Artykuł metodologiczny
Mikrotubule, które są polimerami tubuliny, odgrywają kluczową rolę jako składnik cytoszkieletu w komórkach eukariotycznych i są znane ze swojej dynamicznej niestabilności. W badaniu tym opracowano metodę frakcjonowania mikrotubul w celu rozdzielenia ich na stabilne mikrotubule, labilne mikrotubule i wolną tubulinę w celu oceny stabilności mikrotubul w różnych tkankach myszy.
Mikrotubule, złożone z dimerów α/β-tubuliny, są kluczowym składnikiem cytoszkieletu w komórkach eukariotycznych. Te rurkowate polimery wykazują dynamiczną niestabilność, ponieważ podjednostki heterodimeru tubuliny ulegają powtarzalnej polimeryzacji i depolimeryzacji. Precyzyjna kontrola stabilności i dynamiki mikrotubul, osiągnięta dzięki modyfikacjom potranslacyjnym tubuliny i białkom związanym z mikrotubulami, jest niezbędna dla różnych funkcji komórkowych. Dysfunkcje mikrotubul są silnie związane z patogenezą, w tym z zaburzeniami neurodegeneracyjnymi. Trwające badania koncentrują się na środkach terapeutycznych ukierunkowanych na mikrotubule, które modulują stabilność, oferując potencjalne opcje leczenia tych chorób i nowotworów. W związku z tym zrozumienie stanu dynamicznego mikrotubul ma kluczowe znaczenie dla oceny postępu choroby i efektów terapeutycznych.
Tradycyjnie, dynamika mikrotubul była oceniana in vitro lub w hodowanych komórkach poprzez wstępne frakcjonowanie lub test immunologiczny, przy użyciu przeciwciał ukierunkowanych na potranslacyjne modyfikacje tubuliny. Jednak dokładna analiza stanu tubuliny w tkankach za pomocą takich procedur stanowi wyzwanie. W tym badaniu opracowaliśmy prostą i innowacyjną metodę frakcjonowania mikrotubul w celu oddzielenia stabilnych mikrotubul, labilnych mikrotubul i wolnej tubuliny w tkankach myszy.
Procedura polegała na homogenizacji wypreparowanych tkanek myszy w buforze stabilizującym mikrotubule w stosunku objętościowym 19:1. Homogenaty poddano następnie frakcjonowaniu w dwuetapowym procesie ultrawirowania po wstępnym powolnym wirowaniu (2 400 × g) w celu usunięcia zanieczyszczeń. Pierwszy etap ultrawirowania (100 000 × g) wytrącił stabilne mikrotubule, podczas gdy otrzymany supernatant poddano drugiemu etapowi ultrawirowania (500 000 × g) w celu frakcjonowania labilnych mikrotubul i rozpuszczalnych dimerów tubuliny. Metodą tą określono proporcje tubuliny stanowiącej stabilne lub labilne mikrotubule w mózgu myszy. Ponadto zaobserwowano wyraźne różnice w stabilności mikrotubul w tkankach, które korelowały ze zdolnością proliferacyjną komórek składowych. Odkrycia te podkreślają znaczący potencjał tej nowatorskiej metody do analizy stabilności mikrotubul w stanach fizjologicznych i patologicznych.
Mikrotubule (MT) to wydłużone struktury rurkowe składające się z protofilamentów składających się z podjednostek heterodimeru α/β-tubuliny. Odgrywają one istotną rolę w różnych procesach komórkowych, takich jak podział komórek, ruchliwość, utrzymanie kształtu i transport wewnątrzkomórkowy, co czyni je integralnymi składnikami cytoszkieletu eukariotycznego1. Ujemny koniec MT, w którym odsłonięta jest podjednostka α-tubuliny, jest stosunkowo stabilny, podczas gdy koniec dodatni, w którym odsłonięta jest podjednostka β-tubuliny, ulega dynamicznej depolimeryzacji i polimeryzacji2. Ten ciągły cykl dodawania i dysocjacji dimer....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
1. Metoda frakcjonowania MT
UWAGA: Wszystkie eksperymenty przeprowadzone w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu Doshisha. Wykorzystano tu myszy C57BL/6J obojga płci w wieku 3-4 miesięcy. W tym protokole wypreparowane tkanki, np. mózg, wątroba czy grasica, były natychmiast homogenizowane w lodowatym buforze stabilizującym mikrotubule (MSB), który zawierał Taxol (stabilizator MT) w stężeniu, które zapobiegało nie tylko depolimeryzacji, ale także repolimeryzacji MT. Homogenat został podzielony na trzy frakcje w dwuetapowym procesie ultrawirowania (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Kwantyfikacja tubuliny we frakcjach P2, P3 i S3 z mózgu myszy metodą frakcjonowania MT
Tubulinę w tkance myszy rozdzielono na frakcje P2, P3 i S3 metodą frakcjonowania MT i oznaczono ilościowo metodą Western blotting (Figura 1A). Osad MT, który pozostał we frakcji P2 przez ultrawirowanie w ilości 100 000 × g przez 20 minut, stanowił 34,86% ± 1,68% całkowitej tubuliny w mózgu myszy. Supernatant (S2) był następnie odwirowywany w stężeniu 500 000 × g przez 60 minut........
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Najważniejszym zadaniem przy badaniu stanu tubuliny w tkance z organizmów żywych jest zapobieganie przypadkowej polimeryzacji MT lub depolimeryzacji podczas przygotowania. Na stabilność MT w próbkach mają wpływ takie czynniki, jak stężenie taksolu w MSB, proporcja ilości tkanki do buforu oraz temperatura podczas procesu od usunięcia tkanki do homogenizacji i odwirowania. W związku z tym warunki zostały zoptymalizowane na każdym etapie protokołu analizy tkanki myszy z 20-krotną objętością homogenatu. Wyższe stężenie takso.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają do zgłaszania konfliktu interesów.
Ta praca była częściowo wspierana przez JST, ustanowienie stypendiów uniwersyteckich w celu tworzenia innowacji w dziedzinie nauki, technologii (A.HT.; JPMJFS2145), JST SPRING (A.HT.; JPMJSP2129), Grant-in-Aid for JSPS Fellows (A.HT.; 23KJ2078), Grant-in-Aid for Scientific Research (B) JSPS KAKENHI (22H02946 for TM), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas zatytułowane "Brain Protein Aging and Dementia Control" od MEXT (TM; 26117004) oraz przez Uehara Research Fellowship od Uehara Memorial Foundation (TM; 202020027). Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| POJEMNIK NA 1,5 ML TUBKA 500 | Beckman Coulter | 357448 | |
| 1A2 | Sigma-Aldrich | T9028 | :5,000 rozcieńczenie |
| Kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy (MES) | Nacalai Tesque | 02442-44 | |
| 300 kDa ultrafiltracyjna kolumna wirowa | Aproscience | PT-1013 | |
| 6-11B1 | Sigma-Aldrich | T7451 | 1:5,000 rozcieńczenie |
| Ä KTAprime plus | Cytiva | 11001313 | |
| anty-mysie IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 rozcieńczenie |
| przeciwbólowe | Peptide Institute Inc. | 4062 | |
| aprotynina | Nacalai Tesque | 03346-84 | |
| Chemi-Lumi One L | Nacalai Tesque | 07880-54 | |
| Butelkowy system filtrów próżniowych Corning | 430758 | 0,22µ m 33,2 cm² Membrana nitrocelulozowa | |
| DIFP | Sigma-Aldrich | 55-91-4 | |
| HOMOGENIZATOR CYFROWY HK-1 | AS ONE | 1-2050-11 | |
| DM1A | Sigma-Aldrich | T9026 | Rozcieńczenie 1:5,000 |
| DTT | Nacalai Tesque | 14128-46 | |
| EGTA | Nacalai Tesque | 37346-05 | |
| FluoroTrans W 3,3 metra Roll | Pall Corporation | BSP0161 | |
| glicerol | Nacalai Tesque | 17018-25 | |
| GTP | Nacalai Tesque | 17450-61 | |
| MIKROWIRÓWKA CHŁODNICZA O DUŻEJ PRĘDKOŚCI Kitman | TOMY | KITMAN-24 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | kolumna Cytiva | 28-9893-35 | |
| Oprogramowanie miernika obrazu | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| ImmunoStar LD | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | 292-69903 | |
| KMX-1 | Milipore | MAB3408 | rozcieńczenie 1:5,000 |
| Analizator obrazu luminescencyjnego LAS-4000 | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| leupeptin | Peptide Institute Inc. | 43449-62 | |
| MgSO4 | Nacalai Tesque | 21003-75 | |
| Na3VO4 | Nacalai Tesque | 32013-92 | |
| NaF Nacalai | Tesque | 31420-82 | |
| kwas okadaikowy | LC Laboratories | O-2220 | |
| OPTIMA MAX-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| pepstatin | Nacalai Tesque | 26436-52 | |
| PMSF | Nacalai Tesque | 27327-81 | |
| Probówki wirówkowe z poliwęglanu do TLA120.2 | Beckman Coulter | 343778 | |
| Koktajl inhibitorów proteazy (cOmplete™, bez EDTA) | Roche | 11873580001 | |
| Oczyszczona tubulina | Cytoszkielet | T240 | |
| QSONICA Q55 | QSonica | Q55 | |
| Taxol | LC Laboratories | P-9600 | |
| TLA-120.2 rotor | Beckman Coulter | 357656 | |
| TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 366725 | |
| TLCK | Nacalai Tesque | 34219-94 | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | |
| β-glicerofosforan | Sigma-Aldrich | G9422 |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie