Artykuł metodologiczny

System potrójnej hodowli komórkowej modelujący ludzką barierę krew-mózg

6.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63134

⸱

30 listopada 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Univ. Artois, UR 2465, Laboratoire de la Barrière Hémato-Encéphalique (LBHE), 2Queen Mary University of London, Department of Chemistry, 3Yamaguchi University Graduate School of Medicine, Department of Neurology and Clinical Neuroscience

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę tworzenia ludzkiej bariery krew-mózg (BBB) w modelu in vitro. Komórki śródbłonka i perycyty są wysiewane po obu stronach wkładki filtracyjnej (przedział krwi), a astrocyty są wysiewane w dolnej studzience (przedział mózgowy). Scharakteryzowany model wykorzystano w eksperymentach z transportem nanocząstek.

Streszczenie

Dostarczanie leków do mózgu pozostaje wyzwaniem ze względu na bardzo specyficzne i ograniczające właściwości bariery krew-mózg (BBB), która kontroluje i ogranicza dostęp do miąższu mózgu. Jednak wraz z rozwojem nanotechnologii opracowano duże panele nowych nanomateriałów w celu usprawnienia dostarczania leków, co uwypukliło potrzebę niezawodnych mikrosystemów in vitro do przewidywania penetracji mózgu w ramach testów przedklinicznych. Oto prosta metoda stworzenia systemu mikrofizjologicznego do modelowania bariery krew-mózg przy użyciu wyłącznie komórek ludzkich. W swojej konfiguracji model składa się z potrójnej hodowli, w tym komórek śródbłonka podobnych do mózgu (BLEC), perycytów i astrocytów, trzech głównych aktorów komórkowych BBB niezbędnych do indukowania i regulowania właściwości BBB w bardziej fizjologiczny sposób bez konieczności stosowania związków zaciskających. Model opracowany w formacie 12-dołkowej płytki, gotowy po 6 dniach potrójnej hodowli, charakteryzuje się właściwościami fizycznymi, ekspresją genów i białek oraz służy do pomiaru transportu polimerowego nanożelu. Model może być wykorzystywany w szerokim zakresie eksperymentów w warunkach zdrowych i patologicznych i stanowi cenne narzędzie do przedklinicznej oceny transportu cząsteczek i cząstek, a także transportu między- i wewnątrzkomórkowego.

Wprowadzenie

BBB, zlokalizowany na poziomie komórek śródbłonka naczyń włosowatych mózgu (EC), kontroluje i reguluje dostęp do miąższu mózgu, co jest kluczowe dla utrzymania homeostazy mózgu i funkcji komórek nerwowych1,2. Jednak w przypadku patologii mózgu brak dostępu do miąższu mózgu stanowi realną przeszkodę w opracowaniu strategii terapeutycznych.

EC BBB posiadają złożony zestaw właściwości, w tym białka ścisłego połączenia (TJ), które uszczelniają przestrzeń międzykomórkową, związane z systemem pomp wypływowych, specyficznych transporterów i receptorów, które kontrolują szlak transkomórkowy1,2,3. Co więcej, wszystkie te właściwości są indukowane i utrzymywane dzięki komunikacji z perycytami osadzonymi w błonie podstawnej BBB EC oraz astrocytami, których końcowe stopy otaczają naczynia włosowate mózgu1,2,3. W związku z tym badanie BBB in vitro jest wyzwaniem, biorąc pod uwagę złożoność jego architektury i komunikację między różnymi typami komórek tworzących jednostkę nerwowo-naczyniową (NVU)2. Co więcej, różne typy komórek mają kluczowe znaczenie dla indukcji i utrzymania właściwości BBB, a w konsekwencji wpływają na przewidywanie przejścia przez BBB. Różne strategie dostarczania leków do mózgu zostały już przetestowane przy użyciu dużego panelu taktyk mających na celu ominięcie ograniczonych właściwości BBB4. Ostatnio, wraz z postępem nanotechnologii, opracowywane są nowe materiały do zastosowań jako nośniki leków5,6. Oprócz większego obciążenia, zmniejszonej toksyczności i zwiększonej biodostępności leków, te nowe nanomateriały mogą być funkcjonalizowane pod kątem strategii konia trojańskiego, która przekracza barierę krew-mózg i jest specyficznie ukierunkowana na komórki w miąższu 5,6. Wśród różnych rodzajów ocenianych nanomateriałów, nanożele cieszą się dużym zainteresowaniem, głównie ze względu na ich właściwości koloidalne i zdolność do dostosowywania struktury chemicznej w celu wprowadzenia właściwości reagujących na bodźce7,8,9,10,11,12,13,14,15.

Modele in vitro są teraz opracowywane do badań przedklinicznych z wykorzystaniem ludzkich komórek do przewidywania przenikania leków do mózgu16. Dostępne są różne ustawienia tych modeli, od monowarstw EC mózgu po wiele systemów komórkowych16. Biorąc pod uwagę znaczenie komórek NVU w indukcji i utrzymaniu bariery krew-mózg oraz skoordynowanej odpowiedzi na środowisko patologiczne, modele BBB in vitro muszą uwzględniać wszystkich tych protagonistów, aby poprawić trafność przewidywania2,17.

Obecna metoda opisuje tworzenie modelu potrójnej hodowli in vitro ludzkiego BBB, który jest w pełni rozwinięty z ludzkimi komórkami do badania specyficznych komórkowych i ludzkich mechanizmów molekularnych. Aby być fizjologicznie istotnym, model składa się z trzech głównych aktorów komórkowych BBB (EC, perycyty i astrocyty) niezbędnych do indukcji i utrzymania właściwości BBB, bez użycia związków napinających i wykazujących zestaw właściwości wymaganych do uznania za model BBB in vitro16,18. Model jest ustawiony w konfiguracji wyznaczającej przedział krwi i mózgu, odpowiedniej do badań przedklinicznych transportu leków i cząstek w celu przewidywania penetracji mózgu. Użyteczność modelu ilustruje pomiar transportu nanożeli polimerowych.

Protokół

Protokół został zatwierdzony przez francuskie Ministerstwo Szkolnictwa Wyższego i Badań (źródło: CODECOH DC2011-1321) oraz przez lokalną komisję rewizyjną (Béthune Maternity Hospital, Beuvry, Francja). W celu uzyskania komórek śródbłonka (EC) uzyskano pisemną i świadomą zgodę rodziców dawcy na pobranie krwi pępowinowej, zgodnie z francuskim ustawodawstwem. Perycyty zostały dostarczone przez profesora Takashi Kanda (Wydział Neurologii i Neurologii Klinicznej, Yamaguchi University Graduate School of Medicine, Ube, Japonia), które zostały wyizolowane zgodnie z Reference19. Pierwotne astrocyty ludzkiej kory mózgowej są kupowane od komercyjnego dostawcy (patrz tabela materiałów).

1. Hodowla komórkowa

  1. Hodowla komórek śródbłonka
    UWAGA: Komórki śródbłonka (EC) pochodzą z hematopoetycznych komórek macierzystych CD34+ wyizolowanych z ludzkiej krwi pępowinowej, zgodnie z metodą opisaną przez Pedroso i wsp.20. Fenotyp śródbłonka EC jest opisany w Pedroso et al.20.
    1. Hodować ludzkie EC przy użyciu pożywki z komórek śródbłonka uzupełnionej 5% płodowej surowicy cielęcej (FCS), 0,5% gentamycyny i 1% suplementu wzrostu komórek śródbłonka (ECM) (patrz tabela materiałów).
    2. W przypadku subkulturacji EC, dwa dni przed ustawieniem modelu, posmaruj jedno naczynie 10 ml 2% żelatyny przez 15 minut w temperaturze 37 °C, a następnie zastąp je 20 ml ciepłego ECM. Rozmrozić jedną fiolkę EC zawierającą 1 milion komórek (komórki zostały ręcznie policzone zgodnie z opisem w kroku 2.3.3 przed zamrożeniem komórek) w wstępnie powlekanym naczyniu do hodowli komórkowych.
    3. Po 3 godzinach w temperaturze 37 °C odnowić pożywkę i utrzymywać komórki aż do ustawienia trikultury w wilgotnej atmosferze w inkubatorze w temperaturze 37 °C w temperaturze poniżej 5 % CO2 i 21 %O2 .
  2. Hodowla perycytów
    UWAGA: Perycyty są izolowane z ludzkiego mózgu zgodnie z protokołem opublikowanym przez Shimizu et al.19, którego procedura izolacji jest zgodna z metodą opublikowaną przez Kanda et al.21 z modyfikacjami.
    1. Hoduj perycyty przy użyciu zmodyfikowanego podłoża Eagle firmy Dulbecco uzupełnionego 4,5 g/l glukozy (DMEM HG), 10% FCS, 1% de penicyliny/streptomycyny i 1% L-glutaminy (patrz tabela materiałów).
    2. W przypadku podhodowli perycytów, pięć dni przed ustawieniem modelu, pokryj dwie szalki 8 ml / naczynie 100 μg / ml roztworu kolagenu typu I w 0,02 N kwasie octowym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT), a następnie umyj dwukrotnie RT DMEM HG. Rozmrozić jedną fiolkę z perycytami zawierającymi 1 milion komórek w stożkowej probówce zawierającej 10 ml ciepłej pożywki i odwirować zawiesinę przez 5 minut w temperaturze 190 x g w temperaturze 20 °C.
    3. Zawiesić osad w 10 ml ciepłej pożywki i wysiać nasiona w wstępnie pokrytych szalkach do hodowli komórkowych wypełnionych 15 ml ciepłej pożywki na naczynie. Pożywkę odnawia się po 3 dniach, a komórki są utrzymywane do momentu ustawienia trikultury w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 i 21%O2 .
  3. Hodowla astrocytów
    1. Hoduj astrocyty przy użyciu pożywki astrocytów uzupełnionej 20% FCS, 1% suplementu wzrostu astrocytów i 1% roztworu penicyliny/streptomycyny (AM) (patrz Tabela materiałów).
    2. W celu subhodowli astrocytów, na tydzień przed ustawieniem modelu, należy pokryć jedną kolbę do hodowli komórek T75 10 ml poli-L-lizyny (PLL) o stężeniu 2 μg/cm2 (PLL) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i dwukrotnie przemyć sterylną wodą RT. Rozmrozić jedną fiolkę astrocytów zawierających 1 milion komórek w 20 ml ciepłej pożywki i nasiona w wstępnie powlekanej kolbie do hodowli komórek T75.
      UWAGA: Komercyjnie uzyskane fiolki z komórkami potwierdzają obecność ~1 miliona komórek, więc liczenie komórek nie zostało tutaj przeprowadzone.
    3. Utrzymać komórki w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO2 i 21%O2 . Pożywkę odnawia się po 24 godzinach, a następnie co 2 dni aż do zawiązania trikultury.

2. Ustawienie modelu potrójnej kultury

UWAGA: Montaż trzech typów komórek odbywa się tego samego dnia. Dzień przed ustawieniem trikultury należy wykonać powlekanie kolagenem typu I na odwróconych filtrach wsadowych (patrz tabela materiałów) i zasiać astrocyty w dołkach pokrytych PLL na 12-dołkowej płytce.

  1. Wysiewanie astrocytów w studzienkach
    1. Pokryć studzienki 500 μl roztworu PLL o stężeniu 2 μg/cm2 zgodnie z opisem w kroku 1.3.2.
    2. Przemyć komórki raz 10 ml ciepłego buforu fosforanowego soli fizjologicznej - bez wapnia i magnezu 1X (1X PBS-CMF) (Tabela 1) przed inkubacją przez 3 minuty w temperaturze 37 °C z 10 ml ciepłego 20% roztworu trypsyny/EDTA (T/E) i mechanicznie odłączyć komórki od kolby. Przenieść zawiesinę do stożkowej probówki zawierającej 5 ml ciepłego, nierozcieńczonego FCS.
      UWAGA: Zgodnie z protokołem dostawcy22, zbieranie astrocytów można zoptymalizować, umieszczając kolbę w inkubatorze na 1 minutę i stukając w kolbę, aby pomóc zakończyć odłączanie. Pozostałe komórki należy zebrać z 5 ml roztworu neutralizującego T/E i umieścić w stożkowej probówce zawierającej FCS.
    3. Odwirowywać zawiesinę przez 5 minut w temperaturze 20 °C przy 190 x g.
    4. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml ciepłego AM. Policz komórki, rozcieńczając 20 μl zawiesiny komórek w 80 μl 1X PBS-CMF przy użyciu ręcznej komory liczącej pod mikroskopem (patrz tabela materiałów). Umieść około 40 000 komórek/cm2 w każdej studzience pokrytej PLL w objętości 1,5 ml ciepłego AM.
  2. Wysiewanie perycytów na odwróconych filtrach wsadowych
    1. Dodać 250 μl roztworu kolagenu typu I (100 μg/ml) na odwrócone wkładki filtracyjne, umieszczone na obrzeżach przykrytego naczynia o wysokości 25 mm (patrz tabela materiałów) za pomocą sterylnej pęsety. Pozostawić powłokę na 1 godzinę w temperaturze pokojowej w sterylnych warunkach.
      UWAGA: Zużyte naczynie musi być wystarczająco wysokie, aby zapewnić utrzymanie sterylności na zewnątrz okapu i unikać kontaktu roztworów na odwróconym filtrze z pokrywą naczynia.
    2. Ostrożnie usunąć roztwór kolagenu typu I za pomocą szklanej pipety podłączonej do systemu zasysającego. Przemyć dwukrotnie 250 μl RT DMEM HG, a następnie ostrożnie usunąć cały roztwór z wkładanych filtrów. Pozostaw powlekane filtry wkładowe w temperaturze pokojowej w sterylnych warunkach do momentu wysiewu komórek.
      UWAGA: Podczas procedury powlekania należy uważać, aby nie dotknąć filtra, aby uniknąć uszkodzenia membrany. Po pokryciu kolagenem typu I filtry wkładowe mogą być przechowywane przez noc w temperaturze pokojowej.
    3. W dniu ustawienia trikultury przemyj perycyty dwukrotnie 10 ml ciepłego 1X PBS-CMF i inkubuj komórki z 2 ml ciepłej trypsyny. Monitoruj działanie trypsyny, obserwując komórki pod mikroskopem. Gdy komórki zaczną się odłączać, usuń trypsynę i dodaj 5 ml ciepłego ECM przed mechaniczną dysocjacją.
    4. Policzyć komórki, rozcieńczając 20 μl zawiesiny komórek w 80 μl 1X PBS-CMF za pomocą ręcznej komory liczącej pod mikroskopem i zasiać 44 500 komórek/cm2 na wstępnie powlekanych filtrach z odwróconym wkładem w objętości 250 μl. Przechowywać filtry wkładane w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 3 godziny w temperaturze poniżej 5% CO2 i 21%O2.
    5. Ostrożnie odwróć wkładki filtracyjne za pomocą sterylnej pęsety w 12-dołkowej płytce zawierającej 1,5 ml ciepłego ECM/studzienki. Filtry wtykowe są teraz gotowe do powlekania z drugiej strony.
  3. Wysiewanie komórek śródbłonka na filtrach wsadowych
    1. Pokryj górną stronę filtrów wkładowych 500 μl hydrożelu na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej (1/48 v/v) (patrz tabela materiałów). Po 1 godzinie, w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 i 21%O2 przemyć raz 500 μl RT DMEM HG.
    2. Przemyj raz 10 ml ciepłego 1X PBS-CMF i inkubuj komórki z 2 ml ciepłej trypsyny. Gdy komórki zaczną się odłączać, usuń trypsynę i dodaj 5 ml ciepłego ECM przed mechaniczną dysocjacją.
    3. Policz komórki, rozcieńczając 20 μl zawiesiny komórek w 80 μl 1X PBS-CMF za pomocą ręcznej komory liczącej pod mikroskopem i zasiaj EC o gęstości 71 500 komórek/cm2 na wstępnie powlekanych filtrach wkładkowych w objętości 500 μl ciepłego ECM.
    4. Zastąp AM 1,5 ml ciepłego ECM / studzienki, a następnie przenieś filtry z wkładkami zasianymi (EC + perycyty) na dołki zawierające astrocyty.
    5. Umieścić systemy komórkowe trikultur w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 i 21 %O2.
  4. Utrzymanie hodowli trójkomórkowej w celu indukcji właściwości BBB
    UWAGA: Do indukcji właściwości BBB w EC konieczne jest 6 dni potrójnej hodowli.
    1. Odnawiać pożywkę co drugi dzień do 6 dnia, ostrożnie usuwając pożywkę z górnej i dolnej komory za pomocą szklanej pipety połączonej z systemem aspiracji.
    2. Szybko wymień na ciepły ECM w objętości 500 μl w górnej komorze i 1,5 ml w dolnej komorze i umieść komórki z powrotem w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 i 21% O2 .

3. Walidacja fenotypu BBB

UWAGA: Po 6 dniach potrójnej hodowli, czasie niezbędnym do wywołania fenotypu BBB w ECs, ludzki model BBB jest gotowy do eksperymentów. Fizyczna integralność komórek śródbłonka podobnego do mózgu (BLEC) jest wizualizowana przez barwienie immunofluorescencyjne białek TJ oceniane za pomocą testu przepuszczalności do markerów integralności BBB. Walidacja fenotypu BBB obejmuje również analizę ekspresji genów/białek i funkcjonalność pomp wypływowych zgodnie z procedurą opisaną w Deligne et al., 23. Perycyty i astrocyty są wizualizowane za pomocą odpowiednich markerów barwienia zgodnie z procedurą opisaną w Deligne i wsp. 202023.

  1. Barwienie immunofluorescencyjne
    1. Zamocuj filtry wkładowe i astrocyty w lodowatym metanolu/acetonie (50/50 v/v) na 1 minutę i umyj dwukrotnie RT 1X PBS-CMF.
    2. Ostrożnie oddziel filtr od wkładu, przecinając membranę za pomocą skalpela. Wykonaj immunocytochemię na błonie i studzienkach dennych zgodnie z Deligne et al.23.
      UWAGA: Do etapu blokowania użyj 250 μl bufora blokującego SEA BLOCK (patrz Tabela materiałów) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Test integralności BBB
    1. Ocenić integralność fizyczną BLEC za pomocą testu przepuszczalności przy użyciu markerów integralności BBB o różnych masach cząsteczkowych, takich jak fluoresceina sodu (NaF) i dekstran 20 kDa (FD20) (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Eksperyment można przeprowadzić zgodnie z procedurą opisaną w Deligne et al.23.
  3. Funkcjonalność pompy Efflux
    1. Oceń funkcjonalność glikoproteiny P (P-gp) i białka oporności na raka piersi (BCRP), mierząc wewnątrzkomórkową akumulację rodaminy 123 (R123) z i bez Elacridaru, inhibitora P-gp i BCRP (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Eksperyment można przeprowadzić zgodnie z procedurą opisaną w Deligne et al.23.
  4. Ekspresja genów i białek
    1. Pobrać próbkę genów i białek na lodzie po szybkim umyciu komórek zimnym filtrem Ringera (RH) (Tabela 1). Przed pobraniem próbki EC zeskrob perycyty z odwróconych filtrów wsadowych20.

4. Transport nanożelu

UWAGA: Aby oszacować przejście polimerowych nanożeli (NG) z komory luminalnej do abluminalnej modelu BLEC trikultury, 0,1 mg/ml roztworu NG dodano w 6 dniu na komorze luminalnej przez 24 godziny. Badane NG były fluorescencyjnie znakowanymi hydrożelami na bazie N-izopropylacrylamidu (NIPAM) o średniej wielkości 8-10 nm (patrz Tabela Materiałów).

  1. Zważyć nanożel w proszku i rozpuścić go w ECM w stężeniu 1 mg/ml. Sonikować roztwór przez 10 minut i filtrować za pomocą filtra PTFE 0,2 μm.
    UWAGA: Przygotuj świeży roztwór gazu ziemnego w dniu eksperymentu.
  2. Zmienić pożywkę w komorze luminalnej i dodać 50 μl roztworu gazu ziemnego do górnej komory, aby uzyskać końcowe stężenie 0,1 mg/mL.
    UWAGA: Wykonać rozcieńczenie 1:10 od oryginalnego roztworu.
  3. Po 24 godzinach inkubacji zebrać podwielokrotności z komór luminalowych (20 μl) i abluminalnych (200 μl) i umieścić je na czarnej płytce 96-dołkowej.
  4. Określić ilościowo fluorescencję za pomocą fluorescencyjnego czytnika wielopłytkowego (patrz tabela materiałów) z czarną 96-dołkową płytką, ustawiając długości fal wzbudzenia/emisji na 477/540 nm. Oblicz procent przecięcia odnoszący się do początkowego roztworu roboczego dodanego w czasie = 0 h (t0)6,15.
    UWAGA: Aby przygotować 96-dołkową płytkę do pomiaru fluorescencji, dodać 200 μl roztworu z komory abluminalnej i 20 μl roztworu z komory luminalnej i preparatu t0 (dodać 180 μl ECM, aby osiągnąć końcową objętość 200 μL). Dołącz również krzywą kalibracyjną i ślepą próbkę do płytki odczytu. Parametry instrumentalne: Metoda detekcji - Fluorescencja, Pozycja optyczna - Góra, Typ odczytu - Punkt końcowy, Długość fali wzbudzenia - 477 nm, Długość fali emisji - 540 nm, Czułość - 100, Drąganie - Podwójny orbital przez 5 s.

Wyniki

Konfiguracja ludzkiego modelu potrójnej hodowli BBB
Protokół niezbędny do konfiguracji ludzkiego modelu BBB in vitro opisano na Rysunku 1; obejmuje on kolejne kroki, których kolejność musi być ściśle przestrzegana. Najpierw trzy typy komórek są hodowane indywidualnie w naczyniach do hodowli komórkowej (Rysunek 1A), a następnie są łączone w systemie filtrów wkładkowych. Konfiguracja potrójnej hodowli rozpoczyna się od wysiewu pierwszego typu komórek, astrocytów, do uprzednio powleczonego dołu. Następnego dnia perycyty i komórki śródbłonka (ECs) są wysiewane odpowiednio na uprzednio powleczone powierzchnie abluminalną i luminalną filtra wkładkowego. Filtr wkładkowy jest następnie przenoszony nad astrocyty. Model jest utrzymywany w hodowli przez 6 dni, co jest czasem niezbędnym do indukowania właściwości BBB w komórkach ECs, przy wymianie medium co drugi dzień zgodnie z opatentowanym modelem współhodowli24. Komórki ECs są następnie nazywane BLECs (Rysunek 1B).

Charakterystyka ludzkiego modelu BHE
Potrójny model hodowli komórkowej został poddany charakterystyce pod kątem obecności zestawu właściwości specyficznych dla BHE. Przede wszystkim dane immunocytochemiczne potwierdziły ekspresję konwencjonalnych markerów, takich jak receptor czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego β (PDGFR-β)25,26 oraz desmina dla perycytów i kwaśnego białka włókienstwa glejowego (GFAP)26 dla astrocytów (Rysunek 2A). Zatem po 6 dniach hodowli z perycytami i astrocytami, monowarstwa BLEC, wizualizowana za pomocą barwienia złączy przylegających na VE-Cadherin, wykazuje ciągłą lokalizację białek TJ, Claudin-5 i ZO-1, na granicach komórek (Rysunek 2A). Uformowanie się TJ koreluje z niskimi współczynnikami przepuszczalności parakomórkowej, zmierzonymi przy użyciu markerów integralności BHE o niskiej masie cząsteczkowej, tj. NaF (376 Da)16,27, oraz o wysokiej masie cząsteczkowej, tj. FD20 (20 kDa)27, co przedstawiono na Rysunku 2B. Wartości pomiarowe są porównywalne z walidowanymi modelami BHE in vitro wykorzystującymi to samo źródło EC23,24,28. Łącznie wyniki te podkreślają niską przepuszczalność parakomórkową monowarstwy BLEC w potrójnej hodowli, co jest charakterystyczne dla BHE in vivo. Dodatkowo wewnątrzkomórkowa akumulacja R123 w BLEC wykazała znaczny wzrost w obecności inhibitora pompy efflux Elacridar23,24 w porównaniu do warunków kontrolnych bez jego dodatku (Rysunek 2C). Wskazuje to na obecność aktywnych cząsteczek pomp efflux, mianowicie P-gp i BCRP, w komórkach BLEC.

Aby dokładniej scharakteryzować BLEC, zbadano ekspresję genów i poziom białek kluczowych cech BBB (Rycina 3). Dane uzyskane w modelu potrójnej hodowli porównano z walidowanym i opatentowanym modelem współhodowli składającym się z EC i pericytów24, który posłużył jako model kontrolny. Astrocyty stanowią trzeci typ komórek dodany do początkowego modelu współhodowli w modelu potrójnej hodowli. W konsekwencji analiza ekspresji genów (Rycina 3A) w BLEC w potrójnej hodowli, w porównaniu z BLEC we współhodowli, wykazała utrzymanie ekspresji kluczowych cech BBB, takich jak białka TJ (claudin-5 i zonula occludens-1) oraz pompy eflluksu (P-gp i BCRP), a także nadekspresję większości badanych transporterów BBB (transporter glukozy 1) i receptorów (receptor transferyny). Dane z ilościowego oznaczania białek (Rycina 3B) okazały się być zgodne z wynikami transkrypcyjnymi. Ogólnie rzecz biorąc, dane te potwierdzają pozytywną indukcję właściwości BBB w warstwie BLEC w potrójnej hodowli, podobnie jak w walidowanym modelu współhodowli. Podsumowując, model potrójnej hodowli wykazuje wymagane właściwości fizyczne i metaboliczne dla mikrofizjologicznego systemu in vitro służącego do modelowania BBB.

Zastosowanie w strategiach dostarczania leków – pomiar transportu nanżeli
Aby ocenić możliwość wykorzystania modelu potrójnej hodowli do badania nowych strategii dostarczania substancji do mózgu, oceniono transport neutralnych NG na bazie NIPAM znakowanych fluorescencyjnie6,15. W czasie 0 min NG umieszczono w przedziale luminalnym w stężeniu 0,1 mg/mL (Rycyna 4A). Po 24 h inkubacji w przedziale abluminalnym stwierdzono obecność 5,82% NG (Rycina 4B), co dowodzi ich zdolności do przenikania przez BLECs.

Wyniki demonstrują przydatność modelu do pomiaru przepuszczalności małych i większych związków, opisanej za pomocą markerów integralności, oraz do oceny transportu nanomateriałów, takich jak polimerowe NGs.

Schemat modelu bariery krew-mózg; komórki śródbłonka, perycyty, astrocyty; układ potrójnej hodowli.
Rysunek 1Przedstawienie krytycznych etapów przygotowania potrójnej hodowli in vitro model ludzkiej bariery krew-mózg. (A) Obrazy w kontraście fazowym trzech komponentów komórkowych modelu BBP: komórek śródbłonkowych (EC), pericytów (PC) i astrocytów (AC). Pasek skali = 250 µm. (B) Schematyczna i ilustracyjna oś czasu dla procesu tworzenia potrójnej hodowli ludzkiej BBB in vitro model. Podświetlone pole przedstawia procedurę powlekania odwróconego wkładu z filtrem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Model bariery krew-mózg: markery komórek śródbłonkowych (Ve-Cadh, CLD5, ZO1) i powiązane wyniki na wykresach.
Rysunek 2: Ocena właściwości potrójnego modelu kultur BBB. (A) Reprezentatywne obrazy immunobarwienia dla charakterystycznych markerów BLECs (Claudin-5: CLD5, Zona Occludens-1: ZO1 i VE-Cadherin: Ve-Cadh), perycytów (Platelet-Derived Growth Factor Receptor-β: PDGFR-β i desmina) oraz astrocytów (Glial Fibrillary Acidic Protein: GFAP). Pasek skali = 10 µm. (B) Przepuszczalność parakomórkowa BLECs dla fluorescencyjnych markerów integralności BBB: fluoresceiny sodowej (NaF, 376 Da, Pe: 0.61 ± 0.062) i FITC-dekstranu (FD20, 20 kDa, Pe: 0.04 ± 0.005). N = 3; n = 9. Średnia ± SEM. (C) Funkcjonalność P-gp i BCRP w komórkach śródbłonka oceniono poprzez kwantyfikację wewnątrzkomórkowego R123 z dodatkiem (124.2% ± 3.39%) i bez dodatku (100% ± 8.79%) Elacridaru. N = 4; n = 12. Średnia ± SEM. p = 0.017 przy użyciu nieparzystego testu t. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres słupkowy ekspresji genów i białek; ko-kultura BBB ECs; CLD5, ZO1, GLUT1, TRFR, PGP, BCRP.
Rycina 3: Ocena ekspresji genów BLEC i poziomu białek dla charakterystycznych markerów w modelu potrójnej kultury w porównaniu z modelem ko-kultury BBB. (A) Ekspresja genów białek połączeń szczelnych (Claudin-5: CLD5 i Zona Occludens-1: ZO1), transporterów (Transporter glukozy-1: GLUT1, Glikoproteina P: PGP oraz Białko oporności na raka piersi: BCRP) oraz receptorów dużych cząsteczek (Receptor transferryny: TRFR), znormalizowana względem ekspresji RPLP0. N = 3; n = 9. (B) Poziom białek połączeń szczelnych (CLD5 i ZO1), transporterów (GLUT1, PGP i BCRP) oraz receptorów dużych cząsteczek (TRFR), znormalizowany względem ekspresji β-aktyny. N = 3; n = 9. Średnia ± SEM. Dla (A) i (B) wartości > 1 odpowiadają wyższej ekspresji genów lub wyższym poziomom białek w modelu potrójnej kultury. Czerwona linia odpowiada wartości 1, gdzie poziom ekspresji (genów lub białek) w obu modelach jest równoważny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat transportu nanogelu; układ oceny NP z wynikami fluorescencji.
Rysunek 4: Pomiar transportu nanogelu w potrójnym modelu hodowli. (A) Schematyczny przedstawienie testu transportu nanogelu. (B) Procentowy transport nanogelu po 24 h inkubacji w potrójnym modelu hodowli (5,82% ± 0,09%). N = 2; n = 6. Średnia ± SEM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Nazwa buforuSkładUwaga
Masa cząsteczkowa
Fosforanowy bufor solny, wolny od wapnia i magnezuPBS-CMFNaCl8 g/L58.4Dodać wszystkie składniki do sterylnej wody i odczekać do całkowitego rozpuszczenia. pH otrzymanego roztworu musi mieścić się w zakresie 7.3-7.4. Przefiltrować roztwór przez membranę 0.22 µm i przechowywać sterylny roztwór w temperaturze 4 °C.
KCl0.2 g/L74.55
KH2PO40.2 g/L136.09
NaHPO4-12 H2O2.87 g/L358.14
woda
Ringer HEPESRHNaCl8.8 g/L58.4Dodać wszystkie składniki do sterylnej wody i odczekać do całkowitego rozpuszczenia. Dostosować pH do 7.4 (początkowe pH roztworu wynosi około 6.8). Przefiltrować roztwór przez membranę 0.22 µm i przechowywać sterylny roztwór w temperaturze 4 °C.
KCl0.387 g/L74.55
CaCl20.244 g/L110.99
MgCl2 6H2O0.0406 g/L203.3
NaHCO30.504 g/L84.1
HEPES1.19 g/L238.3
Glukoza0.504 g/L180.16
woda

Tabela 1: Skład różnych buforów użytych w protokole.

Dyskusja

Leczenie chorób mózgu pozostaje wyzwaniem, biorąc pod uwagę trudność leków w pokonaniu bariery krew-mózg, aby dotrzeć do ich komórkowych i molekularnych celów w miąższu mózgu.

Opracowywanie leków na choroby mózgu wykazuje obecnie niski wskaźnik sukcesu, ponieważ większość leków wykazujących obiecujące wyniki w modelach przedklinicznych nie wykazała żadnych korzyści, gdy była stosowana w klinice. Zgodnie z "zasadą 3R", która ma na celu zmniejszenie liczby zwierząt wykorzystywanych do eksperymentów, opracowywane są modele b krew-mózg in vitro w celu badania patologii mózgu i przewidywania penetracji mózgu przez narkotyki29. Modele in vitro BBB zostały opracowane głównie z wykorzystaniem komórek zwierzęcych i stały się bardziej wyrafinowane w celu zwiększenia trafności uzyskanych wyników16. Jeden ze znaczących postępów w wykorzystaniu komórek ludzkich, który przynosi niezaprzeczalnie nowe spojrzenie i większą szczegółowość na poziomie komórkowym i molekularnym, do badania mechanizmów chorób u ludzi16. Opracowanie odpowiednich modeli wymaga jednak rozważenia poprawy ustawień modelu BBB in vitro oraz wiedzy uzyskanej dzięki modelom zwierzęcym. W związku z tym należy wziąć pod uwagę złożoność architektury bariery krew-krew i znaczenie komunikacji komórka-komórka w badaniu bariery krew-krew w warunkach fizjologicznych i patologicznych30.

Przedstawiony tutaj protokół opisuje metodę tworzenia pełnego modelu ludzkiego BBB in vitro , obejmującego trzy główne typy komórek BBB, bez ograniczeń dostępu do tkanki mózgowej. Jako system wielokomórkowy, indukcja i utrzymanie właściwości BBB, bez sztucznego użycia związków napinających, ale zamiast tego indukowane przez komunikację komórka-komórka, jest bardziej fizjologicznie istotne i zgodne z indukcją in vivo właściwości BBB31. W związku z tym poszanowanie chronologii protokołu ma zasadnicze znaczenie dla jego powodzenia. Co więcej, czasy inkubacji podczas ustawiania potrójnej hodowli i po połączeniu trzech typów komórek stanowią główne krytyczne etapy protokołu.

Właściwości BBB w EC są indukowane przez kokulturę z perycytami, jak opisano dla modelu kokultury24. W związku z tym hodowla perycytów na odwrotnej stronie filtra wkładowego jest najbardziej krytycznym punktem i wymaga ścisłego przestrzegania protokołu w przypadku ryzyka braku wystarczającej liczby perycytów do indukcji właściwości BBB. Po pierwsze, podczas procedury powlekania, a także wysiewu komórek, należy zwrócić uwagę, aby pokrywa szalki Petriego nie stykała się z powłoką, a także z podłożem po wysianiu komórek, aby zapewnić dobre pokrycie filtra i nie spowodować utraty komórek (kroki 2.2.1 i 2.2.4). Ponadto, po wysianiu perycytów, konieczne jest odczekanie wskazanego czasu na przyłączenie perycytów (krok 2.2.4) przed przywróceniem wkładki filtra w celu powlekania i wysiewu EC po drugiej stronie (kroki 2.2.5 i 2.3). Po wysianiu potrzeba sześciu dni, aby indukować właściwości BBB poprzez komunikację komórka-komórka (krok 2.4).

Model jest walidowany pod względem ograniczonej przepuszczalności (związanej z ustawieniem ścisłych połączeń), ponieważ EC modelu potrójnej hodowli wyświetlają wartości przepuszczalności dla markerów integralności BBB podobne do zwalidowanego modelu kohodowli, a także mierzone w zwalidowanych modelach zwierzęcych lub ludzkich 16,27,32. Co więcej, walidacja modelu BBB in vitro wymaga, oprócz ograniczonej przepuszczalności, odpowiedzi na inne typy komórek NVU oraz ekspresji funkcjonalnych receptorów i transporterów16. Ponadto model jest powtarzalny i wytwarza wiele filtrów wkładowych i studzienek do przeprowadzania licznych analiz (ekspresja genów i białek, barwienie fluorescencyjne, testy toksyczności) na każdym typie komórek z osobna, bez konieczności stosowania metody sortowania komórek.

Model został opracowany przy użyciu filtra o wielkości porów 0,4 μm, aby mieć po jednym typie ogniwa z każdej strony filtra wkładowego. System filtrów wpuszczanych pozwolił na badanie komunikacji między komórkami w warunkach fizjologicznych poprzez przeniesienie go na dobrze zawierające astrocyty. Obecność astrocytów w systemie stanowi wartość dodatnią w porównaniu z początkowym modelem kohodowli in vitro 24. Rzeczywiście, biorąc pod uwagę znaczenie astrocytów w fizjologii BBB, ten trzeci typ komórek pozwala na dalsze zrozumienie komunikacji komórka-komórka w obrębie BBB. Co więcej, system hodowli trójkomórkowej może być również badany w stanach patologicznych, takich jak udar, w których astrocyty odgrywają istotną rolę 33,34,35. Ponadto konstrukcja BLEC / perycytów po obu stronach filtra wkładowego może być łatwo umieszczona na innych typach komórek, aby naśladować stany patologiczne, takie jak rak mózgu23.

Wielkość porów filtra wkładanego może powodować ograniczenia w przypadku niektórych eksperymentów, takich jak transmigracja komórek przez barierę krew-mózg. Jednak opracowanie modelu o większym rozmiarze porów wymaga dostosowania protokołu w celu zapewnienia utworzenia fizjologicznej monowarstwy EC, a nie wielu warstw, co nie jest fizjologicznie istotne dla naśladowania BBB36.

Przydatność modelu została zademonstrowana za pomocą eksperymentu z transportem NGs, wykazując możliwość przeprowadzenia eksperymentu z transportem przy użyciu systemu wielokomórkowego. Niemniej jednak należy zdawać sobie sprawę z trudności związanych z posiadaniem związku lub cząsteczki kontrolnej do eksperymentu transportowego, o właściwościach porównywalnych z NG, ponieważ każda nanostruktura wykazuje unikalny zestaw właściwości (masa cząsteczkowa, ładunek, kształt, właściwości fizyczne, tworzenie korony białkowej).

Jednym z ograniczeń modelu jest brak naprężeń ścinających, które, jak wykazano, wpływają na różnicowanie EC i ekspresję białek TJ37. Jednak opracowanie systemu fluidycznego naśladującego naczynia włosowe mózgu jest wyzwaniem, biorąc pod uwagę złożoność dodawania części płynnej, wymagającej określonego urządzenia, w systemie wielokomórkowym. Co więcej, dane urządzenie zwykle nie jest dostępne na rynku i nie pozwala na wiele powtórzeń, co sprawia, że systemy fluidyczne są mniej przystosowane do zastosowań o wysokiej przepustowości.

Podsumowując, ten potrójny system hodowli składający się z komórek ludzkich odtwarza in vitro architekturę bariery krew-mózg. Pozwala to na generowanie wielu wkładek, które można wykorzystać do obszernego przesiewania związków.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca została przyznana w ramach programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji na podstawie umowy o grant nr 764958, w ramach projektu NANOSTEM, innowacyjnej sieci szkoleniowej Marie Skłodowska-Curie (ITN) (Fellowship Eleonora Rizzi). Stypendium dla Clémence Deligne, Société Française de lutte contre les Cancers et les leucémies (SFCE), Stowarzyszenie "l'étoile de Martin" oraz Stowarzyszenie "Cassandra contre la leucémie".

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cell Culture
Astocyte Medium (AM)ScienCell 1801
Suplement na wzrost astrocytówScienCell 1852Suplement wzrostu astrocytów jest dostarczany w zestawie AM.
Naczynie do hodowli komórkowych 100 mmCorning 430293100 mm x 20 mm; naczynie służące do rozmrażania EC i PC przed ustawieniem triculture
Naczynie do hodowli komórkowych 150 mmCorning 430599Wysokość tych szalek (25 mm) umożliwia wysiewanie PC w odwróconej wkładce w celu ustawienia modelu trikultury.
Kolagen I Corning354236Ogon szczura 
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco31600-083
Suplement na wzrost komórek śródbłonkaw proszku ScienCell 1051Suplement na wzrost komórek śródbłonka jest dostarczany w zestawie ECM.
Pożywka dla komórek śródbłonka (ECM)ScienCell 1001
Surowica dla cieląt płodowych SigmaF7524
ŻelatynaSigmaG25002% żelatyna ze skóry świni w PBS-CMF
GentamycynaBiochromA6A-2712
GlukozaSigmaG6152w proszku
GlutaminaMerck1002891000
Astrocyty ludzkiej kory mózgowejScienCell 1800-SC
Komora zliczania komórek MalassezavWR HECH40453702Liczenie zostało przeprowadzone ręcznie.
MatrigelCorning354230Hydrożel na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej
Penicylina/StreptomycynaScienCell 0503Roztwór penicyliny/streptomycyny znajduje się w zestawach ECM i AM.
Poli-L-lizynaScienCell 0413
System SteritopMilliporeSCGPT0SRE0,22 & mikro; m wielkość porów
Wkładka Transwell Corning34010,4 & mikro; Filtr z poliwęglanu o dużych porach 
Roztwór neutralizujący trypsynę/EDTAScienCell 0113
Roztwór trypsyny/EDTAScienCell 0103
Immunocytochemia
SEA BLOCK bufor blokującyThermoScientific37527
Alexa Fluor 568 przeciwciało wtórne anty-myszyThermofisherA11031Rozcieńczenie 1:500
Alexa Fluor 568 przeciwciało drugorzędowe anty-królikaThermofisherA11036Rozcieńczenie 1:500
Przeciwciało pierwszorzędowe anty-Claudin-5InVitrogen34-1600Rozcieńczenie 1:100
Przeciwciało pierwszorzędowe anty-DesminAbcamab6322Rozcieńczenie 1:200
Przeciwciało pierwszorzędowe przeciwglejowe fibrylarne białko fibrylarneDakoZ0334Rozcieńczenie 1:500
Przeciwciało pierwszorzędowe przeciwpłytkowe-&betaAbcamab51090Rozcieńczenie 1:200
Przeciwciało pierwszorzędowe anty-VE-kadherynyAbcamab207732Rozcieńczenie 1:200
Przeciwciało pierwszorzędowe Anti-Zona Occludens-1InVitrogen61-7300Rozcieńczenie 1:200
Normalna surowica koziaSigmaG6767
ProLong Diamond Anti Blaknięcie z DAPIInvitrogen P36962
Ekspresja genów
NucleoSpin Rna/Protein Macherey Nagel KitMacherey-Nagel740,933,250
96 basenik wielopłytkowyBioradHSP9601
iSCRIPTBiorad1708841
Arkusz uszczelniający BioradMSB1001
SsoFast EvaGreen SupermixBiorad172-5201
Ekspresja białka
2x Laemli Sample BufferBiorad161-0737Dodać 50 &mikro; L bMerkaptoetanolu do 950 &mikro; L buforu Laemmli i przechowywać w temperaturze -20°C. Rozcieńczyć w stosunku 1:1 próbką białka do oznaczenia.
Przeciwciało pierwszorzędowe przeciw rakowi piersiAbcamab207732Obróbka wstępna 15 minut w temperaturze pokojowej pod mieszaniem; rozcieńczenie 1:1000, O.N. przy 4° C
Przeciwciało pierwszorzędowe anty-Claudina-5Abcamab15106Obróbka wstępna 5 minut w 95° C; rozcieńczenie 1:1000, O.N. przy 4° C
Transporter antyglukozy 1 przeciwciało pierwszorzędoweMillipore07-1401Obróbka wstępna 5 minut w temperaturze 95° C; rozcieńczenie 1:1000, O.N. przy 4° C
Przeciwciało wtórne anty-myszyDakoP0447Rozcieńczenie 1:5000 w TBS-Tween
Przeciwciało pierwszorzędowe anty-glikoproteinyP GenetexGTX23364Obróbka wstępna 15 minut w RT pod mieszaniem; rozcieńczenie 1:400, 3 godziny w RT
Przeciwciało drugorzędowe anty-królikaDakoP0448Rozcieńczenie 1:8000 w TBS-Tween
Przeciwciało pierwszorzędowe antytransferynyAbcamab84036Obróbka wstępna 5 minut w temperaturze 95& C; rozcieńczenie 1:1000, O.N. przy 4° C
Przeciwciało pierwszorzędowe Anti-Zona occludens-1Abcamab216880Obróbka wstępna 5 minut w 95° C; rozcieńczenie 1:1000, O.N. przy 4° C
Kryterium TGX Gel Biorad5678083
Rozwiązanie ECL PrimeAmersham RPN2236Revelation rozwiązanie do trzymania w ciemności
Koktajl inhibitora fospatazy 2SigmaP5726
Koktajl inhibitorów fospatazy 3SigmaP0044
Inhibitor proteazySigmaP8340
Wzorce białekBiorad161-0373Markery masy cząsteczkowej
RIPA 10xMilipore20-188
TBS 10xBiorad1706435
TRIS-GlycineBiorad1610771
Test1706531
BBB
Sodium FluoresceinAmpresco0681λ ex = 490 nm; λ em= 525 nm   
ElacridarSigmaSML0486GF120918
FITC-Dekstran 20 kDaSigmaFD-20Sλ ex = 490 nm; λ em=  525 nm   
Rodamina 123SigmaR8004i lambda; ex = 501 nm; λ em= 538 nm   
SynergyTM H1 BioTek InstrumentsFluorescencyjny czytnik wielopłytkowy
Nanogel Transport
strzykawkaTerumoSS+01T1mL 
FiltrFisherScientific151614990,2 & mikro; m Filtr membranowy PTFE,
hydrożele na bazie N-izopropylacyloamidu (NIPAM) o średnicy 15 mm   Nanożele (NG) użyte w badaniu zostały dostarczone przez naszego współpracownika z Queen Mary University London, Department of Chemistry. NG są kowalencyjnie znakowane cząsteczką fluorescencyjną (λ ex = 477 nm; λ em = 540 nm). NG są liofilizowane i wysyłane w postaci proszku, w tym stanie są stabilne w temperaturze pokojowej przez długi czas.
integralności 1

Bibliografia

  1. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37, 13-25 (2010).
  2. Profaci, C. P., Munji, R. N., Pulido, R. S., Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease: Important unanswered questions. The Journal of Experimental Medicine. 217 (4), 20190062(2020).
  3. Abbott, N. J. Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery. Journal of Inherited Metabolic Disease. 36 (3), 437-449 (2013).
  4. Kreuter, J. Drug delivery to the central nervous system by polymeric nanoparticles: What do we know. Advanced Drug Delivery Reviews. 71, 2-14 (2014).
  5. Zhang, W., Mehta, A., Tong, Z., Esser, L. L.Advanced science. 8 (10), Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany. 2003937(2021).
  6. Vashist, A., et al. Nanogels as potential drug nanocarriers for CNS drug delivery. Drug Discovery Today. 23 (7), 1436-1443 (2018).
  7. Lombardo, S. M., Schneider, M., Türeli, A. E., Günday Türeli, N. Key for crossing the BBB with nanoparticles: The rational design. Beilstein Journal of Nanotechnology. 11, 866-883 (2020).
  8. Bernardo-Castro, S., et al. Therapeutic nanoparticles for the different phases of ischemic stroke. Life. 11 (6), Basel, Switzerland. 482(2021).
  9. Salinas, Y., Castilla, A. M., Resmini, M. An L-proline based thermoresponsive and pH-switchable nanogel as a drug delivery vehicle. Polymer Chemistry. 9 (17), 2271-2280 (2018).
  10. Liu, P., Pearce, C. M., Anastasiadi, R. M., Resmini, M., Castilla, A. M. Covalently crosslinked nanogels: An NMR study of the effect of monomer reactivity on composition and structure. Polymers. 11 (2), 353(2019).
  11. Preman, N. K., Jain, S., Johnson, R. P. ”Smart” polymer nanogels as pharmaceutical carriers: A versatile platform for programmed delivery and diagnostics. ACS Omega. 6 (8), 5075-5090 (2021).
  12. Cuggino, J. C., Blanco, E. R. O., Gugliotta, L. M., Alvarez Igarzabal, C. I., Calderón, M. Crossing biological barriers with nanogels to improve drug delivery performance. Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. 307, 221-246 (2019).
  13. Basso, J., et al. Hydrogel-based drug delivery nanosystems for the treatment of brain tumors. Gels. 4 (3), Basel, Switzerland. 62(2018).
  14. Harilal, S., et al. Revisiting the blood-brain barrier: A hard nut to crack in the transportation of drug molecules. Brain Research Bulletin. 160, 121-140 (2020).
  15. Papadimitriou, S. A., Robin, M. P., Ceric, D., O'Reilly, R. K., Marino, S., Resmini, M. Fluorescent polymeric nanovehicles for neural stem cell modulation. Nanoscale. 8 (39), 17340-17349 (2016).
  16. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  17. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (8), 650-661 (2007).
  18. Reichel, A., Begley, D. J., Abbott, N. J. An overview of in vitro techniques for blood-brain barrier studies. Methods in Molecular Medicine. 89, 307-324 (2003).
  19. Shimizu, F., et al. Peripheral nerve pericytes modify the blood-nerve barrier function and tight junctional molecules through the secretion of various soluble factors. Journal of Cellular Physiology. 226 (1), 255-266 (2011).
  20. Pedroso, D. C., et al. Improved survival, vascular differentiation and wound healing potential of stem cells co-cultured with endothelial cells. PLoS One. 6 (1), 16114(2011).
  21. Kanda, T., Iwasaki, T., Yamawaki, M., Ikeda, K. Isolation and culture of bovine endothelial cells of endoneurial origin. Journal of Neuroscience Research. 49 (6), 769-777 (1997).
  22. Data sheet on human astrocytes culture. Technical resources from ScienCell. , Available from: https://www.sciencellonline.com/human-astrocytes.html#product_tabs_technicalresources (2021).
  23. Deligne, C., et al. Development of a human in vitro blood-brain tumor barrier model of diffuse intrinsic pontine glioma to better understand the chemoresistance. Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 37(2020).
  24. Cecchelli, R., et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 9 (6), 99733(2014).
  25. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From physiology to disease and back. Physiological Reviews. 99 (1), 21-78 (2019).
  26. Daneman, R., Prat, A. The Blood-Brain Barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), 020412(2015).
  27. Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: Physiology, pathology, and pharmacology. Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).
  28. Heymans, M., Figueiredo, R., Dehouck, L., Francisco, D., Sano, Y., Shimizu, F., Kanda, T., Bruggmann, R., Engelhardt, B., Winter, P., Gosselet, F., Maxime, C. Contribution of brain pericytes in blood-brain barrier formation and maintenance: A transcriptomic study of co-cultured human endothelial cells derived from hematopoietic stem cells. Fluids Barriers CNS. 17, 48(2020).
  29. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
  30. Neuhaus, W. In Vitro Models of the Blood-Brain Barrier. Handbook of Experimental Pharmacology. 265, 75-110 (2021).
  31. Hoheisel, D., Nitz, T., Franke, H., Wegener, J., Hakvoort, A., Tilling, T., Galla, H. J. Hydrocortisone reinforces the blood-brain properties in a serum free cell culture system. Biochemical and Biophysical Research Communications. 247 (2), 312-315 (1998).
  32. Drolez, A., et al. Selection of a relevant in vitro blood-brain barrier model to investigate pro-metastatic features of human breast cancer cell lines. PloS One. 11 (3), 0151155(2016).
  33. Neuhaus, W., Gaiser, F., Mahringer, A., Franz, J., Riethmüller, C., Förster, C. The pivotal role of astrocytes in an in vitro stroke model of the blood-brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 352(2014).
  34. Mysiorek, C., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-α activation protects brain capillary endothelial cells from oxygen-glucose deprivation-induced hyperpermeability in the blood-brain barrier. Current Neurovascular Research. 6 (3), 181-193 (2009).
  35. Culot, M., et al. Cerebrovascular protection as a possible mechanism for the protective effects of NXY-059 in preclinical models: An in vitro study. Brain Research. 1294, 144-152 (2009).
  36. Vandenhaute, E., Drolez, A., Sevin, E., Gosselet, F., Mysiorek, C., Dehouck, M. -P. Adapting co-culture in vitro models of the blood-brain barrier for use in cancer research: Maintaining an appropriate endothelial monolayer for the assessment of transendothelial migration. Laboratory Investigation. 96 (5), 588-598 (2016).
  37. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neuroscience. 12, 40(2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Potrójny system hodowliludzki model komórkowykomórki śródbłonka mózgukokultura pericytów i astrocytówpowlekanie poli-L-lizynąbiałka połączeń ścisłychprzepuszczalność parakomórkowatransport nanogeluinhibitor pompy efflux
System potrójnej hodowli komórkowej modelujący ludzką barierę krew-mózg
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.