Method Article

Protokół oparty na mikrodysekcji laserowej do analizy LC-MS/MS profilu proteomicznego granulek neuromelaniny

DOI:

10.3791/63289

⸱

December 16th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Medizinisches Proteom-Center, Medical Faculty, Ruhr-University Bochum, 2Medical Proteome Analysis, Center for Proteindiagnostics (PRODI), Ruhr-University Bochum, 3Center of Mental Health; Clinic and Policlinic for Psychiatry, Psychosomatics and Psychotherapy, University Hospital Wuerzburg, 4Psychiatry Department of Clinical Research, University of Southern Denmark Odense University Hospital, 5Center of Mental Health, Department of Child and Adolescent Psychiatry, Psychosomatics and Psychotherapy, University Hospital of Wuerzburg, University of Wuerzburg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Solidny protokół jest tutaj prezentowany do izolowania granulek neuromelaniny z ludzkiej tkanki pośmiertnej istoty czarnej pars compacta za pomocą mikrodysekcji laserowej. Ten zmieniony i zoptymalizowany protokół znacznie minimalizuje wymagany czas pobierania próbek, zmniejsza wymaganą ilość próbki oraz usprawnia identyfikację i kwantyfikację białek za pomocą analizy LC-MS/MS.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuromelanina to czarno-brązowawy pigment, obecny w tak zwanych granulkach neuromelaniny (NMG) w neuronach dopaminergicznych istoty czarnej pars compacta. Oprócz neuromelaniny, NMG zawierają różne białka, lipidy i metale. Chociaż neurony dopaminergiczne zawierające NMG są preferencyjnie tracone w chorobach neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Parkinsona i demencja z ciałami Lewy'ego, niewiele wiadomo o mechanizmie powstawania NMG i roli NMG w zdrowiu i chorobie. W związku z tym niezbędne są dalsze badania nad charakterystyką molekularną NMG. Niestety, standardowe protokoły izolacji białek opierają się na ultrawirowaniu w gradiencie gęstości i dlatego wymagają dużych ilości tkanki ludzkiej. W ten sposób ustanowiono tutaj protokół oparty na zautomatyzowanej mikrodysekcji laserowej (LMD), który umożliwia pobieranie NMG i otaczającej tkanki istoty czarnej (SN) przy użyciu minimalnych ilości tkanki w bezstronny, zautomatyzowany sposób. Wycięte próbki są następnie analizowane za pomocą spektrometrii mas w celu rozszyfrowania ich składu proteomicznego. W tym procesie zidentyfikowano 2079 białek, z których 514 zidentyfikowano wyłącznie w NMG, a 181 w SN. Obecne wyniki zostały porównane z poprzednim badaniem, w którym zastosowano podobne podejście oparte na LMD, osiągając nakładanie się 87,6% dla obu proteomów, weryfikując możliwość zastosowania przedstawionego tutaj poprawionego i zoptymalizowanego protokołu. Aby potwierdzić obecne wyniki, interesujące białka analizowano za pomocą ukierunkowanej spektrometrii mas, np. eksperymentów z równoległym monitorowaniem reakcji (PRM).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Każda tkanka składa się z niejednorodnej mieszaniny różnych typów komórek, ale specyficzna izolacja jednego typu komórki często jest niezbędna do dokładniejszej charakterystyki. Mikrodysekcja laserowa (LMD), łącząca mikroskop z aplikacją laserową, jest potężnym narzędziem do specyficznej izolacji obszarów tkanek, pojedynczych komórek lub podstruktur komórkowych ze złożonego kompozytu. Zastosowanie LMD w połączeniu ze spektrometrią mas (LMD-MS) zostało już z powodzeniem wdrożone w przypadku kilku pytań badawczych, w tym izolacji DNA1, RNA2 i proteins3,4,5. W tym protokole opisano poprawiony i zoptymalizowany protokół LMD-MS do analizy proteomicznej ludzkiej pośmiertnej tkanki mózgowej i składników subkomórkowych w celu rozszyfrowania nowych patomechanizmów choroby Parkinsona.

Neuromelanina to, prawie nierozpuszczalny pigment znajdujący się w katecholaminergicznym, wytwarzającym dopaminę neuronach istoty czarnej pars compacta6. Wraz z białkami i lipidami gromadzi się w ziarnistościach przypominających organelle otoczonych podwójną błoną, zwaną granulkami neuromelaniny (NMG)7,8,9. NMG można zaobserwować u ludzi od trzeciego roku życia, zwiększając swoją ilość i gęstość w procesie starzenia10,11. Do tej pory nie ma jednoznacznej hipotezy na temat powstawania neuromelaniny, ale jednym z założeń jest to, że neuromelanina powstaje w wyniku utleniania dopaminy12. Inne hipotezy opierają się na enzymatycznej produkcji neuromelaniny (np. tyrozynazy)13. Stwierdzono, że sama neuromelanina ma wysokie powinowactwo do wiązania lipidów, toksyn, jonów metali i pestycydów. Na podstawie tych ustaleń zakłada się, że powstawanie NMG chroni komórkę przed gromadzeniem się substancji toksycznych i utleniających oraz przed toksynami środowiskowymi14,15. Oprócz tej funkcji neuroprotekcyjnej istnieją dowody na to, że neuromelanina może powodować efekty neurodegeneracyjne, np. poprzez wysycenie żelaza i późniejszą katalizę wolnych rodników16,17. Co więcej, neuromelanina uwalniana podczas procesów neurodegeneracyjnych może być rozkładana przez nadtlenek wodoru, co może przyspieszać martwicę przez reaktywne metale i inne toksyczne związki wcześniej związane z neuromelaniną i może przyczyniać się do zapalenia nerwów i uszkodzenia komórek18. Jednak do tej pory dokładna rola NMG w procesach neurodegeneracyjnych, takich jak przebieg choroby Parkinsona, nie jest do końca poznana. Mimo to NMG wydają się być zaangażowane w patogenezę choroby Parkinsona, a ich specyficzna analiza ma ogromne znaczenie dla rozwikłania ich roli w neurodegeneracji. Niestety, powszechne zwierzęta laboratoryjne (np. myszy i szczury) oraz linie komórkowe nie mają NMGs19. Dlatego naukowcy szczególnie polegają na pośmiertnej tkance mózgowej do swojej analizy. W przeszłości izolacja NMG za pomocą wirowania w gradionym gradieniu gęstości opierała się na dostępności dużych ilości istoty czarnej tissue20,21. Obecnie LMD prezentuje wszechstronne narzędzie do specyficznego izolowania NMG z próbek ludzkiego mózgu, a następnie analizowania ich za pomocą LC-MS/MS.

W tym protokole przedstawiona jest ulepszona i zautomatyzowana wersja poprzedniego protokołu22 do izolacji NMG i otaczających tkanek (SN), umożliwiając szybsze generowanie próbek, większą liczbę zidentyfikowanych i ilościowo oznaczonych białek oraz znaczne zmniejszenie wymaganych ilości tkanek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użycie ludzkiej tkanki mózgowej zostało zatwierdzone przez komisję etyki Uniwersytetu Ruhry w Bochum w Niemczech (numer pliku 4760-13), zgodnie z niemieckimi przepisami i wytycznymi. Protokół ten został zastosowany do komercyjnie uzyskanych plastrów tkanek substantia nigra pars compacta. Graficzny przegląd prezentowanego protokołu jest pokazany w Rysunek 1.

1. Cięcie tkanek

  1. Wstępnie schłodzić komorę kriostatu.
    UWAGA: Każda tkanka wymaga różnych temperatur kriostatu, które można znaleźć w odpowiednim protokole dostawcy.
  2. Wyczyść nóż ze stali nierdzewnej 70% etanolem i zainstaluj go w uchwycie ostrza.
  3. Przenieś tkankę z zamrażarki o temperaturze -80 °C do kriostatu za pomocą zamrażarki i pozwól jej dostosować się do temperatury komory kriostatu przez 15 minut.
  4. Jednoznacznie oznacz szkiełka membranowe za pomocą ołówka.
    UWAGA: Szkiełka membranowe PET/PEN są wymagane do pobierania próbek na podstawie LMD. Ze szkiełkami membranowymi PET/PEN należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ są one niezwykle delikatne.
  5. Nałóż kroplę dostępnego w handlu zamrożonego podłoża sekcyjnego na uchwyt na chusteczkę. Przed całkowitym zamrożeniem należy umieścić tkankę na podłożu z zamrożonego wycinka i pozostawić do stwardnienia, tak aby tkanka była połączona z uchwytem na tkankę.
  6. Zainstaluj uchwyt na chusteczki w komorze kriostatu i dostosuj jego orientację przed rozpoczęciem cięcia. Optymalna orientacja uchwytu zależy od orientacji tkanki.
    UWAGA: Może być konieczne przycięcie tkanki, aż do osiągnięcia płaszczyzny przekroju potrzebnej dla plastrów.
  7. Zanim dojdziesz do obszaru tkanki będącej przedmiotem zainteresowania, dostosuj ustawienie cięcia do żądanej grubości tkanki.
    UWAGA: 5 lub 10 μm to sugerowana grubość dla tego protokołu, ponieważ sekcje o grubości 20 μm okazały się niezgodne z pobieraniem próbek opartym na LMD22.
  8. Wytnij dwie sekcje i wyrzuć je.
  9. Odłóż płytkę stabilizatora.
  10. Wytnij fragment tkanki, ostrożnie otwórz płytkę zapobiegającą przetaczaniu, weź szkiełko membranowe i zapobiegaj fałdowaniu się tkanki, umieszczając sekcję tkanki na szkiełku membranowym.
    UWAGA: Przechowywanie szkiełek membranowych w temperaturze pokojowej przed przyklejeniem umożliwia dokładne mocowanie próbki. Na tym samym szkiełku membranowym można umieścić kilka odcinków, ale należy zapobiec nakładaniu się tkanek.
  11. Skrawki tkanek umieszczone na szkiełkach membranowych należy przechowywać w kriostacie do czasu zakończenia cięcia.
  12. Tkankę poddaną kriosekcji należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszej obróbki lub bezpośrednio postępować zgodnie z poniższą procedurą. Szkiełka z pociętymi tkankami przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.

2. Mikrodysekcja laserowa i katapultowanie ciśnieniowe

UWAGA: Ponieważ granulki neuromelaniny są widoczne bez żadnych zabarwień ze względu na ich czarno-brązowawy kolor, barwienie nie jest konieczne dla tego protokołu. Niemniej jednak, w razie potrzeby, z tym protokołem można połączyć różne procedury barwienia. Należy pamiętać, że stosowanie roztworów blokujących lub przeciwciał będzie miało wpływ na analizy LC-MS/MS.

  1. Włącz system MicroBeam i otwórz powiązane oprogramowanie na komputerze (patrz tabela materiałów).
  2. Umieść szkiełko z błoną tkankową w uchwycie SlideHolder na RoboStage z tkanką skierowaną do góry.
    UWAGA: W zależności od urządzenia LMD może być konieczne umieszczenie szkiełka membranowego w taki sposób, aby tkanka była skierowana w dół. Ogólnie rzecz biorąc, pobieranie próbek odbywa się w środowisku o kontrolowanej temperaturze, aby zapewnić optymalne i powtarzalne warunki.
  3. Ustaw mikroskop na żądane powiększenie (w tym przypadku stosuje się 50-krotne) dla skanów przeglądowych.
  4. Użyj funkcji skanowania, która znajduje się w oknie Nawigatora w interfejsie oprogramowania, aby uzyskać skan przeglądowy przekroju tkanki. Wyszukaj lewy górny róg i prawy dolny róg obszaru zainteresowania i wybierz je w interfejsie oprogramowania. Następnie wybierz opcję Skanuj wszystkie ROI, aby wykonać skanowanie.
    UWAGA: Skany poglądowe nie są obowiązkowe, ale umożliwiają lepszą orientację na slajdzie i można je zapisać do późniejszego wykorzystania.
  5. Dostosuj powiększenie mikroskopu do odpowiedniej tkanki, które w tym przypadku granulek neuromelaniny jest 400-krotne.
  6. Wyszukaj obszar z granulkami neuromelaniny. Wybierz Analiza pola widzenia w interfejsie oprogramowania, wybierz Odwróć wynik i ustaw próg dla kanałów RGB tak, aby tylko granulki neuromelaniny były podświetlone na czerwono w oknie podglądu. Kliknij OK, aby użyć dostosowanych ustawień dla pola view.
    UWAGA: Może się zdarzyć, że mniejsze obiekty o ciemnym kolorze również zostaną wybrane. Aby to uwzględnić, wyrzuć wszystkie przedmioty zajmujące obszar mniejszy niż 100 μm2 przed wyizolowaniem granulek neuromelaniny. Aby to zrobić, otwórz Listę elementów, klikając ikonę na pasku narzędzi, wybierz rozważany slajd i uporządkuj elementy według obszaru. Wybierz te, których obszary są mniejsze niż 100μm2 i usuń je.
  7. Dostosuj ustawienia lasera, używając obszaru szkiełka, który jest pokryty tylko membraną.
    UWAGA: Zaleca się skorzystanie z Kreatora regulacji lasera cięcia i postępowanie zgodnie z instrukcjami oprogramowania. Wymagane ustawienia lasera mogą się różnić w zależności od prowadnicy. Dla sekcji 5 μm z 400-krotnym powiększeniem typowe ustawienia to 32 energia i 51 ostrości do cięcia oraz 28 energii i -1 ognisko do katapultowania impulsów laserowych (LPC).
  8. Dostosuj ustawienia prędkości pozycjonowania i cięcia, aby zapewnić odpowiednią izolację.
    UWAGA: Stwierdzono, że 30% prędkość jest optymalna dla izolacji NMG.
  9. Napełnij nakrętkę probówki do pobierania próbek ultraczystą wodą o pojemności 50 μl i włóż nasadkę do kolektora RoboMover.
    UWAGA: Kolektor probówek używany do obecnych eksperymentów może przenosić jedną probówkę do pobierania próbek na raz.
  10. Umieść RoboMover nad RoboStage II za pomocą interfejsu oprogramowania, aby rozpocząć pobieranie próbek.
    UWAGA: Aby to zrobić, otwórz okno RoboMover, w którym wyświetlany jest kolektor. Kliknij nasadkę probówki do pobierania próbek wyświetlaną w oknie RoboMover, aby przesunąć nasadkę do obszaru roboczego. Dostosuj optymalną wysokość poruszania się i pracy w oknie RoboMover. W przeciwnym razie woda w nasadce może spaść na zjeżdżalnię lub katapultowane przedmioty nie dotrą do nasadki.
  11. Uruchom laser. Kontroluj ustawienia energii i ostrości podczas procesu laserowego i dostosuj ustawienia w razie potrzeby. Zapewnić właściwą izolację i katapultowanie wyizolowanych obiektów do nasadki probówki do pobierania próbek dla co najmniej pierwszych dziesięciu obiektów.
    UWAGA: Właściwa izolacja i katapultowanie muszą być sprawdzone wizualnie. Oba powinny skutkować obszarem wolnym od tkanek o rozmiarze wstępnie wybranego obiektu w wycinku tkanki (patrz Rysunek 2C,D). Dostosuj ustawienia lasera, jeśli obiekt pozostaje przyczepiony do wycinka tkanki po cięciu i katapultowaniu. Do katapultowania stwierdzono, że opcja CenterRoboLPC dobrze nadaje się do izolacji NMG. Ustawienia katapultowania można dostosować dla każdego wybranego obiektu na liście elementów.
  12. Po zakończeniu próbkowania przesuń RoboMover do pozycji wyjściowej. Wyjąć probówkę do pobierania próbek.
    UWAGA: Gdy liczba zebranych obiektów jest raczej niska, a obiekty są wystarczająco duże, pobranie próbki można zapewnić, klikając przycisk Cap Check, który umieści nasadkę probówki do pobierania próbek pod mikroskopem, tak aby można było policzyć liczbę obiektów znajdujących się w wodzie w nasadce (patrz Rysunek 2H).
  13. Odwirować próbkę za pomocą wirówki. Krótkie wirowania trwające 5 s ze zwiększającą się siłą odśrodkową spowodowaną przyspieszeniem wirówki okazały się wystarczające. Na tym etapie należy przechowywać próbki w temperaturze -80 °C, ponieważ wszystkie próbki powinny być dalej przetwarzane razem.
    UWAGA: W celu porównania profilu proteomicznego wyizolowano również tkankę otaczającą NMG po ich wycięciu. Izolację otaczającej tkanki przeprowadzono przy 50-krotnym powiększeniu.
  14. Wysuszyć próbki w koncentratorze próżniowym. Stwierdzono, że 1,5 h wystarcza na 50 μl wody.
  15. Rozpuścić i poddać lizie tkankę w 40 μl kwasu mrówkowego przez 20 minut (temperatura pokojowa).
  16. Zwiększ lizę tkanek poprzez sonikację z częstotliwością 45 kHz (kiloherców) przez 5 minut w kąpieli sonizacyjnej. Napełnij kąpiel sonikacyjną lodem, aby zapobiec topnieniu rurek. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego przetwarzania.

3. Trawienie tryptyczne

  1. Rozmrażanie próbek na lodzie.
  2. Próbki należy całkowicie wysuszyć w koncentratorze próżniowym.
  3. Wypełnić próbkę 50 μl odpowiedniego buforu do wytrawiania, np. 50 mM wodorowęglanu amonu.
  4. Po dodaniu 1,25 μl 200 mM 1,4-ditiotreitolu, próbki inkubować przez 30 minut w temperaturze 60 °C i 300 obr./min przy użyciu termomiksera, a następnie schłodzić je do temperatury pokojowej (RT).
  5. Następnie inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności po dodaniu 1,36 μl 0,55 M jodoacetamidu.
  6. Dodać odpowiednią ilość trypsyny do próbek i inkubować próbki przez noc (~16 h) w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Dla 1 000 000μm2 stwierdzono, że 0,1 μg trypsyny jest wystarczające.
  7. Dodać 2,6 μl 10% kwasu trifluorooctowego (TFA) do próbek, aby zatrzymać trawienie (stężenie końcowe 0,5% TFA).
  8. Całkowicie wysuszyć próbki za pomocą koncentratora próżniowego. Następnie należy napełnić próbki do określonej objętości końcowej 0,1% TFA. Próbki NMG wypełniono do 20 μl, z czego 5 μl użyto do jednego eksperymentu ze spektrometrią mas (MS).
  9. Przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia. Określić stężenie peptydu za pomocą analizy aminokwasów lub innej odpowiedniej metody kwantyfikacji (np. Direct Detect).
    UWAGA: Małe ilości próbek mogą nie być możliwe do oszacowania przy użyciu wymienionych technik. Aby zapewnić identyczne obciążenie próbki, każda próbka powinna zawierać taką samą ilość wyizolowanej tkanki, a każda próbka powinna być traktowana jednakowo.

4. Wysokosprawna chromatografia cieczowa i spektrometria mas

UWAGA: Następująca analiza spektrometrycznej mas (MS) za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) jest zoptymalizowana dla konkretnego systemu LC z urządzeniem do kolumny pułapkującej i spektrometrem masowym używanym tutaj (patrz Tabela materiałów). W przypadku innych systemów LC i MS zalecana jest adaptacja parametrów.

  1. Korzystając z oprogramowania Xcalibur, dostosuj ustawienia HPLC w następujący sposób.
    1. Kolumna pułapki: Ustawić temperaturę na 60 °C, natężenie przepływu na 30 μL/min, uruchomić bufor na 0,1% kwasu trifluorooctowego.
    2. Analityczna kolumna C18 z odwróconymi fazami: ustawić temperaturę na 60 °C, natężenie przepływu na 30 μl/min, bufor roboczy A na 0,1% kwasu trifluorooctowego, bufor biegowy B na 84% acetonitrylu i gradient na 5%-30% bufor biegowy B przez 98 min.
      UWAGA: Adaptacja gradientu może być nieunikniona i jest zdecydowanie zalecana w przypadku stosowania różnych tkanek lub komórek. Całkowity czas gradientu może się różnić ze względu na obciążenie próbki na początku gradientu i mycie próbki na końcu gradientu. Całkowite nachylenie w tym protokole składa się z 7-minutowego załadunku próbki i dodatkowego mycia kolumny przez 15 minut, co daje łączny czas gradientu wynoszący 120 minut.
  2. Utwórz metodę akwizycji zależnej od danych (DDA) za pomocą konfiguracji instrumentu XCalibur, którą można znaleźć w menu mapy drogowej oprogramowania HPLC.
  3. W zakładce Global Parameters (Parametry globalne) zdefiniuj tryb infuzji Chromatografia cieczowa, oczekiwaną szerokość piku LC (30 s) oraz domyślny stan naładowania (2).
  4. Przejdź do zakładki Parametry skanowania i dodaj następujące skany i filtry w podanej kolejności: MS OT, MIPS, Intensywność, Stan ładowania, Wykluczenie dynamiczne i ddMS2 OT HCD.
    UWAGA: Szczegółowe ustawienia parametrów dla każdego skanowania i filtra można znaleźć w Tabeli Uzupełniającej 1. Optymalne ustawienia MS i DDA mogą się różnić w zależności od używanego spektrometru masowego, a także typu próbki i dlatego powinny być dostosowane.
  5. Przygotować próbki, rozpuszczając 200-400 ng peptydów próbki w określonej objętości 0,1% TFA we wlotach fiolek ze szkła obojętnego do spektrometrii mas. Jeżeli oznaczanie stężenia nie ma zastosowania ze względu na małą ilość próbki, należy sprawdzić identyczne obciążenie próbki, porównując całkowity prąd jonowy (TIC).
    UWAGA: W tym celu należy otworzyć plik wynikowy z pomiarem spektrometrii mas w odpowiednim oprogramowaniu, np. FreeStyle, i sprawdzić chromatogram. Natężenia powinny być porównywalne dla wszystkich próbek. Reprezentatywny TIC jest pokazany w Rysunek 3.
  6. Przeanalizuj surowe dane uzyskane za pomocą odpowiedniego oprogramowania proteomicznego, np. MaxQuant23, Progenesis QI for Proteomics lub Proteome Discoverer i przeprowadź analizę danych statystycznych na podstawie pytania badawczego.

5. Analiza surowych danych proteomicznych za pomocą MaxQuant

UWAGA: Szczegółowe informacje na temat parametrów MaxQuant znajdują się w Tabeli Uzupełniającej 2. Zostały one pokrótce opisane poniżej.

  1. Załaduj nieprzetworzone pliki do oprogramowania MaxQuant w nagłówku danych raw, klikając przycisk Załaduj.
  2. Przypisz nazwy próbek, klikając Ustaw eksperyment.
  3. Zdefiniuj parametry specyficzne dla grupy. Najpierw dodaj modyfikacje. Ze względu na przetwarzanie próbki wybierz deamidację (NQ), utlenianie (M) i karbamidometylację (N-term) jako zmienne modyfikacje i dodaj karbamidometylację (C) jako ustaloną modyfikację.
  4. Wybierz Trypsyna jako enzym trawienny w zakładce Trawienie.
  5. Dodaj opcję kwantyfikacji bez etykiety LFQ na karcie Kwantyfikacja bez etykiety. Jeśli do przetworzenia ma być więcej niż 10 plików, wybierz opcję Szybkie LFQ, aby skrócić czas przetwarzania. Dodano opcję iBAQ jako miarę kwantyfikacji białka24.
  6. Upewnij się, że wszystkie inne parametry specyficzne dla grupy pozostają w ustawieniach fabrycznych.
  7. Przejdź do zakładki Parametry globalne i dodaj plik FASTA pochodzący z uniprot.org w zakładce Sekwencje. Zmodyfikuj odpowiednio regułę identyfikatora i dodaj identyfikator taksonomii, w tym przypadku 9606 dla homo sapiens.
  8. Do ilościowego oznaczania białka wybierz peptydy Unique i Razor.
  9. Upewnij się, że wszystkie inne parametry globalne pozostają w ustawieniach fabrycznych.
  10. Kliknij Start i pobierz proteingroups.txt dane wyjściowe po analizie MaxQuant w celu dalszej analizy w Perseus.

6. Analiza statystyczna z wykorzystaniem Perseusa

  1. Załaduj plik proteingroups.txt w programie Perseus, dodaj wartości iBAQ jako kolumny główne i posortuj wszystkie inne kolumny według ich typu.
  2. Odfiltruj wabiki i zanieczyszczenia, filtrując wiersze na podstawie kolumny kategorii.
  3. Filtruj wyniki na podstawie prawidłowych wartości. W omawianym przypadku, gdy do analizy włączono tylko dwie próbki, wybrano minimalną liczbę jednej ważnej wartości.
  4. Wyeksportuj dane wyjściowe Perseusa w formacie .txt do dalszego przetwarzania, na przykład w programie Excel, i oceń wyniki dotyczące pytania badawczego.

7. Walidacja wybranych białek

UWAGA: Powszechnie stosowanymi metodami walidacji danych dotyczących stwardnienia rozsianego są, na przykład, barwienie immunologiczne lub Western Blot. Ze względu na ciemny kolor i autofluorescencję neuromelaniny, immunologiczne barwienie białek wewnątrz granulek neuromelaniny za pomocą przeciwciał sprzężonych z peroksydazą chrzanową lub fluoroforem nie ma zastosowania. Do analizy Western Blot konieczne byłoby pobranie bardzo dużych ilości tkanek pośmiertnych. W związku z tym wybrane białka są walidowane za pomocą celowanej spektrometrii mas, a w niniejszym przypadku przeprowadzono równoległe eksperymenty z monitorowaniem reakcji (PRM).

  1. Wybierz białka do walidacji. Wybierz peptydy tych białek już wykryte w eksperymentach DDA. Peptydy nie powinny zawierać pominiętych rozszczepień ani modyfikacji, aby zapewnić wiarygodną ocenę ilościową.
    UWAGA: Przyczyn walidacji jednego konkretnego białka może być kilka, na przykład zróżnicowana liczebność w badanych warunkach. Aby uzyskać reprezentatywne wyniki, wybrano cytoplazmatyczną dyneinę 1 o łańcuchu ciężkim 1, która okazała się być równoważnie obfita w próbkach NMG i SN i dlatego może być wykorzystana jako odniesienie w celu zapewnienia równego obciążenia próbki.
  2. Użyj wybranych peptydów, aby skonfigurować pierwszą wersję metody PRM za pomocą oprogramowania HPLC. Zachowaj wszystkie ustawienia chromatografii i parametrów globalnych z metody DDA.
  3. Dodaj MS OT i tMS2 OT HCD jako typy skanowania. Upewnij się, że ustawienia dla MS OT są takie same jak dla metody DDA. Szczegółowe ustawienia dla metody PRM znajdują się w Tabeli Uzupełniającej 1.
  4. Dla tMS2 OT HCD dodaj wybrane peptydy jako listę włączenia. W związku z tym należy dodać sekwencję aminokwasów i wartość m/z zaobserwowaną w pomiarach DDA. W pierwszym eksperymencie PRM nie dodawaj okien czasu przechowywania ani nie ustawiaj t start na 0 i t stop na 120 (dla 120-minutowego gradientu).
  5. Oceń metodę PRM po pomiarze za pomocą odpowiedniego oprogramowania, na przykład Skyline, i uzyskaj czas retencji peptydów dodanych do listy włączenia. W przypadku włączonych peptydów należy sprawdzić, czy porównywalne piki są obserwowalne dla co najmniej trzech jonów prekursorowych w skanach MS1 i pięciu jonów fragmentacyjnych w skanach MS2 z niskim błędem masy (±5 ppm).
  6. Uściślij metodę PRM, na przykład zwiększając rozdzielczość skanowania tMS2 OT HCD i dodając okna czasu przechowywania do listy dołączeń.
    UWAGA: W obecnych eksperymentach stwierdzono, że okna retencji wynoszące 3 minuty są dobrze dopasowane (obserwowany czas retencji w pierwszym eksperymencie PRM ± 1,5 minuty).
  7. Za pomocą udoskonalonej metody PRM należy przeprowadzić kwantyfikację peptydów i białek będących przedmiotem zainteresowania na podstawie obszaru piku zarówno na poziomie MS1, jak i MS2 za pomocą odpowiedniego oprogramowania.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Specyficzna izolacja NMG i tkanki SN jest najważniejszym krokiem dla pomyślnego zastosowania tego protokołu. Korzystając z funkcji analizy pola widzenia w oprogramowaniu LMD dostarczonym przez dostawcę, NMG mogą być automatycznie wybierane w sposób zależny od koloru. W związku z tym należy zidentyfikować obszary tkanek zawierające NMG (Rysunek 2A) i przeprowadzić analizę pola widzenia z dostosowanymi progami kolorów, co spowoduje oznakowanie NMG (Rysunek 2B). Po pr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LMD jest szeroko stosowaną techniką izolacji określonych obszarów tkanek, pojedynczych komórek lub struktur subkomórkowych. W przedstawionym tutaj poprawionym i zautomatyzowanym protokole technika ta jest stosowana do specyficznej izolacji granulek neuromelaniny (NMG) i tkanki otaczającej NMG (SN). Do tej pory opublikowano i szeroko stosowano dwa różne podejścia do izolacji NMG z ludzkiej pośmiertnej tkanki mózgowej:

a) Nieciągły gradient sacharozy zużywający 1 g tkanki istoty cza...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez de. NBI, projekt niemieckiego Federalnego Ministerstwa Edukacji i Badań Naukowych (BMBF) (numer grantu FKZ 031 A 534A) oraz P.U.R.E. (Jednostka Badawcza ds. Białek w Europie w Europie) i Centrum Diagnostyki Białek (ProDi), oba z Ministerstwa Innowacji, Nauki i Badań Nadrenii Północnej-Westfalii w Niemczech.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-ditiotreitolAppliChemA1101
AcetonitrylMerck1.00029.2500
Wodorowęglan amonuSigma-AldrichA6141
Kwas mrówkowySigma-Aldrich56302
JodoacetamidAppliChemA1666,0100
Micro Tube 500Carl Zeiss415190-9221-000
Spektrometr masowy Orbitrap Fusion Lumos TribridThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFADBMBHQ
PALM MicroBeamZeiss494800-0014-000
PEN Szkiełkomembranowe Carl Zeiss415190-9041-000
substantia nigra pars compacta plastry tkanekNavarrabiomed Biobank (Pampeluna, Hiszpania)
Kwas trifluorooctowyMerck91707
Klasa sekwencjonowania trypsynyServa37283.01
Ultimate 3000 RSLC nano LC systemThermo Fisher ScientificULTIM3000RSLCNANO
Nazwa oprogramowaniaWeblink/CompanyVersion
FreeStyleThermo Fisher Scientific1.6
MaxQuanthttps://www.maxquant.org/1.6.17.0
PALMRoboZeiss4.6 pro
Perseushttps://www.maxquant.org/perseus/1.6.15.0
Skylinehttps://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view20.2.0.343
XCaliburThermo Fisher Scientific4.3

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, C., et al. DNA profiling of spermatozoa by laser capture microdissection and low volume-PCR. PloS One. 6 (8), 22316(2011).
  2. Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
  3. Eggers, B., et al. Advanced fiber type-specific protein profiles derived from adult murine skeletal muscle. Proteomes. 9 (2), 28(2021).
  4. Kley, R. A., et al. A combined laser microdissection and mass spectrometry approach reveals new disease relevant proteins accumulating in aggregates of filaminopathy patients. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 12 (1), 215-227 (2013).
  5. Güttsches, A. -K., et al. Proteomics of rimmed vacuoles define new risk allele in inclusion body myositis. Annals of Neurology. 81 (2), 227-239 (2017).
  6. Bogerts, B. A brainstem atlas of catecholaminergic neurons in man, using melanin as a natural marker. The Journal of Comparative Neurology. 197 (1), 63-80 (1981).
  7. Engelen, M., et al. Neuromelanins of human brain have soluble and insoluble components with dolichols attached to the melanic structure. PloS One. 7 (11), 48490(2012).
  8. Duffy, P. E., Tennyson, V. M. Phase and electron microscopic observations of lewy bodies and melanin granules in the substantia nigra and locus caeruleus in parkinsonʼs disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 24 (3), 398-414 (1965).
  9. Zecca, L., et al. Interaction of human substantia nigra neuromelanin with lipids and peptides. Journal of Neurochemistry. 74 (4), 1758-1765 (2000).
  10. Fenichel, G. M., Bazelon, M. Studies on neuromelanin. II. Melanin in the brainstems of infants and children. Neurology. 18 (8), 817-820 (1968).
  11. Halliday, G. M., et al. Evidence for specific phases in the development of human neuromelanin. Journal of Neural Transmission. 113 (6), Vienna, Austria. 721-728 (2006).
  12. Zucca, F. A., et al. Interactions of iron, dopamine and neuromelanin pathways in brain aging and Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 155, 96-119 (2017).
  13. Carballo-Carbajal, I., et al. Brain tyrosinase overexpression implicates age-dependent neuromelanin production in Parkinson's disease pathogenesis. Nature Communications. 10 (1), 973(2019).
  14. Zecca, L., Zucca, F. A., Wilms, H., Sulzer, D. Neuromelanin of the substantia nigra: a neuronal black hole with protective and toxic characteristics. Trends in Neurosciences. 26 (11), 578-580 (2003).
  15. Paris, I., Lozano, J., Perez-Pastene, C., Muñoz, P., Segura-Aguilar, J. Molecular and neurochemical mechanisms in PD pathogenesis. Neurotoxicity Research. 16 (3), 271-279 (2009).
  16. Zecca, L., et al. Neuromelanin can protect against iron-mediated oxidative damage in system modeling iron overload of brain aging and Parkinson's disease. Journal of Neurochemistry. 106 (4), 1866-1875 (2008).
  17. Zarȩba, M., Bober, A., Korytowski, W., Zecca, L., Sarna, T. The effect of a synthetic neuromelanin on yield of free hydroxyl radicals generated in model systems. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1271 (2-3), 343-348 (1995).
  18. Karlsson, O., Lindquist, N. G. Melanin affinity and its possible role in neurodegeneration. Journal of neural transmission. 120 (12), Vienna, Austria. 1623-1630 (2013).
  19. Marsden, C. D. Pigmentation in the nucleus substantiae nigrae of mammals. Journal of Anatomy. 95, 256-261 (1961).
  20. Tribl, F., et al. 34;Subcellular proteomics" of neuromelanin granules isolated from the human brain. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 4 (7), 945-957 (2005).
  21. Zucca, F. A., et al. Neuromelanin organelles are specialized autolysosomes that accumulate undegraded proteins and lipids in aging human brain and are likely involved in Parkinson's disease. NPJ Parkinson's Disease. 4, 17(2018).
  22. Plum, S., et al. Proteomic characterization of neuromelanin granules isolated from human substantia nigra by laser-microdissection. Scientific Reports. 6, 37139(2016).
  23. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  24. Krey, J. F., et al. Mass spectrometry quantitation of proteins from small pools of developing auditory and vestibular cells. Scientific Data. 5, 180128(2018).
  25. Oliveros, J. C. Venny: An interactive tool for comparing lists with Venn's diagrams. , Available from: https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html (2007).
  26. Plum, S., et al. Combined enrichment of neuromelanin granules and synaptosomes from human substantia nigra pars compacta tissue for proteomic analysis. Journal of Proteomics. 94, 202-206 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Laser MicrodissectionNeuromelanin GranulesProteomic AnalysisMass SpectrometrySubstantia NigraProtein QuantificationLabel Free QuantificationTryptic DigestionParallel Reaction MonitoringDopaminergic Neurons

Related Articles