Artykuł metodologiczny

Fermentacja kontrolowana światłem do produkcji mikrobiologicznej, chemicznej i białkowej

DOI:

10.3791/63269

⸱

22 marca 2022

 ,  , 
1Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University, 2The Andlinger Center for Energy and the Environment, Princeton University, 3Department of Molecular Biology, Princeton University, 4High Meadows Environmental Institute, Princeton University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetyczna kontrola metabolizmu mikrobiologicznego oferuje elastyczną dynamiczną kontrolę nad procesami fermentacji. Niniejszy protokół pokazuje, jak skonfigurować fermentację regulowaną niebieskim światłem do produkcji chemicznej i białkowej w różnych skalach objętościowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fabryki komórek mikrobiologicznych oferują zrównoważoną alternatywę dla produkcji chemikaliów i rekombinowanych białek z odnawialnych surowców. Jednak przeciążenie mikroorganizmu modyfikacjami genetycznymi może zmniejszyć sprawność i produktywność gospodarza. Problem ten można przezwyciężyć za pomocą kontroli dynamicznej: indukowalnej ekspresji enzymów i szlaków, zwykle przy użyciu dodatków chemicznych lub odżywczych, w celu zrównoważenia wzrostu i produkcji komórek. Optogenetyka oferuje nieinwazyjną, wysoce przestrajalną i odwracalną metodę dynamicznej regulacji ekspresji genów. W tym miejscu opisujemy, jak skonfigurować kontrolowane światłem fermentacje zmodyfikowanych Escherichia coli i Saccharomyces cerevisiae do produkcji chemikaliów lub rekombinowanych białek. Omawiamy, jak stosować światło w wybranych momentach i dawkach, aby rozdzielić wzrost i produkcję drobnoustrojów w celu poprawy kontroli fermentacji i wydajności, a także kluczowe kwestie związane z optymalizacją w celu uzyskania najlepszych wyników. Dodatkowo opisujemy, jak zaimplementować sterowanie oświetleniem w eksperymentach bioreaktorów na skalę laboratoryjną. Protokoły te ułatwiają przyjęcie kontroli optogenetycznej w zmodyfikowanych mikroorganizmach w celu poprawy wydajności fermentacji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetyka, kontrola procesów biologicznych za pomocą białek reagujących na światło, oferuje nową strategię dynamicznego kontrolowania fermentacji mikrobiologicznej w celu produkcji chemicznej i białkowej1,2. Obciążenie zmodyfikowanymi szlakami metabolicznymi oraz toksyczność niektórych produktów pośrednich i produktów często upośledza wzrost komórek3. Takie naprężenia mogą prowadzić do słabej akumulacji biomasy i zmniejszenia wydajności3. Wyzwanie to można rozwiązać, dzieląc czasowo fermentacje na fazę wzrostu i produkcji, które poświęcają zasoby metaboliczne odpowiednio na akumulację biomasy lub syntezę produktu4. Niedawno wykazaliśmy, że przejście od wzrostu do produkcji w tej dwufazowej fermentacji można wywołać zmianami warunków oświetlenia5,6,7. Wysoka przestrajalność, odwracalność i ortogonalność sygnałów świetlnych8 oferują unikalne zalety fermentacji kontrolowanych światłem, które są trudne lub niemożliwe do odtworzenia za pomocą induktorów chemicznych stosowanych w dynamicznej kontroli konwencjonalnych fermentacji dwufazowych4,9,10,11.

Białko EL222 reagujące na niebieskie światło, pochodzące z Erythrobacter litoralis zostało wykorzystane do opracowania kilku obwodów optogenetycznych dla inżynierii metabolicznej u Saccharomyces cerevisiae5,7,12,13. EL222 zawiera domenę czujnika światła i tlenu (LOV), która ulega przesunięciu konformacyjnemu po aktywacji światłem niebieskim (465 nm), co pozwala mu związać się z pokrewną sekwencją DNA (C120) 13. Fuzja EL222 z domeną aktywacji wirusa VP16 (VP16-EL222) powoduje powstanie czynnika transkrypcyjnego reagującego na światło niebieskie, który może odwracalnie aktywować ekspresję genów w S. cerevisiae7 i innych organizmach14 z syntetycznego promotora PC120. Kilka obwodów opartych na EL222 zostało opracowanych i wykorzystanych do produkcji chemicznej u S. cerevisiae, takich jak podstawowy aktywowany światłem system OptoEXP7, w którym interesujący gen jest bezpośrednio wyrażany z PC120 (Rysunek 1A). Jednak obawy związane z przenikaniem światła przy wysokich gęstościach komórek, zwykle spotykanych w fazie produkcji fermentacji, zmotywowały nas do opracowania odwróconych obwodów, które są indukowane w ciemności, takich jak obwody OptoINVRT i OptoQ-INVRT (Rysunek 1B)5,7,13. Systemy te wykorzystują regulony galaktozy (GAL) lub kwasu chinowego (Q) odpowiednio z S. cerevisiae i N. crassa, kontrolując odpowiadające im represory (GAL80 i QS) za pomocą VP16-EL222, aby stłumić ekspresję genów w świetle i silnie ją indukować w ciemności. Połączenie obwodów OptoEXP i OptoINVRT skutkuje dwukierunkową kontrolą ekspresji genów, umożliwiając dwufazowe fermentacje, w których faza wzrostu jest indukowana światłem niebieskim, a faza produkcji ciemnością (Rysunek 2A)5,7.

Użycie światła zamiast ciemności do wywołania ekspresji genów podczas fazy produkcji znacznie rozszerzyłoby możliwości kontroli optogenetycznej, ale wymagałoby również pokonania ograniczeń penetracji światła związanych z wysokimi gęstościami komórek, zwykle spotykanymi w tej fazie fermentacji. W tym celu opracowaliśmy obwody, znane jako OptoAMP i OptoQ-AMP, które wzmacniają odpowiedź transkrypcyjną na stymulację światłem niebieskim. Obwody te wykorzystują mutanty typu dzikiego lub nadwrażliwego VP16-EL222 do kontrolowania produkcji aktywatorów transkrypcyjnych Gal4p lub QF2 odpowiednio regulatorów GAL lub Q, osiągając zwiększoną czułość i silniejszą ekspresję genów za pomocą światła12,13 (Rysunek 1C). Obwody OptoAMP mogą osiągnąć pełną i jednorodną indukcję światła w bioreaktorach o pojemności 5 litrów przy gęstości optycznej (mierzonej przy 600 nm; OD600) wartości co najmniej 40 przy zaledwie ~0,35% natężeniu oświetlenia (5% dawki światła na zaledwie ~7% powierzchni objętościowej). Świadczy to o wyższym stopniu czułości w porównaniu do OptoEXP, który wymaga blisko 100% oświetlenia12. Zdolność do skutecznego indukowania ekspresji genów za pomocą światła przy dużej gęstości komórek otwiera nowe możliwości dynamicznej kontroli fermentacji. Obejmuje to fermentacje operacyjne w więcej niż dwóch fazach czasowych, takich jak fermentacje trójfazowe, w których fazy wzrostu, indukcji i produkcji są ustalane z unikalnymi harmonogramami światła w celu optymalizacji produkcji chemicznej (Rysunek 2B) 12.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Obwody optogenetyczne do dynamicznej kontroli S. cerevisiae. Układy OptoEXP, OptoINVRT i OptoAMP oparte są na światłoczułym układzie VP16-EL222. (A) W obwodzie OptoEXP ekspozycja na światło niebieskie powoduje zmianę konformacyjną i dimeryzację VP16-EL222, co odsłania domenę wiążącą DNA i umożliwia transkrypcję z PC120. Rysunek został zmodyfikowany z Zhao et al.7. (B) Obwody OptoINVRT wykorzystują regulony GAL (pokazane) lub Q do indukowania ekspresji w ciemności. W obwodach opartych na GAL VP16-EL222 i GAL4 są konstytutywnie wyrażane, podczas gdy PC120 napędza ekspresję represora GAL80 (w obwodach opartych na Q GAL4 i GAL80 są zastępowane odpowiednio przez QF2 i QS, a zamiast promotora GAL stosuje się syntetyczny promotor zawierający QUAS). W świetle Gal80p zapobiega aktywacji genu będącego przedmiotem zainteresowania z PGAL1. W ciemności GAL80 nie ulega ekspresji i szybko ulega degradacji poprzez fuzję go z konstytutywną domeną degronową (mała brązowa domena), co pozwala na aktywację PGAL1 przez Gal4p. Rysunek został zmodyfikowany z Zhao et al.5. (C) Obwody OptoAMP wykorzystują również VP16-EL222 do sterowania regulonami GAL (pokazano) lub Q. W tych obwodach represor GAL80 (lub QS) jest konstytutywnie wyrażany i łączony z światłoczułym degronem (małą niebieską domeną) zapewniającym ścisłą represję w ciemności. PC120 i nadwrażliwy mutant VP16-EL222 kontrolują ekspresję GAL4 (lub QF2) za pomocą światła, co silnie aktywuje PGAL1 (lub promotor zawierający QUAS) w świetle. Obwody pochodzące z GAL mogą wykorzystywać zmodyfikowane formy PGAL1, takie jak PGAL1-M lub PGAL1-S, które mają zwiększoną aktywność, a także promotory typu dzikiego kontrolowane przez regulon GAL (PGAL1, PGAL10, PGAL2, PGAL7). Rysunek został zmodyfikowany z Zhao et al.12. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-introduction-2
Rysunek 2: Dwu- i trzyfazowe fermentacje w czasie. (A) Fermentacje dwufazowe prowadzone z odwróconymi obwodami składają się z fazy wzrostu napędzanej światłem i fazy produkcji ciemnej. W fazie wzrostu biomasa gromadzi się, ponieważ ścieżka produkcji pozostaje stłumiona. Po osiągnięciu pożądanego OD600 komórki są przesuwane do ciemności w celu dostosowania metabolicznego przed ponownym zawieszeniem w świeżych pożywkach w fazie produkcji. (B) W procesie trójfazowym fazy wzrostu, inkubacji i produkcji są określone przez unikalne harmonogramy światła, które mogą składać się z ciemnego okresu wzrostu, inkubacji pulsacyjnej i fazy produkcji w pełni oświetlonej. Figurka stworzona za pomocą Biorenderu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Obwody optogenetyczne zostały również opracowane do dynamicznej kontroli produkcji chemicznej i białkowej u E. coli. Obwody OptoLAC sterują bakteryjnym represorem LacI za pomocą reagującego na światło obwodu pDawn, który jest oparty na dwuskładnikowym systemie YF1/FixJ6 (Rysunek 3). Podobnie jak OptoINVRT5, obwody OptoLAC są zaprojektowane do tłumienia ekspresji genów w świetle i indukowania jej w ciemności. Poziomy ekspresji przy użyciu obwodów OptoLAC mogą dorównywać lub przewyższać te osiągnięte przy standardowej indukcji izopropylu β-d-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG), zachowując w ten sposób siłę indukcji chemicznej, oferując jednocześnie zwiększoną przestrajalność i odwracalność6. W związku z tym obwody OptoLAC umożliwiają skuteczną kontrolę optogenetyczną inżynierii metabolicznej u E. coli.

figure-introduction-3
Rysunek 3: Obwody OptoLAC do dynamicznej kontroli E. coli. Obwody OptoLAC dostosowują system pDawn i operon lac, aby osiągnąć aktywację w ciemności i tłumienie w świetle. W ciemności YF1 fosforyluje FixJ, który następnie aktywuje promotorP FixK2 do ekspresji represora cI. Represor cI zapobiega ekspresji represora lacI z promotora PR, co umożliwia transkrypcję genu będącego przedmiotem zainteresowania z promotora zawierającego lakO. I odwrotnie, niebieskie światło zmniejsza aktywność kinazy siatkowej YF1, odwracając fosforylację FixJ, a tym samym ekspresję cI, co depreparuje ekspresję lacI i zapobiega ekspresji promotora zawierającego lakO. Rysunek został zmodyfikowany z Lalwani et al.6. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Opisujemy tutaj podstawowe protokoły kontrolowanej światłem fermentacji S. cerevisiae i E. coli do produkcji chemicznej lub białkowej. Zarówno w przypadku drożdży, jak i bakterii, w pierwszej kolejności skupiamy się na fermentacji z fazą wzrostu napędzaną światłem i fazą produkcji wywołaną ciemnością, którą umożliwiają obiegi OptoINVRT i OptoLAC. Następnie opisujemy protokół trójfazowej (wzrost, indukcja, produkcja) fermentacji sterowanej światłem, która jest możliwa dzięki obwodom OptoAMP. Ponadto opisujemy, jak zwiększyć skalę fermentacji kontrolowanej optogenetycznie z mikropłytek do bioreaktorów w skali laboratoryjnej. Dzięki temu protokołowi staramy się zapewnić kompletny i łatwy do odtworzenia przewodnik dotyczący przeprowadzania fermentacji kontrolowanej światłem w produkcji chemicznej lub białkowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja chemiczna kontrolowana światłem przy użyciu obwodu S. cerevisiae OptoINVRT7

  1. Konstrukcja szczepu
    1. Uzyskaj szczep z his3 auksotrofią, ponieważ ten marker jest niezbędny dla większości istniejących plazmidów OptoINVRT 5. Jeśli szukasz regulacji optogenetycznej genu, który jest natywny dla S. cerevisiae, skonstruuj szczep, w którym usunięta jest dowolna endogenna kopia genu.
    2. Zlinearyzuj plazmid zawierający obwód OptoINVRT7, taki jak EZ-L4395, i zintegruj go z his3-locus szczepu auksotroficznego przy użyciu standardowych metod transformacji octanu litu15. W przypadku korzystania z plazmidu EZ-L439, który zawiera składniki tłumiące PGAL1 w świetle i aktywujące go w ciemności, należy dokonać linearyzacji w miejscu ograniczenia PmeI.
    3. Po przemianie odwirować komórki przy 150 x g przez 1 minutę i delikatnie ponownie zawiesić w 200 μl świeżej pożywki syntetycznej z kroplą histydyny (SC-His).
    4. Umieść całą objętość komórek na płytkach agarowych SC-His i inkubuj w temperaturze 30 °C przez 2-3 dni, aż pojawią się kolonie.
    5. Przygotuj kompetentne komórki z tego szczepu przy użyciu standardowych protokołów transformacji octanu litu i przekształć je za plazmidem zawierającym gen(y), który ma być kontrolowany optogenetycznie za promotorem PGAL1-M lub PGAL1-S5.
      UWAGA: Użycie plazmidu, który integruje się w δ-miejscach (YARCdelta5) i wybiera za pomocą Zeocin, pozwala na stabilną integrację z wieloma kopiami7,16,17,18.
    6. Po przetworzeniu odwirować kulturę o sile 150 x g przez 1 minutę i delikatnie ponownie zawiesić w 200 μl świeżej pożywki SC.
      UWAGA: Promotor PGAL1-M jest syntetyczną wersją promotora PGAL1 z usuniętymi miejscami represji Mig1p, podczas gdy PGAL1-S jest zmodyfikowaną wersją PGAL1-M, która ma dodatkowe miejsca wiązania aktywatora Gal4p. Zwykły promotor PGAL1 może być używany do kontrolowania wyrażenia; Jednak siła ekspresji będzie niższa niż w przypadku tych zaprojektowanych promotorów.
    7. Umieść całą objętość komórek na płytce agarowej z dekstrozą peptonową (YPD) z ekstraktem drożdżowym, jeśli integrujesz się z miejscami δ, lub na płytce SC, jeśli przekształcasz się z plazmidem zawierającym marker selekcyjny. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 16 godzin w stałym niebieskim świetle, aby utrzymać optogenetycznie kontrolowany gen w stanie stłumionym.
      UWAGA: W przypadku niektórych szczepów, kolonie mogą rosnąć szybciej, gdy są inkubowane w impulsach światła niebieskiego (np. 1 s wł./79 s wyłączone, 5 s włączone/75 s wyłączone, 10 s włączone/70 s wyłączone itp.), a nie w stałym oświetleniu, które należy określić eksperymentalnie dla każdego szczepu, jeśli to konieczne.
    8. Użyj dowolnego źródła światła o długości fali 465 nm i umieść panel LED ~40 cm nad płytką tak, aby natężenie światła wynosiło ~80-110 μmol/m2/s. Zmierz natężenie za pomocą miernika kwantowego (patrz Tabela materiałów).
    9. W przypadku integracji z miejscami δ utwórz replikę płytki na płytkach YPD zawierających zakres stężeń zeocyny od 400 μg/ml do 1,200 μg/ml, aby wybrać dla różnych numerów kopii całkowania5,7,12,16,17,18. Inkubować płytki replik w temperaturze 30 °C w stałym lub pulsacyjnym niebieskim świetle przez 2-3 dni, aż pojawią się kolonie.
  2. Wstępna selekcja najlepszych rodzin
    1. Wybierz osiem kolonii z każdej płytki i użyj ich do zaszczepienia 1 ml pożywki SC-His uzupełnionej 2% glukozą w indywidualnych dołkach 24-dołkowej płytki. Hodować na 24-dołkowych płytkach pod komórkami przez noc (16-20 godzin) w temperaturze 30 °C z prędkością 200 obr./min (średnica orbity 19 mm) wytrząsając się przy stałym oświetleniu światłem niebieskim.
    2. Następnego ranka rozcieńczyć każdą kulturę w 1 ml świeżej pożywki SC-His z 2% glukozą do wartości OD600 w zakresie 0,01-0,3 i hodować na 24-dołkowych płytkach pod stałym lub pulsacyjnym światłem w temperaturze 30 °C z 200 obr./min, wytrząsając, aż osiągną gęstość komórek między 2 a 9 wartościami OD600 (Rysunek 4A). Ilość czasu potrzebna na tę fazę wzrostu będzie zależeć od odmiany.
    3. Inkubować płytki w ciemności przez 4 godziny w temperaturze 30 °C, wstrząsając prędkością 200 obr./min, wyłączając panel świetlny i owijając płytki folią aluminiową.
      UWAGA: Ten etap pozwala komórkom metabolicznie przejść do fazy produkcji przed ponownym zawieszeniem w pożywce produkcyjnej.
    4. Aby rozpocząć fazę produkcji, należy odwirować kultury na 24-dołkowej płytce o sile 234 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić komórki w 1 ml świeżej pożywki SC z 2% glukozą. Uszczelnij płytki, aby zapobiec parowaniu pożądanego produktu, za pomocą sterylnej taśmy uszczelniającej do mikropłytek.
    5. Fermentować zamknięte płytki w ciemności przez 48 godzin w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min. Upewnij się, że talerze są owinięte folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło.
      UWAGA: Owijanie talerzy folią nie ogranicza dostępności tlenu ani gazów podczas fermentacji; Jednak sterylna taśma uszczelniająca ogranicza przenoszenie gazów. W taśmie można zrobić małe otwory, aby w razie potrzeby wprowadzić tlen.
  3. Zbiór i analiza
    1. Aby zebrać fermentacje, odwirować płytki przez 5 minut przy 234 x g i przenieść 800 μl supernatantu do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
    2. W zależności od interesującej substancji chemicznej należy przeprowadzić analizę przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC-MS) lub innej metody analitycznej przy użyciu techniki przygotowania próbki najlepiej dopasowanej do zastosowanego instrumentu.

2. Produkcja białek kontrolowana światłem za pomocą systemu E. coli OptoLAC

  1. Konstrukcja szczepu
    1. Transformacja elektrokompetentna BL21 DE3 ΔlacI ΔlacI-DE3 z plazmidem zawierającym obwód OptoLAC1B lub OptoLAC2B6 i plazmidem, który wyraża rekombinowane białko będące przedmiotem zainteresowania z promotora PT719.
    2. Po przekształceniu odzyskuj komórki przez 1 godzinę w 1 ml super optymalnego bulionu z represją kataboliczną (SOC; 2% trypton, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glukozy) w temperaturze 37 °C z rotacją lub wstrząsaniem.
      UWAGA: Plazmid zawierający białko będące przedmiotem zainteresowania musi być zgodny z plazmidem OptoLAC (tj. inny marker oporności i początek replikacji) i nie może zawierać kopii lacI.
    3. Odwirować komórki przy 4845 x g przez 3 minuty i zagęścić osad w 200 μl pożywki bulionu lizogennego (LB). Umieść całe skoncentrowane komórki na płytce agarowej LB z odpowiednimi antybiotykami i hoduj w temperaturze 37 °C przez noc w ciągłym niebieskim świetle, aby utrzymać stłumioną ekspresję białka.
  2. Wstępne badanie przesiewowe w celu weryfikacji ekspresji
    1. Weź trzy pojedyncze kolonie i użyj ich do zaszczepienia 1 ml pożywki LB odpowiednimi antybiotykami w pojedynczych dołkach 24-dołkowej płytki. Rośnie przez noc (16-20 h) w temperaturze 37 °C z prędkością 200 obr./min, wstrząsając przy stałym oświetleniu światłem niebieskim (Rysunek 4A).
    2. Następnego dnia użyj 1,5 μl kultury do zmierzenia OD600 w spektrofotometrze z pomiarem mikroobjętości. Rozcieńczyć kultury na 1 ml świeżego LB na płytkach 24-dołkowych do wartości OD600 w zakresie 0,01-0,1.
    3. Hoduj kultury w temperaturze 37 °C z prędkością 200 obr./min, wytrząsając w niebieskim świetle przez 2-3 godziny. Począwszy od drugiej godziny, wykonuj pomiary OD600 co 15 minut, aby upewnić się, że kultury nie przerosną zakresu OD600 0,1-1,5.
    4. Gdy kultury osiągną pożądaną średnicę zewnętrzną600, wyłącz panel świetlny i zawiń płytkę w folię aluminiową, aby rozpocząć fazę produkcji. Przechowywać płytkę w ciemności przez 8 godzin (37 °C), 20 godzin (30 °C) lub 48 godzin (18 °C), wstrząsając 200 obr./min.
    5. Zmierz i zapisz końcową wartość OD600 dla każdej kultury.
  3. Zbiór i analiza
    1. Przenieś 800 μl każdej kultury do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wiruj przez 5 minut przy 17 000 x g.
    2. Zawiesić osad komórkowy w 200 μl buforu do sporządzania zawiesiny (Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM).
      UWAGA: Stężenie NaCl można dostosować w oparciu o analizowane białko rekombinowane.
    3. Dodać 50 μl 6 do próbek dodecylosiarczanu sodu (SDS) (Tris 375 mM, pH 6,8, SDS 9%, glicerol 50%, błękit bromofenolowy 0,03%, DTT 9%). Inkubować w temperaturze 100 °C przez 10 minut z wytrząsaniem z prędkością 700 obr./min w termomikserze.
    4. Załaduj ~3-20 μL kultury w 12% żelu SDS-PAGE. Przyjmując jako wskazówkę końcowy pomiar OD600, załadować w przybliżeniu taką samą ilość białka dla każdej próbki (co odpowiada 10 μl próbki odpowiadającej końcowej wartości OD600 wynoszącej 1). Użyj zasilacza, aby uruchomić elektroforezę pod napięciem 100 V, aż żel zostanie całkowicie rozwiązany.
    5. Zabarwić żel roztworem błękitu brylantowego Coomassie G-250, podgrzewając przez 30-40 s w kuchence mikrofalowej, a następnie inkubując na rotatorze platformowym przez co najmniej 15 minut.
    6. Dwukrotnie spłucz wodą dejonizowaną i odplamiaj na rotatorze platformy przez co najmniej 30 minut (lub przez noc), dodając dwie chusteczki czyszczące zawiązane w węzeł, aby pomóc wchłonąć plamę. Gotuj żel w wystarczającej ilości wody w kuchence mikrofalowej przez 15 minut, aby przyspieszyć proces odbarwiania.

3. Fermentacja trójfazowa z wykorzystaniem systemu OptoAMP S. cerevisiae

  1. Konstrukcja szczepu
    1. Uzyskaj szczep z markerem auksotroficznym his3, ponieważ ten marker jest niezbędny do korzystania z istniejących plazmidów OptoAMP5. Jeśli szukasz regulacji optogenetycznej genu, który jest natywny dla S. cerevisiae, skonstruuj szczep, w którym endogenna kopia tego genu jest usunięta.
    2. Zlinearyzuj plazmid zawierający obwód OptoAMP4, taki jak EZ-L58012, i zintegruj go z locus his3 szczepu auksotroficznego przy użyciu standardowych metod transformacji octanu litu15. W przypadku korzystania z EZ-L580 należy zlinearyzować plazmid w miejscu restrykcji PmeI.
    3. Po przemianie odwirować komórki przy sile 150 x g przez 1 minutę i delikatnie ponownie zawiesić w 200 μl świeżej pożywki SC-His.
    4. Pokryć całą objętość komórek na pożywce selektywnej (SC-His-agar) i inkubować w temperaturze 30 °C przez 2-3 dni, aż pojawią się kolonie.
    5. Przygotuj kompetentne komórki z tego szczepu i przekształć je za plazmidem zawierającym gen(y), który ma być kontrolowany optogenetycznie za promotorem PGAL1-S12.
      UWAGA: Użycie plazmidu, który integruje się w δ miejscach i selekcjonuje za pomocą Zeocyny, pozwala na stabilną integrację i selekcję wielu kopii.
    6. Po przekształceniu odwirować kulturę przy sile 150 x g przez 1 minutę i delikatnie ponownie zawiesić w 200 μl świeżej pożywki SC.
      UWAGA: Promotor PGAL1-S jest syntetyczną wersją promotora PGAL1, w której miejsca represji Mig1p są usuwane i dodawane są dodatkowe miejsca wiązania aktywatora Gal4p. Można użyć zwykłego promotora PGAL1; Jednak siła ekspresji będzie niższa niż w tym zaprojektowanym promotorze.
    7. Umieścić całą objętość komórek na płytce agarowej YPD lub SC-dropout i inkubować w temperaturze 30 °C przez 16 godzin w ciemności (owinięte folią aluminiową). Inkubacja w ciemności utrzymuje gen kontrolowany optogenetycznie w stanie stłumienia, co pozwala komórkom skierować swoje zasoby metaboliczne na wzrost komórek, a nie na produkcję chemiczną.
    8. W przypadku integracji z miejscami δ, replikuj płytkę na płytkach YPD zawierających zakres stężeń zeocyny, aby wybrać dla różnych numerów kopii całkowania. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C w ciemności (owinięte folią aluminiową) przez 2-3 dni, aż pojawią się kolonie.
  2. Wstępna selekcja najlepszych rodzin
    1. Wybierz osiem kolonii z każdej płytki i użyj ich do zaszczepienia 1 ml pożywki SC-His z 2% glukozą w indywidualnych dołkach 24-dołkowej płytki. Hoduj komórki przez noc (16-20 godzin) w ciemności w temperaturze 30 °C z potrząsaniem 200 obr./min.
    2. Następnego ranka rozcieńczyć każdą kulturę w 1 ml świeżej pożywki SC-His z 2% glukozą do 0,1 OD600 i rosnąć w ciemności w temperaturze 30 °C z prędkością 200 obr./min, wstrząsając, aż osiągną OD600 równe 3. Zawiń talerze w folię aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło. Ilość czasu potrzebna na tę fazę wzrostu będzie zależeć od odmiany.
    3. Aby rozpocząć fazę indukcji, należy inkubować płytki w świetle pulsacyjnym (na przykład 5 s włączenia/95 s wyłączenia) przez 12 godzin w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem 200 obr./min. Użyj dowolnego źródła światła o długości fali 465 nm i umieść panel LED nad płytką tak, aby natężenie światła wynosiło ~80-110 μmol/m2/s dla uzyskania optymalnych rezultatów (Rysunek 4A).
      UWAGA: Optymalny czas trwania impulsu świetlnego dla tej inkubacji będzie się różnić w zależności od wytwarzanej substancji chemicznej. Zaleca się wyświetlanie różnych harmonogramów oświetlenia od 0,1% (np. 1 s na 999 s wyłączonych) do 100% (pełne światło).
    4. Aby rozpocząć fazę produkcji, należy odwirować kultury o sile 234 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić w świeżej pożywce SC-His z 2% glukozą. Uszczelnij płytki, aby zapobiec parowaniu pożądanego produktu, za pomocą sterylnej taśmy uszczelniającej do mikropłytek.
    5. Fermentować szczelnie zamknięte płytki w świetle przez 48 godzin w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min. Na tym etapie zoptymalizuj harmonogram oświetlenia, ponieważ niektóre chemikalia korzystają z pulsacyjnej fazy produkcji, a nie z pełnego światła.
  3. Zbiór i analiza
    1. Zebrać wyniki fermentacji, odwirowując płytki przez 5 minut przy 234 x g i przenosząc 800 μl supernatantu do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
    2. W zależności od interesującej substancji chemicznej należy przeprowadzić analizę przy użyciu HPLC, GC-MS lub innej metody analitycznej przy użyciu techniki przygotowania próbki najlepiej dopasowanej do używanego instrumentu.

4. Produkcja chemiczna (mewalonianu) z E. coli w bioreaktorze sterowanym światłem

  1. Wstępna inokulacja i konfiguracja bioreaktora
    1. Zaszczepić kolonię szczepu E. coli zmodyfikowanego przy użyciu kontrolowanej światłem produkcji chemicznej w 5 ml minimalnych soli M9 (3,37 mM Na2HPO4, 2,2 mM KH2PO4, 0,855 mM NaCl, 0,935 mM NH4Cl) uzupełnionych 0,2% w/v casaminokwasami, 5% w/v glukozy i mieszaniną metali śladowych20 (0,0084 g/L EDTA, 0,0025 g/L CoCl2, 0,015 g/L MnCl2, 0,0015 g/L CuCl2, 0,003 g/L H3BO3, 0,0025 g/L Na2MoO4, 0,008 g/L ZnCl2, 0,06 g/L cytrynian Fe(III), 0,0045 g/L tiamina, 1,3 g/L MgSO4) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
    2. Hoduj kulturę przez noc w temperaturze 30 °C z prędkością 200 obr./min, wstrząsając przy niebieskim oświetleniu.
    3. Ustaw płytę czołową zbiornika bioreaktora, upewniając się, że zainstalowane są następujące porty: wkładka do sondy termicznej; sonda tlenu rozpuszczonego (DO); rozpylacz gazu - podłączyć do źródła powietrza przez filtr 0,2 μm; wirnik; skraplacz gazu - podłączyć do filtra 0,2 μm; przewód chłodzący (x2); przewody zasilające (x2) - jeden do dodawania mediów, jeden do kontroli pH; przewód do pobierania próbek - upewnić się, że sięga do dna zbiornika; pusty port; Sonda pH - przed instalacją skalibruj sondę z wzorcami pH = 4 i pH = 7, albo autoklaw z resztą naczynia, albo wysterylizuj 95% etanolem i asepcie włóż przed ustawieniem.
    4. Napełnij naczynie 1 litrem przefiltrowanej wody, zamocuj płytę głowicy i dokręć, upewniając się, że O-ring dobrze przylega i uszczelnia.
    5. Zakryj wszelkie otwory w reaktorze folią aluminiową.
    6. Przygotuj trzy paski rurki: jeden do usuwania wody, jeden do wprowadzania paszy i jeden do kontroli pH. Przykryj końce folią aluminiową i zawiń wszystkie rurki w folię aluminiową.
      UWAGA: NH4OH, który jest używany do regulacji pH, nie przepływa płynnie w rurkach silikonowych, co może prowadzić do niedokładnych prędkości przepływu i nadmiernej podstawifikacji kultury. Aby uniknąć tego problemu, należy używać biokompatybilnych przewodów pompy (BPT) do zasilania NH4OH.
    7. Autoklaw w bioreaktorze i rurkach, używając 30-minutowego cyklu cieczy.
    8. Usuń materiały z autoklawu. Gdy ostygnie na tyle, aby można było go obsługiwać, podłącz wirnik, sondy pH i DO, źródło powietrza, wlot i wylot skraplacza oraz wlot i wylot chłodzenia do stacji sterującej.
    9. Włóż sondę termiczną i przykryj naczynie płaszczem grzewczym. Przymocuj kurtkę w kierunku górnej części naczynia, aby uniknąć blokowania kultury przed ekspozycją na światło.
    10. Podłączyć jedną ze sterylnych probówek do przewodu do pobierania próbek i zabezpieczyć przez pompę do pobierania próbek. Umieść drugi koniec tak, aby spływał do pustego pojemnika, który może pomieścić co najmniej 1 l. Spuść wodę z wnętrza naczynia.
    11. Podłącz kolejną sterylną rurkę do jednego z przewodów zasilających i zabezpiecz przez jedną z pomp zasilających. Podłącz drugi koniec rurki do butelki z podłożem M9. Wprowadzić pożywkę do reaktora.
    12. Podłącz kolejną sterylną rurkę do jednego z przewodów zasilających i zabezpiecz przez jedną z pomp zasilających. Podłącz drugi koniec rurki do butelki zawierającej 28%-30% NH4OH,
      UWAGA: NH4OH jest. Pracuj pod wyciągiem podczas przenoszenia do butelki do karmienia i upewnij się, że butelka do karmienia jest umieszczona w dodatkowym zbiorniku.
    13. Umieść trzy panele świetlne w trójkątnej formacji w odległości ~20 cm od reaktora, sprawdzając, czy natężenie światła na powierzchni naczynia osiąga ~80-110 μmol/m2/s z każdej strony (Rysunek 4B).
    14. Następnego dnia włącz system bioreaktora i agregat chłodniczy. Ustawić nastawę temperatury reaktora na 37 °C, wartość zadaną pH na 7,0, a mieszanie na 200 obr./min. Płaszcz grzewczy powinien się włączyć.
    15. Skalibruj sondę DO, najpierw czekając, aż pomiary temperatury i DO staną się stałe (będzie to 100% wartość zadana). Następnie odłącz sondę od systemu (będzie to nastawa 0%). Powtarzaj, aż pomiar DO ustabilizuje się na poziomie 100%, gdy sonda jest podłączona, a następnie ustaw nastawę DO na 20%.
  2. Produkcja chemiczna kontrolowana światłem
    1. Zaszczepić bioreaktor do początkowego OD600 0,001-0,1. Włącz panele świetlne, aby zainicjować wzrost.
    2. Po 3 godzinach rozpocząć pobieranie próbek z linii pobierania próbek w celu wykonania pomiarów OD600, aby uniknąć przerostu optymalnej gęstości komórek indukcji (ρs). Po osiągnięciu optymalnego ρs (optymalna wartość dla produkcji mewalonianu wynosi 0,17), wyłącz panele świetlne, przykryj reaktor folią aluminiową i owiń konfigurację czarną tkaniną, aby rozpocząć ciemną fazę produkcji.
    3. Dodać 50 μl środka przeciwpieniącego, 8 godzin po przełączeniu w ciemność. Odkręć pusty port i odpipetuj płyn przeciwpieniący bezpośrednio do reaktora.
    4. Za pomocą portu pobierania próbek można okresowo pobierać próbki do analizy metodą HPLC lub GC.
  3. Demontaż i analiza
    1. Po zakończeniu eksperymentu wyłącz system. Ostrożnie odkręć sondy DO i pH i umyj je wodą z mydłem. Odkręć głowicę i umyj ją wodą z mydłem za pomocą szczotki.
    2. Przenieść kulturę do pustego pojemnika i dodać wybielacz do końcowego stężenia 10% v/v. Umieścić w dygestorii i usunąć po 30 minutach.
    3. Umyj naczynie reaktora wodą z mydłem za pomocą szczotki.
    4. Przygotuj próbki do analizy w oparciu o interesujący Cię produkt. Do produkcji mewalonianu należy zmieszać 560 μl kultury ze 140 μl 0,5 M HCl i wirować z dużą prędkością przez 1 min. To przekształca mewalonian w (±)-mewalonolakton.
      UWAGA: HCl stanowi zagrożenie dla zdrowia. Z odpowiednimi środkami ochrony osobistej należy obchodzić się z odpowiednimi środkami ochrony osobistej i upewnić się, że probówki z próbkami są prawidłowo zakryte przed wirowaniem.
    5. Wirować przy 17 000 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść 250 μl supernatantu do fiolki HPLC.
    6. W przypadku mewalonianu próbki należy analizować przy użyciu kolumny jonowymiennej z kwasami organicznymi. Określ ilościowo produkcję za pomocą detektora indeksu refrakcji (RID), porównując obszary pików z wzorcem (±)-mewalonolaktonu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetyczna regulacja metabolizmu mikrobiologicznego została pomyślnie wdrożona do produkcji różnorodnych produktów, w tym biopaliw, chemikaliów luzem, białek i produktów naturalnych5,6,7,12,13. Większość z tych procesów jest zaprojektowana tak, aby wzrost komórek zachodził w świetle (gdy niska gęstość komórek stwarza minimalne wyzwania związane z penetracj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kontrola dynamiczna jest od dawna stosowana w celu poprawy wydajności inżynierii metabolicznej i produkcji białek rekombinowanych4. Zmiany w ekspresji enzymatycznej są najczęściej realizowane za pomocą induktorów chemicznych, takich jak IPTG21, galaktoza22 i tetracyklina23, ale są również pośredniczone przy użyciu warunków procesu, takich jak temperatura i pH. Optogenetyczna kontrola ekspresji genów eliminuje potrzebę zmian pa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy złożyli wnioski patentowe na obwody i metody optogenetyczne opisane w niniejszym artykule.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te badania były wspierane przez Departament Energii Stanów Zjednoczonych, Biuro Nauki, Biuro Badań Biologicznych i Środowiskowych Nagroda Numer DE-SC0019363, Nagroda NSF CAREER CBET-1751840, The Pew Charitable Trusts, oraz Camille Dreyfus Teacher-Scholar Award.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kontrolowana światłem produkcja chemiczna przy użyciu S. cerevisiae
24-well culture plateUSA ScientificCC7672-7524
Agar w proszkuThermo Fisher Scientific303991049
Folia aluminiowaReynoldsB004NG90YO
BioSpectrometer z μ KuwetaEppendorf6135000923
Niebieski panel LEDHQRP884667106091218
EZ-L439 OptoINVRT7 PlazmidNie dotyczyNiedotyczy Patrz Referencja 1
GlukozaThermo Fisher Scientific501879892 (G8270-5KG)
MikrowirówkaThermo Fisher Scientific75002403
Probówkido mikrowirówekUSA Scientific1615-5510
Wytrząsarka orbitalnaYamato Scientific AmericaSOU-300
Szalka PetriegoCelltreat229656
PmeINew England BiolabsR0560L
Miernik kwantowyApogee InstrumentsMQ-510
Replika urządzenia do galwanizacjiThomas ScientificF37848-0000
Repliki podkładek galwanicznychSunrise Science Products3005-012
SC-His w proszkuSunrise Science Products1303-030
SC Kompletny proszekSunrise Science Products1459-100
Sterylna folia uszczelniającaExcel ScientificSTR-SEAL-PLT
Płytki agarowe YPDVWR100217-054
ZeocinThermo Fisher ScientificR25005
Kontrolowana światłem produkcja białka przy użyciu E. coli
6X SDS Sample BufferCepham Life Sciences10502
12% żele białkowe z akryloamiduThermo Fisher ScientificNP0341BOX
24-dołkowa płytka hodowlanaUSA ScientificCC7672-7524
Folia aluminiowaReynoldsB004NG90YO
BioSpectrometer z μ kuwetaEppendorf6135000923
Niebieski panel LEDHQRP884667106091218
Coomassie Brilliant Blue G-250Thermo Fisher Scientific20279
Komórka do elektroforezyBio-Rad1658004
Zasilacz do elektroforezyBio-Rad1645050
LB bulion (Miller)Fisher Scientific
MikrowirówkaThermo Fisher Scientific75002403
Probówki do mikrowirówekUSA Scientific1615-5510
NaClThomas ScientificSX0425-1
Plazmidy OptoLACN/A/APatrz odniesienie 2
Wytrząsarka orbitalnaYamato Scientific AmericaSOU-300
PetriegoCelltreat229656
Miernik kwantowyApogee InstrumentsMQ-510
SOC mediumThermo Fisher Scientific15544034
ThermomixerEppendorf5382000015
Tris baseFisher ScientificBP1521
Fermentacja trójfazowa przy użyciu S. cerevisiae
co protokół "Produkcja chemiczna kontrolowana światłem przy użyciu S. cerevisiae" oraz następujące:
EZ-L580 OptoAMP4 PlazmidN/AN/APatrz odniesienie 10
Produkcja chemiczna w bioreaktorze sterowanym światłem
Folia aluminiowaReynoldsB004NG90YO
Bioreaktor przeciwpieniącySigma-AldrichA8311
ze stacją kontrolnąEppendorfB120110001
BioSpectrometer z μ kuwetaEppendorf6135000923
BleachVWR Scientific89501-620 (CS)
Niebieski panel LEDHQRP884667106091218
rurka BPTFisher Scientific14-170-15
GlukozaThermo Fisher Scientific501879892 (G8270-5KG)
Kwas solny (HCl)Fisher Scientific7647-01-0
M9 Sole minimalneThermo Fisher ScientificA1374401
MikrowirówkaThermo Fisher Scientific75002403
Probówki do mikrowirówekUSA Scientific1615-5510
Roztwór NH4OHSigma-AldrichI0503-1VL
Wytrząsarka orbitalnaYamato Scientific AmericaSOU-300
Miernik kwantowyApogee InstrumentsMQ-510
SC Kompletny proszekSunrise Science Products1459-100
BP97235 N szalka Te same materiały,

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Figueroa, D., Rojas, V., Romero, A., Larrondo, L. F., Salinas, F. The rise and shine of yeast optogenetics. Yeast. 38 (2), 131-146 (2021).
  2. Pouzet, S., et al. The promise of optogenetics for bioproduction: Dynamic control strategies and scale-up instruments. Bioengineering. 7 (4), 151(2020).
  3. Venayak, N., Anesiadis, N., Cluett, W. R., Mahadevan, R. Engineering metabolism through dynamic control. Current Opinion in Biotechnology. 34, 142-152 (2015).
  4. Lalwani, M. A., Zhao, E. M., Avalos, J. L. Current and future modalities of dynamic control in metabolic engineering. Current Opinion in Biotechnology. 52, 56-65 (2018).
  5. Zhao, E. M., et al. Design and characterization of rapid optogenetic circuits for dynamic control in yeast metabolic engineering. ACS Synthetic Biology. 9 (12), 3254-3266 (2020).
  6. Lalwani, M. A., et al. Optogenetic control of the lac operon for bacterial chemical and protein production. Nature Chemical Biology. 17 (1), 71-79 (2021).
  7. Zhao, E. M., et al. Optogenetic regulation of engineered cellular metabolism for microbial chemical production. Nature. 555 (7698), 683-687 (2018).
  8. Baumschlager, A., Khammash, M. Synthetic biological approaches for optogenetics and tools for transcriptional light-control in bacteria. Advanced Biology. 5 (5), 2000256(2021).
  9. Dvorak, P., et al. Exacerbation of substrate toxicity by IPTG in Escherichia coli BL21(DE3) carrying a synthetic metabolic pathway. Microbial Cell Factories. 14, 201(2015).
  10. Hartline, C. J., Schmitz, A. C., Han, Y., Zhang, F. Dynamic control in metabolic engineering: Theories, tools, and applications. Metabolic Engineering. 63, 126-140 (2021).
  11. Ni, C., Dinh, C. V., Prather, K. L. J. Dynamic control of metabolism. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 12, 519-560 (2021).
  12. Zhao, E. M., et al. Optogenetic amplification circuits for light-induced metabolic control. ACS Synthetic Biology. 10 (5), 1143-1154 (2021).
  13. Lalwani, M. A., Zhao, E. M., Wegner, S. A., Avalos, J. L. The Neurospora crassa Inducible Q System Enables Simultaneous Optogenetic Amplification and Inversion in Saccharomyces cerevisiae for Bidirectional Control of Gene Expression. ACS Synthetic Biology. 10 (8), 2060-2075 (2021).
  14. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  15. Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
  16. Marx, H., Mecklenbräuker, A., Gasser, B., Sauer, M., Mattanovich, D. Directed gene copy number amplification in Pichia pastoris by vector integration into the ribosomal DNA locus. FEMS Yeast Research. 9 (8), 1260-1270 (2009).
  17. Nordén, K., et al. Increasing gene dosage greatly enhances recombinant expression of aquaporins in Pichia pastoris. BMC Biotechnology. 11, 47(2011).
  18. Zhao, E. M., et al. Light-based control of metabolic flux through assembly of synthetic organelles. Nature Chemical Biology. 15 (6), 589-597 (2019).
  19. Dowee, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).
  20. Zhou, K., Edgar, S., Stephanopoulos, G. Engineering microbes to synthesize plant isoprenoids. Methods in Enzymology. 575, 225-245 (2016).
  21. Arfman, N., Worrell, V., Ingram, L. O. Use of the tac promoter and lacI(q) for the controlled expression of Zymomonas mobilis fermentative genes in Escherichia coli and Zymomonas mobilis. Journal of Bacteriology. 174 (22), 7370-7378 (1992).
  22. Steen, E. J., et al. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of n-butanol. Microbial Cell Factories. 7 (1), 1-8 (2008).
  23. Tan, S. Z., Manchester, S., Prather, K. L. J. Controlling central carbon metabolism for improved pathway yields in Saccharomyces cerevisiae. ACS Synthetic Biology. 5 (2), 116-124 (2015).
  24. Jayaraman, P., et al. Blue light-mediated transcriptional activation and repression of gene expression in bacteria. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6994(2016).
  25. Fernandez-Rodriguez, J., Moser, F., Song, M., Voigt, C. A. Engineering RGB color vision into Escherichia coli. Nature Chemical Biology. 13 (7), 706-708 (2017).
  26. Ding, Q., et al. Light-powered Escherichia coli cell division for chemical production. Nature Communications. 11 (1), 1-14 (2020).
  27. Senoo, S., Tandar, S. T., Kitamura, S., Toya, Y., Shimizu, H. Light-inducible flux control of triosephosphate isomerase on glycolysis in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 116 (12), 3292-3300 (2019).
  28. Ramakrishnan, P., Tabor, J. J. Repurposing synechocystis PCC6803 UirS-UirR as a UV-violet/green photoreversible transcriptional regulatory tool in E. Coli. ACS Synthetic Biology. 5 (7), 733-740 (2016).
  29. Tabor, J. J., Levskaya, A., Voigt, C. A. Multichromatic control of gene expression in escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 405 (2), 315-324 (2011).
  30. Stewart, C. J., McClean, M. N. Design and implementation of an automated illuminating, culturing, and sampling system for microbial optogenetic applications. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (120), e54894(2017).
  31. Grødem, E. O. S., Sweeney, K., McClean, M. N. Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments. BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).
  32. Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, (2016).
  33. Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
  34. Steel, H., Habgood, R., Kelly, C., Papachristodoulou, A. In situ characterisation and manipulation of biological systems with Chi.Bio. PLoS Biology. 18 (7), (2020).
  35. Carrasco-López, C., García-Echauri, S. A., Kichuk, T., Avalos, J. L. Optogenetics and biosensors set the stage for metabolic cybergenetics. Current Opinion in Biotechnology. 65, 296-309 (2020).
  36. Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7 (1), 1-11 (2016).
  37. Melendez, J., et al. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative Biology: Quantitative Biosciences From Nano to Macro. 6 (3), 366-372 (2014).
  38. Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
  39. Castillo-Hair, S. M., Baerman, E. A., Fujita, M., Igoshin, O. A., Tabor, J. J. Optogenetic control of Bacillus subtilis gene expression. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
  40. Xia, A., et al. Optogenetic modification of pseudomonas aeruginosa enables controllable twitching motility and host infection. ACS Synthetic Biology. 10 (3), 531-541 (2021).
  41. Pu, L., Yang, S., Xia, A., Jin, F. Optogenetics manipulation enables prevention of biofilm formation of engineered pseudomonas aeruginosa on surfaces. ACS Synthetic Biology. 7 (1), 200-208 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Fermentacja sterowana wiat emregulacja optogenetycznamikrobiologiczne fabryki kom rkoweprodukcja bia ek rekombinowanychEscherichia coliSaccharomyces cerevisiaedynamiczna ekspresja gen weksperymenty w bioreaktorachindukcja wiat em impulsowymprodukcja chemiczna

Powiązane artykuły