Niniejsza praca opisuje etapy produkcji gotowego do użycia qPCR do wykrywania DNA T. cruzi, który może być wstępnie załadowany do naczynia reakcyjnego i przechowywany w lodówce przez kilka miesięcy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Gotowy do użycia qPCR do wykrywania DNA Trypanosoma cruzi lub innych organizmów chorobotwórczych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Real-time PCR (qPCR) to niezwykle czuła i precyzyjna technika, która pozwala na wzmacnianie niewielkich ilości celów kwasu nukleinowego z wielu próbek. Jest szeroko stosowany w wielu obszarach badawczych i osiągnął zastosowanie przemysłowe w takich dziedzinach jak diagnostyka człowieka i selekcja cech w uprawach organizmów modyfikowanych genetycznie (GMO). Jednak qPCR nie jest techniką odporną na błędy. Mieszanie wszystkich odczynników w jedną mieszankę główną, a następnie rozprowadzanie ich na 96 dołkach zwykłej płytki qPCR, może prowadzić do błędów operatora, takich jak nieprawidłowe mieszanie odczynników lub niedokładne dozowanie do studzienek. W tym miejscu przedstawiono technikę zwaną żelyfikacją, w której większość wody obecnej w mieszance wzorcowej jest zastępowana odczynnikami, które po poddaniu do próżni tworzą mieszaninę zol-żel. W efekcie odczynniki qPCR są skutecznie konserwowane przez kilka tygodni w temperaturze pokojowej lub kilka miesięcy w temperaturze 2-8 oC. Przedstawiono tu szczegóły przygotowania każdego roztworu wraz z oczekiwanym aspektem żelowej reakcji przeznaczonej do wykrywania satelitarnego DNA T. cruzi (satDNA). Podobną procedurę można zastosować do wykrywania innych organizmów. Rozpoczęcie żelowanej serii qPCR jest tak proste, jak wyjęcie płytki z lodówki, dodanie próbek do odpowiednich dołków i rozpoczęcie cyklu, skracając w ten sposób czas przygotowania reakcji na pełnej płytce do czasu potrzebnego do załadowania próbek. Dodatkowo, żelowane reakcje PCR mogą być wytwarzane i kontrolowane pod kątem jakości w partiach, oszczędzając czas i unikając typowych błędów operatora podczas przeprowadzania rutynowych reakcji PCR.
Wprowadzenie
Choroba Chagasa została odkryta na początku XX wieku w wiejskich regionach Brazylii, gdzie ubóstwo było powszechne1,2. Nawet dzisiaj choroba ta jest nadal związana ze społecznymi i ekonomicznymi uwarunkowaniami zdrowia w obu Amerykach. Choroba Chagasa jest dwufazowa, składa się z fazy ostrej i przewlekłej. Jest to spowodowane zakażeniem pasożytem Trypanosoma cruzi, przenoszonym przez wektory owadów, transfuzjami krwi drogą wrodzoną lub doustnym spożyciem skażonej żywności3,4.
Diagnostyka choroby Chagasa może być dokonana poprzez obserwację objawów klinicznych (zwłaszcza objawu Romaña), mikroskopię rozmazu krwi, serologię i testy molekularne, takie jak PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) lub amplifikacja izotermiczna4,5,6,7,8,9. Objawy kliniczne i mikroskopia rozmazu krwi są stosowane w podejrzanych przypadkach ostrych zakażeń, podczas gdy poszukiwanie przeciwciał jest stosowane jako narzędzie przesiewowe u pacjentów bezobjawowych. Ze względu na swoją czułość i swoistość, qPCR sugeruje się stosowanie jako narzędzia do monitorowania pacjentów przewlekle chorych, u pacjentów poddawanych leczeniu w stanie ostrym mierzącego obciążenie pasożytami we krwi oraz jako zastępczy marker niepowodzenia terapeutycznego6,8,10,11,12. Chociaż testy qPCR są bardziej czułe i specyficzne niż obecnie dostępne, skutecznie uniemożliwia się ich wykorzystanie jako narzędzi diagnostycznych w regionach o niekorzystnych warunkach gospodarowania ze względu na wymóg niskich temperatur podczas transportu i przechowywania13,14,15.
Aby obejść tę przeszkodę, zbadano techniki konserwacji, takie jak liofilizacja i żelyfikacja16,17. Podczas gdy liofilizacja zapewnia przechowywanie przez lata, wymaga specjalnie przygotowanych odczynników bez obecności glicerolu, który jest powszechnie stosowany do stabilizacji/konserwacji enzymów18. Chociaż wykazano, że żelowanie zapewnia konserwację przez wiele miesięcy, pozwala na użycie zwykłych odczynników19. Roztwór żelujący składa się z czterech składników, z których każdy pełni określoną rolę w procesie: cukry trehaloza i melezytoza chronią biomolekuły podczas procesu wysuszania poprzez redukcję wolnych cząsteczek wody w roztworze, glikogen wytwarza szerszą matrycę ochronną, a aminokwas lizyna jest wykorzystywany jako wymiatacz wolnych rodników w celu zahamowania reakcji utleniania między karboksylem biocząsteczki, grupy aminowe i fosforanowe. Składniki te definiują mieszaninę zol-żel, która zapobiega utracie struktury trzeciorzędowej lub czwartorzędowej podczas procesu wysuszania, pomagając w ten sposób utrzymać aktywność biomolekuł po ponownym nawodnieniu19. Po ustabilizowaniu się w probówkach reakcyjnych, reakcje mogą być przechowywane przez kilka miesięcy w temperaturze 2-8 °C lub kilka tygodni w temperaturze 21-23 °C zamiast zwykłej -20 °C. Podejście to zostało już uwzględnione w testach mających pomóc w diagnozowaniu chorób, takich jak choroba Chagasa, malaria, leiszmanioza, gruźlica i cyklosporioza13,14,15,20.
Niniejsza praca opisuje wszystkie kroki do przygotowania wymaganych roztworów do procedury żelowania, pułapki w tym procesie, oraz oczekiwany końcowy aspekt gotowego do użycia żelizowanego qPCR wewnątrz ośmioprobówkowych pasków. Ten sam protokół można dostosować do pojedynczych probówek lub płytek 96-dołkowych. Wreszcie, wykrycie DNA T. cruzi zostanie pokazane jako próba kontrolna.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie roztworów podstawowych i mieszaniny żelującej
UWAGA: Cztery roztwory podstawowe zostaną przygotowane (400 mg/ml melezytozy, 400 mg/ml trehalozy, 0,75 mg/ml lizyny i 200 mg/ml glikogenu) i zmieszane zgodnie z proporcją pokazaną w Tabeli 1 w celu wytworzenia mieszaniny żelującej. Chociaż protokół opisuje produkcję 10 ml roztworów podstawowych, można go dostosować do mniejszych lub większych objętości.
- Roztwór Melezitose
- Zważyć 4 g melezytozy w plastikowej probówce o pojemności 15 ml, dodać 6 ml wody wolnej od nukleaz i wirować z maksymalną prędkością urządzenia, aż proszek zostanie rozpuszczony.
UWAGA: Można dodać więcej wody, aby ułatwić solucjonizację, uważając, aby nie przekroczyć końcowej objętości (patrz poniżej). - Uzupełnić końcową objętość do 10 ml wodą wolną od nukleaz. Etykietować i przechowywać w temperaturze 2-8 °C przez okres do 6 miesięcy.
- Zważyć 4 g melezytozy w plastikowej probówce o pojemności 15 ml, dodać 6 ml wody wolnej od nukleaz i wirować z maksymalną prędkością urządzenia, aż proszek zostanie rozpuszczony.
- Roztwór trehalozy
- Zważyć 4 g trehalozy w plastikowej probówce o pojemności 15 ml, dodać 6 ml wody wolnej od nukleaz i wirować z maksymalną prędkością instrumentu, aż proszek zostanie rozpuszczony.
UWAGA: Można dodać więcej wody, aby ułatwić solucjonizację, uważając, aby nie przekroczyć końcowej objętości (patrz poniżej). - Uzupełnić objętość do 10 ml wodą wolną od nukleaz i przefiltrować roztwór przez filtr 0,2 μm. Etykietować i przechowywać w temperaturze 2-8 °C przez okres do 6 miesięcy.
- Zważyć 4 g trehalozy w plastikowej probówce o pojemności 15 ml, dodać 6 ml wody wolnej od nukleaz i wirować z maksymalną prędkością instrumentu, aż proszek zostanie rozpuszczony.
- Roztwór glikogenu
- Zważyć 2 g glikogenu w plastikowej probówce o pojemności 15 ml, dodać 6 ml wody wolnej od nukleaz i wirować z maksymalną prędkością urządzenia, aż proszek zostanie rozpuszczony.
UWAGA: Można dodać więcej wody, aby ułatwić solucjonizację, uważając, aby nie przekroczyć końcowej objętości (patrz poniżej). - Utrzymuj roztwór w spoczynku w temperaturze 2-8 °C przez 8-12 godzin, ponieważ solubilizacja glikogenu wytwarza dużo pęcherzyków (Rysunek 1). Uzupełnić objętość do 10 ml wodą wolną od nukleaz. Etykietować i przechowywać w temperaturze 2-8 °C przez okres do 6 miesięcy.
- Zważyć 2 g glikogenu w plastikowej probówce o pojemności 15 ml, dodać 6 ml wody wolnej od nukleaz i wirować z maksymalną prędkością urządzenia, aż proszek zostanie rozpuszczony.
- Roztwór lizyny
- Odważ 7,5 mg lizyny w plastikowej probówce o pojemności 15 ml, dodaj 6 ml wody wolnej od nukleaz. Wirować z maksymalną prędkością instrumentu, aż proszek zostanie rozpuszczony.
UWAGA: Można dodać więcej wody, aby ułatwić solucjonizację, uważając, aby nie przekroczyć końcowej objętości (patrz poniżej). - Uzupełnić objętość do 10 ml wodą wolną od nukleaz i przefiltrować roztwór przez filtr 0,2 μm. Przenieść roztwór do kolby bursztynowej lub chronić ją przed światłem. Etykietować i przechowywać w temperaturze 2-8 °C przez okres do 6 miesięcy.
- Odważ 7,5 mg lizyny w plastikowej probówce o pojemności 15 ml, dodaj 6 ml wody wolnej od nukleaz. Wirować z maksymalną prędkością instrumentu, aż proszek zostanie rozpuszczony.
- Mieszanina żelująca (GM)
- W plastikowej probówce o pojemności 50 ml wymieszać objętości roztworów podstawowych zgodnie z tabelą 1.
- Wymieszaj odczynniki przez dziesięć inwersji probówki od końca do końca.
UWAGA: Nie ma potrzeby wykonywania etapu filtracji, jeśli jest on wykonywany w okapie bezpieczeństwa z przepływem laminarnym. Jeśli ten krok nie jest wykonywany w czystym środowisku, przefiltruj roztwór przez filtr 0,2 μm przed przeniesieniem go do kolby bursztynowej. - Przenieść roztwór do kolby bursztynowej lub chronić ją przed światłem. Etykietować i przechowywać w temperaturze 2-8 °C przez okres do 3 miesięcy.
UWAGA: Jako etap kontroli jakości przygotowania mieszaniny żelującej należy upewnić się, że zmierzone wartości pH, przewodności i gęstości mieszczą się w następujących zakresach: pH 5,55-6,66; przewodność 0,630-0,757 mS/cm; i gęstość 1,08-1,11 g / cm3. Wszystkie pomiary powinny być wykonywane w temperaturze 25 °C.
2. Przygotowanie głównej mieszanki qPCR do żelowania
UWAGA: Na tym etapie przygotowywana jest główna mieszanka qPCR do żelowania. W związku z tym do mieszanki nie dodaje się wody, ale zamiast tego dodaje się mieszaninę żelującą (tabela 2).
- Rozmrozić odczynniki w pojemniku chłodniczym. Wymieszać odczynniki w probówce o pojemności 1,5 ml zgodnie z tabelą 2. Przykład reakcji z końcową objętością 25 μl zawierającą 5 μl próbki DNA pokazano tutaj.
UWAGA: Na tym etapie próbki DNA nie dodaje się do mieszaniny; stosuje się go tutaj wyłącznie do obliczania końcowych objętości każdego odczynnika głównej mieszaniny qPCR. Próbki DNA należy dodać tuż przed rozpoczęciem biegu (patrz krok 4 poniżej).
3. Żelowanie odczynników na naczyniach reakcyjnych
- Odpowiednio pomnożyć objętości podane w tabeli 2 w celu przygotowania paska zawierającego osiem probówek lub płytki 96-dołkowej.
- Odmierzyć pipetą 18,5 μl głównej mieszanki żelującej przedstawionej w tabeli 2 do każdej studzienki reakcyjnej.
UWAGA: Ta objętość reprezentuje objętości mieszaniny oligonukleotydów, buforu PCR i mieszaniny żelującej użytej do jednej reakcji (zgodnie z tabelą 2) i będzie się różnić w zależności od stężenia odczynników i objętości potrzebnej do jednej reakcji. Końcowa objętość w głównej mieszance żelującej różni się od objętości w zwykłej mieszance wzorcowej, ponieważ nie dodaje się wody. - Umieść rurki/płytkę w wsporniku przewodzącym ciepło (np. aluminiowym) wewnątrz pieca próżniowego.
UWAGA: Wspornik przewodzący ciepło jest opcjonalny. Operator musi upewnić się, że spód rur styka się z półką pieca próżniowego, aby umożliwić szybką równowagę termiczną. - Umieść jeden worek z gliny bentonitowej na każde dwie płytki 96-dołkowe.
UWAGA: Worki z glinki bentonitowej służą do absorpcji usuniętej wody z głównej mieszanki żelującej przez różnicę ciśnień wywieraną przez próżnię. Okazało się, że worki z glinki bentonitowej nie są potrzebne dla mniej niż dwóch płytek 96-dołkowych. - Poddać probówki/płytkę zawierającą główną mieszankę żelującą trzem cyklom próżniowym (30 ± 5 mBar) trwającym 30 minut każdy, na przemian z uwalnianiem podciśnienia, aż do osiągnięcia ciśnienia atmosferycznego (900-930 mBar), w kontrolowanej temperaturze (30 °C ± 1 °C) (Rysunek 2).
UWAGA: Przyrząd wykorzystuje oprogramowanie do kontroli parametrów, a przykład cyklu jest pokazany na Rysunek 2. Użytkownik musi utworzyć profil dla przebiegu, wskazując wybrane parametry. - Po zakończeniu cyklu sprawdź probówki/płytki pod kątem prawidłowego żelowania odczynników, upewniając się, że objętość jest widocznie zmniejszona (Rysunek 3) i że płyny nie poruszają się po stukaniu palcami w probówki/płytki.
UWAGA: Gdyby żelowanie nie nastąpiło, roztwór rozprysnąłby się na ściankach rurki po stuknięciu w rurki (Rysunek 3). - Przed użyciem uszczelnić i przechowywać probówki/płytki w temperaturze 2-8 °C przez 8-12 godzin.
4. Korzystanie z żelowanego qPCR
- Wyjmij pasek rurki lub płytkę z lodówki i otwórz ją na stacji roboczej w celu manipulowania próbką. Do każdego naczynia reakcyjnego dodać 15 μl wody wolnej od nukleaz.
UWAGA: Przyjmuje się, że objętość żelowanych odczynników wynosi około 5 μL. Tak więc wraz z objętością próbki DNA (patrz poniżej) końcowa objętość reakcji wynosi 25 μl. - Dodać 5 μl próbki DNA.
UWAGA: Można użyć dowolnej matrycy DNA o jakości qPCR. W niniejszej pracy DNA wyekstrahowano z 108 T. cruzi epimastigotes (szczep Dm28c) i seryjnie rozcieńczono w stosunku 1:10 przy użyciu buforu TE. - Uszczelnij rurki/płytki i przejdź do wybranego sprzętu. Uruchom eksperyment i przejdź do regularnej analizy danych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Trzy z odczynników tworzących mieszaninę żelującą rozpuszczają się łatwo po intensywnym mieszaniu w wirówce vortex. Jednak glikogen wymaga ostrożnego mieszania w wirówce vortex, aby upewnić się, że proszek został całkowicie rozpuszczony. Niestety, intensywne mieszanie w wirówce vortex powoduje powstawanie wielu pęcherzyków powietrza, co utrudnia określenie rzeczywistej objętości roztworu (Rysunek 1A-B). Dlatego niezbędne jest pozostawienie roztworu glikogenu...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ostatnie lata uwypukliły potrzebę znalezienia bardziej czułych i specyficznych technologii, które pomogłyby w diagnozowaniu chorób tropikalnych i zaniedbanych. Chociaż testy parazytologiczne (mikroskopia optyczna) i serologiczne są ważne dla kontroli epidemiologicznej, mają ograniczenia, zwłaszcza w odniesieniu do czułości i możliwości zastosowania w miejscu opieki nad pacjentem. Techniki amplifikacji DNA, takie jak PCR, amplifikacja izotermiczna i odpowiednie odmiany, są od dawna stosowane w warunkach laboratoryjnych, a...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Autorzy chcieliby wyrazić swoją wdzięczność Aline Burda Farias za pomoc techniczną przy piecu próżniowym, a także administracji Instituto de Biologia Molecular do Parana (IBMP, Kurytyba, Brazylia) za umożliwienie dostępu do wspomnianego sprzętu. Praca ta została częściowo sfinansowana z grantu CNPq 445954/2020-5.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Worki z glinki bentonitowej (aktywowane) | Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Hiszpania) | 026157/STD | Nie mylić z okładami z żelu krzemionkowego |
| Glikogen | Amersham Bioscience | Cat# US16445 | |
| Lizyna | Acros Organic | Cat# 365650250 | |
| Melezitoze | Sigma-Aldrich | Cat# 63620 | |
| Woda | wolna od nukleazpreferowany dostawca | ||
| Oligonukleotydy, preferowany | dostawca | ||
| PCR, mastermix | preferowany dostawca lub Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Kurytyba, Brazylia) | Chagas NAT | |
| Termocykler PCR | preferowany dostawca | ||
| oprogramowania do pieca próżniowego | Memmert Gmbh | Celsius v10.0 | |
| Trehaloza | Sigma-Aldrich | Cat# T9531 | |
| DNA Trypanosoma cruzi z | pasożytów hodowanych we własnym zakresie lub zakupionych od akredytowanych dostawców, takich jak ATCC | ||
| Piec próżniowy | Memmert Gmbh | VO-400 |
Bibliografia
- Lewinsohn, R. Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas's disease). Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).
- Bern, C., et al. Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review. The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).
- Pereira, K. S., et al. Chagas' disease as a foodborne illness. Journal of Food Protection. 72 (2), 441-446 (2009).
- Tanowitz, H. B., et al. Chagas' disease. Clinical Microbiology Reviews. 5 (4), 400-419 (1992).
- Rassi, A., Marin-Neto, J. A. Chagas disease. Lancet. 375 (9723), 1388-1402 (2010).
- Ramírez, J. C., et al. Analytical validation of quantitative real-time PCR methods for quantification of trypanosoma cruzi DNA in blood samples from chagas disease patients. The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (5), 605-615 (2015).
- Rivero, R., et al. Rapid detection of Trypanosoma cruzi by colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A potential novel tool for the detection of congenital Chagas infection. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 89 (1), 26-28 (2017).
- Schijman, A. G. Molecular diagnosis of Trypanosoma cruzi. Acta Tropica. 184, 59-66 (2018).
- Besuschio, S. A., et al. Trypanosoma cruzi loop-mediated isothermal amplification (Trypanosoma cruzi Loopamp) kit for detection of congenital, acute and Chagas disease reactivation. Plos Neglected Tropical Diseases. 14 (8), 0008402(2020).
- Duffy, T., et al. Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in chagas disease patients. Plos Neglected Tropical Diseases. 3 (4), (2009).
- Melo, M. F., et al. Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients. Parasites & Vectors. 8 (1), 154(2015).
- Parrado, R., et al. Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191(2019).
- de Rampazzo, R. C. P., et al. A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs. Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).
- Rampazzo, R. C. P., et al. Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases. The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).
- Costa, A. D. T., et al. Ready-to-use qPCR for detection of Cyclospora cayetanensis or Trypanosoma cruzi in food matrices. Food and Waterborne Parasitology. 22, 00111(2021).
- Sun, Y., et al. Pre-storage of gelified reagents in a lab-on-a-foil system for rapid nucleic acid analysis. Lab on a Chip. 13, 1509-1514 (2013).
- Kamau, E., et al. Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria. Malaria Journal. 13, 158(2014).
- Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. Recent advances and further challenges in lyophilization. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).
- Rosado, P. M. F. S., López, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures. PubChem. , (2002).
- Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study. PLoS One. 15 (12), 0242408(2020).
- Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. J. Evaluation of an improved U.S. food and drug administration method for the detection of Cyclospora cayetanensis in produce using real-time PCR. Journal of Food Protection. 80 (7), 1133-1144 (2017).
- Iglesias, N., et al. Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR. Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).
- Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies. Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
