Czynność tę można powtarzać do momentu usunięcia wszystkich naczyń.
      UWAGA: Splot hialoidalny przypomina przezroczystą, pajęczynowatą strukturę.
  3. Napełnij probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL ilością 500 μL lodowatego 1x PBS i umieść w nich siatkówki. Izoluj wszystkie siatkówki z oczu i umieszczaj je w lodowatym PBS przed przejściem do kolejnego kroku.
    UWAGA: Używaj jednej probówki na mysz, tak aby dwie siatkówki z tej samej myszy znajdowały się w jednej probówce. Jeśli tkanka siatkówki zostanie przerwana, przenieś ją w kilku fragmentach. Całkowity czas sekcji tkanki siatkówki dla miotu myszy powinien wynieść od 15 do 60 min, licząc od momentu eutanazji do końcowej izolacji tkanki siatkówki.

Proces izolacji tkanki siatkówki z użyciem FACS; obejmuje schematy przekroju oka i obrazy pelletu komórkowego.
Rysunek 1: Przegląd protokołu izolacji. (A) Schemat osi czasu izolacji z szacowanym czasem dla każdego etapu: izolacja tkanki siatkówki, trawienie, barwienie przeciwciałami, FACS oraz okno żywotności komórek. (B) Instrukcja krok po kroku izolacji tkanki siatkówki z oka, z ponumerowanymi etapami sekcji: 1) przebicie rogówki, 2) rozerwanie rogówki, 3) rozerwanie twardówki, 4) usunięcie twardówki z siatkówki, 5) dalsze usuwanie twardówki i tkanki łącznej z siatkówki, 6) usunięcie ciała szklistego i naczyń ciała szklistego z siatkówki. (C) Reprezentatywne obrazy tkanki siatkówki podczas różnych etapów trawienia: przed trawieniem, po trawieniu, pellet (czarne strzałki wskazują tkankę siatkówki lub pellet komórkowy). Przedrukowano za zgodą Chavkin et al., opublikowano w S. Karger AG, Basel17. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

3. Trawienie tkanki siatkówki do uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek

  1. Przygotować 500 μL roztworu do trawienia na każdą parę wyizolowanych siatkówek. Dodać FBS i kolagenazę typu II do DMEM, aby uzyskać końcowe stężenie 10% FBS i 1 mg/mL kolagenazy typu II. Wymieszać i ogrzać roztwór do 37 °C w kąpieli wodnej.
  2. Usunąć nadmiar PBS z probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL, ostrożnie odpipetowując płyn. Pozostawić ilość PBS wystarczającą do całkowitego pokrycia tkanki siatkówki, około 100 μL w każdej probówce.
  3. Dodać 500 μL roztworu do trawienia do każdej probówki z tkanką siatkówki (Rysunek 1C).
    1. Używając pipety P1000 z odpowiednim końcem, wykonać pięciokrotne pipetowanie w górę i w dół, aby wymieszać tkankę siatkówki z roztworem do trawienia.
  4. Inkubować mieszaninę do trawienia w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 min.
    1. Używając pipety P1000 z odpowiednim końcem, pipetować mieszaninę do trawienia w górę i w dół co 5 min. Po inkubacji tkanka siatkówki powinna rozpaść się do postaci zawiesiny pojedynczych komórek, a mieszanina do trawienia powinna stać się mętna (Rysunek 1C).

4. Zliczanie komórek

  1. Ustaw wirówkę stołową w temperaturze 4 °C i umieść w niej probówki z mieszaniną trawienną. Odwirowaj mieszaninę trawienną przy 375 x g przez 5 min.
  2. Ostrożnie usuń supernatant roztworu trawiennego za pomocą pipety. Nie naruszaj osadu komórkowego (Rysunek 1C). Resuspenduj osad w 500 μL lodowatego 1x PBS, delikatnie mieszając go pipetą w górę i w dół.
  3. Policz komórki za pomocą hematocytometru pod mikroskopem.
    UWAGA: Liczba komórek wynosi w przybliżeniu 1 x 106 komórek z dwóch siatkówek.
  4. Upewnij się, że komórki zostały prawidłowo zresuspendowane poprzez delikatne mieszanie, a następnie odlicz 20 μL zawiesiny komórkowej do trzech probówek do barwienia kontrolnego (probówka 1: kontrola IgG, probówka 2: kontrola CD31 i probówka 3: kontrola CD45), zgodnie z wcześniejszym opisem i zastosowaniem17,18.
  5. Ustaw wirówkę stołową w temperaturze 4 °C i umieść w niej probówki zawierające komórki. Odwirowaj komórki przy 375 x g przez 5 min.

5. Immunobarwienie komórek przeciwciałami

  1. Przygotować 100 μL buforu do barwienia na dwie barwione siatkówki oraz cztery probówki kontrolne. Do buforu HBSS dodać FBS, HEPES i D-glukozę do uzyskania stężenia końcowego 10% FBS, 10 mM HEPES i 1 mg/mL D-glukozy.
  2. Przygotować przeciwciała sprzężone z fluorochromem przeciwko CD31 i CD45. Dodać przeciwciała w rozcieńczeniu 1:100 do buforu do barwienia (probówka 1: tylko przeciwciało IgG, probówka 2: tylko przeciwciało CD31, probówka 3: tylko przeciwciało CD45). Dodać 1 μL przeciwciała na 100 μL buforu do barwienia, aby uzyskać końcowe stężenie przeciwciał 2 μg/mL.
  3. Ostrożnie usunąć PBS z przemytego osadu komórkowego za pomocą pipety.
  4. Resuspender osad w 100 μL roztworu do barwienia przeciwciałami na każde 0,5 x 106 komórek.
    1. Inkubować zawiesinę pojedynczych komórek z roztworem do barwienia przeciwciałami przez 30 min na lodzie, w ciemności. Opukiwać probówki co 10 min, aby delikatnie wymieszać komórki.

6. Przygotowanie do fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS)

  1. Ustaw wirówkę stołową na 4 °C i umieść w niej probówki zawierające komórki. Odwiruj komórki przy 375 x g przez 5 min.
    1. Odlej supernatant i resuspenderuj komórki w 500 μL 1x PBS w celu ich przemycia.
  2. Ustaw wirówkę stołową na 4 °C i umieść w niej probówki zawierające komórki. Odwiruj komórki przy 375 x g przez 5 min
  3. Przygotuj 1,5 mL buforu do FACS (1% FBS w 1x PBS).
    1. Odlej supernatant i resuspenderuj osad komórkowy w 300 μL buforu do FACS, delikatnie mieszając za pomocą pipety.
  4. Dodaj jodek propidyny (PI) do probówek z próbkami zawierającymi bufor do FACS do uzyskania końcowego stężenia 0,5 μg/mL. PI służy jako marker żywotności.
  5. Przenieś i połącz zawiesiny komórkowe do probówek testowych o pojemności 5 mL, używając nakrętki z filtrem do komórek. Nakrętka powinna zawierać filtr 35 μm; zawiesiny komórkowe można pipetować bezpośrednio na filtr.
    1. Przechowuj probówki do FACS w ciemności na lodzie, a następnie przenieś je do sortera komórkowego.

7. Konfiguracja instrumentu FACS

  1. Zainstaluj dyszę 100 µm w urządzeniu FACS.
    UWAGA: Dysza tej wielkości minimalizuje objętość zbieranego materiału i maksymalizuje gęstość izolowanych komórek.
  2. Przygotuj 250 μL 1x PBS w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL jako probówce do zbierania, która zostanie zainstalowana w urządzeniu FACS.

8. Izolacja żywych komórek śródbłonka za pomocą FACS

  1. Włącz instrument FACS oraz komputer. Kliknij ikonę oprogramowania FACS, aby uruchomić program na komputerze w celu sterowania instrumentem FACS i jego obsługi. Przeprowadź rutynowe testy kontroli jakości.
  2. Wgraj próbki z barwieniem kontrolnym do instrumentu FACS, aby dostroić osie. Zacznij od komórek barwionych wyłącznie przeciwciałem IgG, aby wygenerować i dostroić FSC oraz SSC, następnie użyj przeciwciała CD31, aby wygenerować i dostroić CD31, a potem przeciwciała CD45, aby wygenerować i dostroić CD45. Zapisz dane z próbek kontrolnych.
  3. Wgraj zbarwione komórki z próbki do instrumentu FACS i przeprowadź analizę próbki.
  4. Wyznacz bramkę dla komórek na podstawie parametrów rozproszenia światła w przód i z boku (odpowiednio FSC-A i SSC-A) (Ryc. 2A).
    UWAGA: Parametry FSC-A i SSC-A służą do wyboru komórek na podstawie ich rozmiaru, gęstości, ziarnistości, właściwości powierzchniowych i współczynnika załamania światła.
  5. Wyznacz bramkę dla komórek na podstawie FSC-A i FSC-H, aby zidentyfikować dublety komórkowe i zebrać wyłącznie pojedyncze komórki (Ryc. 2A).
    UWAGA: Parametry FSC-A i FSC-H są wykorzystywane do wyboru pojedynczych komórek w oparciu o zasadę, że podczas rozproszenia światła w przód dublety komórkowe będą stanowiły krople o większym stosunku pola do wysokości.
  6. Wyznacz bramkę dla komórek na podstawie PI i SSC-A, aby zidentyfikować komórki żywe (Ryc. 2A).
    UWAGA: Komórki żywe będą PI-ujemne.
  7. Za pomocą kontroli ustaw bramkę CD31+/CD45- i wyznacz bramkę dla komórek na podstawie CD31 i CD45 (Ryc. 2A,B).
    1. Włóż probówkę odbiorczą zawierającą 250 μL buforu FACS.
    2. Rozpocznij sortowanie komórek CD31-dodatnich/CD45-ujemnych do zainstalowanej probówki odbiorczej.
    3. Przechowuj probówki odbiorcze na lodzie do dalszych analiz. Na tym etapie próbki mogą zostać poddane procesom do zastosowań w sekwencjonowaniu nowej generacji1.

9. Wykonanie testu żywotności

  1. Wymieszaj 10 μL komórek z 10 μL 0,4% roztworu błękitu trypanowego w celu oceny żywotności komórek.
  2. Policz żywe komórki, nienosząc zabarwionej mieszaniny na szkiełko hemocytometru. Umieść szkiełko pod mikroskopem, aby dokładnie ocenić żywotność. Komórki zabarwione na niebiesko uznaj za nieżywe, a komórki bezbarwne za żywe.
    1. Podziel liczbę żywych komórek przez całkowitą liczbę komórek, aby obliczyć procent żywotności.

10. Wykonanie analizy ekspresji genów

  1. Przygotować od 10 000 do 20 000 komórek na próbkę i przeprowadzić izolację RNA w celu analizy ekspresji genów w komórkach śródbłonka siatkówki myszy. Izolację RNA przeprowadza się przy użyciu dostępnego komercyjnie zestawu opartego na wytrącaniu RNA etanolem, a następnie wirowaniu i zastosowaniu kolumn membranowych do przemycia i elucji oczyszczonego RNA z lizatu komórkowego. Na tym etapie próbki mogą zostać poddane obróbce do wybranych zastosowań sekwencjonowania następnej generacji1.
  2. Przeprowadzić konwersję RNA do cDNA z wykorzystaniem odwrotnej transkryptazy oraz odpowiednich odczynników wspomagających19.
  3. Oznaczyć ilość cDNA za pomocą barwnika wiążącego się z DNA oraz urządzenia do ilościowej PCR (qPCR)20. Nanieść próbki cDNA na płytkę qPCR z 384 dołkami wraz z primerami do amplifikacji wybranych genów. Całkowita objętość reakcji powinna wynosić 10 µL, wliczając barwnik wiążący się z DNA, który posłuży do ilościowego oznaczenia amplifikacji genów.
    1. Do pomiaru ekspresji genów należy zastosować primery bezpośrednie i odwrotne dla CD31, VE-Cadherin, CD45 oraz β-actin.
  4. Wykorzystać próbkę do zastosowań w sekwencjonowaniu następnej generacji1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Trawienie tkanki siatkówki oraz immunostaining na CD31 i CD45 pozwalają na zidentyfikowanie populacji komórek śródbłonka CD31+/CD45- po bramkowaniu na komórki, pojedyncze komórki oraz żywotność (Rysunek 2A). Immunostaining na CD45 jest niezbędny do wyeliminowania komórek CD31+/CD45+, do których należą płytki krwi oraz niektóre leukocyty21. Dla każdego eksperymentu należy przeprowadzić kontrole w celu wykazania swoistości przeciwciał i wyznaczenia strategii bramkowania...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje metodę izolacji komórek śródbłonka z postnatalnej mysiej tkanki siatkówki, która została zoptymalizowana pod kątem wysokiej liczby komórek, czystości i żywotności. Czystość komórek uzyskuje się przez izolację FACS populacji komórek śródbłonka z strawionej zawiesiny pojedynczej komórki za pomocą barwienia immunologicznego CD31+/CD45-. Jakość izolacji określa się ilościowo w testach żywotności za pomocą barwienia błękitem trypanowym i ekspresji genów za pomocą qPCR dla CD31, CD45 i VE-kadheryny (chocia...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie ujawnili żadnych istotnych informacji.

Podziękowania

Dziękuję Ośrodkowi Cytometrii Przepływowej Uniwersytetu Wirginii, Centrum Analizy Genomowej Uniwersytetu Wirginii oraz Ośrodkowi Analizy Genomu i Technologii Uniwersytetu Wirginii za ich wysiłek, wiedzę i rady w przyczynieniu się do prezentowanych eksperymentów. Badanie to zostało sfinansowane z grantów NIH dla N.W.C. (T32 HL007224, T32 HL007284), SC (T32 HL007284), KW (R01 HL142650) i K.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2 ml Eppendorf  probówki safe-lockUSA Scientific4036-3352
5 ml Probówki Falcon z sitkiem do komórek Snap CapCorning352235
60 mm Naczynie hodowlane bez TCCorning430589
APC Rat Anti-Mouse CD31BD Biosciences551262
APC Rat IgG2a κ Kontrola izotypuBD Biosciences553932
BD FACSChorus SoftwareBD BiosciencesFACSCHORUS
BD FACSMelody Cell SorterBD BiosciencesFACSMELODY
Kolagenaza typu IISigma-Aldrich234115
Costar 48-dołkowe przezroczyste płytki wielodołkowe poddane działaniu TC, indywidualnie pakowane, sterylneCorning3548
D-GlucoseGibcoA2494001
Jednorazowe pipety z podziałkąFisher Scientific12-711-9AM
Wosk do patelni preparacyjnejCarolina629100
Nożyczki do preparacjiNarzędzia do nauki o napięciu14085-08
Mikroskop stereoskopowy M165 FCLeicaM165FC
Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle (DMEM)Gibco11965-052
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Gibco14190144
Eppendorf  Probówki do mikrowirówek Flex-Tubes 1,5 mlSigma-Aldrich22364120
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gemini Bio100-106
Kleszcze do drobnego rozwarstwianiaFine Science Tools11250-00
Buforowany roztwór soli Hanka (HBSS)Gibco14175095
HEPES (1M)Gibco15630130
iScript cDNA Zestaw do syntezyBio-Rad1708890
Isoflurane, USPCovetrus11695067772
Isotemp General Purpose Deluxe Kąpiel wodnaFisher ScientificFSGPD20
Podkład: ActB_Forward: 5'- agagggaaatcgtgcgtgac -3'Integrated DNA TechnologiesN/A
Primer: ActB_Reverse: 5'- caatagtgatgacctggccgt -3'Integrated DNA TechnologiesN/A
Elementarz: CD31_Forward: 5'- gagcccaatcacgtttcagttt -3'Integrated DNA TechnologiesN/A
Elementarz: CD31_Reverse: 5'- tccttcctgcttcttgctagct -3'Zintegrowane technologie DNA Niedotyczy
Elementarz: CD45_Forward: 5'- gggttgttctgtgccttgtt -3'Zintegrowane technologie DNA Niedotyczy
Podkład: CD45_Reverse: 5'- ctggacggacacagttagca -3'Zintegrowane technologie DNA Niedotyczy
Podkład: VE-Cadherin_Forward: 5'- tcctctgcatcctcactatcaca -3'Zintegrowane technologie DNA Niedotyczy
Podkład: VE-Cadherin_Reverse: 5'- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3'Zintegrowane technologie DNANie dotyczy
jodku propidiumSigma-AldrichP4864
RNeasy Plus Mini KitQiagen74134
Wirówka Sorvall Legend Micro 21R, chłodzonaThermoFisher75002477
SYBR-Green iTaq Uniwersalny SYBR Green SupermixBio-Rad172-5120
Roztwór błękitu trypanowegoThermoFisher15250061
V450 Szczurzy anty-mysz CD45BD Biosciences560501
V450 Szczur IgG2b i kappa; Kontrola izotypuBD Biosciences560457

Bibliografia

  1. Slatko, B. E., Gardner, A. F., Ausubel, F. M. Overview of next-generation sequencing technologies. Current Protocols in Molecular Biology. 122 (1), 59(2018).
  2. Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. Single cell analysis in vascular biology. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 42(2020).
  3. Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function. Current Opinion in Hematology. 28 (3), 221-229 (2021).
  4. Potter, A. S., Potter, S. S., S, Dissociation of tissues for single-cell analysis. Methods in Molecular Biology. 1926, 55-62 (2019).
  5. Braga, F. A. V., Miragaia, R. J. Tissue handling and dissociation for single-cell RNA-seq. Single Cell Methods: Methods in Molecular Biology. 1979, 9-21 (2019).
  6. Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociatin-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  7. Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665(2019).
  8. Connolly, S., Hores, T., Smith, L., D'Amore, P. Characterization of vascular development in the mouse retina. Microvascular Research. 36 (3), 275-290 (1988).
  9. Crist, A., Young, C., Meadows, S. Characterization of arteriovenous identity in the developing neonate mouse retina. Gene Expression Patterns: GEP. 23-24, 22-31 (2017).
  10. dela Paz, N. G., D'Amore, P. A. Arterial versus venous endothelial cells. Cell and Tissue Research. 335 (1), 5-16 (2009).
  11. Fang, J. S., Hirschi, K. K. Molecular regulation of arteriovenous endothelial cell specification. F1000Res. 8, (2019).
  12. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
  13. Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nature Protocols. 5 (9), 1518-1534 (2010).
  14. Ruiz, S., et al. A mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia generated by transmammary-delivered immunoblocking of BMP9 and BMP10. Scientific Reports. 6, 37366(2016).
  15. Fang, J. S., et al. Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification. Nature Communication. 8 (1), 2149(2017).
  16. Ola, R., et al. SMAD4 prevents flow induced arterial-venous malformations by inhibiting Casein Kinase 2. Circulation. 138 (21), 2379-2394 (2018).
  17. Chavkin, N. W., Walsh, K., Hirschi, K. K. Isolation of highly purified and viable retinal endothelial cells. Journal of Vascular Research. 58 (1), 49-57 (2020).
  18. Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry PartB: Clinical Cytometry. 76 (6), 355-364 (2009).
  19. Bachman, J. Reverse-transcription PCR (RT-PCR). Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).
  20. Green, M. R., Sambrook, J. Quantification of RNA by real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Cold Spring Harbour Protocols. 2018 (10), (2018).
  21. Liu, L., Shi, G. P. CD31: beyond a marker for endothelial cells. Cardiovascular Research. 94 (1), 3-5 (2012).
  22. Zarkada, G., et al. Specialized endothelial tip cells guide neuroretina vascularization and blood-retina-barrier formation. Developmental Cell. 56 (15), 2237-2251 (2021).
  23. Su, X., Sorenson, C. M., Sheibani, N. Isolation and characterization of murine retinal endothelial cells. Molecular Vision. 9, 171-178 (2003).
  24. Benedito, R., et al. The notch ligands Dll4 and Jagged1 have opposing effects on angiogenesis. Cell. 137 (6), 1124-1135 (2009).
  25. Daneman, R., et al. Wnt/beta-catenin signaling is required for CNS, but not non-CNS, angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 641-646 (2009).
  26. Okabe, K., et al. Neurons limit angiogenesis by titrating VEGF in retina. Cell. 159 (3), 584-596 (2014).
  27. Crist, A. M., Lee, A. R., Patel, N. R., Westhoff, D. E., Meadows, S. M. Vascular deficiency of Smad4 causes arteriovenous malformations: a mouse model of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia. Angiogenesis. 21 (2), 363-380 (2018).
  28. Kim, Y. H., Choe, S. W., Chae, M. Y., Hong, S., Oh, S. P. SMAD4 deficiency leads to development of arteriovenous malformations in neonatal and adult mice. Journal of the American Heart Association. 7 (21), 009514(2018).
  29. Ma, W., et al. Absence of TGFbeta signaling in retinal microglia induces retinal degeneration and exacerbates choroidal neovascularization. eLife. 8, 42049(2019).
  30. Luo, W., et al. Arterialization requires the timely suppression of cell growth. Nature. 589 (7842), 437-441 (2021).
  31. Lawson, N. D., Vogel, A. M., Weinstein, B. M. sonic hedgehog and vascular endothelial growth factor act upstream of the Notch pathway during arterial endothelial differentiation. Developmental Cell. 3 (1), 127-136 (2002).
  32. Larrivee, B., et al. ALK1 signaling inhibits angiogenesis by cooperating with the Notch pathway. Developmental Cell. 22 (3), 489-500 (2012).
  33. Wythe, J. D., et al. ETS factors regulate Vegf-dependent arterial specification. Developmental Cell. 26 (1), 45-58 (2013).
  34. Davis, D. M., Purvis, J. E. Computational analysis of signaling patterns in single cells. Seminars in Cell and Developmental Biology. 0, 35-43 (2015).
  35. Gaudet, S., Miller-Jensen, K. Redefining signaling pathways with an expanding single-cell toolbox. Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).
  36. Aibar, S., et al. SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering. Nature Methods. 14 (11), 1083-1086 (2017).
  37. Trapnell, C., et al. The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells. Nature Biotechnology. 32 (4), 381-386 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja kom reksortowanie kom rek aktywowane fluorescencjtrawienie tkanki siatk wkisekwencjonowanie RNA pojedynczych kom rekbramkowanie CD31 CD45rozw j naczyniowyywotno kom reksekwencjonowanie RNA
Izolacja mysich komórek śródbłonka siatkówki do sekwencjonowania nowej generacji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.