Model operacji Rossa u gryzoni: implantacja syngenicznego przeszczepu tętnicy płucnej w pozycji ogólnoustrojowej

Wrodzone zwężenie zastawki aortalnej to podgrupa wrodzonych wad serca charakteryzujących się niedrożnością drogi lewej komory, w której zmiana znajduje się na poziomie zastawkowym. Wada rozwojowa występuje u około 0,04-0,38 na 1000 żywych urodzeń¹.

Dostępne opcje korekty są liczne, a każda z nich ma swoje zalety i wady. Dla pacjentów kwalifikujących się do korekcji dwukomorowej², podejście może być ukierunkowane na naprawę zastawki (przezskórna lub chirurgiczna walwulotomia) lub jej wymianę³. Ta ostatnia jest preferowana, gdy zastawka aortalna jest uważana za nie do uratowania; Jednak dostępne opcje są ograniczone dla pacjentów pediatrycznych. Rzeczywiście, bioprotezy zastawek nie są wskazane do wymiany aorty w młodej populacji ze względu na ich wczesne zwapnienie⁴. Z drugiej strony, zwyrodnienie zastawek mechanicznych jest znacznie wolniejsze, ale wymagają one terapii przeciwzakrzepowej przez całe życie⁵. Ponadto głównym ograniczeniem tych protez jest brak potencjału wzrostu, który predysponuje pacjentów do dodatkowych ponownych interwencji.

Interesującą opcją terapeutyczną w populacji pediatrycznej jest przeniesienie autoprzeszczepu płucnego do pozycji aortalnej o nazwie "operacja Rossa". W takim przypadku zastawka płucna jest następnie zastępowana homoprzeszczepem (Rysunek 1)⁶. Procedura ta może stanowić najlepszy wybór chirurgiczny dla dzieci, ponieważ autoprzeszczep płucny zachowuje swój potencjał wzrostu i nie niesie ze sobą ryzyka związanego z terapią przeciwzakrzepową przez całe życie. Co więcej, procedura Rossa może być bardzo przydatna również u młodych dorosłych, aby uniknąć mechanicznej lub biologicznej zastawki, mając potencjał, aby stać się najlepszym rozwiązaniem chirurgicznym.

Wyniki po wymianie zastawki aortalnej na autoprzeszczep płucny są doskonałe, z przeżyciem większym niż 98% i dobrymi długoterminowymi wynikami⁷. Badania literaturowe wskazują na 93% i 90% brak konieczności wymiany homograftu płucnego odpowiednio w wieku 4 i 12 lat⁸.

Głównym ograniczeniem tej procedury jest tendencja autoprzeszczepu do rozszerzania się w długim okresie, zwłaszcza gdy jest stosowany jako wolnostojący zamiennik korzenia. Może to spowodować niewydolność zastawkową, która może wymagać ponownej interwencji. Rzeczywiście, najdłuższe badanie kontrolne przeprowadzone do tej pory wykazało brak reoperacji w celu wymiany autoprzeszczepu na poziomie 88% po 10 latach i 75% po 20 latach⁹.

Możliwość odtworzenia operacji Rossa w warunkach eksperymentalnych stanowi podstawowy warunek wstępny do zbadania podstawowego mechanizmu adaptacji autoprzeszczepu płucnego do ciśnienia ogólnoustrojowego. W przeszłości zaproponowano kilka modeli. Są one jednak zwykle ograniczone do eksperymentów ex-vivo lub modeli zwierzęcych in vivo ze stosunkowo drogimi dużymi zwierzętami. W tym badaniu staraliśmy się ustalić model implantacji przeszczepu tętnicy płucnej (PAG) u gryzoni w pozycji ogólnoustrojowej, jako korzeń wolnostojący.

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Padwie (OPBA, numer protokołu nr 55/2017) i zatwierdzone przez włoskie Ministerstwo Zdrowia (Autoryzacja nr 700/2018-PR), zgodnie z Dyrektywą Unii Europejskiej 2010/63/UE i włoską ustawą 26/2014 o opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych.

1. Opieka nad zwierzętami i model eksperymentalny

1. Upewnij się, że wszystkie szczury Lewisa pochodzą z jednej firmy (tabela materiałów). Utrzymuj szczury w konwencjonalnych obiektach ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody.
2. Upewnij się, że waga szczurów waha się od 320-400 g dla grupy biorcy i 200-250 g dla grupy dawców.

2. Protokół przedoperacyjny

UWAGA: Wszystkie operacje muszą być wykonywane w czystych warunkach. Użyj samców i samic dorosłych szczurów Lewisa jako biorców i dawców, aby wykonać przeszczep syngeniczny.

1. Wykonać dootrzewnowe wstrzyknięcie tramadolu (5 mg/kg) 15 minut przed zabiegiem.
2. Pojedynczą dawkę gentamycyny należy podać domięśniowo (5 mg/kg) bezpośrednio przed zabiegiem chirurgicznym.
3. W celu indukcji znieczulenia należy dostarczyć 4% sewofluranu w 1 l/min tlenu do komory poli(metakrylanu metylu), w której umieszcza się zwierzę. Do podtrzymania znieczulenia należy stosować 2,0-2,5% sewofluranu w 1 l/min tlenu przez cały czas trwania zabiegu.
4. Ogol zwierzę wzdłuż linii środkowej na szerokość 2 cm od mostka do 1 cm powyżej okolicy narządów płciowych za pomocą brzytwy. Następnie wysterylizuj skórę roztworem jodu.
5. Aby zapobiec zamoczeniu zwierzęcia i zapobiec rozpraszaniu ciepła podczas zabiegu, należy przykryć zwierzę przezroczystą folią z tworzywa sztucznego.
6. Oceń poziom znieczulenia przed wykonaniem zabiegu, oceniając brak reakcji na szkodliwy bodziec.

3. Operacja dawcy

1. Preparat dla zwierząt i serca:
   1. Umieść znieczulone zwierzę na tacy korkowej stroną ogonową skierowaną w stronę chirurga. Wykonaj nacięcie xipho-łonowe o długości około 5-6 cm i cofnij na boki dwa płaty mięśniowo-skórne.
   2. Podać objętość 1 ml roztworu soli fizjologicznej o temperaturze 4 °C zawierającego 500 j.m. heparyny przez żyłę główną jamy brzusznej.
   3. Po 1 minutach przetnij przeponę od lewej do prawej i wykonaj torakotomię przednią, aby odsłonić serce.
   4. Ostudzić bijące serce, skrapiając roztworem soli fizjologicznej o temperaturze 4 °C.
   5. Wykonaj perikardiektomię i tymektomię, aby uzyskać pełny widok łuku aorty. Usuń pozostałe tkanki tłuszczowe otaczające aortę.
   6. Przeciąć na łuku, tuż nad początkiem tętnicy bezimiennej; przeciąć również tę ostatnią.
   7. Przeciąć żyłę główną piersiową dolną (IVC) i wprowadzić kaniulę 22 G, aby wstrzyknąć do serca 20-25 ml roztworu soli fizjologicznej o temperaturze 4 °C, wywierając lekki nacisk. Przerwij perfuzję, gdy serce przestanie bić, a przepływ z aorty stanie się czysty.
2. Eksplantat PAG:
   UWAGA: Dokładne pobranie i delikatne obchodzenie się z PAG jest niezbędne do osiągnięcia optymalnej implantacji u biorcy. Nie dotykaj go bezpośrednio instrumentami, zamiast tego używaj bawełnianych wacików.
   1. Wykonaj badanie ultrasonograficzne, aby ocenić średnicę PA w jej naturalnym położeniu.
   2. Włóż mikroszczypce pod tylną ścianę naczynia i przytnij je za pomocą mikronożyczek jak najbliżej jego rozwidlenia, aby zmaksymalizować długość PAG.
   3. Delikatnie przytrzymaj PA za pomocą mikrokleszczyków z pierścieniem i oddziel go od prawej komory za pomocą nożyczek z mikrosprężyną. Zbierz PAG, w tym trochę mięśnia prawej komory.
3. Przygotowanie PAG:
   1. Umieść PAG na gazie zwilżonej zimną solą fizjologiczną na stole operacyjnym i sprawdź naczynie pod mikroskopem operacyjnym.
   2. Przetnij wszelkie obfite otaczające tkanki, pozostawiając tylko 1 mm mięśnia komorowego. Ustaw długość naczynia na 5 mm.

4. Implantacja przeszczepu tętnicy płucnej (PAG)

1. Przygotowanie zwierzęcia biorcy:
   1. Umieść znieczulone zwierzę na tacy korkowej stroną ogonową skierowaną w stronę chirurga.
   2. Wykonaj środkowe nacięcie podłużne i użyj dwóch mini retraktorów, aby utrzymać brzuch otwarty.
   3. Pobrać jelita za pomocą dwóch wacików i przykryć je gazą nasączoną solą fizjologiczną o temperaturze 39 °C, co pozwala na uwidocznienie obszaru zaotrzewnowego z ekspozycją podnerkowej aorty brzusznej (AA).
      UWAGA: Podczas zabiegu ważne jest, aby od czasu do czasu zwilżać jelita za pomocą strzykawki zawierającej sól fizjologiczną o temperaturze 39 °C, aby zapobiec hipotermii, krytycznemu stanowi powszechnemu u gryzoni
   .
   4. Usuń tylną otrzewną ciemieniową między dwiema tętnicami nerkowymi i rozwidleniem biodrowym za pomocą dwóch bawełnianych wacików i usuń tkankę tłuszczową wokół AA podnerkowego. Pozostawić tylko niewielką porcję tłuszczu powyżej AA, aby ułatwić obsługę na naczyniu.
   5. Oddziel AA od IVC. Aby wykonać tę procedurę, najpierw przełóż zakrzywione kleszcze za tylną ścianą aorty i użyj ich do otwarcia przejścia między AA i IVC. Następnie użyj jedwabnego szwu 2-0, aby utworzyć pętlę wokół AA, aby podnieść naczynie i oddzielić AA od IVC. Podwiązać dowolną tętnicę lędźwiową wychodzącą z podnerkowej AA za pomocą jedwabnego szwu 6/0 i podzielić ją.
   6. Obróć zwierzę o 90° w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, kładąc głowę po lewej stronie operatora. AA leżało teraz poziomo w mikroskopijnym polu.
   7. Użyj dwóch klipsów Yasargil, aby zacisnąć podnerkowe AA i umieść je w odległości 1,5 cm od siebie. Przetransektuj AA w środku między dwoma klipami.
   8. Przepłukać dwa końce naczyń heparyną (1 UI/ml) w roztworze soli fizjologicznej, aby usunąć wszelkie skrzepy. Usuń wszelkie zanieczyszczenia przypadkowe z naczyń.
2. Implantacja PAG:
   1. Umieść PAG między dwoma końcami, tak aby koniec komory był skierowany w stronę części czaszki zwierzęcia.
   2. Użyj nici polipropylenowej 10-0, aby wykonać dwa charakterystyczne pojedyncze szwy łączące PG z AA. Zabieg należy wykonać na obu końcach PAG, zakładając szew po przeciwnych stronach obwodu naczynia.
   3. Wykonaj zespolenie end-to-end między PAG i AA, zaczynając od dystalnego końca. Użyj jednego z dwóch końców dystalnego szwu punktu orientacyjnego do zespolenia tylnego, używając sekwencji od biorcy do przeszczepu od wewnątrz/do przeszczepu, aby wykonać szew biegnący składający się z około sześciu szwów.
   4. Gdy szew dotrze do bliższego punktu orientacyjnego, wykonaj podwójny półzaczep zakończony kwadratowym węzłem za pomocą szwu i jednego z dwóch końców proksymalnego szwu punktu orientacyjnego. Zastosuj gumowe kleszczyki do komarów do szwów, aby zapewnić przyczepność.
   5. Wykonaj to samo zespolenie na przedniej ścianie. Całą procedurę należy przeprowadzić na bliższym końcu PAG. Zachowaj szczególną ostrożność podczas wykonywania zespolenia proksymalnego, aby uniknąć włączenia jakiejkolwiek ulotki do linii szwów.
   6. Najpierw zwolnij dystalny zacisk, aby PAG został wypełniony krwią wsteczną (przepływ pod niskim ciśnieniem) w celu sprawdzenia zespolenia. Napraw wyciek krwi za pomocą jednego szwu. Po ocenie zespolenia dystalnego należy wykonać tę samą procedurę na bliższym końcu.
3. Końcowe etapy operacji na biorcy:
   1. Oceń drożność PAG i nałóż dwa paski gąbki żelatynowej na linie szwów po obu stronach PAG (jeśli to konieczne). Wywieraj delikatny nacisk przez kilka sekund za pomocą dwóch bawełnianych wacików, aby wspomóc hemostazę.
   2. Przenieś jelita do jamy brzusznej i zamknij ściany polipropylenowym szwem biegowym 4/0.

5. Procedura pozorowana

1. Wykonać identyczne przygotowanie zwierzęcia, jak wcześniej zilustrowane dla szczurów biorców.
2. Przeciąć podnerkowe AA, w połowie drogi między nerką a początkiem tętnic biodrowych.
3. Ponownie przybliżyć dwa końce AA za pomocą zespolenia typu end-to-end, jak opisano wcześniej. Usuń dwa klipsy i wykonaj dokładną procedurę hemostazy.
4. Zmień położenie jelit i zamknij ścianę brzucha warstwami, tak jak w przypadku zwierząt biorców.

6. Opieka pooperacyjna i obserwacja

1. Podawać ciepły roztwór soli fizjologicznej (5 ml) do tkanki podskórnej grzbietu zwierzęcia w celu nawodnienia. Umieść szczura pod lampą grzewczą i monitoruj go wizualnie aż do przebudzenia, które zwykle trwa do 5 minut po zatrzymaniu znieczulenia. Umieścić zwierzę w klatce o temperaturze pokojowej 22–24 °C, z natychmiastowym i nieograniczonym dostępem do pożywienia i wody.
2. Tramadol (5 mg/kg) należy podawać domięśniowo w celu znieczulenia pooperacyjnego dwa razy dziennie przez pierwsze 48 godzin po zabiegu. Następnie należy codziennie i regularnie monitorować stan zdrowia i masę ciała biorcy.
3. Obserwacja: Podczas obserwacji należy wykonać seryjne badania ultrasonograficzne po tygodniu, miesiącu i dwóch miesiącach, aby ocenić funkcję PAG. Podczas tych badań zmierz średnicę naczynia, szczytową prędkość skurczową (PSV) i prędkość końcoworozkurczową. Zmierz te parametry wewnątrz PAG oraz na poziomie proksymalnego i dystalnego AA.
4. Po dwóch miesiącach obserwacji należy poddać zwierzęta eutanazji poprzez zastosowanie CO₂ przez kilka minut, a następnie eksplantację PAG, która zostanie poddana analizie histopatologicznej.

Łącznie 39 dorosłych szczurów rasy Lewis zostało włączonych do tego badania: 17 zwierząt wykorzystano jako dawców PAG, 17 zwierząt jako biorców i 5 jako pozorowanych (grupa kontrolna) (Tabela 1). Samce szczurów stanowiły 22 (56%), a samice 17 (44%); Te ostatnie były używane tylko w grupie dawców.

Podczas operacji nie wystąpiło żadne zdarzenie śmiertelne ze 100% przeżyciem. Podczas obserwacji dwa zwierzęta z grupy przeszczepionej zakończyły się zgonem, odpowiednio po 12 i 51 dniach; wskaźnik przeżycia na koniec badania wynosił 91% (Tabela 1).

Mediana wagi szczurów wynosiła 387 g (przedział międzykwartylowy, IQR, 358-394 g) dla grupy biorcy i 328 g (IQR=304-337 g) dla grupy dawców. Po tygodniu od zabiegu mediana masy ciała wynosiła 363 g (IQR=350-376 g) z 6% spadkiem w porównaniu z masą sprzed operacji. Zwierzęta odzyskały swoją wagę w ciągu pierwszego miesiąca obserwacji (mediana 387 g, IQR 369-392 g), a końcowa waga po dwóch miesiącach wynosiła 397 g (IQR=391-402 g) (Rysunek 2).

Mediana czasu obserwacji wynosiła 62,5 dnia (IQR=60-68 dni) w grupie po przeszczepie i 62 dni (IQR=61-67 dni) w grupie pozorowanej (p=0,68).

Przedoperacyjna mediana średnicy PA w jej rodzimym położeniu wynosiła 3,20 mm (IQR=3,18-3,23 mm). Mediana średnicy PAG wynosiła 4,03 mm (IQR=3,74-4,13 mm) po jednym tygodniu, 4,07 mm (IQR=3,80-4,28 mm) po miesiącu i 4,27 mm (IQR=3,90-4,35 mm) po dwóch miesiącach (Rysunek 3A). Był to wzrost odpowiednio o 25,9%, 27,2% i 33,5% w porównaniu ze średnicą w pozycji rodzimej. Wzrost średnicy był istotnie różny przy porównaniu wartości w pozycji natywnej i wartości w jednym tygodniu (p=0,003), natomiast w kolejnych badaniach nie stwierdzono istotnego wzrostu. Średnica aorty w grupie pozorowanej wynosiła 1,41 mm (IQR=1,35-1,62 mm) po tygodniu i 1,41 mm (IQR=1,29-1,70 mm) po dwóch miesiącach. Mediana PSV na poziomie PAG wynosiła 220,07 mm/s (IQR=210,43-246,41 mm/s) po tygodniu, 430,88 mm/s (IQR=375,28-495,56 mm/s) po miesiącu i 373,68 mm/s (IQR=305,78-429,81 mm/s) po dwóch miesiącach. W porównaniu z grupą pozorowaną stwierdzono istotną różnicę w PSV po jednym tygodniu (mediana 419,12 mm/s, IQR=408,42-561,32 mm/s; p<0,001), podczas gdy pod koniec badania nie stwierdzono żadnej różnicy (392,92 mm/s, IQR=305,89-514,27 mm/s; p=0,5) (Ryc. 3B).

Pod koniec badania analiza histologiczna nie wykazała żadnych oznak zakrzepicy śródbłonka, a zwapnienie ścian nie było znaczące w większości przypadków (Rysunek 4).

Rysunek 1: Reprezentatywny obraz operacji Rossa. Na zdjęciu widać fazy operacji Rossa. (A) Eksplantat zastawki aortalnej i korzenia; (B) Transpozycja autoprzeszczepu tętnicy płucnej w pozycji aortalnej; (C) Wymiana autoprzeszczepu tętnicy płucnej na homograft. A: zastawka aortalna i korzeń; H: homoprzeszczep; P: zastawka płucna i korzeń. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przebieg czasowy masy ciała w grupie po przeszczepie. Wykres przedstawia przebieg w czasie masy ciała szczura w grupie przeszczepionej. Wartości są wyrażone jako mediana i przedział międzykwartylowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Zmiana średnicy i szczytowej prędkości skurczowej w przeszczepie tętnicy płucnej. Wykresy pokazują zmianę średnicy (A) i szczytowej prędkości skurczowej (B) wewnątrz przeszczepu tętnicy płucnej podczas seryjnych ocen ultrasonograficznych. Wartości są wyrażone jako mediana i przedział międzykwartylowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Mikroskopowa ocena PAG. Zdjęcie przedstawia PAG po eksplantacji (A). B) ocena radiograficzna; (C) Barwienie hematoksyliną i eozyną, oryginalne powiększenie 12,5x. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Charakterystyka i wyniki badania. *Wartości są wyrażone jako mediana i przedział międzykwartylowy.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.