Artykuł metodologiczny

Izolacja mysich komórek śródbłonka siatkówki do sekwencjonowania nowej generacji

DOI:

10.3791/63133

⸱

11 października 2021

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, University of Virginia School of Medicine, 2Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine, 3Department of Cardiology, University of Virginia School of Medicine, 4Hematovascular Biology Center, University of Virginia School of Medicine, 5Yale Cardiovascular Research Center, Yale University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metodę izolacji mysich komórek śródbłonka siatkówki po urodzeniu, zoptymalizowanych pod kątem wydajności, czystości i żywotności komórek. Komórki te nadają się do sekwencjonowania nowej generacji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnie ulepszenia w sekwencjonowaniu nowej generacji poszerzyły wiedzę badaczy na temat biologii molekularnej i komórkowej, a kilka badań ujawniło nowe paradygmaty w biologii naczyniowej. Zastosowanie tych metod do modeli rozwoju naczyń krwionośnych wymaga optymalizacji technik izolacji komórek z tkanek embrionalnych i postnatalnych. Wydajność, żywotność i czystość komórek muszą być maksymalne, aby uzyskać dokładne i powtarzalne wyniki z metod sekwencjonowania nowej generacji. Model unaczynienia siatkówki noworodków myszy jest wykorzystywany przez naukowców do badania mechanizmów rozwoju naczyń krwionośnych. Naukowcy wykorzystali ten model do zbadania mechanizmów angiogenezy i specyfikacji losu tętniczo-żylnego podczas tworzenia i dojrzewania naczyń krwionośnych. Zastosowanie technik sekwencjonowania nowej generacji do badania modelu rozwoju naczyń krwionośnych siatkówki wymaga optymalizacji metody izolacji komórek śródbłonka siatkówki, która maksymalizuje wydajność, żywotność i czystość komórek. Protokół ten opisuje metodę izolacji, trawienia i oczyszczania tkanki siatkówki myszy za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Wyniki wskazują, że oczyszczona przez FACS populacja komórek śródbłonka CD31 + / CD45 jest wysoce wzbogacona o ekspresję genów komórek śródbłonka i nie wykazuje zmian w żywotności przez 60 minut po FACS. Uwzględniono reprezentatywne wyniki podejść do sekwencjonowania nowej generacji na komórkach śródbłonka wyizolowanych tą metodą, w tym sekwencjonowania masowego RNA i sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki, wykazując, że ta metoda izolacji komórek śródbłonka siatkówki jest kompatybilna z aplikacjami sekwencjonowania nowej generacji. Ta metoda izolacji komórek śródbłonka siatkówki pozwoli na zastosowanie zaawansowanych technik sekwencjonowania w celu ujawnienia nowych mechanizmów rozwoju naczyń krwionośnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wysoka przepustowość sekwencjonowania kwasów nukleinowych za pomocą metod sekwencjonowania nowej generacji znacznie poszerzyła wiedzę badaczy na temat biologii molekularnej i komórkowej. Te zaawansowane techniki obejmują sekwencjonowanie RNA całego transkryptomu, sekwencjonowanie DNA docelowych regionów w celu identyfikacji polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP), sekwencjonowanie DNA związanych czynników transkrypcyjnych w sekwencjonowaniu immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) lub otwarte regiony chromatyny w teście sekwencjonowania chromatyny dostępnej dla transpozazy (ATAC) oraz sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki1. W biologii naczyniowej postępy te pozwoliły naukowcom wyjaśnić skomplikowane mechanizmy rozwoju i choroby, a także rozróżnić wzorce ekspresji genów wzdłuż kontinuum różnych fenotypów2,3. Przyszłe eksperymenty mogą jeszcze bardziej zdefiniować złożone mechanizmy poprzez połączenie sekwencjonowania nowej generacji z ocenianymi modelami rozwoju naczyń krwionośnych, ale metody przygotowania próbek muszą być kompatybilne z zaawansowanymi technikami sekwencjonowania.

Jakość, dokładność i powtarzalność metod sekwencjonowania nowej generacji zależą od metody przygotowania próbki. Podczas izolowania podzbioru komórek lub generowania zawiesin pojedynczych komórek z tkanek, optymalne metody trawienia i oczyszczania są niezbędne do maksymalizacji liczby komórek, żywotności i czystości populacji komórek4,5. Wymaga to równowagi w metodzie trawienia: silne trawienie jest konieczne, aby uwolnić komórki z tkanki i uzyskać wystarczającą liczbę komórek do dalszych podejść, ale żywotność komórek będzie negatywnie naruszona, jeśli trawienie będzie zbyt silne6,7. Ponadto czystość populacji komórek jest niezbędna do uzyskania wiarygodnych wyników i dokładnej analizy danych, co można osiągnąć za pomocą FACS. Podkreśla to znaczenie optymalizacji metod izolacji komórek w celu zastosowania sekwencjonowania nowej generacji do ustalonych modeli rozwoju naczyń krwionośnych.

Dobrze scharakteryzowanym modelem do badania rozwoju naczyń krwionośnych jest mysi model rozwoju naczyniowego. Unaczynienie siatkówki myszy rozwija się po urodzeniu w dwuwymiarowym splocie powierzchownym, z początkowym angiogennym kiełkowaniem nerwu wzrokowego widocznym w dniu pourodzeniowym (P)3, przodem angiogennym z komórkami łodygi i wierzchołka oraz początkowym dojrzewaniem naczynia widocznym w P6 i dojrzewaniem splotu naczyniowego widocznym po P98,9. Podczas przebudowy początkowego splotu naczyniowego, komórki śródbłonka przechodzą specyfikację w kierunku fenotypów tętniczych, naczyń włosowatych i żylnych w różnych naczyniach, aby wytworzyć sieć krążenia10,11. Dlatego metoda ta pozwala naukowcom na wizualizację tworzenia się angiogennych splotów naczyniowych oraz specyfikacji i dojrzewania śródbłonka tętniczo-żylnego w różnych punktach czasowych podczas rozwoju9. Ponadto model ten zapewnia metodę badania wpływu transgenicznej manipulacji na angiogenezę i rozwój splotu naczyniowego, która została zastosowana do badania rozwoju naczyń, malformacji tętniczo-żylnych i neowaskularyzacji indukowanej tlenem12,13,14,15,16. Aby połączyć metody sekwencjonowania nowej generacji z modelem rozwoju naczyń krwionośnych siatkówki myszy, konieczny jest zoptymalizowany protokół izolacji komórek śródbłonka z tkanki siatkówki.

Ten protokół opisuje zoptymalizowaną metodę trawienia tkanki siatkówki od myszy w P6 w celu maksymalizacji wydajności, czystości i żywotności komórek. Tkanka siatkówki jest izolowana od myszy P6, trawiona przez 20 minut, barwiona immunologicznie dla CD31 i CD45 i oczyszczana przez FACS w celu wyizolowania jednokomórkowej zawiesiny komórek śródbłonka w ciągu około 2,5 godziny (Figura 1A). Stwierdzono, że te komórki śródbłonka zachowują wysoką żywotność przez 60 minut po izolacji17, co pozwala na przygotowanie biblioteki do metod sekwencjonowania nowej generacji. Ponadto przedstawiono reprezentatywne wyniki dla bramkowania FACS i wyników kontroli jakości z dwóch oddzielnych metod sekwencjonowania nowej generacji wykorzystujących ten protokół izolacji: sekwencjonowania RNA całego transkryptomu i sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki. Metoda ta pozwala na zastosowanie podejść sekwencjonowania nowej generacji w połączeniu z modelem unaczynienia siatkówki w celu wyjaśnienia nowych mechanizmów rozwoju naczyń krwionośnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Yale oraz Uniwersytetu Wirginii zatwierdziły wszystkie eksperymenty na zwierzętach wymienione w tym protokole.

1. Zdobądź mysie oczy do izolacji siatkówki

  1. Przygotuj 1x lodowaty PBS i dodaj 500 μl do każdego dołka na 48-dołkowej płytce.
  2. Eutanazja nowonarodzonych myszy w szóstym dniu po urodzeniu (P6) zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi instytucjonalnymi. W tym eksperymencie mioty około 4-8 nowonarodzonych myszy są poddawane eutanazji w punkcie P6 poprzez inhalację izofluranu przez co najmniej trzy minuty po zatrzymaniu oddechu, a następnie dekapitację.
  3. Usuń oczy z każdej z myszy. Odetnij skórę i błonę nad okiem, przecinając prostopadle do powieki za pomocą nożyczek preparacyjnych. Następnie za pomocą kleszczy delikatnie dociśnij powyżej i poniżej oka, aby oko wysunęło się z oczodołu.
    1. Ostrożnie ściśnij pod okiem kleszczemi i przetnij nerw wzrokowy, który utrzymuje oko w przyczepieniu. Następnie umieść każde oko w 48-dołkowej płytce w przygotowanym 1x lodowatym PBS aż do zakończenia zbiorów.
      UWAGA: Użyj jednej studzienki na mysz, z obiema oczami z jednej myszy w tej samej studzience.

2. Wyizoluj tkankę siatkówki myszy

  1. Napełnij szalkę Petriego, wyłożoną podkładką preparacyjną na dnie, 500 μl 1x lodowatego PBS, aby zanurzyć oczy i umieścić ją pod mikroskopem preparacyjnym ustawionym na powiększenie 4,0x.
    1. Zawieś oczy w podkładce preparacyjnej za pomocą pipety transferowej z szeroką końcówką, aby nie uszkodzić oczu.
      UWAGA: Upewnij się, że oczy są całkowicie pokryte PBS.
  2. Używając dwóch cienkich kleszczy preparacyjnych, przytrzymaj nerw wzrokowy jednym ze szczypiec w celu stabilizacji, a drugim kleszczami przebij otwór przez przednią komorę, w której rogówka i twardówka łączą się (Rysunek 1B). Rozerwij otwór w kółko około 75% długości wokół rogówki.
    1. Trzymając nerw wzrokowy jednym z kleszczy, użyj drugich kleszczy, aby delikatnie oderwać twardówkę od tkanki siatkówki.
    2. Jak powyżej, za pomocą drugich kleszczy delikatnie oderwać ciało szkliste tkanki siatkówki.
    3. Ponownie, za pomocą drugich kleszczy, delikatnie usuń soczewkę i naczynia splotu szklistego, które nie odpadły po usunięciu ciała szklistego. Aby to zrobić, sięgnij do siatkówki otwartymi kleszczami, aż prawie dotkniesz siatkówki, zamknij kleszcze, aby chwycić soczewkę i naczynia splotu hialoidalnego, a następnie wyciągnij kleszcze z siatkówki. Można to powtarzać, aż wszystkie naczynia zostaną usunięte.
      UWAGA: Splot hialoidalny przypomina przezroczystą, przypominającą pajęczynę strukturę.
  3. Napełnij 2 ml probówek do mikrowirówek 500 μl 1x lodowatego PBS i umieść siatkówki w probówkach. Odizoluj wszystkie siatkówki od oczu i umieść je w lodowatym PBS przed przejściem dalej.
    UWAGA: Użyj jednej rurki na mysz, przy czym dwie siatkówki tej samej myszy mają tę samą rurkę. Jeśli tkanka siatkówki jest rozdarta, przenieś ją na wiele części. Całkowity czas wycięcia tkanki siatkówki u miotu myszy powinien zająć 15-60 minut, rozpoczynając od eutanazji, a kończąc na końcowej izolacji tkanki siatkówki.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Przegląd protokołu izolacji. (A) Schemat harmonogramu izolacji z szacowanym czasem dla każdego kroku: Izolacja tkanki siatkówki, trawienie, barwienie przeciwciał, FACS i okno żywotności komórek. (B) Przewodnik krok po kroku dotyczący izolacji tkanki siatkówki z oka, z ponumerowanymi krokami preparacji: 1) przekłucie rogówki, 2) rozdarcie rogówki, 3) rozdarcie twardówki, 4) usunięcie twardówki z siatkówki, 5) dalsze usunięcie twardówki i tkanki łączącej z siatkówki, 6) usunięcie ciała szklistego i naczyń szklistych z siatkówki. (C) Reprezentatywne obrazy tkanki siatkówki podczas różnych etapów trawienia: przed trawieniem, po trawieniu, osad (czarne strzałki podświetlają tkankę siatkówki lub osad komórkowy). Opublikowano za zgodą Chavkina i wsp. Opublikowano w S. Karger AG, Basel17. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Trawienie tkanki siatkówki do zawiesiny pojedynczej komórki

  1. Przygotować 500 μl roztworu trawiącego na każde dwie izolowane siatkówki. Dodaj FBS i kolagenazę typu II do DMEM do końcowego stężenia 10% FBS i 1 mg / ml kolagenazy typu II. Wymieszać i ogrzać roztwór do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.
  2. Usunąć nadmiar PBS z probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml, ostrożnie pipetując. Pozostaw wystarczającą ilość PBS, aby całkowicie pokryć tkankę siatkówki, około 100 μl w każdej probówce.
  3. Dodać 500 μl roztworu wytrawiającego do każdej probówki z tkanką siatkówki (Rysunek 1C).
    1. Za pomocą pipetora P1000 i końcówki pipety pięciokrotnie pipetować w górę i w dół tkankę siatkówki w roztworze wytrawiającym.
  4. Mieszaninę wytrawiającą inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 minut.
    1. Za pomocą pipetora P1000 i końcówki pipety pipetować mieszaninę wytrawiającą w górę i w dół co 5 minut. Po inkubacji tkanka siatkówki rozpuściła się w zawiesinę jednokomórkową, więc mieszanina trawienna powinna być mętna (Rysunek 1C).

4. Policz komórki

  1. Ustaw wirówkę stołową na 4 °C i umieść w niej probówki z mieszaniną do wytrawiania. Mieszaninę wytrawiającą osadzać przez odwirowanie w stężeniu 375 x g przez 5 min.
  2. Ostrożnie usunąć roztwór do wytrawiania szwadronu przez pipetowanie. Nie zakłócaj osadu komórkowego (Rysunek 1C). Ponownie zawiesić granulkę w 500 μl lodowatego 1x PBS, delikatnie mieszając w górę iw dół za pomocą pipety.
  3. Policz komórki za pomocą hemocytometru pod mikroskopem.
    UWAGA: Liczba komórek wynosi około 1 x 106 komórek na dwie siatkówki.
  4. Upewnij się, że komórki są prawidłowo ponownie zawieszone przez delikatne mieszanie, a następnie podwielokrotnić 20 μl zawiesiny komórek do trzech probówek w celu barwienia kontrolnego (probówka 1: kontrola IgG, probówka 2: kontrola CD31 i probówka 3: kontrola CD45), zgodnie z opisem i wcześniejszym użyciem17,18.
  5. Ustawić wirówkę stołową w temperaturze 4 °C i umieścić w niej probówki zawierające komórki. Granulować komórki przez odwirowanie w stężeniu 375 x g przez 5 minut.

5. Barwienie immunologiczne komórek za pomocą przeciwciał

  1. Przygotować 100 μl buforu barwiącego na dwie barwione siatkówki oraz cztery probówki kontrolne. Dodaj FBS, HEPES i D-glukozę do buforu HBSS do końcowego stężenia 10% FBS, 10 mM HEPES i 1 mg/ml D-glukozy.
  2. Otrzymać fluorescencyjnie sprzężone przeciwciała przeciwko CD31 i CD45. Dodać przeciwciała w rozcieńczeniu 1:100 do buforu barwiącego (probówka 1: tylko przeciwciało IgG, probówka 2: tylko przeciwciało CD31 i probówka 3: tylko przeciwciało CD45). Dodać 1 μl przeciwciała na 100 μl buforu barwiącego, aby uzyskać końcowe stężenie przeciwciał 2 μg/ml.
  3. Ostrożnie usunąć PBS z przemytych osadów komórkowych za pomocą pipetowania.
  4. Zawiesić osad w 100 μl roztworu barwiącego przeciwciała na 0,5 x 106 komórek.
    1. Zawiesinę jednokomórkową inkubować z roztworem barwiącym przeciwciała przez 30 minut na lodzie w ciemności. Stukaj w probówki co 10 minut, aby delikatnie wymieszać komórki.

6. Przygotuj się do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją

  1. Ustawić wirówkę stołową w temperaturze 4 °C i umieścić w niej probówki zawierające komórki. Komórki osadu przez odwirowanie przy 375 x g przez 5 min.
    1. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić te komórki w 500 μl 1x PBS do przemycia.
  2. Ustawić wirówkę stołową w temperaturze 4 °C i umieścić w niej probówki zawierające komórki. Komórki osadu przez odwirowanie przy 375 x g przez 5 min
  3. Przygotuj 1,5 ml buforu FACS (1% FBS w 1x PBS).
    1. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 300 μl buforu FACS, delikatnie mieszając z pipetorem.
  4. Dodać jodek propydyny (PI) do probówek zawierających bufor FACS do końcowego stężenia 0,5 μg/ml. PI jest używany jako marker żywotności.
  5. Przenieś i połącz zawiesiny komórek z probówkami o pojemności 5 ml przez zatrzask z sitkiem do komórek. Nasadka zatrzaskowa sitka komórkowego powinna zawierać filtr 35 μm, a zawiesiny komórek mogą być pipetowane bezpośrednio na filtr.
    1. Trzymaj probówki FACS na lodzie w ciemności i przenieś je do sortera komórek.

7. Konfiguracja instrumentu FACS

  1. Zainstaluj dyszę 100 μm w przyrządzie FACS.
    UWAGA: Dysza o tym rozmiarze minimalizuje objętość zbierania i maksymalizuje gęstość izolowanych komórek.
  2. Przygotuj 250 μl 1x PBS do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml jako probówkę zbiorczą, która ma być zainstalowana w urządzeniu FACS.

8. Izoluj żywotne komórki śródbłonka za pomocą FACS

  1. Włącz instrument FACS i komputer. Kliknij ikonę oprogramowania FACS, aby otworzyć oprogramowanie FACS na komputerze w celu uruchomienia i obsługi instrumentu FACS. Wykonuj rutynowe testy kontroli jakości.
  2. Załaduj próbki wybarwione kontrolnie do przyrządu FACS, aby wyregulować osie. Zacznij od komórek tylko przeciwciał IgG, aby wytworzyć i dostosować FSC i SSC, następnie przeciwciało CD31 tylko do wygenerowania i dostosowania CD31, a następnie tylko przeciwciało CD45 do wytworzenia i dostosowania CD45. Rejestrować dane z próbek kontrolnych.
  3. Załaduj barwione komórki próbki do przyrządu FACS i uruchom próbkę.
  4. Bramka komórek na podstawie parametrów rozproszenia do przodu i rozrzutu bocznego (odpowiednio FSC-A i SSC-A) ( Rysunek 2A).
    UWAGA: Parametry FSC-A i SSC-A służą do wyboru komórek na podstawie rozmiaru, gęstości, ziarnistości, właściwości powierzchni i indeksu załamania światła.
  5. Bramki komórkowe według FSC-A i FSC-H do identyfikacji dubletów komórkowych i zbierania tylko pojedynczych komórek (Rysunek 2A).
    UWAGA: Parametry FSC-A i FSC-H służą do selekcji pojedynczych komórek w oparciu o zasadę, że podczas rozpraszania do przodu dublety komórek będą kropelkami zawierającymi większy stosunek powierzchni do wysokości.
  6. Komórki bramkowe według PI i SSC-A do identyfikacji żywotnych komórek (Rysunek 2A).
    UWAGA: Żywe komórki będą PI-ujemne.
  7. Wykonaj bramkę CD31+/CD45- ze sterowaniem i komórkami bramki według CD31 i CD45 (Rysunek 2A,B).
    1. Włożyć probówkę zbiorczą z 250 μl buforu FACS.
    2. Rozpocznij sortowanie komórek, które są CD31-dodatnie/CD45-ujemne do zainstalowanej probówki zbiorczej.
    3. Trzymaj probówki zbiorcze na lodzie do dalszej analizy. Na tym etapie próbki mogą być przetwarzane dla aplikacji sekwencjonowania nowej generacji1.

9. Wykonaj test żywotności

  1. Wymieszaj 10 μl komórek z 10 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego, aby ocenić żywotność komórek.
  2. Policz żywe komórki, pipetując barwioną mieszaninę na szkiełko hemocytometru. Umieść szkiełko pod mikroskopem, aby uzyskać dokładne zliczenie żywotności. Policz niebieskie komórki jako niezdolne do życia i policz czyste komórki jako żywotne.
    1. Podziel liczbę żywotnych komórek przez całkowitą liczbę komórek, aby obliczyć procent żywotności.

10. Wykonaj test ekspresji genów

  1. Uzyskaj 10 000-20 000 komórek na próbkę i wykonaj izolację RNA, aby przeanalizować ekspresję genów mysich komórek śródbłonka siatkówki. Izolację RNA przeprowadza się za pomocą dostępnego na rynku zestawu, który wykorzystuje wytrącanie RNA na bazie etanolu, a następnie odwirowanie i kolumny membranowe do mycia i elucji oczyszczonego RNA z lizatu komórkowego. Na tym etapie próbki mogą być przetwarzane dla niektórych aplikacji sekwencjonowania nowej generacji1.
  2. Przekształć RNA w cDNA za pomocą enzymu odwrotnej transkryptazy i odczynników pomocniczych19.
  3. Określ ilościowo za pomocą barwnika wiążącego DNA i ilościowej maszyny do PCR (qPCR)20. Załaduj próbki cDNA do 384-dołkowej płytki qPCR ze starterami, aby amplifikować interesujące geny. Objętość reakcji powinna wynosić 10 μl, w tym barwnik wiążący DNA, który zostanie wykorzystany do ilościowego określenia amplifikacji genów.
    1. Użyj starterów CD31, VE-kadheryny, CD45 i β-aktyny do przodu i do tyłu, aby zmierzyć ekspresję genów.
  4. Użyj przykładu dla aplikacji sekwencjonowania nowej generacji1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trawienie tkanki siatkówki i barwienie immunologiczne dla CD31 i CD45 daje możliwą do zidentyfikowania populację komórek śródbłonka CD31+/CD45- po bramkowaniu dla komórek, pojedynczych komórek i żywotności (Rysunek 2A). Barwienie immunologiczne CD45 jest wymagane do wyeliminowania komórek CD31+/CD45+, które obejmują płytki krwi i niektóre leukocyty21. Dla każdego eksperymentu należy przeprowadzić kontrole, aby wykazać swoistość przeciwciał i wskazać strategię bramkowania (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje metodę izolacji komórek śródbłonka z postnatalnej mysiej tkanki siatkówki, która została zoptymalizowana pod kątem wysokiej liczby komórek, czystości i żywotności. Czystość komórek uzyskuje się przez izolację FACS populacji komórek śródbłonka z strawionej zawiesiny pojedynczej komórki za pomocą barwienia immunologicznego CD31+/CD45-. Jakość izolacji określa się ilościowo w testach żywotności za pomocą barwienia błękitem trypanowym i ekspresji genów za pomocą qPCR dla CD31, CD45 i VE-kadheryny (chocia...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie ujawnili żadnych istotnych informacji.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękuję Ośrodkowi Cytometrii Przepływowej Uniwersytetu Wirginii, Centrum Analizy Genomowej Uniwersytetu Wirginii oraz Ośrodkowi Analizy Genomu i Technologii Uniwersytetu Wirginii za ich wysiłek, wiedzę i rady w przyczynieniu się do prezentowanych eksperymentów. Badanie to zostało sfinansowane z grantów NIH dla N.W.C. (T32 HL007224, T32 HL007284), SC (T32 HL007284), KW (R01 HL142650) i K.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2 ml Eppendorf  probówki safe-lockUSA Scientific4036-3352
5 ml Probówki Falcon z sitkiem do komórek Snap CapCorning352235
60 mm Naczynie hodowlane bez TCCorning430589
APC Rat Anti-Mouse CD31BD Biosciences551262
APC Rat IgG2a κ Kontrola izotypuBD Biosciences553932
BD FACSChorus SoftwareBD BiosciencesFACSCHORUS
BD FACSMelody Cell SorterBD BiosciencesFACSMELODY
Kolagenaza typu IISigma-Aldrich234115
Costar 48-dołkowe przezroczyste płytki wielodołkowe poddane działaniu TC, indywidualnie pakowane, sterylneCorning3548
D-GlucoseGibcoA2494001
Jednorazowe pipety z podziałkąFisher Scientific12-711-9AM
Wosk do patelni preparacyjnejCarolina629100
Nożyczki do preparacjiNarzędzia do nauki o napięciu14085-08
Mikroskop stereoskopowy M165 FCLeicaM165FC
Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle (DMEM)Gibco11965-052
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Gibco14190144
Eppendorf  Probówki do mikrowirówek Flex-Tubes 1,5 mlSigma-Aldrich22364120
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gemini Bio100-106
Kleszcze do drobnego rozwarstwianiaFine Science Tools11250-00
Buforowany roztwór soli Hanka (HBSS)Gibco14175095
HEPES (1M)Gibco15630130
iScript cDNA Zestaw do syntezyBio-Rad1708890
Isoflurane, USPCovetrus11695067772
Isotemp General Purpose Deluxe Kąpiel wodnaFisher ScientificFSGPD20
Podkład: ActB_Forward: 5'- agagggaaatcgtgcgtgac -3'Integrated DNA TechnologiesN/A
Primer: ActB_Reverse: 5'- caatagtgatgacctggccgt -3'Integrated DNA TechnologiesN/A
Elementarz: CD31_Forward: 5'- gagcccaatcacgtttcagttt -3'Integrated DNA TechnologiesN/A
Elementarz: CD31_Reverse: 5'- tccttcctgcttcttgctagct -3'Zintegrowane technologie DNA Niedotyczy
Elementarz: CD45_Forward: 5'- gggttgttctgtgccttgtt -3'Zintegrowane technologie DNA Niedotyczy
Podkład: CD45_Reverse: 5'- ctggacggacacagttagca -3'Zintegrowane technologie DNA Niedotyczy
Podkład: VE-Cadherin_Forward: 5'- tcctctgcatcctcactatcaca -3'Zintegrowane technologie DNA Niedotyczy
Podkład: VE-Cadherin_Reverse: 5'- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3'Zintegrowane technologie DNANie dotyczy
jodku propidiumSigma-AldrichP4864
RNeasy Plus Mini KitQiagen74134
Wirówka Sorvall Legend Micro 21R, chłodzonaThermoFisher75002477
SYBR-Green iTaq Uniwersalny SYBR Green SupermixBio-Rad172-5120
Roztwór błękitu trypanowegoThermoFisher15250061
V450 Szczurzy anty-mysz CD45BD Biosciences560501
V450 Szczur IgG2b i kappa; Kontrola izotypuBD Biosciences560457

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Slatko, B. E., Gardner, A. F., Ausubel, F. M. Overview of next-generation sequencing technologies. Current Protocols in Molecular Biology. 122 (1), 59(2018).
  2. Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. Single cell analysis in vascular biology. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 42(2020).
  3. Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function. Current Opinion in Hematology. 28 (3), 221-229 (2021).
  4. Potter, A. S., Potter, S. S., S, Dissociation of tissues for single-cell analysis. Methods in Molecular Biology. 1926, 55-62 (2019).
  5. Braga, F. A. V., Miragaia, R. J. Tissue handling and dissociation for single-cell RNA-seq. Single Cell Methods: Methods in Molecular Biology. 1979, 9-21 (2019).
  6. Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociatin-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  7. Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665(2019).
  8. Connolly, S., Hores, T., Smith, L., D'Amore, P. Characterization of vascular development in the mouse retina. Microvascular Research. 36 (3), 275-290 (1988).
  9. Crist, A., Young, C., Meadows, S. Characterization of arteriovenous identity in the developing neonate mouse retina. Gene Expression Patterns: GEP. 23-24, 22-31 (2017).
  10. dela Paz, N. G., D'Amore, P. A. Arterial versus venous endothelial cells. Cell and Tissue Research. 335 (1), 5-16 (2009).
  11. Fang, J. S., Hirschi, K. K. Molecular regulation of arteriovenous endothelial cell specification. F1000Res. 8, (2019).
  12. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
  13. Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nature Protocols. 5 (9), 1518-1534 (2010).
  14. Ruiz, S., et al. A mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia generated by transmammary-delivered immunoblocking of BMP9 and BMP10. Scientific Reports. 6, 37366(2016).
  15. Fang, J. S., et al. Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification. Nature Communication. 8 (1), 2149(2017).
  16. Ola, R., et al. SMAD4 prevents flow induced arterial-venous malformations by inhibiting Casein Kinase 2. Circulation. 138 (21), 2379-2394 (2018).
  17. Chavkin, N. W., Walsh, K., Hirschi, K. K. Isolation of highly purified and viable retinal endothelial cells. Journal of Vascular Research. 58 (1), 49-57 (2020).
  18. Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry PartB: Clinical Cytometry. 76 (6), 355-364 (2009).
  19. Bachman, J. Reverse-transcription PCR (RT-PCR). Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).
  20. Green, M. R., Sambrook, J. Quantification of RNA by real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Cold Spring Harbour Protocols. 2018 (10), (2018).
  21. Liu, L., Shi, G. P. CD31: beyond a marker for endothelial cells. Cardiovascular Research. 94 (1), 3-5 (2012).
  22. Zarkada, G., et al. Specialized endothelial tip cells guide neuroretina vascularization and blood-retina-barrier formation. Developmental Cell. 56 (15), 2237-2251 (2021).
  23. Su, X., Sorenson, C. M., Sheibani, N. Isolation and characterization of murine retinal endothelial cells. Molecular Vision. 9, 171-178 (2003).
  24. Benedito, R., et al. The notch ligands Dll4 and Jagged1 have opposing effects on angiogenesis. Cell. 137 (6), 1124-1135 (2009).
  25. Daneman, R., et al. Wnt/beta-catenin signaling is required for CNS, but not non-CNS, angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 641-646 (2009).
  26. Okabe, K., et al. Neurons limit angiogenesis by titrating VEGF in retina. Cell. 159 (3), 584-596 (2014).
  27. Crist, A. M., Lee, A. R., Patel, N. R., Westhoff, D. E., Meadows, S. M. Vascular deficiency of Smad4 causes arteriovenous malformations: a mouse model of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia. Angiogenesis. 21 (2), 363-380 (2018).
  28. Kim, Y. H., Choe, S. W., Chae, M. Y., Hong, S., Oh, S. P. SMAD4 deficiency leads to development of arteriovenous malformations in neonatal and adult mice. Journal of the American Heart Association. 7 (21), 009514(2018).
  29. Ma, W., et al. Absence of TGFbeta signaling in retinal microglia induces retinal degeneration and exacerbates choroidal neovascularization. eLife. 8, 42049(2019).
  30. Luo, W., et al. Arterialization requires the timely suppression of cell growth. Nature. 589 (7842), 437-441 (2021).
  31. Lawson, N. D., Vogel, A. M., Weinstein, B. M. sonic hedgehog and vascular endothelial growth factor act upstream of the Notch pathway during arterial endothelial differentiation. Developmental Cell. 3 (1), 127-136 (2002).
  32. Larrivee, B., et al. ALK1 signaling inhibits angiogenesis by cooperating with the Notch pathway. Developmental Cell. 22 (3), 489-500 (2012).
  33. Wythe, J. D., et al. ETS factors regulate Vegf-dependent arterial specification. Developmental Cell. 26 (1), 45-58 (2013).
  34. Davis, D. M., Purvis, J. E. Computational analysis of signaling patterns in single cells. Seminars in Cell and Developmental Biology. 0, 35-43 (2015).
  35. Gaudet, S., Miller-Jensen, K. Redefining signaling pathways with an expanding single-cell toolbox. Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).
  36. Aibar, S., et al. SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering. Nature Methods. 14 (11), 1083-1086 (2017).
  37. Trapnell, C., et al. The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells. Nature Biotechnology. 32 (4), 381-386 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja kom reksortowanie kom rek aktywowane fluorescencjtrawienie tkanki siatk wkisekwencjonowanie RNA pojedynczych kom rekbramkowanie CD31 CD45rozw j naczyniowyywotno kom reksekwencjonowanie RNA

Powiązane artykuły