Masowa produkcja grzybów entomopatogenicznych, Metarhizium robertsii i Metarhizium pinghaense, do komercyjnego stosowania przeciwko szkodnikom owadzim

Summary

Grzyby entomopatogeniczne zyskały na znaczeniu jako środki biologicznej kontroli szkodników rolniczych. W tym badaniu z powodzeniem przeprowadzono masową produkcję wystarczającej liczby odpornych zakaźnych propagul południowoafrykańskich izolatów zarówno Metarhizium robertsii, jak i M. pinghaense do komercyjnego stosowania przeciwko szkodnikom owadzim, przy użyciu rolnych produktów zbożowych.

Abstract

Entomopatogeniczne grzyby z kompleksu gatunków Metarhizium anisopliae zyskały na znaczeniu jako środki biologicznej kontroli szkodników rolniczych. Wzrost odporności szkodników na chemiczne środki owadobójcze, rosnące obawy dotyczące negatywnego wpływu insektycydów na zdrowie ludzi oraz zanieczyszczenie środowiska pestycydami doprowadziły do globalnego dążenia do znalezienia nowych, zrównoważonych strategii ochrony upraw i zwalczania szkodników. Wcześniej prowadzono próby masowej hodowli takich gatunków grzybów entomopatogenicznych (EPF) jak Beauveria bassiana. Jednak przeprowadzono tylko ograniczone próby masowej hodowli Metarhizium robertsii i M. pinghaense do stosowania przeciwko szkodnikom owadzim. Badanie to miało na celu masową produkcję wystarczającej liczby odpornych zakaźnych rozprzestrzeniania się południowoafrykańskich izolatów M. robertsii i M. pinghaense do zastosowań komercyjnych. Jako stałe substraty fermentacyjne EPF użyto trzech rolnych produktów zbożowych, płatków owsianych, płatków jęczmiennych i ryżu. Do inokulacji substratów stałych zastosowano dwie metody inokulacji, zawiesiny konidialne i płynną kulturę grzybów blastospor. Zaobserwowano, że inokulacja za pomocą zawiesin konidialnych jest stosunkowo mniej skuteczna, ponieważ zaobserwowano zwiększone poziomy zanieczyszczenia na substratach stałych w porównaniu z metodą inokulacji blastospor. Stwierdzono, że płatki owsiane nie są odpowiednim substratem wzrostowym zarówno dla M. robertsii, jak i M. pinghaense, ponieważ z podłoża nie zebrano suchych konidiów. Stwierdzono, że płatki jęczmienne faworyzują produkcję konidiów M. robertsii w stosunku do M. pinghaense, a z podłoża zebrano średnio 1,83 g ± 1,47 g suchych konidiów M. robertsii i zero gramów konidów M. pinghaense. Stwierdzono, że ziarna ryżu sprzyjają masowej produkcji konidialnej zarówno izolatów M. pinghaense, jak i M. robertsii, przy czym średnio 8,2 g ± 4,38 g i 6 g ± 2 g zebrano z podłoża.

Introduction

Grzyby entomopatogeniczne (EPF) zyskały na znaczeniu jako środki ochrony roślin w biologicznej kontroli ważnych szkodników rolniczych owadów^1,2. Entomopatogeny, które występują naturalnie w glebie, powodują epizootię w populacjach różnych gatunków szkodników³. Gatunki EPF są specyficzne dla żywiciela i stwarzają stosunkowo niewielkie ryzyko pod względem atakowania gatunków niedocelowych i są nietoksyczne dla środowiska⁴. EPF mają unikalny mechanizm inwazji na swojego gospodarza, a także do rozprzestrzeniania się i utrzymywania się w jego najbliższym otoczeniu¹. Atakują żywiciela głównie poprzez bezpłciowe zarodniki, które przyczepiają się do naskórka gospodarza i wnikają w niego, aby zaatakować i namnażać się w hemocle gospodarza. Gospodarz ostatecznie umiera z powodu wyczerpania składników odżywczych hemolimfy lub w wyniku toksemii spowodowanej toksycznymi metabolitami uwalnianymi przez grzyba. Po śmierci, w idealnych warunkach środowiskowych, grzyb pojawia się na zewnętrznej powierzchni (jawna grzybica) zwłok żywiciela^5,6.

Rosnące obawy dotyczące negatywnego wpływu pozostałości chemicznych na zdrowie ludzkie, zanieczyszczenie środowiska i rozwój odporności na szkodniki doprowadziły do globalnego dążenia do zmniejszenia ilości chemicznych środków owadobójczych oraz znalezienia alternatywnych, nowatorskich i zrównoważonych strategii ochrony upraw i zwalczania szkodników6^,7,8. Stworzyło to możliwości opracowania insektycydów na bazie mikroorganizmów do stosowania w programach integrowanej ochrony przed szkodnikami (IPM), które są bardziej ekologicznie korzystne niż konwencjonalna kontrola chemiczna^3,8.

Aby opracować skuteczny środek kontroli mikrobiologicznej szkodnika rolniczego, należy najpierw wyizolować odpowiedni organizm, scharakteryzować, zidentyfikować i potwierdzić jego chorobotwórczość dla docelowego szkodnika. Jednak do wytworzenia opłacalnego produktu do stosowania w programach kontroli biologicznej potrzebna jest łatwa, opłacalna metoda produkcji czynnika mikrobiologicznego na dużą skalę^{9,10,11,12,13}. Masowa produkcja znacznych ilości dobrej jakości entomopatogenów zależy od szczepu drobnoustrojów, środowiska, docelowego szkodnika, formulacji, rynku, strategii stosowania i pożądanego produktu końcowego^14,15,16. EPF może być produkowany masowo przy użyciu fermentacji płynnego substratu w celu wytworzenia blastospor lub procesu fermentacji substratu stałego w celu wytworzenia konidii powietrznych^6,17,18. Jednak masowa produkcja i proces formulacji entomopatogenów ma bezpośredni wpływ na zjadliwość, koszt, okres przydatności do spożycia i skuteczność polową produktu końcowego. Aby skutecznie stosować je w IPM, proces produkcji entomopatogenów musi być łatwy do przeprowadzenia, wymagać minimalnego nakładu pracy, wytwarzać wysokowydajne stężenie zjadliwych, żywotnych i trwałych propagul oraz być niskokosztowy^4,13,14,16.

Zrozumienie wymagań żywieniowych entomopatogenów jest ważne dla masowej uprawy wszystkimi metodami hodowli^4,12. Składniki odżywcze pożywki produkcyjnej mają znaczący wpływ na atrybuty powstających propagul, w tym skuteczność kontroli biologicznej, plon, tolerancję na wysuszenie i trwałość^8,19,20,21. Optymalizacja procesów produkcyjnych ma na celu uwzględnienie takich czynników²². W przypadku EPF głównymi wymaganiami dobrego wzrostu, zarodnikowania i masowej produkcji konidiów grzybowych są odpowiednia wilgotność, optymalna temperatura wzrostu, pH, wymiana gazowa CO₂ i O₂ oraz odżywianie, w tym dobre źródła fosforu, węglowodanów, węgla i azotu¹⁸.

Jaronski i Jackson¹⁸ opisują metodę fermentacji substratu stałego jako najbardziej efektywną i najbardziej zbliżoną do naturalnego procesu produkcji EPF w stosunku do metody fermentacji płynnego substratu, ponieważ w warunkach naturalnych konidium grzybowe jest przenoszone na solidnych, wyprostowanych strukturach, takich jak powierzchnia zwłok owadów. Produkty rolne i produkty uboczne zawierające skrobię są najczęściej wykorzystywane do masowej produkcji grzybów hypokrealei, ponieważ grzyby łatwo rozkładają skrobię poprzez wydzielanie wysoce skoncentrowanych enzymów hydrolitycznych z ich strzępek, aby przeniknąć do substancji stałej i uzyskać dostęp do składników odżywczych obecnych w substancji^11,17,18,23. Produkty zbożowe spełniają również wymagania dotyczące zdrowej produkcji biomasy, ponieważ po uwodnieniu i sterylizacji substraty mogą wchłaniać dalsze składniki odżywcze z dowolnego płynnego podłoża^16,18,24.

Wcześniej, kilka badań próbowało masowo hodować gatunki EPF, takie jak Beauveria bassiana (Bals.) Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas i niektóre z Metarhizium anisopliae (Metschn.) Kompleks gatunków Sorokin izoluje na różnych podłożach^16,23,24. Do takich masowo produkowanych i komercyjnie opracowywanych izolatów należą: Green Muscle^® (szczep IMI 330189), opracowany z M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner) J.F. Bisch, Rehner & Humber, Metarhizium 69 (szczep Meta 69 ICIPE69) i Real Metarhizium 69 (L9281), opracowany z M. anisopliae, oraz Broadband^® (szczep PPRI 5339) i Eco-Bb^®, opracowany z B. bassiana^{25, 26}. Podjęto jednak ograniczone próby masowej hodowli Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner & Humber oraz Metarhizium pinghaense Chen & Guo. Te dwa izolaty zostały wybrane w poprzednim badaniu jako najskuteczniejsze do zwalczania wełnowca, Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)²⁷. W związku z tym obecne badanie miało na celu sformułowanie i masową produkcję wystarczającej liczby odpornych zakaźnych propagul lokalnych izolatów M. robertsii i M. pinghaense do komercyjnego zastosowania przeciwko szkodnikom owadzim. Do masowej produkcji konidiów grzybowych dla obu izolatów EPF zastosowano metodę fermentacji substratu stałego. Do inokulacji substratów stałych zastosowano dwie metody inokulacji EPF, wykorzystujące zawiesiny konidialne i płynną kulturę grzybów blastospor.

Protocol

1. Źródło szczepów grzybów

1. Należy użyć wyizolowanych południowoafrykańskich szczepów grzybów zarówno M. pinghaense 5 HEID (numer dostępu do GenBank: MT367414/MT895630), jak i M. robertsii 6EIKEN (MT378171/MT380849), zebranych z sadów jabłoniowych w prowincji Western Cape w Republice Południowej Afryki.
2. Hoduj kultury każdego izolatu EPF na 60 g pożywki z dekstrozą Sabouraud i agaru, uzupełnionym 1 g ekstraktu drożdżowego (SDAY) i 10 μl streptomycyny.
   UWAGA: Inkubować kultury EPF w kontrolowanej temperaturze ± 25 °C w ciemności.

2. Inokulacja zawiesiny konidialnej Metarhizium pinghaense i M. robertsii

1. Przygotowanie podłoży stałych
   1. Użyć dwóch produktów rolnych, a mianowicie płatków owsianych i płatkowanego jęczmienia, jako pożywek wzrostowych dla dwóch izolatów EPF i worków do autoklawu (305 mm × 660 mm) jako worków fermentacyjnych.
   2. Użyj małej rurki odpływowej z polichlorku winylu (1000 mm × 50 mm), aby utworzyć szyjkę dla worka fermentacyjnego na otwartym końcu worka autoklawu i użyj taśmy autoklawu, aby przymocować rurkę do worka.
   3. Zamknij rurkę sterylną zatyczką z waty, aby umożliwić wystarczającą wymianę gazu podczas fermentacji.
   4. Zważyć suche ziarna (200 g) zarówno płatków owsianych, jak i płatków jęczmiennych i umieścić je w workach fermentacyjnych, a do każdej torebki dodać 100 ml wody destylowanej i dokładnie wymieszać zawartość worków.
   5. Pozostaw mokre ziarna na 15-30 minut, aby wchłonęły wilgoć przed autoklawowaniem i sterylizacją. Przygotuj sześć worków dla każdego rodzaju ziarna i aby zapobiec zanieczyszczeniu, umieść worki w innych workach autoklawu i autoklaw substratów w temperaturze 121 °C przez 55 minut.
2. Przygotowanie inokulum zawiesiny konidialnej
   1. Zbierz 2-3-tygodniowe konidia grzybowe z kultur grzybów zarówno M. pinghaense, jak i M. robertsii, skrobając je za pomocą sterylnego ostrza chirurgicznego.
   2. Zebrane konidia grzybowe zawiesić w 20 ml sterylnej wody destylowanej, uzupełnionej 0,05% Tween 20 i mieszać zawiesiny konidiów przez 2 minuty.
   3. Przygotować 20 ml zawiesiny konidialnej o stężeniu 1 × 10⁷ konidiów/ml i zaszczepić odpowiednio płatki owsiane i płatki jęczmienne substratów stałych.
      UWAGA: Użyj hemocytometru, aby określić stężenia konidialne.
3. Inokulacja substratów stałych
   1. Otwórz każdą torebkę, wyjmując zatyczki z waty bawełnianej, a następnie dodaj przygotowaną 20 ml zawiesinę konidialną do schłodzonego substratu w autoklawie.
   2. Ponownie zamknij worki za pomocą zatyczek na szyję i masuj zawartość worka, aby inokulum grzybów równomiernie wymieszało się z podłożem ziarnistym.
   3. Inkubować worki fermentacyjne w kontrolowanej temperaturze ± 25 °C i zapewnić wystarczającą wymianę gazową między kulturą a środowiskiem.
      UWAGA: Ta procedura musi być przeprowadzana w komorze z przepływem laminarnym.
4. Faza fermentacji
   1. Ręcznie wmasuj substraty zbożowe w workach fermentacyjnych 2 dni po inokulacji i inkubacji, kiedy nastąpi widoczny wzrost grzybni i substrat zaczął być zbrylany przez rosnący grzyb.
      UWAGA: Odbywa się to w celu wymieszania zaszczepionych granulek, aby umożliwić rozgałęzienie grzybni podczas pierwszych wczesnych etapów wegetatywnego wzrostu grzybów.
   2. Użyj kuchennego wałka do ciasta, aby manipulować łożem podłoża, aby uniknąć fizycznej niejednorodności łoża podłoża ziarnistego i grubości łoża masy podłoża.
      UWAGA: Proces ten wspomaga metabolizm grzybów, co optymalizuje produkcję zarodników grzybów i maksymalizuje powierzchnię, promując plon konidiów¹⁸.
   3. Pozostaw proces fermentacji do 4-5 tygodni i sprawdzaj worki fermentacyjne co 2 dni pod kątem obecności białego przerostu wegetatywnego, który może rozwinąć się podczas procesu fermentacji, co może znacznie wpłynąć na plon konidiów grzybowych.
      UWAGA: Natychmiast zakończ fermentację w workach fermentacyjnych zawierających biały przerost wegetatywny i wysusz kultury grzybów¹⁸.

3. Inokulacja Blastospore

1. Produkcja i inokulacja blastospore
   1. Przygotować płynną pożywkę hodowlaną, zawierającą 1 l wody destylowanej, 30 g glukozy, 20 g ekstraktu drożdżowego, 4 g diazasadu fosforanu potasu (_K2HPO4), 15 ml ługu kukurydzianego i 10 μg/ml antybiotyku Streptomycyny, zarówno dla M. pinghaense, jak i M. robertsii.
   2. Najpierw podgrzej wodę destylowaną, wyłącz ją przed osiągnięciem temperatury wrzenia i dodaj każdy ze składników, z wyjątkiem Streptomycyny, do gorącej wody w garnku. Doprowadź podłoże do delikatnego wrzenia przez 3-4 minuty i ciągle mieszaj podłoże, aby umożliwić prawidłowe wymieszanie składników i zapobiec osadzaniu się niektórych składników na dnie garnka.
   3. Wlej w sumie 100 ml pożywki do dziewięciu różnych kolb o pojemności 250 ml i umieść wacik na każdej kolbie, a następnie przykryj watę folią aluminiową jako korkiem (Rysunek 1A).
   4. Podłoże w autoklawie należy umieszczać w kolbach przez 55 minut w temperaturze 121 °C. Po autoklawowaniu pozwól pożywce w kolbach ostygnąć i dodaj 10 mg/ml streptomycyny do pożywki w każdej kolbie (Rysunek 1B).
   5. Zebrać dwie do trzech pętli bakteryjnych konidiów grzybów z 2-3-tygodniowych płytek do hodowli grzybów dla obu izolatów EPF, M. pinghaense i M. robertsii, i przenieść do każdej 100 ml płynnej pożywki w kolbach o pojemności 250 ml w sterylnych warunkach i zamknąć kolby.
   6. Inkubować płynne kolby hodowlane w temperaturze ± 25 °C, na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min przez 3 dni i przerwać inkubację, gdy kultury wykazują oznaki wysokiego zmętnienia ze wzrostem blastospor grzybów (Rysunek 1C).
   7. W celu wykrycia ewentualnego zanieczyszczenia bakteryjnego z kultur, należy pobrać 100 μl próbki z każdej płynnej kolby hodowlanej po 24 godzinach podczas inkubacji i umieścić ją na trzech płytkach SDA na izolat. Inkubować płytki przez 48 godzin, w kontrolowanej temperaturze ± 25 °C.
2. Przygotowanie podłoża stałego
   1. Użyj parzonego białego ryżu długoziarnistego jako stałego podłoża substratowego dla blastospor zarówno M. pinghaense, jak i M. robertsii (zaadaptowane z Jaronski and Jackson¹⁸).
   2. Przygotuj worki fermentacyjne zgodnie z powyższymi opisami, w krokach 2.1.1-2.1.3, a do każdej torebki dodaj 1 kg ryżu i 300 ml sterylnej wody destylowanej.
   3. Delikatnie wymieszać zawartość worków fermentacyjnych i umieścić w zewnętrznych workach autoklawu w pozycji pionowej i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 55 minut. Po autoklawowaniu pozostaw substraty do ostygnięcia przez ± 45 minut w sterylnych warunkach.
3. Inokulacja i fermentacja
   1. Usunąć zamknięcie każdej z płynnych kolb hodowlanych zarówno M. pinghaense, jak i M. robertsii pod wpływem przepływu laminarnego i palić brzeg każdej kolby przez 10 s.
   2. Wlej 100 ml płynnych kultur do worków fermentacyjnych, usuwając zatyczki z waty z ich szyjek (Rysunek 2). Umieść bawełniane zatyczki z powrotem na miejscu i przykryj górną część szyi torby papierem chirurgicznym zabezpieczonym gumką recepturką.
      UWAGA: Określ stężenie blastospor dla każdej kolby za pomocą hemocytometru i użyj stężeń blastospor 1 × 10⁷ - 5 × 10⁸ blastospor/ml do inokulacji substratów²⁸.
   3. Przekręć górną część worka i wymieszaj zawartość worka, potrząsając i lekko manipulując podłożem przez masaż, a następnie inkubuj worki w temperaturze ± 25 °C, spłaszczając podłoże w workach, aby zapobiec tworzeniu się grubych łóżek¹⁸.
   4. Rozbij substrat w workach fermentacyjnych przez masowanie zawartości worków, 2-3 dni po inokulacji i inkubacji, kiedy nastąpił widoczny wzrost grzybni i związanie substratu przez grzyba (zaadaptowane z techniki Jaronskiego i Jacksona¹⁸).
      UWAGA: Pozwól fermentacji kontynuować przez 4 tygodnie.

Rysunek 1: Płynna pożywka hodowlana w kolbach o pojemności 250 ml. (A) Przed sterylizacją w autoklawie. (B) Po autoklawie i zaszczepieniu zarodnikami EPF. (C) Mętne podłoże z blastosporami grzybów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przygotowana płynna pożywka do hodowli blastospor. A) Metarhizium robertsii i B) Metarhizium pinghaense przed inokulacją ryżu jako stałego substratu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Suszenie kultur grzybów

1. Suszyć kultury grzybów przez 10-12 dni po fermentacji, przed ich użyciem w próbach, przenosząc zarodnikowane kultury do brązowych worków papierowych o wadze 26-30 kg (30 x 43 x 15250 cm³).
2. Aby poprawić wytrzymałość na rozciąganie toreb papierowych, odetnij poziomo jedną trzecią górnej części każdej torby i wyłóż spód torby (Rysunek 3A, B).

Rysunek 3: Przygotowanie torebek papierowych, proces suszenia kultur i pakowanie. (A,B) Przygotowanie brązowych toreb papierowych. Procedura suszenia kultur gatunków Metarhizium uprawianych na (C,E) ryżu parboiled i (D,F) płatkowanym jęczmieniu. (G) Torby papierowe zamykane zszywkami w celu stworzenia trójkątnej konstrukcji namiotu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Delikatnie rozdrobnij substrat w każdym worku fermentacyjnym, odetnij róg każdej torebki i przenieś całą kulturę do papierowych torebek przez przestrzeń pozostawioną przez odcięty róg (Rysunek 3C-F). Aby uniknąć nadmiernej ucieczki zarodników grzybów do powietrza, wykonuj ten proces powoli.
   UWAGA: Przeprowadź ten proces w sterylnych warunkach, przy użyciu przepływu laminarnego, aby uniknąć zanieczyszczenia.
4. Oznacz każdą papierową torbę i złóż dwukrotnie górny koniec każdej torby i zamknij zszywkami, aby stworzyć trójkątną konstrukcję namiotu, a następnie umieść torby na drucianych stojakach do suszenia, aby umożliwić właściwe, równomierne suszenie, w kontrolowanej temperaturze ± 25 °C i niskiej wilgotności 30-40%.
5. Codziennie obracaj worki, aby umożliwić równomierne wysuszenie kultur i uniknąć ponownego wzrostu wegetatywnego, który mógłby mieć miejsce, co obniżyłoby wydajność zarodników grzybów nadających się do zbioru.
6. Zważyć każdy worek do suszenia co 2 dni podczas procesu suszenia i kontynuować proces suszenia dla każdej torby, aż zaobserwuje się niewielką lub żadną zmianę masy worków między kolejnymi dniami.

5. Zbiór konidiów grzybowych

1. Konidia grzybowe zbiera się mechanicznie z kultur za pomocą trzech sitek zagnieżdżonych, sita testowego (ETS) o oczkach nr 35 (o aperturze 500 μm), zagnieżdżonych na sicie testowym (o aperturze 212 μm), zagnieżdżonych na siatce ETS nr 100 (o aperturze 150 μm), zamontowanych na szalce zbiorczej.
2. Powoli załadować próbkę suchej kultury na sito ETS nr 35 i przykryć sito pokrywką, aby zapobiec uwalnianiu konidiów grzybowych do powietrza.
3. Dodaj 10-12 szklanych kulek do sit, aby wspomóc przejście konidiów grzybowych przez sita siatkowe i uniknąć zatrzymywania konidiów w sicie, co może skutkować zmniejszonym odzyskiwaniem zarodników.
4. Zaklej taśmą i uszczelnij połączenia sita za pomocą taśmy elektrycznej, aby zapobiec wydostawaniu się pyłu konidialnego.
5. Umieść sita na wytrząsarce wibracyjnej, wyposażonej w lepką podkładkę, aby zabezpieczyć miskę zbiorczą i sita na 20-25 minut, przy ruchu 560-640 drgań na minutę (Rysunek 4).
   UWAGA: Technika zaczerpnięta z Jaronskiego i Jacksona¹⁸.

Rysunek 4: Zbieranie zarodników grzybów z suszonych kultur Metarhizium robertsii na ryżu i płatkach jęczmiennych. (A) 10-12 szklanych kulek dodanych do sit, aby ułatwić przejście konidiów grzybowych przez sita siatkowe. Konidia M. robertsii zbierane z kultur na (B) ryżu i (C) słabo płatkowanym. (D) Sita na wytrząsarce wibracyjnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Wyjmij sita testowe z miski zbiorczej, zbierz konidia i przechowuj zebrane konidia w hermetycznych i nieprzepuszczalnych dla wody workach z zamkiem błyskawicznym do długotrwałego przechowywania (3-6 miesięcy).

6. Kwantyfikacja wytworzonych konidiów grzybowych

1. Zmierzyć i zapisać masę każdego substratu ziarnowego przed zbiorem konidiów grzybowych z każdego podłoża.
2. Zmierz całkowitą masę zebranych konidiów, odejmując masę zebranych zarodników od masy stałego podłoża.
   UWAGA: Całkowity plon konidiów obejmuje nie tylko zebrane konidia, ale także konidia grzybowe pozostawione na podłożu stałym.
3. Zważyć podłoże i usunąć 10 g z ważonego podłoża. Zawiesić 10 g substratu w 0,05% Tween 20 i rozcieńczyć w 10 ml sterylnej wody destylowanej.
4. Mieszaj zawiesinę wirowo przez 2 minuty i użyj hemocytometru, aby zliczyć zarodniki, aby określić liczbę konidiów wypłukanych z podłoża.
5. Przeprowadzić dalsze rozcieńczenia, przenosząc 1000 ml 10 ml przemytej zawiesiny konidialnej do 9 ml sterylnej wody destylowanej w celu uzupełnienia 10 ml zawiesiny do rozcieńczania.
6. Mieszaj zawiesiny konidialne przez 2 minuty i oznacz stężenia konidiów.
   UWAGA: Postępuj zgodnie z procedurą i wzorem opisanym przez Inglisa, Enkerli i Goettel³⁰, aby określić stężenie konidialne zawiesin.
7. Zebrać i zawiesić łącznie 0,1 g zebranego proszku konidialnego z każdej kultury w 10 ml sterylnej wody destylowanej uzupełnionej 0,05% Tween 20 i mieszać wirowo zawiesinę konidialną przez 2 minuty i określić stężenie konidiów za pomocą hemocytometru.
8. Przeprowadzić dalsze rozcieńczenia, przenosząc 1000 ml 10 ml zawiesiny konidialnej do 9 ml sterylnej wody destylowanej w celu uzupełnienia 10 ml rozcieńczonej zawiesiny.
9. Mieszaj wirowo zawiesiny konidiów przez 2 minuty, obliczaj stężenia konidiów i określaj liczbę konidiów na gram.
10. Pomnóż liczbę konidiów na gram zebranego proszku przez początkową masę zebranego proszku konidialnego. Pomnóż liczbę konidiów wypłukanych z podłoża przez całkowitą masę zużytego substratu, będącego substratem, z którego konidia zostały zebrane.
11. Dodaj do siebie dwie podane wartości i podziel przez początkową suchą masę podłoża, aby obliczyć liczbę konidiów na kg lub g substratu¹⁸.
    UWAGA: Obliczenia zostały wykonane głównie dla podłoża ryżowego. Test kiełkowania lub żywotności konidiów przeprowadzono zarówno dla izolatów M. pinghaense, jak i M. robertsii w celu określenia żywotności wyprodukowanych konidiów.

7. Analiza danych

1. Za pomocą odpowiedniego programu komputerowego należy przeprowadzić analizę statystyczną uzyskanych wyników.
   UWAGA: Analizę statystyczną danych przeprowadzono przy użyciu programu STATISTICA w wersji 13.5.0.17.

Results

Spadek masy zawartości kultur na ryżu zarówno dla M. pinghaense, jak i M. robertsii został zaobserwowany z biegiem czasu podczas fazy suszenia kultur grzybów, przy czym nie zaobserwowano żadnej lub niewielkiej zmiany w masie, gdy kultury były suche (Rysunek 5). Zebrany suchy proszek konidiów grzybowych zarówno M. pinghaense, jak i M. robertsii jest pokazany na Rysunek 6.

Discussion

Udana integracja czynników mikrobiologicznych do biologicznego zwalczania ważnych agrofagów rolniczych w agroekosystemie zależy zarówno od sukcesu, jak i łatwości masowej produkcji entomopatogenów jako pierwszego kroku w warunkach laboratoryjnych. Masowa produkcja EPF jest ważna dla zastosowania na szeroką skalę i dostępności produktów EPF w programach IPM wykorzystujących kontrolę biologiczną 9,10,11,12,13.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,05% Tween 20	Lasec		Dodawany do zawiesin konidialnych, aby umożliwić mieszanie się zarodników grzybów z wodą
20 ml butelek McCartney	Lasec		Używany do wytwarzania zawiesin konidialnych
Folia			Używana jako osłona zatyczek z waty w kolbie o pojemności 250 ml
Autoklaw			Służy do sterylizacji materiałów i składników używanych do produkcji konidiów Proces
Worki autoklawowe	Lasec		Worki fermentacyjne lub pojemniki na substrat stałe
Taśma autoklawowa	Lasec		Do mocowania rur PVC na workach fermentacyjnych Brązowe
torby			Służy do suszenia kultur konidiów na ziarnach rolnych
Spalarnia Bunsena	Labnet (Labnet International, Inc.)		Służy do wypalania sprzętu (ostrza chirurgiczne, pętle do zaszczepiania i brzegi kolb)
Sito testowe			Służy do oddzielania konidiów grzybowych od rolniczych substratów zbożowych
Alkohol kukurydziany	stromy SIGMA	66071-94-1	Składnik płynnego podłoża blastosporowego
Wata	Lasec		Używany jako zatyczka szyi do worków fermentacyjnych
Laboratorium Duran butelki	Neolab		Służy do autoklawowania pożywki SDA i wody destylowanej
Taśma			Służy do zaklejania i uszczelniania połączeń sit, aby zapobiec wydostawaniu się pyłu konidialnego Sito
		ENDECOTTS	Służy do oddzielania konidiów grzybowych od rolniczych podłoży zbożowych
Kolby Erlenmeyera, Wąska szyjka, kolba 250 ml	Lasec		Nośnik płynnego podłoża blastospory
Etanol (99%)	Lasec		Używany do sterylizacji ostrzy chirurgicznych i pętli inokulacyjnych
Płatki jęczmienne	Zdrowie Połączenie Wholefoods		Zboże rolnicze stosowane jako stałe podłoże do wzrostu substratów dla konidiów zarówno M. pinghaense i M. robertsii
płatki owsiane	marki		TigerZboże rolnicze stosowane jako stałe podłoże wzrostowe dla konidiów zarówno M. pinghaense jak i M. robertsii
Glukoza	Merck		Składnik płynnej pożywki blastosporowej
Komora wzrostowa / inkubatory			Do uprawy kultur konidiów grzybów
Hemocytometr			Służy do oznaczania stężeń
konidialnychPętle inokulacyjne	Lasec		Do zbierania zarodników w celu unieszkodliwienia płynnej pożywki do wzrostu blastospor
Kuchenny wałek			Służy do manipulowania złożem stałego podłoża ziarnistego
Szafka z przepływem laminarnym	ESCO Szafka		Zapewnij jako sterylne środowisko podczas inokulacji substratu
Metarhizium pinghaense konidia	Stellenbosch Uniwersytet	5HEID	Kultury używane do kultury masowej konidia Metarhizium pinghaense
>Metarhizium robertsii konidia	Uniwersytet Stellenbosch	6EIKEN	Kultury używane do hodowli masowej konidiów Metarhizium robertsii
Mikroskop	ZEIZZ (Zakres. A1)		Służy do oznaczania stężeń konidiów i żywotności konidiów
Wytrząsarka orbitalna	IncoShake- LABOTEC		Używana w procesie produkcji blastospor
Ryż parboiled	Spekko		Zboże rolnicze stosowane jako stałe podłoże wzrostu substratów dla konidiów zarówno M. pinghaense , jak i M. robertsii
Penicylina-Streptomycyna	SIGMA		Dodawany do pożywki SDA, aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu
Szalki Petriego	Lasec		Pojemniki na pożywkę SDA
Pipety i końcówki do pipet	Labnet (BioPette PLUS)		Służy do odmierzania składników płynów
Rura			Służy do tworzenia szyjki do worka fermentacyjnego
Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HPO4)	SIGMA-ALDRICH		Składnik płynnego podłoża blastosporowego
Gumowa opaska			Służy do zabezpieczania papieru chirurgicznego na torbie fermentacyjnej Szyjki rur PVC
Agar dekstrozowy Sabaroud (SDA)	NEOGEN Pożywka		hodowlana używana do hodowli zarodników zarówno Metarhizium pinghaense jak i Metarhizium robertsii
Sterylna woda	destylowana		Do nawilżania zbóż rolnych, do wytwarzania zawiesin konidialnych
Lepka podkładka			Służy do zabezpieczania osadów na wytrząsarce wibracyjnej
Ostrze chirurgiczne	Lasec		Służy do zeskrobywania zarodników z kultur grzybów
Papier chirurgiczny	Lasec		Służy do pokrywania szyjek z PVC i zatyczek z waty fermentacyjnej Worka
wibracyjnego			Służy do strząsania konidiów z rolniczych substratów zbożowych
Mieszalnik Vortex	Labnet (Labnet International, Inc.)		Służy do mieszania zawiesin konidialnych w butelkach Mc Cartney
Ekstrakt drożdżowy	Biolab		Dodano do pożywki SDA w celu poprawy kiełkowania i wzrostu zarodników
Worki z zamkiem błyskawicznym	GLAD		Służy do przechowywania zebranych konidiów grzybowych