Grzyby entomopatogeniczne zyskały na znaczeniu jako środki biologicznej kontroli szkodników rolniczych. W tym badaniu z powodzeniem przeprowadzono masową produkcję wystarczającej liczby odpornych zakaźnych propagul południowoafrykańskich izolatów zarówno Metarhizium robertsii, jak i M. pinghaense do komercyjnego stosowania przeciwko szkodnikom owadzim, przy użyciu rolnych produktów zbożowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Masowa produkcja grzybów entomopatogenicznych, Metarhizium robertsii i Metarhizium pinghaense, do komercyjnego stosowania przeciwko szkodnikom owadzim
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Entomopatogeniczne grzyby z kompleksu gatunków Metarhizium anisopliae zyskały na znaczeniu jako środki biologicznej kontroli szkodników rolniczych. Wzrost odporności szkodników na chemiczne środki owadobójcze, rosnące obawy dotyczące negatywnego wpływu insektycydów na zdrowie ludzi oraz zanieczyszczenie środowiska pestycydami doprowadziły do globalnego dążenia do znalezienia nowych, zrównoważonych strategii ochrony upraw i zwalczania szkodników. Wcześniej prowadzono próby masowej hodowli takich gatunków grzybów entomopatogenicznych (EPF) jak Beauveria bassiana. Jednak przeprowadzono tylko ograniczone próby masowej hodowli Metarhizium robertsii i M. pinghaense do stosowania przeciwko szkodnikom owadzim. Badanie to miało na celu masową produkcję wystarczającej liczby odpornych zakaźnych rozprzestrzeniania się południowoafrykańskich izolatów M. robertsii i M. pinghaense do zastosowań komercyjnych. Jako stałe substraty fermentacyjne EPF użyto trzech rolnych produktów zbożowych, płatków owsianych, płatków jęczmiennych i ryżu. Do inokulacji substratów stałych zastosowano dwie metody inokulacji, zawiesiny konidialne i płynną kulturę grzybów blastospor. Zaobserwowano, że inokulacja za pomocą zawiesin konidialnych jest stosunkowo mniej skuteczna, ponieważ zaobserwowano zwiększone poziomy zanieczyszczenia na substratach stałych w porównaniu z metodą inokulacji blastospor. Stwierdzono, że płatki owsiane nie są odpowiednim substratem wzrostowym zarówno dla M. robertsii, jak i M. pinghaense, ponieważ z podłoża nie zebrano suchych konidiów. Stwierdzono, że płatki jęczmienne faworyzują produkcję konidiów M. robertsii w stosunku do M. pinghaense, a z podłoża zebrano średnio 1,83 g ± 1,47 g suchych konidiów M. robertsii i zero gramów konidów M. pinghaense. Stwierdzono, że ziarna ryżu sprzyjają masowej produkcji konidialnej zarówno izolatów M. pinghaense, jak i M. robertsii, przy czym średnio 8,2 g ± 4,38 g i 6 g ± 2 g zebrano z podłoża.
Wprowadzenie
Grzyby entomopatogeniczne (EPF) zyskały na znaczeniu jako środki ochrony roślin w biologicznej kontroli ważnych szkodników rolniczych owadów1,2. Entomopatogeny, które występują naturalnie w glebie, powodują epizootię w populacjach różnych gatunków szkodników3. Gatunki EPF są specyficzne dla żywiciela i stwarzają stosunkowo niewielkie ryzyko pod względem atakowania gatunków niedocelowych i są nietoksyczne dla środowiska4. EPF mają unikalny mechanizm inwazji na swojego gospodarza, a także do rozprzestrzeniania się i utrzymywania się w jego najbliższym otoczeniu1. Atakują żywiciela głównie poprzez bezpłciowe zarodniki, które przyczepiają się do naskórka gospodarza i wnikają w niego, aby zaatakować i namnażać się w hemocle gospodarza. Gospodarz ostatecznie umiera z powodu wyczerpania składników odżywczych hemolimfy lub w wyniku toksemii spowodowanej toksycznymi metabolitami uwalnianymi przez grzyba. Po śmierci, w idealnych warunkach środowiskowych, grzyb pojawia się na zewnętrznej powierzchni (jawna grzybica) zwłok żywiciela5,6.
Rosnące obawy dotyczące negatywnego wpływu pozostałości chemicznych na zdrowie ludzkie, zanieczyszczenie środowiska i rozwój odporności na szkodniki doprowadziły do globalnego dążenia do zmniejszenia ilości chemicznych środków owadobójczych oraz znalezienia alternatywnych, nowatorskich i zrównoważonych strategii ochrony upraw i zwalczania szkodników6,7,8. Stworzyło to możliwości opracowania insektycydów na bazie mikroorganizmów do stosowania w programach integrowanej ochrony przed szkodnikami (IPM), które są bardziej ekologicznie korzystne niż konwencjonalna kontrola chemiczna3,8.
Aby opracować skuteczny środek kontroli mikrobiologicznej szkodnika rolniczego, należy najpierw wyizolować odpowiedni organizm, scharakteryzować, zidentyfikować i potwierdzić jego chorobotwórczość dla docelowego szkodnika. Jednak do wytworzenia opłacalnego produktu do stosowania w programach kontroli biologicznej potrzebna jest łatwa, opłacalna metoda produkcji czynnika mikrobiologicznego na dużą skalę9,10,11,12,13. Masowa produkcja znacznych ilości dobrej jakości entomopatogenów zależy od szczepu drobnoustrojów, środowiska, docelowego szkodnika, formulacji, rynku, strategii stosowania i pożądanego produktu końcowego14,15,16. EPF może być produkowany masowo przy użyciu fermentacji płynnego substratu w celu wytworzenia blastospor lub procesu fermentacji substratu stałego w celu wytworzenia konidii powietrznych6,17,18. Jednak masowa produkcja i proces formulacji entomopatogenów ma bezpośredni wpływ na zjadliwość, koszt, okres przydatności do spożycia i skuteczność polową produktu końcowego. Aby skutecznie stosować je w IPM, proces produkcji entomopatogenów musi być łatwy do przeprowadzenia, wymagać minimalnego nakładu pracy, wytwarzać wysokowydajne stężenie zjadliwych, żywotnych i trwałych propagul oraz być niskokosztowy4,13,14,16.
Zrozumienie wymagań żywieniowych entomopatogenów jest ważne dla masowej uprawy wszystkimi metodami hodowli4,12. Składniki odżywcze pożywki produkcyjnej mają znaczący wpływ na atrybuty powstających propagul, w tym skuteczność kontroli biologicznej, plon, tolerancję na wysuszenie i trwałość8,19,20,21. Optymalizacja procesów produkcyjnych ma na celu uwzględnienie takich czynników22. W przypadku EPF głównymi wymaganiami dobrego wzrostu, zarodnikowania i masowej produkcji konidiów grzybowych są odpowiednia wilgotność, optymalna temperatura wzrostu, pH, wymiana gazowa CO2 i O2 oraz odżywianie, w tym dobre źródła fosforu, węglowodanów, węgla i azotu18.
Jaronski i Jackson18 opisują metodę fermentacji substratu stałego jako najbardziej efektywną i najbardziej zbliżoną do naturalnego procesu produkcji EPF w stosunku do metody fermentacji płynnego substratu, ponieważ w warunkach naturalnych konidium grzybowe jest przenoszone na solidnych, wyprostowanych strukturach, takich jak powierzchnia zwłok owadów. Produkty rolne i produkty uboczne zawierające skrobię są najczęściej wykorzystywane do masowej produkcji grzybów hypokrealei, ponieważ grzyby łatwo rozkładają skrobię poprzez wydzielanie wysoce skoncentrowanych enzymów hydrolitycznych z ich strzępek, aby przeniknąć do substancji stałej i uzyskać dostęp do składników odżywczych obecnych w substancji11,17,18,23. Produkty zbożowe spełniają również wymagania dotyczące zdrowej produkcji biomasy, ponieważ po uwodnieniu i sterylizacji substraty mogą wchłaniać dalsze składniki odżywcze z dowolnego płynnego podłoża16,18,24.
Wcześniej, kilka badań próbowało masowo hodować gatunki EPF, takie jak Beauveria bassiana (Bals.) Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas i niektóre z Metarhizium anisopliae (Metschn.) Kompleks gatunków Sorokin izoluje na różnych podłożach16,23,24. Do takich masowo produkowanych i komercyjnie opracowywanych izolatów należą: Green Muscle® (szczep IMI 330189), opracowany z M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner) J.F. Bisch, Rehner & Humber, Metarhizium 69 (szczep Meta 69 ICIPE69) i Real Metarhizium 69 (L9281), opracowany z M. anisopliae, oraz Broadband® (szczep PPRI 5339) i Eco-Bb®, opracowany z B. bassiana25, 26. Podjęto jednak ograniczone próby masowej hodowli Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner & Humber oraz Metarhizium pinghaense Chen & Guo. Te dwa izolaty zostały wybrane w poprzednim badaniu jako najskuteczniejsze do zwalczania wełnowca, Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)27. W związku z tym obecne badanie miało na celu sformułowanie i masową produkcję wystarczającej liczby odpornych zakaźnych propagul lokalnych izolatów M. robertsii i M. pinghaense do komercyjnego zastosowania przeciwko szkodnikom owadzim. Do masowej produkcji konidiów grzybowych dla obu izolatów EPF zastosowano metodę fermentacji substratu stałego. Do inokulacji substratów stałych zastosowano dwie metody inokulacji EPF, wykorzystujące zawiesiny konidialne i płynną kulturę grzybów blastospor.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Źródło szczepów grzybowych
- Należy wykorzystać oba rodzaje izolowanych szczepów grzybów z RPA *M. pinghaense* 5 HEID (numer dostępu GenBank: MT367414/MT895630) i *M. robertsii* 6EIKEN (MT378171/MT380849), pobrane z sadów jabłoniowych w prowincji Western Cape w RPA.
- Hodować kultury każdego izolatu EPF na 60 g pożywki Sabouraud dextrose agar z dodatkiem 1 g ekstraktu drożdżowego (SDAY) i 10 µL streptomycyny.
UWAGA: Hodowle EPF należy inkubować w kontrolowanej temperaturze ± 25 °C w ciemności.
2. Inokulacja zawiesiną konidiów Metarhizium pinghaense i M. robertsii
- Przygotowanie podłoży stałych
- Wykorzystaj dwa produkty rolnicze, mianowicie płatki owsiane i płatki jęczmienne, jako podłoża wzrostowe dla dwóch izolatów EPF oraz worki autoklawowalne (305 mm × 660 mm) jako worki fermentacyjne.
- Należy wykorzystać niewielką rurę odpływową z polichlorku winylu (1000 mm × 50 mm), aby stworzyć szyjkę dla worka fermentacyjnego na otwartym końcu worka do autoklawowania, a następnie za pomocą taśmy do autoklawowania przymocować rurę do worka.
- Zamknąć rurkę sterylnym czopem z waty bawełnianej, aby zapewnić odpowiednią wymianę gazową podczas fermentacji.
- Odważ suchą masę ziaren (200 g) zarówno dla płatków owsianych, jak i jęczmiennych, umieść je w workach do fermentacji, a następnie do każdego worka dodaj 100 ml wody destylowanej i dokładnie wymieszaj zawartość worków.
- Pozostaw mokre ziarna na 15–30 min w celu wchłonięcia wilgoci przed autoklawowaniem i sterylizacją. Przygotuj sześć woreczków dla każdego rodzaju ziarna, a aby zapobiec kontaminacji, umieść woreczki w innych workach autoklawowych i autoklawuj podłoża w 121 °C przez 55 min.
- Przygotowanie inokulum w postaci zawiesiny konidiów
- Zbiór konidiów grzybów w wieku 2-3 tygodni z kultur obu szczepów *M. pinghaense* i M. robertsii poprzez skrobanie za pomocą sterylnego skalpela.
- Zawiesić zebrane konidia grzybów w 20 ml sterylnej wody destylowanej z dodatkiem 0,05% Tween 20, a następnie mieszać zawiesiny konidialne na wstrząsarzu wortex przez 2 min.
- Przygotować 20 ml zawiesiny konidiów o stężeniu 1 × 107 konidia/ml i zaszczepić odpowiednio stałe podłoża z płatków owsianych i płatków jęczmiennych.
UWAGA: Do wyznaczania stężeń konidiów należy użyć komory licznej (hemocytometru).
- Inokulacja podłoży stałych
- Otwórz każdy worek, wyjmując watowane korki, a następnie dodaj przygotowaną zawiesinę konidiów o objętości 20 ml do schłodzonego, autoklawowanego podłoża.
- Ponownie zamknij worki za pomocą korków szyjek i masuj ich zawartość, aby inokulum grzybowe równomiernie wymieszało się z podłożem zbożowym.
- Inkubować worki fermentacyjne w kontrolowanej temperaturze ± 25 °Coraz zapewnić odpowiednią wymianę gazową między hodowlą a środowiskiem.
UWAGA: Niniejszą procedurę należy przeprowadzać w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
- Faza fermentacji
- Ręcznie wymieszać podłoża ziarna w workach fermentacyjnych 2 dni po inokulacji i inkubacji, gdy pojawi się widoczny wzrost grzybni, a podłoże zacznie zbijać się w grudki pod wpływem rosnącego grzyba.
UWAGA: Zabieg ten wykonuje się w celu wymieszania zaszczepionych granulek, aby umożliwić rozgałęzianie się grzybni podczas wczesnych etapów wegetatywnego wzrostu grzybów. - Należy użyć kuchennego wałka do wyrównania warstwy podłoża, aby uniknąć fizycznej heterogeniczności ziaren oraz nierównomiernej grubości masy podłoża.
UWAGA: Proces ten stymuluje metabolizm grzybni, co optymalizuje produkcję zarodników grzybów oraz maksymalizuje powierzchnię kontaktu, zwiększając tym samym wydajność konidiów18. - Kontynuuj proces fermentacji przez okres do 4–5 tygodni, kontrolując worki fermentacyjne co 2 dni pod kątem obecności białego narostu wegetatywnego, który może rozwinąć się podczas fermentacji i znacząco wpłynąć na wydajność konidiów grzyba.
UWAGA: Należy natychmiast przerwać fermentację w workach fermentacyjnych wykazujących jakiekolwiek białe narosty wegetatywne i wysuszyć kultury grzybów18.
- Ręcznie wymieszać podłoża ziarna w workach fermentacyjnych 2 dni po inokulacji i inkubacji, gdy pojawi się widoczny wzrost grzybni, a podłoże zacznie zbijać się w grudki pod wpływem rosnącego grzyba.
3. Inokulacja blastosporami
- Produkcja blastospor i inokulacja
- Przygotować płynną pożywkę zawierającą 1 L wody destylowanej, 30 g glukozy, 20 g ekstraktu drożdżowego, 4 g fosforanu potasu dwuzasadowego (K2HPO4), 15 mL ekstraktu z kukurydzy (corn steep liquor) oraz 10 µg/mL antybiotyku Streptomycin, zarówno dla M. pinghaense, jak i M. robertsii.
- Najpierw podgrzać wodę destylowaną, wyłączyć grzanie przed osiągnięciem punktu wrzenia i dodać do gorącej wody w garnku wszystkie składniki z wyjątkiem Streptomycyny. Doprowadzić pożywkę do łagodnego wrzenia przez 3-4 min, cały czas mieszając, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie składników i zapobiec osadzaniu się niektórych z nich na dnie garnka.
- Wlać łącznie 100 mL pożywki do dziewięciu różnych kolb o pojemności 250 mL, zamknąć każdą kolbę czopem z waty szklanej i przykryć watę folią aluminiową w celu uszczelnienia (Ryc. 1A).
- Autoklawować pożywkę w kolbach przez 55 min w temperaturze 121 °C. Po autoklawowaniu pozwolić pożywce w kolbach ostygnąć, a następnie dodać do każdej kolby 10 mg/mL Streptomycyny (Ryc. 1B).
- Pobrać za pomocą pętli bakteriologicznej od dwóch do trzech porcji konidiów grzyba z 2-3 tygodniowych płyt z kulturą grzyba dla obu izolatów EPF, M. pinghaense i M. robertsii, i przenieść je w warunkach sterylnych do każdej kolby z 100 mL płynnej pożywki, a następnie zamknąć kolby.
- Inkubować kolby z kulturą płynną w temperaturze ± 25 °C na wytrząsarce orbitalnej przy 140 rpm przez 3 dni; inkubację przerwać, gdy kultury wykażą wysoką mętność świadczącą o wzroście blastospor grzyba (Ryc. 1C).
- W celu wykrycia ewentualnej kontaminacji bakteryjnej kultur, pobrać próbkę 100 µL z każdej kolby z kulturą płynną po 24 h inkubacji i wysiać na trzy płytki SDA dla każdego izolatu. Inkubować płytki przez 48 h w kontrolowanej temperaturze ± 25 °C.
- Przygotowanie podłoża stałego
- Jako stałe podłoże dla blastospor M. pinghaense oraz M. robertsii zastosować parboiled długoziarnisty biały ryż (zaadaptowano z Jaronski i Jackson18).
- Przygotować worki fermentacyjne zgodnie z opisem w krokach 2.1.1-2.1.3, a do każdego worka dodać 1 kg ryżu i 300 mL sterylnej wody destylowanej.
- Delikatnie wymieszać zawartość worków fermentacyjnych, umieścić je w pionowej pozycji w zewnętrznych workach autoklawowych i autoklawować w temperaturze 121 °C przez 55 min. Po autoklawowaniu pozwolić podłożom ostygnąć przez ± 45 min w warunkach sterylnych.
- Inokulacja i fermentacja
- Zdjąć zamknięcia z każdej z kolb z kulturą płynną M. pinghaense i M. robertsii w komorze z laminarnym przepływem powietrza i wysterylizować krawędź każdej kolby płomieniem przez 10 s.
- Wlać 100-mililitrowe kultury płynne do worków fermentacyjnych po usunięciu czopów z waty z ich szyjek (Ryc. 2). Ponownie założyć czopy z waty i przykryć górną część szyjki worka papierem chirurgicznym zabezpieczonym gumką recepturką.
UWAGA: Określić stężenie blastospor dla każdej kolby za pomocą hemocytometru i zastosować stężenia blastospor od 1 × 107 do 5 × 108 blastospor/mL do inokulacji podłoży28. - Skręcić górną część worka i wymieszać zawartość poprzez wstrząsanie i lekkie manipulowanie podłożem metodą masażu; inkubować worki w temperaturze ± 25 °C, spłaszczając podłoże w workach, aby zapobiec tworzeniu się grubych warstw18.
- Rozbić podłoże w workach fermentacyjnych poprzez masowanie zawartości worków 2-3 dni po inokulacji i inkubacji, gdy nastąpił widoczny wzrost grzybni i związanie podłoża przez grzyba (zaadaptowano z techniki Jaronski i Jackson18).
UWAGA: Kontynuować fermentację przez 4 tygodnie.
Rysunek 1: Płynna pożywka w kolbach 250-mL. (A) Przed autoklawowaniem. (B) Po autoklawowaniu i inokulacji zarodnikami EPF. (C) Mętna pożywka z blastosporami grzyba. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2: Przygotowane płynne pożywki do hodowli blastospor.** (A) Metarhizium robertsii oraz (B) Metarhizium pinghaense przed inokulacją ryżu jako podłoża stałego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
4. Suszanie kultur grzybowych
- Po fermentacji, przed użyciem w próbach, suszyć kultury grzybowe przez 10-12 dni, przenosząc ukulturowane zarodniki do brązowych papierowych toreb o pojemności 26-30 kg (30 x 43 x 15250 cm3).
- Aby zwiększyć wytrzymałość papierowych toreb na rozciąganie, poziomo odciąć jedną trzecią górnej części każdej torebki i wyłożyć dno torebki (Rycina 3A, B).
Rysunek 3: Przygotowanie papierowych toreb, procedura suszenia kultur oraz pakowanie. (A,B) Przygotowanie brązowych papierowych toreb. Procedura suszenia kultur gatunków Metarhizium hodowanych na (C,E) ryżu parboiled oraz (D,F) płatkach jęczmienia. (G) Papierowe torby zamknięte zszywkami w celu utworzenia trójkątnej struktury namiotowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
- Delikatnie rozkrusz podłoże w każdym worku do fermentacji, odetnij róg każdego worka i przenieś całą kulturę do papierowych torebek przez otwór powstały po odciętym rogu (Rysunek 3C-F). Aby uniknąć nadmiernego uwalniania zarodników grzybów do powietrza, wykonuj ten proces powoli.
UWAGA: Proces ten należy przeprowadzić w warunkach sterylnych, przy użyciu laminaru, aby uniknąć kontaminacji. - Oznacz każdą papierową torebkę, dwukrotnie zawiń górną krawędź każdej torebki i zamknij ją zszywkami, tworząc trójkątną strukturę namiotową, a następnie umieść torebki na drucianych stelażach do suszenia, aby zapewnić prawidłowe i równomierne suszenie w kontrolowanej temperaturze ± 25 °C i niskiej wilgotności 30-40%.
- Codziennie odwracaj torebki, aby umożliwić równomierne suszenie kultur i uniknąć ewentualnego odrostu wegetatywnego, który mógłby obniżyć wydajność zbioru zarodników grzybów.
- Waż każdą torebkę do suszenia co 2 dni w trakcie procesu suszenia i kontynuuj ten proces dla każdej torebki do momentu, aż pomiędzy kolejnymi dniami nie zostanie zaobserwowana żadna lub minimalna zmiana masy torebek.
5. Zbiór konidiów grzybowych
- Mechanicznie zebrać konidia grzybów z kultur, wykorzystując trzy zestackowane sita: sito testowe (ETS) o numerze siatki 35 (z otworem 500-µm), ułożone na sicie testowym (z otworem 212-µm), które z kolei spoczywa na sicie ETS o numerze siatki 100 (z otworem 150-µm), zamontowanych na tacy zbierającej.
- Powoli wsypać suchą próbkę kultury na sito ETS nr 35 i przykryć sito pokrywką, aby zapobiec przedostaniu się konidiów grzybowych do powietrza.
- Do sit dodać 10-12 szklanych kulek, aby ułatwić przechodzenie konidiów grzybowych przez siatki i zapobiec ich zatrzymywaniu się w sicie, co mogłoby skutkować obniżeniem wydajności odzyskiwania zarodników.
- Połączenia sit zakleić i uszczelnić taśmą izolacyjną, aby zapobiec wydostawaniu się pyłu konidialnego.
- Sita umieścić na wstrząsarce wibracyjnej z zamocowaną lepką podkładką służącą do stabilizacji tacy zbierającej i sit na 20-25 min, przy częstotliwości ruchu 560-640 wibracji na minutę (Rysunek 4).
UWAGA: Technika zaadaptowana z opracowania Jaronski i Jackson18.
Rycina 4: Pozyskiwanie zarodników grzybów z wysuszonych kultur Metarhizium robertsii na ryżu i płatkach jęczmienia. (A) 10-12 szklanych kulek dodanych do sit w celu ułatwienia przejścia konidiów grzyba przez siatki. Konidia M. robertsii pozyskane z kultur na (B) ryżu oraz (C) płatkach jęczmienia. (D) Sita na wstrząsarku wibracyjnym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
- Wyjmij sita testowe z tacy zbierającej, zbierz konidia i przechowuj je w szczelnych, wodoodpornych woreczkach strunowych w celu długoterminowego przechowywania (3-6 miesięcy).
6. Ilościowe oznaczenie wytworzonych konidiów grzybowych
- Zważ i zapisz masę każdego podłoża ziarnowego przed zebraniem konidiów grzybowych z każdego podłoża.
- Oblicz całkowitą masę zebranych konidiów, odejmując masę zebranych zarodników od masy stałego podłoża.
UWAGA: Całkowita wydajność konidiów obejmuje nie tylko zebrane konidia, ale także konidia grzybowe pozostałe na stałym podłożu. - Zważ podłoże i pobierz 10 g odważonego podłoża. Zawieś 10 g podłoża w 0,05% Tween 20 i rozcieńcz w 10 mL sterylnej wody destylowanej.
- Mieszaj zawiesinę w wortexie przez 2 min, a następnie za pomocą hemocytometru wykonaj przeliczenie zarodników w celu określenia liczby konidiów wypłukanych z podłoża.
- Wykonaj dalsze rozcieńczenia, przenosząc 1000 µL z 10 mL wypłukanej zawiesiny konidialnej do 9 mL sterylnej wody destylowanej, aby otrzymać 10 mL zawiesin rozcieńczonych.
- Mieszaj zawiesiny konidialne w wortexie przez 2 min i wyznacz stężenia konidiów.
UWAGA: W celu wyznaczenia stężenia konidiów w zawiesinach należy postępować zgodnie z procedurą i wzorem opisanym przez Inglis, Enkerli i Goettel30. - Zebierz i zawieś łącznie 0,1 g zebranego proszku konidialnego z każdej kultury w 10 mL sterylnej wody destylowanej z dodatkiem 0,05% Tween 20, mieszaj zawiesinę konidialną w wortexie przez 2 min i wyznacz stężenie konidiów za pomocą hemocytometru.
- Wykonaj dalsze rozcieńczenia, przenosząc 1000 µL z 10 mL zawiesiny konidialnej do 9 mL sterylnej wody destylowanej, aby otrzymać rozcieńczenia zawiesiny o objętości 10 mL.
- Mieszaj zawiesiny konidialne w wortexie przez 2 min, oblicz stężenia konidiów i wyznacz liczbę konidiów na gram.
- Pomnóż liczbę konidiów na gram zebranego proszku przez początkową masę zebranego proszku konidialnego. Pomnóż liczbę konidiów wypłukanych z podłoża przez całkowitą masę zużytego podłoża, czyli podłoża, z którego zebrano konidia.
- Zsumuj obie otrzymane wartości i podziel przez początkową suchą masę podłoża, aby obliczyć liczbę konidiów na kg lub g podłoża18.
UWAGA: Obliczenia wykonano głównie dla podłoża ryżowego. Test kiełkowania lub żywotności konidialnej przeprowadzono dla izolatów M. pinghaense oraz M. robertsii, aby określić żywotność wytworzonych konidiów.
7. Analiza danych
- Użyj odpowiedniego oprogramowania komputerowego do przeprowadzenia analizy statystycznej uzyskanych wyników.
UWAGA: Analiza statystyczna danych została przeprowadzona przy użyciu programu STATISTICA w wersji 13.5.0.17.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W czasie etapu suszenia kultur grzybowych zaobserwowano spadek masy treści kultur na ryżu zarówno dla M. pinghaense, jak i M. robertsii, przy czym po wyschnięciu kultur nie odnotowano lub odnotowano niewielkie zmiany masy (Rysunek 5). Zebrany proszek z suchych konidiów grzybowych obu gatunków, M. pinghaense oraz M. robertsii, przedstawiono na Rysunku 6.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Udana integracja czynników mikrobiologicznych do biologicznego zwalczania ważnych agrofagów rolniczych w agroekosystemie zależy zarówno od sukcesu, jak i łatwości masowej produkcji entomopatogenów jako pierwszego kroku w warunkach laboratoryjnych. Masowa produkcja EPF jest ważna dla zastosowania na szeroką skalę i dostępności produktów EPF w programach IPM wykorzystujących kontrolę biologiczną 9,10,11,12,13.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Hort Pome, Hort Stone oraz Technology and Human Resources for Industry Programme (THRIP: TP14062571871) za finansowanie projektu.
ORCID:
Letodi L. Mathulwe http://orcid.org/0000-0002-5118-3578
Antoinette P. Malan http://orcid.org/0000-0002-9257-0312
Nomakholwa F. Stokwe http://orcid.org/0000-0003-2869-5652
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,05% Tween 20 | Lasec | Dodawany do zawiesin konidialnych, aby umożliwić mieszanie się zarodników grzybów z wodą | |
| 20 ml butelek McCartney | Lasec | Używany do wytwarzania zawiesin konidialnych | |
| Folia | Używana jako osłona zatyczek z waty w kolbie o pojemności 250 ml | ||
| Autoklaw | Służy do sterylizacji materiałów i składników używanych do produkcji konidiów Proces | ||
| Worki autoklawowe | Lasec | Worki fermentacyjne lub pojemniki na substrat stałe | |
| Taśma autoklawowa | Lasec | Do mocowania rur PVC na workach fermentacyjnych Brązowe | |
| torby | Służy do suszenia kultur konidiów na ziarnach rolnych | ||
| Spalarnia Bunsena | Labnet (Labnet International, Inc.) | Służy do wypalania sprzętu (ostrza chirurgiczne, pętle do zaszczepiania i brzegi kolb) | |
| Sito testowe | Służy do oddzielania konidiów grzybowych od rolniczych substratów zbożowych | ||
| Alkohol kukurydziany | stromy SIGMA | 66071-94-1 | Składnik płynnego podłoża blastosporowego |
| Wata | Lasec | Używany jako zatyczka szyi do worków fermentacyjnych | |
| Laboratorium Duran butelki | Neolab | Służy do autoklawowania pożywki SDA i wody destylowanej | |
| Taśma | Służy do zaklejania i uszczelniania połączeń sit, aby zapobiec wydostawaniu się pyłu konidialnego Sito | ||
| ENDECOTTS | Służy do oddzielania konidiów grzybowych od rolniczych podłoży zbożowych | ||
| Kolby Erlenmeyera, Wąska szyjka, kolba 250 ml | Lasec | Nośnik płynnego podłoża blastospory | |
| Etanol (99%) | Lasec | Używany do sterylizacji ostrzy chirurgicznych i pętli inokulacyjnych | |
| Płatki jęczmienne | Zdrowie Połączenie Wholefoods | Zboże rolnicze stosowane jako stałe podłoże do wzrostu substratów dla konidiów zarówno M. pinghaense i M. robertsii | |
| płatki owsiane | marki | TigerZboże rolnicze stosowane jako stałe podłoże wzrostowe dla konidiów zarówno M. pinghaense jak i M. robertsii | |
| Glukoza | Merck | Składnik płynnej pożywki blastosporowej | |
| Komora wzrostowa / inkubatory | Do uprawy kultur konidiów grzybów | ||
| Hemocytometr | Służy do oznaczania stężeń | ||
| konidialnychPętle inokulacyjne | Lasec | Do zbierania zarodników w celu unieszkodliwienia płynnej pożywki do wzrostu blastospor | |
| Kuchenny wałek | Służy do manipulowania złożem stałego podłoża ziarnistego | ||
| Szafka z przepływem laminarnym | ESCO Szafka | Zapewnij jako sterylne środowisko podczas inokulacji substratu | |
| Metarhizium pinghaense konidia | Stellenbosch Uniwersytet | 5HEID | Kultury używane do kultury masowej konidia Metarhizium pinghaense |
| >Metarhizium robertsii konidia | Uniwersytet Stellenbosch | 6EIKEN | Kultury używane do hodowli masowej konidiów Metarhizium robertsii |
| Mikroskop | ZEIZZ (Zakres. A1) | Służy do oznaczania stężeń konidiów i żywotności konidiów | |
| Wytrząsarka orbitalna | IncoShake- LABOTEC | Używana w procesie produkcji blastospor | |
| Ryż parboiled | Spekko | Zboże rolnicze stosowane jako stałe podłoże wzrostu substratów dla konidiów zarówno M. pinghaense , jak i M. robertsii | |
| Penicylina-Streptomycyna | SIGMA | Dodawany do pożywki SDA, aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu | |
| Szalki Petriego | Lasec | Pojemniki na pożywkę SDA | |
| Pipety i końcówki do pipet | Labnet (BioPette PLUS) | Służy do odmierzania składników płynów | |
| Rura | Służy do tworzenia szyjki do worka fermentacyjnego | ||
| Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | Składnik płynnego podłoża blastosporowego | |
| Gumowa opaska | Służy do zabezpieczania papieru chirurgicznego na torbie fermentacyjnej Szyjki rur PVC | ||
| Agar dekstrozowy Sabaroud (SDA) | NEOGEN Pożywka | hodowlana używana do hodowli zarodników zarówno Metarhizium pinghaense jak i Metarhizium robertsii | |
| Sterylna woda | destylowana | Do nawilżania zbóż rolnych, do wytwarzania zawiesin konidialnych | |
| Lepka podkładka | Służy do zabezpieczania osadów na wytrząsarce wibracyjnej | ||
| Ostrze chirurgiczne | Lasec | Służy do zeskrobywania zarodników z kultur grzybów | |
| Papier chirurgiczny | Lasec | Służy do pokrywania szyjek z PVC i zatyczek z waty fermentacyjnej Worka | |
| wibracyjnego | Służy do strząsania konidiów z rolniczych substratów zbożowych | ||
| Mieszalnik Vortex | Labnet (Labnet International, Inc.) | Służy do mieszania zawiesin konidialnych w butelkach Mc Cartney | |
| Ekstrakt drożdżowy | Biolab | Dodano do pożywki SDA w celu poprawy kiełkowania i wzrostu zarodników | |
| Worki z zamkiem błyskawicznym | GLAD | Służy do przechowywania zebranych konidiów grzybowych |
Bibliografia
- Shah, P. A., Pell, J. K. Entomopathogenic fungi as biological control agents. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5), 413-423 (2003).
- Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. A review of the biology and control of the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae), with special reference to biological control using entomopathogenic fungi and nematodes. African Entomology. 29 (1), 1-16 (2020).
- Ibrahim, L., Laham, L., Touma, A., Ibrahim, S. Mass production, yield, quality, formulation and efficacy of entomopathogenic Metarhizium anisopliae conidia. Current Journal of Applied Science and Technology. 9 (5), 427-440 (2015).
- Banu, J. G., Rajalakshmi, S. Standardisation of media for mass multiplication of entomopathogenic fungi. Indian Journal of Plant Protection. 42 (1), 91-93 (2014).
- Roberts, D. W., Humber, R. A. Entomogenous fungi. Biology of Conidial Fungi. Cole, G. T., Kendrick, W. B. , Academic Press. New York. 201-236 (1981).
- Feng, M. G., Poprawski, T. J., Khachatourians, G. G. Production, formulation and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for insect control. Current status. Biocontrol Science and Technology. 4 (1), 3-34 (1994).
- Karanja, L. W., Phiri, N. A., Oduor, G. I. Effect of different solid substrates on mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae entomopathogens. The Proceedings of the12th KARI Biennial Scientific Conference. , Nairobi, Kenya. 8-12 (2010).
- Prasad, C. S., Pal, R. Mass production and economics of entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae and Verticillium lecanii on agricultural and industrial waste. Scholars Journal of Agriculture and Veterinary Sciences. 1 (1), 28-32 (2014).
- Ehlers, R. U. Mass production of entomopathogenic nematodes for plant protection. Applied Microbiology and Biotechnology. 56 (5), 623-633 (2001).
- Pham, T. A., Kim, J. J., Kim, S. G., Kim, K. Production of blastospore of entomopathogenic Beauveria bassiana in a submerged batch culture. Mycobiology. 37 (3), 218-224 (2009).
- Bhadauria, B. P., Puri, S., Singh, P. K. Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products. The Bioscan. 7 (2), 229-232 (2012).
- Latifian, M., Rad, B., Amani, M. Mass production of entomopathogenic fungi Metarhizium anisopliae by using agricultural products based on liquid-solid diphasic method for date palm pest control. International Journal of Farming and Allied Sciences. 3 (4), 368-372 (2014).
- Agale, S. V., Gopalakrishnan, S., Ambhure, K. G., Chandravanshi, H., Gupta, R., Wani, S. P. Mass production of entomopathogenic fungi (Metarhizium anisopliae) using different grains as a substrate. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7 (1), 2227-2232 (2018).
- Jackson, M. A. Optimizing nutritional conditions for the liquid culture production of effective fungal biological control agents. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 19 (3), 180-187 (1997).
- Deshpande, M. V. Mycopesticides production by fermentation. Potential and challenges. Critical Reviews in Microbiology. 25 (3), 229-243 (1999).
- Sahayaraj, K., Namasivayam, S. K. R. Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products and by products. African Journal of Biotechnology. 7 (12), 1907-1910 (2008).
- Feng, K. C., Liu, L. B., Tzeng, Y. M. Verticillium lecanii spore production in solid-state and liquid-state fermentations. Bioprocess Engineering. 23 (1), 25-29 (2000).
- Jaronski, S. T., Jackson, M. A. Mass production of entomopathogenic Hypocreales. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology 2nd edition. Lacey, L. A. , Academic Press. London. 255-284 (2012).
- Vega, F. E., Jackson, M. A., Mercandier, G., Poprawski, T. J. The impact of nutrition on spore yields for various fungal entomopathogens in liquid culture. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 19 (4), 363-368 (2003).
- El Damir, M. Effect of growing media and water volume on conidial production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Journal of Biological Sciences. 6 (2), 269-274 (2006).
- Pandey, A. K., Kanaujia, K. R. Effect of different grains as solid substrates on sporulation, viability and pathogenicity of Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin. Journal of Biological Control. 22 (2), 369-374 (2008).
- Kassa, A., et al. Whey for mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Mycological Research. 112 (5), 583-591 (2008).
- Sharma, S., Gupta, R. B. L., Yadavam, C. P. S. Selection of a suitable medium for mass multiplication of entomofungal pathogens. Indian Journal of Entomology. 64 (3), 254-261 (2002).
- Bich, G. A., Castrillo, M. L., Villalba, L. L., Zapata, P. D. Evaluation of rice by-products, incubation time, and photoperiod for solid state mass multiplication of the biocontrol agents Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Agronomy Research. 16 (5), 1921-1930 (2018).
- Price, R. E., Müller, E. J., Brown, H. D., D'Uamba, P., Jone, A. A. The first trial of a Metarhizium anisopliae var. acridum mycoinsecticide for the control of the red locust in a recognised outbreak area. International Journal of Tropical Insect Science. 19 (4), 323-331 (1999).
- Hatting, J. L., Moore, S. D., Malan, A. P. Microbial control of phytophagous invertebrate pests in South Africa. Current status and future prospects. Journal of Invertebrate Pathology. 165, 54-66 (2019).
- Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. Laboratory screening of entomopathogenic fungi and nematodes for pathogenicity against the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae). Biocontrol Science and Technology. , (2021).
- Inglis, G. D., Enkerli, J., Goettel, M. S. Laboratory techniques used for entomopathogenic fungi: Hypocreales. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , Academic Press, Elsevier. Chapter 7 189-253 (2012).
- Mehta, J., et al. Impact of carbon & nitrogen sources on the Trichoderma viride (Biofungicide) and Beauveria bassiana (entomopathogenic fungi). European Journal of Experimental Biology. 2 (6), 2061-2067 (2012).
- Burges, H. D. Formulation of mycoinsecticides. Formulation of Microbial Biopesticides. , Springer. Dordrecht. 131-185 (1998).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
