Artykuł metodologiczny

Niezawodna metoda produkcji sferoid na dużą skalę do zastosowań związanych z przesiewaniem i analizą o wysokiej zawartości

DOI:

10.3791/63436

⸱

28 grudnia 2021

 ,  , 
1Cell Screening Laboratory, UCD School of Biology and Environmental Science, University College Dublin

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę produkcji trzech różnych typów sferoidów w sposób, który czyni je odpowiednimi do badań przesiewowych i analiz na dużą skalę o wysokiej zawartości. Ponadto przedstawiono przykłady pokazujące, w jaki sposób można je analizować na poziomie sferoidalnym i poszczególnych komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania przesiewowe o wysokiej zawartości (HCS) i analiza o wysokiej zawartości (HCA) to technologie, które dają badaczom możliwość wyodrębnienia dużych ilościowych pomiarów fenotypowych z komórek. Podejście to okazało się skuteczne w pogłębianiu naszego zrozumienia szerokiego zakresu zarówno podstawowych, jak i stosowanych zdarzeń w biologii komórki. Do tej pory większość zastosowań tej technologii opierała się na wykorzystaniu komórek hodowanych w monowarstwach, chociaż coraz częściej zdaje się sprawę, że takie modele nie podsumowują wielu interakcji i procesów zachodzących w tkankach. W związku z tym nastąpił rozwój i wykorzystanie trójwymiarowych (3D) zespołów komórek, takich jak sferoidy i organoidy. Chociaż te modele 3D są szczególnie przydatne w kontekście biologii nowotworów i badań nad dostarczaniem leków, ich tworzenie i analiza w powtarzalny sposób odpowiedni dla HCS i HCA stwarza szereg wyzwań. Szczegółowo opisany tutaj protokół opisuje metodę generowania wielokomórkowych sferoid nowotworowych (MCTS) i pokazuje, że można ją zastosować do trzech różnych linii komórkowych w sposób zgodny z HCS i HCA. Metoda ta ułatwia produkcję kilkuset sferoid na studzienkę, zapewniając szczególną zaletę polegającą na tym, że w przypadku stosowania w systemie badań przesiewowych można uzyskać dane z kilkuset struktur na studzienkę, z których wszystkie są traktowane w identyczny sposób. Podano również przykłady, które szczegółowo opisują, jak przetwarzać sferoidy do obrazowania fluorescencyjnego w wysokiej rozdzielczości i jak HCA może wyodrębnić cechy ilościowe zarówno na poziomie sferoidalnym, jak i z poszczególnych komórek w każdej sferoidzie. Protokół ten może być z łatwością zastosowany do udzielenia odpowiedzi na wiele ważnych pytań w biologii komórki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tradycyjnie, testy komórkowe były przeprowadzane w monowarstwach rosnących na stałym podłożu, który skutecznie można uznać za dwuwymiarowe (2D) środowisko. Jednak coraz częściej uznaje się, że modele hodowli komórkowych 2D nie mają znaczenia fizjologicznego w niektórych kontekstach i nie mogą replikować wielu złożonych interakcji zachodzących między komórkami1. Trójwymiarowe (3D) metody hodowli komórek szybko stają się popularne wśród badaczy, a modele komórek 3D wykazują duży potencjał do lepszego naśladowania warunków fizjologicznych napotykanych przez komórki w środowisku tkankowym2. Istnieje kilka różnych typów zespołów komórek 3D, które zostały zastosowane, ale dwa najczęstsze typy to sferoidy i organoidy. Sferoidy mogą być hodowane z wielu różnych linii komórkowych i mogą przybierać różne kształty i rozmiary w zależności od użytego typu komórki i metody jej montażu3. Co więcej, sferoidy mogą być również określane jako wielokomórkowe sferoidy nowotworowe (MCTS), gdy są hodowane z linii komórek rakowych, a modele te znalazły szczególne zastosowanie w przedklinicznych badaniach dostarczania leków i toksyczności in vitro4,5. Z drugiej strony organoidy mają na celu lepsze naśladowanie tkanek i narządów w naszym ciele i mogą przyjmować bardziej złożone układy morfologiczne. Produkcja organoidów polega na wykorzystaniu dorosłych komórek macierzystych lub pluripotencjalnych komórek macierzystych, które można przeprogramować na odpowiednie komórki, aby przypominały tkankę lub narząd będący przedmiotem zainteresowania. Są one używane przede wszystkim do badania rozwoju narządów oraz do modelowania chorób i interakcji gospodarz-patogen6.

Istnieje szereg różnych metod używanych do generowania zestawów komórek 3D. Metody oparte na rusztowaniach zapewniają podłoże lub podporę, do której komórki mogą się przyczepiać lub rosnąć w środku. Rusztowania te mogą mieć różne kształty i mogą być wykonane z wielu różnych materiałów. Najczęściej spotykane są składniki macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i hydrożele, które są zaprojektowane tak, aby przypominały naturalne środowisko zewnątrzkomórkowe komórek, a tym samym ułatwiały interakcje fizjologiczne4,7. Materiał podstawowy ECM został wyekstrahowany z guza mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm i wykazano, że zawiera bogatą mieszaninę składników ECM, w tym lamininę, kolagen typu IV i perlecan8. Jednak pomimo korzystnego składu, istnieją dwa główne wyzwania związane z jego stosowaniem, a mianowicie jego zmienność między partiami oraz to, że ma dwa różne stany skupienia poniżej i powyżej 10 °C8,9. W przeciwieństwie do tego, hydrożele mają tę zaletę, że są elastyczne pod względem składników i sztywności, a także można je dostosować do konkretnego zestawu ogniw 3D, żądany7,10. Metody oparte na rusztowaniach są niezbędne do wzrostu organoidów, ale są również szeroko stosowane w przypadku sferoidów. Metody wolne od rusztowań, które działają poprzez zapobieganie przyczepianiu się komórek do powierzchni, na której rosną, są zwykle kompatybilne tylko z montażem sferoidalnym. Przykładem mogą być płytki o bardzo niskim poziomie mocowania (ULA), z płaskim dnem lub dnem w kształcie litery U, które umożliwiają agregację komórek w sferoidy, lub zastosowanie ciągłego mieszania komórek w kolbach obrotowych10.

Wykorzystanie zestawów komórek 3D do badania szerokiej gamy zdarzeń biologicznych szybko zyskuje na popularności; jednak ważne jest, aby wybrana metoda dla ich hodowli była odpowiednia i zgodna z planami ich dalszej analizy. Na przykład zastosowanie płytek ULA generuje sferoidy o wysokiej konsystencji; Metoda ta jest jednak ograniczona do produkcji pojedynczej sferoidy na odwiert, co ogranicza przepustowość. Szczególną uwagę należy zwrócić na obrazowanie fluorescencyjne struktury 3D. Podłoże lub płyta, na której wyrasta zespół, musi być optycznie kompatybilna i należy zachować ostrożność, aby zminimalizować skutki rozpraszania światła spowodowane przez rusztowania, które mogły być używane11. Ten konkretny problem staje się bardziej dotkliwy wraz ze wzrostem apertury numerycznej soczewek obiektywu mikroskopu.

Prawdopodobnie jednym z głównych powodów wyboru do pracy z modelem komórki 3D jest ekstrakcja wolumetrycznych danych obrazowania nie tylko o całym zespole, ale także o poszczególnych komórkach w jego obrębie. W szczególności modele MCTS zaczynają okazywać się bardzo skuteczne w pogłębianiu naszego zrozumienia tego, w jaki sposób terapie przechodzą z zewnątrz do komórek centralnych (tak jak musiałyby to robić w guzie)12, a więc zdobywanie wiedzy z poszczególnych komórek na różnych warstwach jest niezbędne. Technologia obrazowania, która wydobywa informacje ilościowe z pojedynczych komórek, jest określana jako analiza o wysokiej zawartości (HCA) i jest potężnym podejściem w kontekście badań przesiewowych13. Do tej pory HCA był stosowany prawie wyłącznie do kultur jednowarstwowych, ale coraz częściej zdaje sobie sprawę, że to podejście może być stosowane do kultur 3D, umożliwiając badanie szerokiego zakresu funkcji i procesów komórkowych14. Miałoby to wyraźną zaletę, ponieważ można by analizować dużą liczbę zespołów 3D, potencjalnie dostarczając danych na poziomie komórki z całej struktury. Należy jednak przezwyciężyć wyzwania związane z obrazowaniem potencjalnie grubych zespołów komórek, a także generowanych dużych zbiorów danych.

W tym artykule przedstawiono solidną metodę opartą na rusztowaniach do produkcji MCTS na dużą skalę w formacie 96-dołkowym. Metoda ta umożliwia produkcję kilkuset zespołów ogniw 3D w każdym dołku. Pokazano przykłady dla trzech różnych typów komórek, reprezentujących modele guzów litych wątroby, płuc i okrężnicy. Sferoidy, które się tworzą, mogą mieć różne rozmiary, i tak HCA służy do wybierania struktur o określonym rozmiarze i / lub morfologii. Ta cecha zapewnia dodatkową zaletę, że wszystkie zaobserwowane fenotypy mogą być porównywane między sferoidami o różnych rozmiarach, ale wszystkie traktowane w ten sam sposób w tej samej studzience. Podejście to jest kompatybilne z obrazowaniem w wysokiej rozdzielczości, co ważne, dostarczając danych ilościowych zarówno na poziomie komórkowym, jak i subkomórkowym z tych samych zestawów komórkowych. Ta metoda produkcji sferoidów ma dodatkową przewagę nad metodami, które generują pojedynczą sferoidę na studzienkę, ponieważ duża liczba sferoid wytwarzanych w każdym dołku potencjalnie zapewnia wystarczającą biomasę do innych dalszych analiz, takich jak profilowanie transkryptomu i proteomu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórkowa

  1. Przygotowanie nośnika
    1. Przygotuj specjalne podłoża do hodowli komórkowych w zależności od rodzaju linii komórkowej. Upewnij się, że wszystkie podłoża do utrzymania komórek zawierają 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
      UWAGA: Różne linie komórkowe używają różnych pożywek. Komórki raka jelita grubego HT-29 (ATCC HTB-38) są hodowane w McCoys 5A + 10% FBS. Komórki raka wątrobowokomórkowego HepG2 (ATCC HB-8065) są hodowane w Minimum Essential Medium + 1% L-glutaminy + 10% FBS. Komórki raka oskrzelowo-pęcherzykowego H358 (ATCC CRL-5807) są hodowane w pożywce RPMI 1640 + 1% L-glutaminy + 10% FBS. Wszystkie podłoża zawierające L-glutaminę i FBS są określane jako pożywki kompletne. Podczas posiewania komórek, aby rosły jako sferoidy, wymagane jest podłoże wolne od czerwieni fenolowej z 10% FBS, aby uniknąć zabarwienia materiału podstawowego ECM, co z kolei może powodować artefakty podczas procesu obrazowania.
  2. Komórki subkultur
    1. Gdy komórki są w około 80% zlewane, przemyj krótko 2 ml trypsyny-EDTA (0,25% (w/v) trypsyny/0,53 mM EDTA). Odessać trypsynę-EDTA, dodać 3 ml świeżej trypsyny-EDTA i inkubować przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C.
    2. Po odłączeniu komórek od naczynia do hodowli komórkowej dodać 7 ml świeżej, kompletnej pożywki.
    3. Pobrać pipetą 1 ml zawiesiny komórkowej do nowego naczynia do hodowli komórkowych o średnicy 10 cm i dodać 9 ml świeżej, kompletnej pożywki, aby uzyskać rozcieńczenie komórek w stosunku 1:10.
    4. Hodować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 .
    5. Subkulturuj komórki co 3-5 dni, w zależności od linii komórkowej.

2. Generowanie sferoid

  1. Pokryj 96-dołkowe płytki materiałem podstawowym ECM
    1. Rozmrozić materiał podstawowy ECM na lodzie przez noc.
    2. Rozcieńczyć materiał podstawowy ECM w zimnym, wolnym od czerwieni fenolu podłożu bez surowicy, używając wstępnie schłodzonych końcówek utrzymywanych w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Końcowe stężenie materiału podstawowego ECM zależy od użytej linii komórkowej. W przypadku komórek HT-29 i H358 należy użyć 4 mg·mL-1 materiału podstawowego ECM. W przypadku komórek HepG2 należy użyć 4 mg·mL-1 materiału podstawnego ECM o zredukowanym czynniku wzrostu.
    3. Odpipetować 15 μl roztworu podstawowego/medium ECM do 96-dołkowej płytki obrazowej.
      UWAGA: W przypadku produkcji sferoidów na dużą skalę ten etap można wykonać zarówno za pomocą pipety 8-kanałowej, jak i 96-kanałowej głowicy pipetującej, o ile końcówki i zbiornik zawierający materiał podstawowy ECM są schłodzone.
    4. Odwirować płytkę przez 20 minut przy 91 x g w temperaturze 4 °C.
    5. Inkubować płytkę nie dłużej niż 30 minut w temperaturze 37 °C.
  2. Subkultura i liczenie komórek
    1. W okresie inkubacji płytki inkubować komórki za pomocą trypsyny-EDTA i ponownie zawiesić je w kompletnym podłożu zawierającym 10% FBS.
    2. Pobrać pipetą 10 μl zawiesiny komórek do komory zliczającej hemocytometry. Policz liczbę komórek w 4 kwadrantach komory.
    3. Obliczyć liczbę komórek w zawiesinie komórek, określając średnią liczbę komórek w 4 kwadrantach.
      UWAGA: Komórki można również zliczać za pomocą automatycznych urządzeń do liczenia komórek.
    4. Odwirować komórki przy sile 135 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej (RT).
    5. Po granulowaniu komórek odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w kompletnym pożywce wolnej od czerwieni fenolowej, aby uzyskać stężenie 1 x 106 komórek na ml.
  3. Komórki nasienne do płytek pokrytych materiałem podstawowym ECM
    1. Rozcieńczyć komórki w kompletnym podłożu wolnym od czerwieni fenolowej.
      UWAGA: Gęstość zasianych komórek zależy od użytej linii komórkowej. W przypadku komórek HT-29 i HepG2 wysiewa się 3 x 104 komórki na studzienkę; w przypadku komórek H358 4 x 104 komórki są wysiewane na dołek.
    2. Wysiewać komórki w całkowitej objętości 35 μl na studzienkę. Upewnij się, że dodajesz je kroplami okrężnymi ruchami.
      UWAGA: W przypadku produkcji sferoidów na dużą skalę ten etap można wykonać za pomocą pipety 8-kanałowej, o ile możliwe jest uzyskanie okrężnych ruchów pipetowania.
    3. Inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze z 5% CO2 .
    4. Przygotować roztwór materiału podstawowego ECM w kompletnym podłożu wolnym od czerwieni fenolowej, co daje końcowe stężenie 2% materiału podstawowego ECM w studni. Aby to osiągnąć, dodaj 1,2 μl materiału podstawowego ECM do 23,8 μl kompletnego podłoża wolnego od czerwieni fenolowej na studzienkę, co daje końcową objętość 60 μl na studzienkę.
    5. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze z 5% CO2 .
    6. Następnego dnia zastąp pożywkę 100 μl świeżej, kompletnej pożywki bez czerwieni fenolowej.
    7. Pożywkę należy wymieniać co drugi dzień na 100 μl świeżej, kompletnej pożywki bez czerwieni fenolowej.

3. Barwienie immunofluorescencyjne sferoidów

UWAGA: Ten protokół jest adaptacją Nürnberg et al., 202015. Adaptacje te opierają się przede wszystkim na fakcie, że sferoidy opisane w tym protokole są mniejsze niż te użyte w Norymberdze i in. work15 i jako takie ułatwiają krótszy czas inkubacji. Na przykład czas blokowania został skrócony z 2 godzin do 1 godziny. Ponadto, ponieważ protokół jest przeznaczony do wysokoprzepustowej produkcji sferoid, wszystkie etapy przetwarzania są przeprowadzane w studzience, w której sferoidy są hodowane, co oznacza, że przenoszenie pojedynczych sferoid do probówek nie jest wymagane.

  1. Przygotuj wszystkie roztwory i wymagane do utrwalenia i barwienia
    1. Przygotuj sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), dodając 1 tabletkę PBS na 200 ml wody. Autoklaw PBS.
    2. Przygotować paraformaldehyd (PFA) wykonując kroki 3.1.3-3.1.4.
    3. Za pomocą podgrzanego mieszadła podgrzać 400 ml PBS do temperatury 60-70 °C w dygestorium. Dodaj 15 g PFA, mieszając. Po rozpuszczeniu PFA dodać 50 μl 1 M CaCl2 i 50 μl 1 M MgCl2.
    4. Dodaj 100 ml PBS, aby uzyskać końcową objętość 500 ml. Użyj NaOH do zrównoważenia PFA do pH 7,4. Przefiltrować PFA przez sterylne filtry próżniowe (wielkość porów 0,22 μm), podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    5. Przygotować 1 M roztwór podstawowy glicyny, dodając 3,75 g glicyny do 50 ml PBS. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    6. Przygotować 5 ml buforu permeabilizacyjnego, dodając 100 μl Triton X-100, 1 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) i 1,5 ml 1 M glicyny do 2,4 ml PBS. Przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 2 tygodnie.
    7. Przygotować 5 ml buforu blokującego, dodając 100 μl Triton X-100, 0,5 ml DMSO i 0,05 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do 4,9 ml PBS. Porcjować bufor blokujący do probówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    8. Przygotować 5 ml buforu do inkubacji przeciwciał, dodając 10 μl polisorbatu 20, 0,05 g BSA i 250 μl DMSO do 4,74 ml PBS. Podwielokrotność buforu do inkubacji przeciwciał rozmieścić w probówkach o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: W opisanym tutaj protokole sferoidy są montowane tylko w wewnętrznych 60 dołkach płytki 96-dołkowej, chociaż można je przygotować we wszystkich 96 dołkach płytki. Powodem, dla którego sferoidy są przygotowywane tylko w wewnętrznych 60 dołkach, jest to, że niektóre soczewki obiektywowe o dużej aperturze numerycznej nie są w stanie fizycznie zobrazować całej studzienki zewnętrznej ze względu na "spódnicę" na niektórych typach płyt. Powyższe objętości wystarczają do przygotowania 60 studzienek zawierających sferoidy.
  2. Napraw i przepuszczalność sferoid
    1. Ostrożnie usuń podłoże ze sferoid, upewniając się, że warstwa materiału podstawowego ECM nie jest naruszona.
    2. Przemyć sferoidy dwukrotnie 70 μl PBS przez 3 minuty za każdym razem.
    3. Utrwalić sferoidy za pomocą 70 μl 3% PFA przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    4. Przemyć sferoidy dwukrotnie 70 μl PBS przez 3 minuty za każdym razem.
    5. Przechowywać w 70 μl 0,5 M roztworu glicyny przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    6. Przepuszczalność sferoid za pomocą 70 μl buforu permeabilizacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Przemyć sferoidy dwukrotnie 70 μl PBS przez 3 minuty za każdym razem.
    8. Inkubować sferoidy w 70 μl buforu blokującego przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Po zamocowaniu sferoid wszystkie kolejne etapy przetwarzania można wykonać za pomocą pipety 8-kanałowej lub 96-dołkowej głowicy pipetowej, jeśli jest dostępna. Zwiększa to szybkość przygotowania sferoidy przed obrazowaniem.
  3. Sferoidy immunostainowe przy użyciu przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych
    1. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe do odpowiedniego rozcieńczenia w buforze do inkubacji przeciwciał i dodać 70 μl do każdego dołka. Inkubować sferoidy z pierwszorzędowym przeciwciałem przez noc.
      UWAGA: Rozcieńczenie zależy od zastosowanego przeciwciała. W pokazanym tutaj przykładzie lizosomy są barwione immunologicznie mysimi przeciwciałami anty-LAMP1 przy użyciu rozcieńczenia 1:500.
    2. Następnego dnia przemyj sferoidy 5 razy 70 μl PBS przez 3 minuty za każdym razem.
    3. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w rozcieńczeniu 1:500, fluorescencyjnie sprzężoną falloidynę w stosunku 1:500 i Hoechst 33342 (z 1 mg mL-1) w stosunku 1:5000 w buforze do inkubacji przeciwciał i dodać 70 μl do każdej studzienki. Inkubować przez noc.
      UWAGA: Rozcieńczenie przeciwciała zależy od zastosowanego przeciwciała. Zalecane są wysoce zaadsorbowane krzyżowo przeciwciała drugorzędowe, które wykazują wysoką fotostabilność i wysoką jasność.
    4. Następnego dnia przemyj sferoidy 5 razy 70 μl PBS przez 3 minuty za każdym razem.
      UWAGA: Płytki mogą być przechowywane do dwóch tygodni w RT przed obrazowaniem, o ile sferoidy pozostają pokryte PBS.

4. Akwizycja i analiza obrazów sferoid

  1. Akwizycja obrazu
    1. Włóż 96-dołkową płytkę zawierającą sferoidy do konfokalnego mikroskopu przesiewowego o wysokiej zawartości.
    2. Wybierz odpowiednie lasery, aby wzbudzić użyte fluorofory.
    3. Pobieraj kanały sekwencyjnie, aby uniknąć przesłuchów.
    4. Zobrazuj sferoidy za pomocą odpowiednich obiektywów.
      UWAGA: Zaleca się stosowanie obiektywów do zanurzania w wodzie, jeśli są dostępne. Na przykład obiektyw 20x/1,0 NA może obrazować całą studnię w ~77 polach widzenia. Obiektyw 63x/1,15 NA może obrazować całą studnię w około 826 polach widzenia.
    5. Obraz ~30-40 plasterków, w zależności od głębokości sferoidy, przy czym każdy plasterek jest wykonany w odstępie 1,5 μm od poprzedniego.
  2. Analiza obrazu
    1. W celu analizy morfologicznej sferoid należy wykonać kroki 4.2.2-4.2.6.
    2. Segmentuj sferoidy na podstawie fluorescencyjnie sprzężonego barwienia falloidyny.
    3. Podzielić jądra na segmenty na podstawie barwienia Hoechst 33342.
    4. Podziel cytoplazmę każdej komórki na segmenty według pozostałego barwnika Hoechst 33342, który jest obecny w cytoplazmie komórki.
    5. Oblicz różne właściwości morfologiczne sferoid, w tym objętość, powierzchnię, sferyczność i liczbę jąder na sferoidę.
      UWAGA: Informacje te są wyodrębniane przy użyciu różnych algorytmów, które są wbudowane w wybrane oprogramowanie do analizy obrazu.
    6. Dalsze przetwarzanie obrazów w celu usunięcia sferoid mniejszych niż 75 000μm3 i większych niż 900 000 μm3,
      UWAGA: Te wartości są sugestiami umożliwiającymi usunięcie bardzo małych zespołów komórek i dużych zespołów, które mogły powstać w wyniku fuzji wielu sferoid. Na tym etapie sferoidy można również podzielić na różne klasy wielkości.
    7. Aby przeanalizować pojedyncze komórki w sferoidach, wykonaj kroki 4.2.8-4.2.12.
    8. Segmentuj sferoidy na podstawie fluorescencyjnie sprzężonego barwienia falloidyny.
    9. Podzielić jądra na segmenty na podstawie barwienia Hoechst 33342.
    10. Podziel cytoplazmę każdej komórki na segmenty według pozostałego barwnika Hoechst 33342, który jest obecny w cytoplazmie komórki.
    11. Segmentuj lizosomy na podstawie wtórnego barwienia przeciwciałami.
    12. Oblicz różne właściwości morfologiczne komórek w każdej sferoidzie, w tym liczbę lizosomów na komórkę, objętość komórki i powierzchnię komórki.
      UWAGA: Informacje te są wyodrębniane przy użyciu różnych algorytmów, które są wbudowane w wybrane oprogramowanie do analizy obrazu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole szczegółowo opisana jest solidna metoda produkcji zestawów 3D do hodowli komórkowych w formie sferoidów, wykorzystujących różne typy komórek do reprezentowania różnych tkanek nowotworowych. Metoda ta pozwala na generowanie setek sferoid na studzienkę, co umożliwia wykonywanie testów komórkowych w sposób o wysokiej zawartości (Rysunek 1). Podejście to było wcześniej wykorzystywane do badania absorpcji nanocząstek w sferoidach HT-29 16 oraz toksyczności indukowane...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane tutaj podejście szczegółowo opisuje platformę do generowania kilkuset sferoid na studzienkę w sposób odpowiedni dla HCS i HCA. W porównaniu z innymi popularnymi metodami, takimi jak stosowanie płaskodennych i okrągłodennych płytek ULA, które pozwalają na utworzenie tylko jednej sferoidy na studzienkę18,19, metoda ta daje możliwość ekstrakcji informacji o wysokiej rozdzielczości z dużej liczby sferoid w formacie przesiewowym. Warto zauważyć, że metoda ta z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że z pracą tą nie wiążą się żadne konkurencyjne interesy.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za wsparcie grantu na badania infrastrukturalne od Science Foundation Ireland (SFI) (16/RI/3745) dla JCS. Prace w Laboratorium Badań Przesiewowych Komórek UCD są wspierane przez UCD College of Science. ASC jest finansowany przez Irlandzką Radę ds. Badań Naukowych (IRC) Stypendium Podyplomowe Rządu Irlandii (GOIPG/2019/68). Autorzy dziękują również wszystkim członkom laboratorium za ich wkład i pomocne dyskusje. Grafika na rysunku 1 została wygenerowana w programie BioRender.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% Trypsyna-EDTA (1x), czerwień fenolowaGibco25300054
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma AldrichA6003
Chlorek wapniaFisher Scientific10050070
CellCarrier-96 Ultra Microplates, poddana działaniu hodowli tkankowej,, 96-dołkowa z pokrywkąPerkin Elmer6055302Te płytki zostały przemianowane na Phenoplates
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma AldrichD2650
Płodowa surowica bydlęca (FBS), kwalifikowana, zatwierdzona przez UE, pochodząca z Ameryki Południowej, inaktywowana termicznieGibco10500064
Glycine FisherScientificBP381-1
Kozia anty-mysia IgG (H + L) Wysoce adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11029
Roztwór L-glutaminy, 200 mMGibco25030024
Hoechst 33342Sigma Aldrich14533
Chlorek magnezuFisher Scientific10647032
Matrigel Matryca membrany podstawnej, bez czerwieni fenolowej, bez LDEV, 10 mlCorning356237Ten preparat Matrigel można również znaleźć pod tym samym numerem katalogowym w BD Biosciences
Matrigel Czynnik wzrostu Zredukowany MatrigelBD Biosciences356231Ten preparat Matrigel można również znaleźć pod tym samym numerem katalogowym w pożywce 5A firmy Corning
McCoyGibco26600023
Pożywka 5A firmy McCoy z L-glutaminą i wodorowęglanem sodu, bez czerwieni fenolowejHyclone10358633
Minimum Essential Medium (MEM)Gibco21090022
Minimum Essential Medium (MEM), bez glutaminy, bez czerwieni fenolowejGibco51200046
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-LAMP1 (koncentrat)Badania rozwojowe Hybridoma BankH4A3-a
Komora licząca Neubauera8100203 HirschmannNaczynie
hodowli tkankowych nunclon z pokrywką, polistyren, 92 mm x 17 mmThermoFisher Scientific150350
System Opera Phenix HCS i oprogramowanie Harmony HCAPerkin ElmerHCSHH14000000
Paraformaldehyd (PFA)Sigma AldrichP6148
Phalloidin Alexa Fluor 568InvitrogenA12380
Tabletki soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS)Sigma AldrichP4417
Polisorbat 20Sigma AldrichP5927
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX SuplementGibco61870010
RPMI 1640 Medium, bez glutaminy, bez czerwieni fenolowejGibco11835063
Triton X-100Sigma AldrichT9284
Stericup Stericup sterylne filtry próżnioweMilliporeSCGVU05RE
do

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33(2020).
  2. Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6(2018).
  3. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  4. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  5. Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. Three-dimensional liver models: state of the art and their application for hepatotoxicity evaluation. Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).
  6. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  7. Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).
  8. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15, 378-386 (2005).
  9. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  10. Foglietta, F., Canaparo, R., Muccioli, G., Terreno, E., Serpe, L. Methodological aspects and pharmacological applications of three-dimensional cancer cell cultures and organoids. Life Sciences. 254, 117784(2020).
  11. Bardsley, K., Deegan, A. J., El Haj, A., Yang, Y. Current state-of-the-art 3D tissue models and their compatibility with live-cell imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 3-18 (2017).
  12. Darrigues, E., et al. Tracking gold nanorods' interaction with large 3D pancreatic-stromal tumor spheroids by multimodal imaging: Fluorescence, photoacoustic, and photothermal microscopies. Scientific Reports. 10 (1), 3362(2020).
  13. Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C. Microscopy-based high-content screening. Cell. 163 (6), 1314-1325 (2015).
  14. Mysior, M. M., Simpson, J. C. Cell3: A new vision for study of the endomembrane system in mammalian cells. Bioscience Reports. , (2021).
  15. Nürnberg, E., et al. Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (20), (2020).
  16. Cutrona, M. B., Simpson, J. C. A High-throughput automated confocal microscopy platform for quantitative phenotyping of nanoparticle uptake and transport in spheroids. Small. 15 (37), 1902033(2019).
  17. Kelly, S., Byrne, M. H., Quinn, S. J., Simpson, J. C. Multiparametric nanoparticle-induced toxicity readouts with single cell resolution in HepG2 multicellular tumour spheroids. Nanoscale. 13 (41), 17615-17628 (2021).
  18. Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures. Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), 402-414 (2015).
  19. Redondo-Castro, E., Cunningham, C. J., Miller, J., Cain, S. A., Allan, S. M., Pinteaux, E. Generation of human mesenchymal stem cell 3D spheroids using low-binding plates. Bio-protocol. 8 (16), (2018).
  20. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  21. Eismann, B., et al. Automated 3D light-sheet screening with high spatiotemporal resolution reveals mitotic phenotypes. Journal of Cell Science. 133 (11), 245043(2020).
  22. Alsehli, H., et al. An integrated pipeline for high-throughput screening and profiling of spheroids using simple live image analysis of frame to frame variations. Methods. 190, 33-43 (2021).
  23. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 1-11 (2021).
  24. Renner, H., et al. A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids. eLife. 9, 52904(2020).
  25. Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
  26. Collins, A., Miles, G. J., Wood, J., MacFarlane, M., Pritchard, C., Moss, E. Patient-derived explants, xenografts and organoids: 3-dimensional patient-relevant preclinical models in endometrial cancer. Gynecologic Oncology. 156 (1), 251-259 (2020).
  27. Miles, G. J., et al. Evaluating and comparing immunostaining and computational methods for spatial profiling of drug response in patient-derived explants. Laboratory Investigation. 101 (3), 396-407 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Spheroid ProductionHigh Content ScreeningMulticellular Tumor Spheroids3D Cell CultureConfocal MicroscopyFluorescence ImagingMorphological AnalysisCell SegmentationDrug Delivery StudiesProteomic Analysis

Powiązane artykuły