Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pojedyncza komórka wielokrotnego użytku do iteracyjnych analiz epigenomicznych

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63456

⸱

11 lutego 2022

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cellular Oncology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Biostatistics and Data Management Section, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 3CCR Collaborative Bioinformatics Resource (CCBR), Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 4Advanced Biomedical Computational Science, Frederick National Laboratory for Cancer Research sponsored by the National Cancer Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje metodę pojedynczej komórki do iteracyjnych analiz epigenomicznych przy użyciu pojedynczej komórki wielokrotnego użytku. Pojedyncza komórka wielokrotnego użytku umożliwia analizę wielu znaczników epigenetycznych w tej samej pojedynczej komórce i statystyczną walidację wyników.

Streszczenie

Obecne analizy epigenomu pojedynczych komórek są przeznaczone do jednorazowego użytku. Komórka jest wyrzucana po jednorazowym użyciu, co zapobiega analizie wielu znaczników epigenetycznych w jednej komórce i wymaga danych z innych komórek w celu odróżnienia sygnału od eksperymentalnego szumu tła w pojedynczej komórce. W artykule opisano metodę ponownego wykorzystania tej samej pojedynczej komórki do iteracyjnych analiz epigenomicznych.

W tej eksperymentalnej metodzie, białka komórkowe są najpierw zakotwiczone w polimerze poliakrylamidowym, zamiast sieciować je z białkiem i DNA, co łagodzi strukturalne uprzedzenia. Ten krytyczny krok pozwala na wielokrotne eksperymenty z tą samą pojedynczą komórką. Następnie losowy starter z sekwencją rusztowania do ligacji zbliżeniowej jest wyżarzany do genomowego DNA, a sekwencja genomowa jest dodawana do startera przez rozszerzenie za pomocą polimerazy DNA. Następnie przeciwciało przeciwko markerowi epigenetycznemu i kontrolnej IgG, z których każda jest znakowana różnymi sondami DNA, są wiązane z odpowiednimi celami w tej samej pojedynczej komórce.

Ligacja zbliżeniowa jest indukowana między losowym starterem a przeciwciałem poprzez dodanie konektora DNA z komplementarnymi sekwencjami do sekwencji rusztowania losowego startera i sondy przeciwciało-DNA. Podejście to integruje informacje o przeciwciałach i sekwencje pobliskiego genomu w pojedynczym produkcie DNA ligacji zbliżeniowej. Umożliwiając wielokrotne eksperymenty na tej samej pojedynczej komórce, metoda ta pozwala na zwiększenie gęstości danych z rzadkiej komórki i analizę statystyczną przy użyciu tylko danych IgG i przeciwciał z tej samej komórki. Pojedyncze komórki wielokrotnego użytku przygotowane tą metodą mogą być przechowywane przez co najmniej kilka miesięcy i ponownie wykorzystane później w celu poszerzenia charakterystyki epigenetycznej i zwiększenia gęstości danych. Metoda ta zapewnia elastyczność naukowcom i ich projektom.

Wprowadzenie

Technologia jednokomórkowa wkracza w erę multiomiki jednokomórkowej, która integruje indywidualne technologie porozumień jednokomórkowych1. Ostatnio transkryptomika pojedynczych komórek została połączona z metodami wykrywania dostępności chromatyny (scNMT-seq2 i SHARE-seq3) lub modyfikacji histonów (Paired-seq4 i Paired-Tag5). Niedawno transkryptomika i proteomika pojedynczych komórek została zintegrowana z dostępnością chromatyny (DOGMA-seq6). Metody te wykorzystują tagowanie oparte na transpozazie do wykrywania dostępności chromatyny lub modyfikacji histonów.

Podejścia oparte na transpozazie dzielą genomowe DNA i dodają kod kreskowy DNA na końcu fragmentu genomowego DNA. Każdy rozszczepiony fragment genomu może przyjąć tylko do dwóch kodów kreskowych DNA (= jeden znak epigenetyczny na miejsce rozszczepienia), a genomowe DNA w miejscu rozszczepienia zostaje utracone. W związku z tym podejścia oparte na rozszczepieniu wiążą się z kompromisem między liczbą badanych znaczników epigenetycznych a gęstością sygnału. Utrudnia to analizę wielu znaczników epigenetycznych w tej samej pojedynczej komórce. Aby przezwyciężyć ten problem, opracowano metodę epigenomiczną pojedynczej komórki, która nie rozszczepia genomowego DNA7,8.

Oprócz wspomnianego wyżej problemu związanego z rozszczepieniem, podejścia oparte na transpozazie mają inne ograniczenia. W analizie epigenomu pojedynczej komórki kluczowe znaczenie ma znajomość lokalizacji histonów i białek związanych z DNA w genomie. W obecnych podejściach osiąga się to poprzez wykorzystanie nieutrwalonych pojedynczych komórek i zachowanie interakcji białko-DNA i białko-białko. Powoduje to jednak silne odchylenie w kierunku dostępnych regionów chromatyny, nawet w analizie modyfikacji histonów 9. Lokalizacja histonów i białek związanych z genomem w genomie może być zachowana bez sieciowania białko-DNA i białko-białko, przy użyciu rusztowania poliakrylamidowego7,8. Takie podejście zmniejsza odchylenie strukturalne obserwowane w obecnych podejściach, które zależą od interakcji białko-DNA i białko-białko.

Podejścia oparte na transpozach mogą odbierać sygnały tylko raz z pojedynczej komórki. W związku z tym trudno jest wyznaczyć pełny epigenom pojedynczej komórki ze względu na spadek sygnałów. Pojedyncze komórki wielokrotnego użytku zostały opracowane w celu przezwyciężenia obecnych ograniczeń poprzez umożliwienie iteracyjnej analizy epigenomicznej w tej samej pojedynczej komórce.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Schematyczna reprezentacja metody przedstawiona jest na Rysunku 1.

Schemat polimeryzacji i procesu DNA przedstawiający modyfikację akryloamidu, polimerazę i etapy ligacji.
Rysunek 1: Schematyczny przebieg protokołu. Kroki 7.2-13 zostały wyjaśnione za pomocą reprezentacji schematycznych. Każdy wiersz wskazuje poszczególny krok protokołu. Białko komórkowe zaznaczone kolorem zielonym to ludzki nukleosom wygenerowany na podstawie struktury krystalicznej (PDB: 6M4G). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

1. Równoważenie kolumn do odsalania

UWAGA: Kolumny wirówkowe do odsalania są równoważone zgodnie z opisem w poniższych krokach. Zrównoważone kolumny do odsalania są wykorzystywane w krokach 2.1, 3.4 oraz 4.6.

  1. Zdejmij dolną zaślepkę z kolumny do odsalania (odcięcie 7 kDa, objętość złoża kulek 0,5 mL, patrz Tabela materiałów) i poluzuj nasadkę na górze kolumny.
  2. Umieść kolumnę w probówce 1,5 mL o niskim powinowactwie do białek (probówce do zbierania, patrz Tabela materiałów) i wiruj przy 1 500 × g przez 1 min w temperaturze pokojowej, aby usunąć roztwór do przechowywania z kolumny.
    UWAGA: Należy użyć wirówki z rotorem kątowym (swing-out), aby spłaszczyć górną powierzchnię złoża kulek.
  3. Usuń przesącz z probówki 1,5 mL i dodaj 300 µL buforu 150 mM NaCl/100 mM fosforanowego, pH 8,0 (patrz Tabela 1) na wierzch złoża żywicy.
  4. Wiruj przy 1 500 × g przez 1 min w temperaturze pokojowej i usuń przesącz z probówki do zbierania.
  5. Powtórz kroki 1.3-1.4 trzykrotnie.
  6. Wylej bufor z probówki do zbierania i umieść kolumnę w nowej probówce do zbierania.
  7. Użyj zrównoważonej kolumny do odsalania w krokach 2.1, 3.4 i 4.4.

2. Wymiana buforu przeciwciał

UWAGA: Usuń glicerol, argininę i azydek sodu z przeciwciał anti-H3K27ac10, anti-H3K27me310, anti-Med111 oraz anti-Pol II10 (skład buforu przedstawiono w Tabeli 1). Wszystkie kolejne procedury należy przeprowadzać pod czystym wyciągiem, aby uniknąć kontaminacji DNazą. Czas: 1 h

  1. Nanieś roztwór przeciwciał (100 µL, patrz Tabela 2) na wyrównaną kolumnę odsolania przygotowaną zgodnie z krokiem 1.
  2. Wiruj przy 1 500 × g przez 2 min w temperaturze 4 °C, a następnie przenieś przelew z probówki zbiorczej do probówki 1,5 mL o niskim wiązaniu białek.
  3. Zmierz stężenie IgG, korzystając z absorbancji przy 280 nm12 (użyj spektrofotometru mikropobjętościowego).
  4. Przenieś roztwór przeciwciał do kasety do ultrafiltracji (próg odcięcia masy cząsteczkowej 100 kDa, 0,5 mL, patrz Tabela materiałów) i wiruj przy 12 000 × g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
  5. Zmierz stężenie IgG, korzystając z absorbancji przy 280 nm.
  6. Powtarzaj kroki 2.4-2.5, aż stężenie IgG osiągnie poziom 1 mg/mL.

3. Aktywacja przeciwciała

UWAGA: Poniższa procedura jest wykonywana pod czystym dygestorium, aby uniknąć kontaminacji DNazą. Czas: 2,5 h

  1. Rozpuścić 1 mg succinimidylo-6-hydrazynonikotynianu acetonohydrazonu (S-HyNic, patrz Tabela materiałów) w 100 µL bezwodnego N,N-dimetyloformamidu (DMF, patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: DMF jest łatwopalnym rozpuszczalnikiem organicznym i silną toksyną dla wątroby, która wchłania się przez skórę. Należy stosować rękawiczki, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny. Należy przestrzegać instytucyjnych wytycznych dotyczących bezpieczeństwa. Zużyte naczynia laboratoryjne należy utylizować zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
  2. Dodać 0,6 µL roztworu S-HyNic/DMF do 100 µL roztworu przeciwciał (1 mg/mL w 150 mM NaCl/100 mM fosforanie sodu, pH 8,0. Patrz Tabela 2 w celu zapoznania się z użytymi przeciwciałami i kontrolnym IgG).
  3. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 h (chroniąc przed światłem).
  4. Nanieść 100 µL przeciwciał przereagowanych z S-HyNic na górę wyrównanej kolumny odsalającej (patrz krok 1) i wirować przy 1 500 × g przez 2 min w 4 °C w celu zebrania próbki.
  5. Po użyciu usunąć kolumnę odsalającą.
    UWAGA: Stabilność grup HyNic na białkach i innych biomolekułach jest zmienna. Zaleca się bezzwłoczną koniugację biomolekuł zmodyfikowanych HyNic.

4. Aktywacja sondy DNA

UWAGA: Poniższa procedura jest wykonywana pod czystym wyciągiem w celu uniknięcia kontaminacji DNazą. Czas: 2,5 h

  1. Rozpuścić osad sondy DNA modyfikowanej aminą dla przeciwciała lub kontrolnego IgG (Sonda Przeciwciała, Tabela 3) w 20 µL buforu 150 mM NaCl/100 mM fosforanu sodu, pH 8,0.
    UWAGA: Należy szukać cienkiego, przezroczystego osadu/filmu na dnie probówki. Bufor należy nanieść bezpośrednio na osad. Jeśli osad nie jest widoczny, mógł on odkleić się i przywrzeć do ścianki lub zakrętki. W takim przypadku należy odwirować probówkę i sprawdzić, czy na dnie pojawił się osad.
  2. Rozpuścić 1 mg 4-formylobenzoesanu sukcynimidylowego (S-4FB, patrz Tabela materiałów) w 50 µL bezwodnego DMF, a następnie dodać 10 µL DMF do rozpuszczonej Sondy Przeciwciała.
  3. Dodać 4 µL S-4FB/DMF przygotowanego w kroku 4.2, wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 h (chroniąc przed światłem).
  4. Nanieść 34 µL Sondy Przeciwciała przereagowanej z S-4FB na górę wyrównanej kolumny odsolonej (patrz krok 1).
  5. Po całkowitym wchłonięciu próbki nanieść na górę złoża żelu 15 µL buforu 150 mM NaCl/100 mM fosforanu sodu, pH 8,0, a następnie odwirować z prędkością 1 500 × g przez 2 min w temperaturze 4 °C, aby zebrać Sondę Przeciwciała modyfikowaną S-4FB.
  6. Przełom wykorzystać do dalszej koniugacji; zmierzyć absorbancję przy 260 nm i obliczyć stopień odzysku Sondy Przeciwciała.

5. Koniugacja przeciwciała modyfikowanego S-HyNic oraz sondy przeciwciała modyfikowanej S-4FB

UWAGA: Poniższą procedurę należy przeprowadzić pod czystym dygestorium, aby uniknąć kontaminacji DNazą. Czas: 2 h

  1. Wymieszać przeciwciało modyfikowane S-HyNic z sondą przeciwciała modyfikowaną S-4FB, a następnie pipetować roztwór w górę i w dół w celu wymieszania.
  2. Inkubować przez 2 h w temperaturze pokojowej (chroniąc przed światłem).
  3. Aby zatrzymać reakcję, dodać 478,8 µL roztworu do wygaszania i przechowywania (patrz Tabela 1).
  4. Przenieść roztwór przeciwciała sprzężonego z sondą przeciwciała do kasety ultrafiltracyjnej (próg odcięcia masy cząsteczkowej 100 kDa).
  5. Wirować przez 5 min przy 12 000 × g w temperaturze 4 °C.
  6. Sprawdzić objętość roztworu wewnątrz kasety za pomocą pipety.
  7. Powtarzać kroki 5.5-5.6, aż objętość osiągnie 100 µL, a następnie przechowywać w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Stężenie IgG mierzy się za pomocą testu sandwich ELISA13,14,15 przy użyciu standardu IgG.

6. Przygotowanie rdzeniowych kulek magnetycznych

UWAGA: W tej metodzie pojedyncza komórka jest osadzona w dwuwarstwowym koraliku akrylamidowym (patrz Rysunek 2). Rdzeń stanowi magnetyczny koralik poliakrylamidowy. Warstwa zewnętrzna składa się z samego poliakrylamidu. W tej sekcji generowane są magnetyczne koraliki rdzenia. Ta sekcja nie jest niezbędna do przeprowadzenia eksperymentu. Czas: 3 h

Enkapsulacja kulek magnetycznych: probówka z osadem i schemat komórki w warstwach poliakryloamidowych.
Rycina 2: Struktura dwuwarstwowej kulki poliakryloamidowej zapewniająca widoczność i łatwą manipulację w eksperymentach REpi-seq. (A) Nanocząstki magnetyczne z kroku 6.6 po wirowaniu. Nanocząstki magnetyczne są zmodyfikowane monomerem akryloamidu i wbudowane w poliakryloamidową kulkę magnetyczną pokazaną w B.(B) Schematyczna reprezentacja pojedynczej komórki z poliakryloamidową kulką magnetyczną do ponownego użycia. Aby zobaczyć większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

  1. Wymieszać 50 µL buforu wodorowęglanu sodu 1 M, pH 8,5 oraz 450 µL 40% roztworu akryloamidu.
    UWAGA: Akryloamid jest neurotoksyną. Należy stosować rękawiczki, ochronniki oczu i fartuch laboratoryjny. Należy przestrzegać instytucjonalnych wytycznych dotyczących bezpieczeństwa. Zużyte naczynia laboratoryjne należy utylizować zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
  2. Zawiesić 1 g 30 nm proszku tlenku żelaza funkcjonalizowanego estrem NHS (patrz Tabela materiałów) w buforze akryloamid/wodorowęglan sodu i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Ponieważ kuleczki akryloamidowe są przezroczyste, ich widoczność i manipulowanie ich położeniem może być utrudnione. Zastosowanie rdzenia z tlenku żelaza poprawia widoczność i ułatwia manipulację, ponieważ położenie kuleczek można kontrolować za pomocą magnesu. Jednakże, jeśli użytkownicy są zaznajomieni z eksperymentami REpi-seq, można pominąć etap stosowania magnetycznych poliakryloamidowych kuleczek rdzeniowych.
  3. Przenieść zawiesinę nanokuleczek do 2 probówek (1,5 mL), wirować przy 21 300 × g przez 1 h (używając rotora kątowego) w temperaturze 4 °C, a następnie usunąć nadsącz.
  4. Zawiesić osad z dna w 1 mL 40% akryloamidu/bis-akryloamidu (19:1, patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Bis-akryloamid jest neurotoksyną. Należy stosować rękawiczki i fartuch laboratoryjny. Należy przestrzegać instytucjonalnych wytycznych dotyczących bezpieczeństwa. Zużyte naczynia laboratoryjne należy utylizować zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
  5. Wirować przy 21 300 × g przez 1 h (używając rotora kątowego) w temperaturze 4 °C.
  6. Wirować przy 5 000 × g przez 30 min (używając rotora wahadłowego bez hamulca) w temperaturze 4 °C.
  7. Usunąć nadsącz za pomocą pipety P1000, aspirując z niską prędkością.
  8. Dopełnić objętość do 400 µL 40% akryloamidu/bis-akryloamidu (19:1, patrz Tabela materiałów).
  9. Dodać 25 µL 10% roztworu persiarczanu amonu (patrz Tabela 1).
    UWAGA: Persiarczan amonu jest silnym utleniaczem. Pył w powietrzu zawierający persiarczan amonu może podrażnić oczy, nos, gardło, płuca i skórę w przypadku kontaktu. Należy stosować rękawiczki, gogle ochronne i fartuch laboratoryjny. Należy przestrzegać instytucjonalnych wytycznych dotyczących bezpieczeństwa. Zużyte naczynia laboratoryjne należy utylizować zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
  10. Aby wytworzyć magnetyczne poliakryloamidowe kuleczki rdzeniowe, przenieść 0,5 µL zawiesiny tlenku żelaza modyfikowanego akryloamidem do probówki PCR.
  11. Dodać 50 µL 4% N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiaminy/oleju mineralnego (TEMED, patrz Tabela 1) i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: TEMED jest łatwopalnym rozpuszczalnikiem. Pracować pod wyciągiem. Nie wdychać. Przechowywać z dala od otwartego ognia, gorących powierzchni i źródeł zapłonu. Należy stosować rękawiczki, gogle ochronne i fartuch laboratoryjny. Należy przestrzegać instytucjonalnych wytycznych dotyczących bezpieczeństwa. Zużyte naczynia laboratoryjne należy utylizować zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.

7. Modyfikacja grupy aminowej białek komórkowych za pomocą monomeru akryloamidu

UWAGA: Metoda REpi-seq została opracowana w celu analizy epigenomu komórek myszy i człowieka na poziomie pojedynczych komórek. Każdy etap musi zostać zoptymalizowany podczas stosowania tej metody w przypadku komórek gatunków innych niż mysz lub człowiek.

  1. Zbieranie komórek
    UWAGA: Czas: 30 min
    1. Zmierzyć stężenie i żywotność komórek za pomocą licznika komórek (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Żywotność komórek na tym etapie wpływa na liczbę żywych komórek w analizie danych.
    2. Dostosować stężenie komórek do 1 × 105 cells/mL przy użyciu pożywki hodowlanej (*) zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej.
      UWAGA: *Pożywka hodowlana to optymalna pożywka dla analizowanych komórek.
    3. Przenieść 1 mL zawiesiny komórkowej do probówki 1,5 mL.
    4. Wirować zawiesinę komórkową przy 240 × g przez 5 min w temperaturze 4 °C i usunąć nadsącz.
    5. Dodać 1 mL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS), wymieszać komórki delikatnie pipetując, a następnie wirować zawiesinę komórkową przy 240 × g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
    6. Usunąć nadsącz.
      UWAGA: Wszystkie powyższe kroki powinny być wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby zapobiec kontaminacji.
  2. Modyfikacja grup aminowych białek komórkowych za pomocą monomerowego akrylamidu
    UWAGA: Poniższa procedura jest wykonywana w komorze czystej, aby uniknąć kontaminacji DNazą. Czas: 1,5 h
    1. Dodać 1 mL roztworu do modyfikacji grup aminowych (patrz Tabela 1) do osadu komórkowego i resuspender osad przez delikatne pipetowanie.
    2. Inkubować probówkę w lodzie przez 1 h i wirować zawiesinę komórkową przy 240 × g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
    3. Usunąć nadsącz i resuspender komórki w 100 mL 4% akrylamidu/1 mM EDTA/PBS zawierającego barwnik interkalujący DNA (patrz Tabela 1, 1 cell/µL).

8. Przygotowanie pojedynczych komórek do ponownego użycia

  1. Przygotowanie wielokrotnego użytku pojedynczych komórek (wersja manualna)
    UWAGA: Poniższą procedurę należy przeprowadzać w czystej komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby uniknąć kontaminacji DNazą. Czas: 9 h/96 komórek
    1. Wymieszać 1 mL zawiesiny komórkowej (1 komórka/µL) oraz 199 mL 1 mM EDTA/PBS zawierającego barwnik interkalujący DNA (patrz Tabela 1).
    2. Przenieść 200 µL zawiesiny komórkowej do każdego dołka płaskodنnych płytek 96-dołkowych (łącznie 10 płytek, patrz Tabela Materiałów).
    3. Nałożyć pokrywkę na płytkę 96-dołkową i przeskanować 10 płytek za pomocą mikroskopu skanującego (patrz Tabela Materiałów), aby zidentyfikować dołki zawierające pojedynczą komórkę.
    4. Przenieść zawartość dołka zawierającego pojedynczą komórkę do probówki PCR.
      1. Przechylić płytkę (w stronę operatora) i odczekać kilka minut, aż pojedyncza komórka opadnie na dolną krawędź dołka.
      2. Umieścić końcówkę pipety w dolnym narożniku i przenieść pojedynczą komórkę wraz z buforem (aspirując 210 µL/dołek = 200 µL buforu + 10 µL powietrza) do probówki PCR.
        UWAGA: Należy koniecznie użyć końcówki P200 o niskiej retencji.
      3. Sprawdzić dołek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, aby potwierdzić przeniesienie.
      4. Jeśli w dołku nadal znajduje się pojedyncza komórka, dodać 200 µL/dołek 1 mM EDTA/PBS zawierającego barwnik interkalujący DNA.
      5. Następnie powtórzyć proces przenoszenia.
    5. Wirować probówkę PCR przy 240 × g przez 5 min w 4 °C, używając rotora kątowego (swing rotor) bez hamowania.
      UWAGA: Hamowanie powoduje wirowy przepływ cieczy w probówce, co zaburza osadzanie się pojedynczej komórki. Podczas wirowania rotorem kątowym bez hamowania, pojedyncza komórka zawsze opadnie na dno probówki. Jednak w przypadku użycia rotora stałokątowego, pojedyncza komórka przytwierdza się do ścianki bocznej probówki PCR i może zostać utracona.
    6. Usunąć 195 µL supernatantu, stosując bardzo niską prędkość pipetowania.
    7. Dodać 195 µL/probówkę roztworu akrylamidu/bis-akrylamidu/APS (patrz Tabela 1).
    8. Wirować probówkę PCR przy 240 × g przez 5 min w 4 °C, używając rotora kątowego bez hamowania.
    9. Usunąć 195 µL supernatantu przy bardzo niskiej prędkości pipetowania.
    10. Przenieść dolne 3 µL do probówki PCR zawierającej 4% TEMED/olej mineralny oraz magnetyczny koralik poliakrylamidowy (wygenerowany w kroku 6).
      UWAGA: Należy koniecznie użyć końcówki P10 o niskiej retencji. Wydzielić komórkę w pobliżu magnetycznego koralika poliakrylamidowego. W oleju mineralnym ciecz zawierająca pojedynczą komórkę przylega do powierzchni magnetycznego koralika poliakrylamidowego dzięki napięciu powierzchniowemu.
    11. Inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Proces ten generuje dwuwarstwowy koralik żelu akrylamidowego. Rdzeń stanowi magnetyczny koralik żelowy. Warstwa zewnętrzna to żel poliakrylamidowy zawierający pojedynczą komórkę. Pojedyncza komórka jest zatopiona w zewnętrznej warstwie żelu. Bezpieczny punkt przerwania: Po przemyciu wielokrotnego użytku pojedynczych komórek buforem 50% glicerolu/1 mM EDTA/0,05% Tween 20/0,5% BSA/TBS, można je przechowywać w -20 °C do 6 miesięcy.
  2. Przygotowanie wielokrotnego użytku pojedynczych komórek (wersja półautomatyczna)
    UWAGA: Poniższą procedurę należy przeprowadzać w czystej komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby uniknąć kontaminacji DNazą. Czas: 3 h/96 komórek
    1. Wymieszać 1 mL zawiesiny komórkowej (1 komórka/µL) oraz 199 mL 1 mM EDTA/PBS zawierającego barwnik interkalujący DNA (patrz Tabela 1).
    2. Przenieść 200 µL zawiesiny komórkowej do każdego dołka płytki nanowell 4 nL (patrz Rysunek 3 oraz Tabela Materiałów) i umieścić płytkę nanowell 4 nL w automatycznym robocie do pobierania pojedynczych komórek (patrz Tabela Materiałów).
    3. Umieścić 96-dołkową płytkę PCR jako płytkę docelową w automatycznym robocie do pobierania pojedynczych komórek. Upewnić się, że każdy dołek zawiera 200 µL/dołek roztworu akrylamidu/bis-akrylamidu/APS (patrz Tabela 1).
    4. Przenieść pojedynczą komórkę z nanowell 4 nL do dołka 96-dołkowej płytki PCR (patrz Wideo uzupełniające S1).
    5. Nałożyć pokrywkę na 96-dołkową płytkę PCR i wirować ją przy 240 × g przez 5 min w 4 °C, używając rotora kątowego bez hamowania.
    6. Umieścić 96-dołkową płytkę PCR na platformie automatycznego robota do dozowania cieczy (patrz Tabela Materiałów, Rysunek 4 oraz Kod uzupełniający 1).
    7. Przeciągnąć i upuścić Kod uzupełniający 1 do okna oprogramowania (patrz Tabela Materiałów) robota do dozowania cieczy.
    8. Uruchomić program w automatycznym robocie do dozowania cieczy (patrz Wideo uzupełniające S2 oraz Wideo uzupełniające S3).
      1. Usunąć 195 µL supernatantu przy bardzo niskiej prędkości pipetowania.
      2. Dodać 50 µL 4% TEMED/oleju mineralnego.
        UWAGA: Kroki 8.2.8.1-8.2.8.2 mogą być wykonane poprzez manualne pipetowanie.
    9. Inkubować przez noc w temperaturze pokojowej (Rysunek 5). Bezpieczny punkt przerwania: Po przemyciu wielokrotnego użytku pojedynczych komórek buforem 50% glicerolu/1 mM EDTA/0,05% Tween 20/0,5% BSA/TBS, przechowywać je w -20 °C do 6 miesięcy.

Układ do analizy pojedynczych komórek z nanowellami, modułem pobierania; mikroskopia w eksperymencie z badań komórkowych.
Rysunek 3: Automatyczne pobieranie pojedynczych komórek i ich przenoszenie do płytki PCR z 96 dołkami w kroku 8.2. (A) Przegląd systemu pobierania pojedynczych komórek. Robot do pobierania pojedynczych komórek znajduje się w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby uniknąć kontaminacji. (B) Płytka 24-dołkowa z nanodołkami o objętości 4 nL wewnątrz każdego dołka. (C) Rozkład komórek w dołku płytki 24-dołkowej. Zielone kropki to komórki zidentyfikowane jako pojedyncze komórki w każdym nanodołku 4 nL. Purpurowe kropki to komórki zidentyfikowane jako dublety lub multiplety komórek. (D) Obraz w polu jasnym dołka w płytce 24-dołkowej. Zielony kwadrat oznacza nanodołek 4 nL zawierający pojedynczą komórkę. Purpurowy kwadrat oznacza nanodołek 4 nL zawierający wiele komórek. (E) Powiększony obszar wybranych nanodołków 4 nL. Jasne kropki to pojedyncze komórki w nanodołkach 4 nL. System pobierania pojedynczych komórek identyfikuje nanodołki zawierające pojedynczą komórkę poprzez akwizycję obrazów w polu jasnym oraz obrazów fluorescencyjnych komórek z barwieniem DAPI. Zidentyfikowane pojedyncze komórki są przenoszone z nanodołka 4 nL do dołka płytki PCR z 96 dołkami. Paski skali = 2 mm (C, D), 100 µm (E). Skrót = DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat rozmieszczenia płytek PCR i pipetowania dla analizy komórek, przedstawiający końcówki pipet i formowanie żelu polimerowego.
Rycina 4: Generowanie reużywalnych pojedynczych komórek za pomocą robota do obsługi cieczy. (A) Platforma robota do obsługi cieczy. Platforma posiada 11 gniazd na statywy z końcówkami do pipet (końcówki P300: gniazda 1-3, końcówki P20: gniazda 5-6), głęboką płytkę 96-dołkową 2 mL (gniazdo 4), dwie płytki PCR 96-dołkowe zawierające jedną komórkę w każdym dołku (gniazda 7 i 10) oraz dwie płytki 96-dołkowe z płaskim dnem na odpady ciekłe (gniazda 8 i 11). (B) Platforma po rozmieszczeniu sprzętu laboratoryjnego. (C) Schematyczne przedstawienie robotycznego pipetowania w kroku 8.8.1. Program usuwa naddatek, nie aspirując pojedynczej komórki z dna 96-dołkowej płytki PCR. (D) Reużywalne pojedyncze komórki wygenerowane przy użyciu Supplemental Code 1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

9. Przyłączanie i elongacja losowych starterów

UWAGA: Poniższa procedura jest wykonywana pod czystym dygestorium, aby uniknąć kontaminacji DNazą. Gwiazdki (*) przy następujących krokach wskazują, że do kontrolowania pozycji kulek poliakrylamidowych zawierających pojedynczą komórkę wielokrotnego użytku w probówce można użyć separatora magnetycznego. Użycie separatora magnetycznego nie jest jednak niezbędne. Poprzez powolne przesuwanie końcówki pipety w dół wzdłuż ścianki probówki, kulki są spychane w górę w celu przemycia lub wymiany buforu. Czas: 9 h

  1. Usuń olej mineralny za pomocą pipety(*) i przemyj (*) 5 razy 200 µL buforu 1x TP Mg(-) (rozcieńcz bufor 10x TP Mg(-) do stężenia 1x wodą ultrapure, patrz Tabela 1).
  2. Usuń supernatant (*) i dodaj 15 µL buforu do hybrydyzacji (patrz Tabela 1).
  3. Inkubuj przez 1 h na lodzie.
    UWAGA: Celem tej inkubacji jest permeabilizacja błon plazmatycznych i jądrowych oraz wprowadzenie losowego primera do jądra komórkowego.
  4. Umieść probówki PCR w termocyklerze i podgrzej w temperaturze 94 °C przez 3 min.
    UWAGA: Rozmiar probówki wynosi 0,2 mL. Objętość roztworu wynosi około 20 µL, wliczając objętość kuleczki poliakrylamidowej. Temperatura pokrywy termocyklera wynosi 105 °C.
  5. Przenieś probówki do chłodzonego lodem bloku metalowego i inkubuj przez 2 min.
  6. Dodaj 4 µL mieszaniny MgSO4/NaCl/dNTP (patrz Tabela 1) i wymieszaj za pomocą wstrząsarki typu vortex z umiarkowaną prędkością.
  7. Dodaj 1 µL polimerazy Bst, dużego fragmentu (patrz Tabela Materiałów) i wymieszaj za pomocą wstrząsarki typu vortex z umiarkowaną prędkością.
  8. Inkubuj przez 4 h na wstrząsarce (600 rpm w 4 °C).
    UWAGA: Celem tej inkubacji jest wprowadzenie polimerazy Bst do jądra komórkowego.
  9. Umieść probówkę PCR w termocyklerze i uruchom jeden z następujących programów:
    1. Uruchom program 4-godzinny: 10 °C przez 30 min, 20 °C przez 30 min oraz 25 °C przez 180 min.
    2. Alternatywnie uruchom program nocny: 4 °C przez 4 h, 10 °C przez 2 h, 20 °C przez 2 h, 25 °C przez 4 h, a następnie utrzymaj temperaturę 4 °C.
      UWAGA: Rozmiar probówki wynosi 0,2 mL. Objętość roztworu wynosi około 25 µL, wliczając objętość kuleczki poliakrylamidowej. Temperatura pokrywy termocyklera wynosi 105 °C. Bezpieczny punkt przerwania pracy: Można przerwać eksperyment w tym miejscu na maksymalnie 1 dobę, przechowując pojedyncze komórki wielokrotnego użytku w temperaturze 4 °C.

10. Wiązanie przeciwciał

UWAGA: Poniższą procedurę przeprowadza się pod czystym dygestorium, aby uniknąć kontaminacji DNazą. Czas: 1,5 h

  1. Dodaj 1.625 µL roztworu NaCl/EDTA/BSA (patrz Tabela 1) i wymieszać za pomocą wortexa przy niskiej prędkości.
    UWAGA: Ten etap ma na celu 1) ułatwienie chelatacji Mg2+ przez EDTA, 2) stabilizować wiązanie wydłużonego 1Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. losowych starterów w obecności 300 mM NaCl oraz 3) zablokowanie niespecyficznego wiązania przeciwciał przy użyciu albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w kolejnej reakcji.
  2. Inkubować przez 1 h w lodzie, a następnie dodać 0.1 µg/mL każde z przeciwciał oraz kontrolne IgG sprzężone z sondą przeciwciałową (przygotowaną w kroku 5).
  3. Inkubować przez noc na lodzie, delikatnie wstrząsając na inkubatorze wytrząsającym.

11. Ligacja bliskościowa sondy przeciwciałowej i proksymalnie wydłużonego randomowego primera

UWAGA: Poniższą procedurę należy przeprowadzać pod czystym dygestorium, aby uniknąć kontaminacji DNazą. Gwiazdki (*) w następnych krokach wskazują miejsca, w których można użyć separatora magnetycznego do kontrolowania pozycji kulek poliakrylamidowych zawierających pojedynczą, wielokrotnie używaną komórkę w probówce. Użycie separatora magnetycznego nie jest jednak niezbędne. Powolnym prowadzeniem końcówki pipety wzdłuż ścianki probówki można przesuwać kulki w górę w celu ich przemycia lub wymiany buforu. Czas: 6 h

  1. Przemyć (*) dwukrotnie 200 µL buforu 1x TPM-T (inkubacja 20 min podczas każdego płukania) w lodzie. Bufor 10x TPM-T (Tris-HCl/chlorek potasu/siarczan magnezu/Triton X-100) rozcieńczyć do 1x wodą ultrapure).
  2. Usunąć (*) nadsącz i przemyć (*) raz buforem 1x T4 DNA ligase (patrz Tabela materiałów).
  3. Usunąć (*) nadsącz i dodać 19 µL roztworu Ligation Adapter Solution (patrz Tabela 1).
  4. Inkubować przez 1 h w temperaturze 25 °C.
  5. Dodać 1 µL T4 DNA ligase (patrz Tabela materiałów) i wymieszać zawartość probówki na wstrząsarku vortex z średnią prędkością.
  6. Umieścić probówkę w termocyklerze i uruchomić następujący program: program ligacji zbliżeniowej, 4 h w 16 °C oraz 30 min w 25 °C.
    UWAGA: Rozmiar probówki wynosi 0.2 mL. Objętość roztworu wynosi około 25 µL, wliczając objętość kuleczki poliakrylamidowej. Temperatura pokrywy termocyklera to temperatura pokojowa.
  7. Przemyć (*) dwukrotnie, krótko, 200 µL buforu 1x Bst Mg(-) EDTA(+) (patrz Tabela 1; przygotować bufor 1x z buforu stokowego 10x) i przechowywać komórkę w 4 °C przez noc. Bezpieczny punkt przerwania: Eksperyment można przerwać w tym miejscu na maksymalnie 1 dzień, przechowując komórki pojedyncze w 4 °C.

12. Pełna elongacja pierwszego promotora losowego

UWAGA: Poniższa procedura jest wykonywana pod czystym wyciągiem w celu uniknięcia kontaminacji DNazą. Czas: 4,5 h

  1. Przemyć dwukrotnie 200 µL buforu 1x Bst Mg(-) EDTA(-) (patrz Tabela 1, przygotować bufor 1x z buforu stokowego 10x), usunąć supernatant i dodać 20 µL mieszaniny Bst/dNTPs/MgSO4 (patrz Tabela 1).
  2. Wymieszać za pomocą vortexa z prędkością średnią i inkubować przez 4 h na wstrząsarce orbitalnej (w temperaturze 6 °C i przy 500 rpm).
  3. Umieścić probówkę w termocyklerze i uruchomić następujący program pełnej elongacji: 10 °C przez 1 h, 20 °C przez 1 h, 30 °C przez 1 h, 40 °C przez 1 h, 50 °C przez 1 h, 65 °C przez 1 h, 94 °C przez 10 min oraz utrzymać temperaturę 4 °C.
    UWAGA: Bezpieczny punkt przerwania pracy: Eksperyment można w tym miejscu przerwać na maksymalnie 1 dzień, przechowując pojedyncze komórki przeznaczone do ponownego użycia w temperaturze 4 °C.

13. Wielokrotna amplifikacja przez wypieranie

UWAGA: Poniższa procedura jest wykonywana pod czystym wyciągiem w celu uniknięcia kontaminacji DNazą. Czas: 2,5 h (kroki 13.1-13.2) + 15 min (kroki 13.3-13.4) + 1 dzień (kroki 13.5-13.10)

  1. Dodaj 0.4 µL z 100 µM 2nd losowe primery (patrz Tabela 3) i wymieszać za pomocą mieszadła wierzchołkowego (vortexa) z prędkością średnią.
  2. Inkubować przez 2 h w temperaturze 6 °C i 500 obr./min na wytrząsarce orbitalnej, a następnie umieścić probówkę w termocyklerze i ogrzewać w temperaturze 94 °C przez 3 min.
    UWAGA: Rozmiar probówki wynosi 0,2 ml. Objętość roztworu wynosi około 25.4 µL, w tym objętość kulek poliakrylamidowych. Temperatura pokrywy termocyklera wynosi 105 °C.
  3. Umieść probówki w metalowym bloku chłodzonym lodem i dodaj 1 µL/tube polimerazy DNA Bst.
  4. Wymieszaj na wibratorze przy niskiej prędkości, umieść probówki w termocyklerze i uruchom następujący program:
    4 °C przez 4 h, 10 °C przez 30 min, 20 °C przez 30 min, 30 °C przez 30 min, 40 °C przez 30 min, 50 °C przez 30 min, 65 °C przez 60 min, 94 °C przez 3 min, a następnie utrzymać w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Rozmiar probówki wynosi 0,2 ml. Objętość roztworu wynosi około 26.4 µL, w tym objętość kuleczki poliakrylamidowej. Temperatura pokrywy termocyklera wynosi 105 °C. Bezpieczny punkt przerwania pracyZatrzymaj eksperyment w tym miejscu na okres do 1 doby, przechowując pojedyncze komórki przeznaczone do ponownego użycia w 4 °C.
  5. Zebrać supernatant (około 20 µL), a następnie przenieś do probówki do PCR.
  6. Przechowywać zebrany naddatek w temperaturze -80 °C.
  7. Dodaj 20 µL/tube 0,05% Tween 20 / 0,1x buforu TE do probówki PCR zawierającej wielorazową pojedynczą komórkę (patrz Tabela 1) i inkubować wielokrotnego użytku pojedynczą komórkę w 4 °Cprzez noc. Bezpieczny punkt przerwania proceduryPrzerwij eksperyment w tym miejscu na kilka dni, wydłużając czas inkubacji.
  8. Należy zebrać nadsącz i połączyć go z próbką pobraną w kroku 13.5.
  9. Powtórz kroki 13.7-13.8 jeszcze raz. Namocz wielokrotnego użytku pojedynczą komórkę w buforze TBS z dodatkiem 50% glicerolu, 5 mM EDTA, 0,5% BSA i 0,05% Tween20, a następnie inkubuj przez 30 min na wytrząsarce orbitalnej (4 °C, 600 obr./min). Przechowywać wielokrotnego użytku pojedynczą komórkę w temperaturze -20 °C do czasu przeprowadzenia kolejnego eksperymentu.
  10. Dodaj 40 µL z Exo- mieszanina master mix (patrz Tabela 1) i umieść probówkę w termocyklerze, a następnie uruchom następujący program: i) 95 °C przez 5 min, ii) 95 °C przez 30 s, iii) 60 °C 30 s, iv) 72 °C przez 30 s, v) powtórzyć kroki ii-iv 19 razy, vi) 72 °C przez 5 min, vii) utrzymać w 4 °C.
    UWAGA: Rozmiar probówki wynosi 0,2 ml. Objętość roztworu wynosi około 45 µL, w tym objętość kuleczki poliakrylamidowej. Temperatura pokrywy termocyklera wynosi 105 °C. Bezpieczny punkt przerwania pracyEksperyment można w tym miejscu przerwać na co najmniej kilka dni, przechowując próbkę w temperaturze -80 °C.

14. Oczyszczanie fenolem i chloroformem oraz wytrącanie glikolem polietylenowym

UWAGA: Poniższa procedura jest wykonywana pod czystym dygestorium, aby uniknąć kontaminacji DNazą. Czas: 1,5 h

  1. Przenieś produkt do probówki 0,5 mL o niskim wiązaniu DNA i dodaj 100 µL mieszaniny fenol:chloroform:alkohol izoamylowy.
    UWAGA: Mieszanina fenol:chloroform:alkohol izoamylowy powoduje podrażnienia i może wywołać oparzenia w wyniku kontaktu. Należy używać rękawiczek, gogli ochronnych i fartucha laboratoryjnego. Stosować wyłącznie w odpowiednio wentylowanych pomieszczeniach lub przy użyciu odpowiedniej maski ochronnej. Należy przestrzegać instytucyjnych wytycznych dotyczących bezpieczeństwa. Zużyte naczynia laboratoryjne należy utylizować zgodnie z wytycznymi instytucji.
  2. Wstrząsać ręcznie przez 30 s, a następnie wirować przy 12 000 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
  3. Zebrać fazę wodną (80 µL) do probówki 0,5 mL o niskim wiązaniu DNA i dodać 40,84 µL/probówkę mieszaniny akrylamidu liniowego/MgCl2 (patrz Tabela 1).
  4. Dodać 47,06 µL/probówkę 50% (w/v) PEG8000 (wolnego od RNazy) i wymieszać poprzez pipetowanie.
  5. Inkubować przez 20 min w temperaturze pokojowej, a następnie wirować przy 240 × g przez 10 min w temperaturze pokojowej.
  6. Usunąć nadsącz i dodać 400 µL/probówkę 80% etanolu (EtOH).
  7. Przemyć 80% EtOH, usunąć nadsącz za pomocą aspiratora i wysuszyć osad na powietrzu.
  8. Resuspender osad w 20 µL buforu 1 mM EDTA/10 mM Tris-HCl, pH 7,4 i przechowywać roztwór w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Stężenie DNA należy zmierzyć przy użyciu barwnika interkalacyjnego specyficznego dla dwuniciowego DNA (patrz Tabela materiałów). Bezpieczny punkt przerwania: Na tym etapie eksperyment można bezpiecznie przerwać na co najmniej tydzień.

15. Transkrypcja in vitro

UWAGA: Poniższa procedura jest wykonywana pod czystym dygestorium, aby uniknąć kontaminacji DNazą i RNazą. Czas: 5 h

  1. Odmrozić DNA produktów pochodzących z pojedynczych komórek (z kroku 14) i przygotować mieszaną bibliotekę produktów z pojedynczych komórek, mieszając 2 µL/komórkę produktów DNA (objętość całkowita 20 µL).
  2. Dodać 26 µL master mixu do transkrypcji In vitro (patrz Tabela materiałów oraz protokół producenta) i wymieszać poprzez pipetowanie.
  3. Umieścić probówkę PCR w termocyklerze i inkubować przez 4 h w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Rozmiar probówki to 0,2 mL. Objętość roztworu wynosi 46 µL. Temperatura pokrywy termocyklera to 105 °C.
  4. Dodać 5 µL 10x buforu do DNazy I (patrz Tabela materiałów) oraz dodać 4 µL DNazy I (wolnej od RNaz, 4 U, patrz Tabela materiałów).
  5. Wymieszać i inkubować przez 15 min w temperaturze 37 °C, a następnie przenieść próbkę do probówki 0,5 mL.
  6. Dodać 300 µL/probówkę tiocyjanianu guanidyny-fenolu-chloroformu (patrz Tabela materiałów) i wymieszać poprzez delikatne wstrząsanie w wortexie.
    UWAGA: Tiocyjanian guanidyny-fenol-chloroform może powodować poważne oparzenia chemiczne w wyniku kontaktu. Należy stosować rękawice, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny. Używać wyłącznie w warunkach odpowiedniej wentylacji lub stosować odpowiednią maskę ochronną. Należy przestrzegać instytucjonalnych wytycznych dotyczących bezpieczeństwa. Zużyte naczynia laboratoryjne należy utylizować zgodnie z wytycznymi instytucji.
  7. Inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej (R.T.) na wytrząsarce, a następnie przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do 3 dni.
    UWAGA: Bezpieczny punkt przerwania: Eksperyment można bezpiecznie przerwać w tym miejscu na okres do 3 dni.

16. Oczyszczanie RNA

UWAGA: Poniższą procedurę należy przeprowadzać pod czystym dygestorium, aby uniknąć kontaminacji DNazą i RNazą. Czas: 2 h

  1. Do próbki z kroku 15.7 dodać 80 µL/probówkę chloroformu i energicznie wstrząsnąć probówką ręcznie przez 15 s.
  2. Inkubować przez 2-15 min w temperaturze pokojowej, a następnie wirować próbkę z prędkością 12,000 × g przez 15 min w temperaturze 4 °C.
  3. Zebrać i przenieść fazę wodną próbki (~200 µL) do nowej probówki o pojemności 1.5 mL.
  4. Dodać 600 µL/probówkę mieszaniny tiocyjanianu guanidyny-fenol-chloroform i przenieść próbkę do probówki 1.5 mL.
  5. Dodać 180 µL/probówkę chloroformu i energicznie wstrząsnąć probówką ręcznie przez 15 s.
  6. Wirować próbkę z prędkością 12,000 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
  7. Zebrać i przenieść fazę wodną próbki (~450 µL) do probówki 1.5 mL.
  8. Do fazy wodnej dodać 60 µL/probówkę akryloamidu liniowego (5 µg/µL) oraz 400 µL/probówkę 100% izopropanolu.
  9. Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 10 min, a następnie wirować z prędkością 12,000 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
  10. Ostrożnie usunąć nadsącz.
  11. Przemyć osad RNA 3 razy 200 µL 75% etanolu (EtOH/woda wolna od RNaz), usunąć nadsącz i wysuszyć osad RNA na powietrzu.
    UWAGA: Nie dopuszczać do całkowitego wyschnięcia RNA, ponieważ osad może stracić rozpuszczalność.
  12. Resuspendować osad RNA w 20 µL wody wolnej od RNaz zawierającej inhibitor RNazy (1 µL/20 µL) i rozpuścić osad poprzez pipetowanie.
  13. Zmierzyć absorbancję przy 260 nm.

17. Odwrotna transkrypcja

UWAGA: Poniższą procedurę należy przeprowadzić pod czystym dygestorium, aby uniknąć kontaminacji DNazą. Czas: 1 h

  1. Do każdej probówki dodać 7 µL mieszaniny starterów do odwrotnej transkrypcji i dNTP (patrz Tabela 1 oraz Tabela 3), a następnie umieścić probówki w termocyklerze.
    UWAGA: Rozmiar probówki wynosi 0,2 mL. Objętość roztworu wynosi 27 µL. Temperatura pokrywy termocyklera wynosi 105 °C.
  2. Ogrzewać w temperaturze 65 °C przez 5 min, a następnie umieścić probówki na lodzie na co najmniej 1 min.
  3. Do każdej probówki dodać 14 µL master mixu odwrotnej transkryptazy (patrz Tabela 1) i wymieszać poprzez pipetowanie.
  4. Umieścić probówki w termocyklerze i inkubować w temperaturze 55 °C przez 10 min, a następnie w 80 °C przez 10 min.
    UWAGA: Rozmiar probówki wynosi 0,2 mL. Objętość roztworu wynosi 60 µL. Temperatura pokrywy termocyklera wynosi 105 °C.

18. Synteza drugiej nici

UWAGA: Poniższą procedurę należy przeprowadzić pod czystym wyciągiem, aby uniknąć kontaminacji DNazą. Czas: 2,5 h

  1. Do każdej probówki dodaj 40 µL wody ultrapure i podziel 100 µL roztworu do dwóch probótek PCR o pojemności 0,2 mL (po 50 µL na probówkę).
  2. Do każdej probówki dodaj 60 µL mieszaniny do syntezy drugiej nici (patrz Tabela 1), umieść probówki w termocyklerze i uruchom następujący program: i) 95 °C przez 5 min, ii) 95 °C przez 30 s, iii) 60 °C przez 30 s, iv) 72 °C przez 30 s, v) powtórz kroki ii-iv 20 razy oraz vi) utrzymaj temperaturę 4 °C.
    UWAGA: Rozmiar probówki to 0,2 mL. Objętość roztworu wynosi 110 µL. Temperatura pokrywy termocyklera wynosi 105 °C.
  3. Do każdej probówki dodaj 4,4 µL 0,5 M EDTA (stężenie końcowe 20 mM) i przechowuj w temperaturze -80 °C przez noc.
    UWAGA: Bezpieczny punkt przerwania: Eksperyment można w tym miejscu bezpiecznie przerwać na maksymalnie kilka dni.
  4. Oczyść DNA za pomocą oczyszczania fenolowo-chloroformowego oraz wytrącania glikolem polietylenowym (opisane w kroku 14).
    UWAGA: Bezpieczny punkt przerwania: Eksperyment można w tym miejscu bezpiecznie przerwać na co najmniej jeden tydzień.

19. Trawienie enzymami restrykcyjnymi i selekcja wielkości

UWAGA: Poniższa procedura jest wykonywana pod czystym dygestorium, aby uniknąć kontaminacji DNaza. Czas: 3 h (kroki 19.1-19.7)

  1. Zmierz stężenie oczyszczonego DNA (z kroku 18.4), mierząc absorbancję przy 260 nm.
  2. Przenieś 6 µg DNA do probówki PCR, dodaj 30 µL buforu do trawienia 10x i uzupełnij objętość do 294 µL wodą ultrapure.
  3. Dodaj 6 µL enzymu restrykcyjnego BciVI i inkubuj w 37 °C przez 1 h.
  4. Przeprowadź wytrącanie EtOH z użyciem liniowego poliakryloamidu.
    1. Dodaj 60 µL/probówkę 3 M octanu sodu (pH 5.2), a następnie dodaj 40 µL/probówkę akryloamidu liniowego (5 mg/mL, patrz Tabela materiałów).
    2. Dodaj 400 µL/probówkę EtOH i inkubuj przez noc w -20 °C.
      UWAGA: Bezpieczny punkt przerwania: Eksperyment można bezpiecznie przerwać w tym miejscu na jeden dzień.
    3. Wiruj z prędkością 12,000 × g przez 10 min w 4 °C i usuń nadsącz.
    4. Przemyj osad dwukrotnie 80% EtOH i wysusz osad.
    5. Rozpuść osad w 20 µL buforu 1xTE i dodaj 4 µL/probówkę świeżego buforu do ładowania żelu 6x.
  5. Naniesienie próbki na żel agarozowy 5%/bufor 0.5x TAE i przeprowadź elektroforezę (50 V przez 40 min).
  6. Wytnij i zbierz fragment żelu powyżej 50 bp (patrz Rysunek 6) i wyizoluj DNA za pomocą zestawu do izolacji z żelu.
    UWAGA: Bezpieczny punkt przerwania: Eksperyment można bezpiecznie przerwać w tym miejscu na co najmniej jeden tydzień.
  7. Przygotuj bibliotekę do sekwencjonowania, korzystając z zestawu do przygotowania bibliotek DNA (patrz Tabela materiałów)16,17.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pojedyncze komórki K562 przygotowano zgodnie z protokołem opisanym w kroku 8 (patrz Rycina 5). Pojedyncze komórki osadzono w zewnętrznej warstwie kuleczki poliakrylamidowej. DNA komórkowe zabarwiono i zwizualizowano przy użyciu barwnika interkalującego do barwienia DNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym artykule opisano krok po kroku protokół dla niedawno zgłoszonej analizy multiepigenomicznej pojedynczych komórek przy użyciu pojedynczych komórek wielokrotnego użytku7. W kolejnych akapitach omawiamy punkty krytyczne, podkreślając potencjalne ograniczenia w protokole.

Jednym z krytycznych punktów w całym protokole (z kroków 7.2-13) jest unikanie zanieczyszczenia DNazą. Pojedyncza komórka ma tylko dwie kopie genomowego DNA. Dlatego uszkodzenie genomowego DNA kryty...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Doktorzy Ohnuki i Tosato są współtwórcami patentu zatytułowanego "Metody przygotowania pojedynczej komórki wielokrotnego użytku oraz metody analizy epigenomu, transkryptomu i genomu pojedynczej komórki" (EP3619307 i US20200102604). Wniosek patentowy został złożony częściowo w oparciu o wstępne wyniki związane z technologią opisaną w niniejszym manuskrypcie. Wynalazek lub wynalazki opisane i zastrzeżone w niniejszym zgłoszeniu patentowym zostały dokonane, gdy wynalazcy byli pełnoetatowymi pracownikami rządu Stanów Zjednoczonych. W związku z tym, zgodnie z 45 Kodeksem Przepisów Federalnych, część 7, wszystkie prawa, tytuły i udziały w tym zgłoszeniu patentowym zostały lub powinny być zgodnie z prawem przeniesione na rząd Stanów Zjednoczonych. Rząd Stanów Zjednoczonych przekazuje część otrzymywanych przez siebie tantiem, na rzecz swoich pracowników-wynalazców zgodnie z 15 Kodeksem Stanów Zjednoczonych § 3710c.

Podziękowania

Dziękujemy doktorom Davidowi Sanchezowi-Martinowi i Christopherowi B. Buckowi za komentarze na etapie konceptualizacji projektu. Dziękujemy również Genomics Core, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health za pomoc we wstępnych eksperymentach oraz Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH za porady w zakresie analizy obliczeniowej. Dziękujemy Pani Annie Word za pomoc w optymalizacji polimeraz DNA wykorzystywanych w metodzie. W pracy wykorzystano zasoby obliczeniowe klastra NIHHPC Biowulf (http://hpc.nih.gov). Projekt ten jest wspierany przez Program Stacjonarny Centrum Badań nad Rakiem, National Cancer Institute, National Institutes of Health, NCI Director's Innovation Award (#397172) oraz fundusze federalne z National Cancer Institute w ramach umowy nr. HHSN261200800001E. Dziękujemy doktorom Tomowi Misteli, Carol Thiele, Douglasowi R. Lowe'emu i wszystkim członkom Laboratorium Onkologii Komórkowej za owocne komentarze.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10x Bufor CutSmartNew England BioLabsB600410x Bufor do wytrawiania
200 proof etanolWarner-Graham Company200 proofEthanol
5-hydroksymetylocytozyna (5-hmC) Przeciwciało monoklonalne [HMC/4D9]EpigentekA-1018-100Anti-5hmC
Acridine Orange/Propidium Jodek BejcaLogos BiosystemsF23001Licznik komórek
Roztwór akryloamidu, 40% w H2O, do biologii molekularnejMilliporeSigma01697-500ML40% roztwór akryloamidu
Mikroskop fluorescencyjny typu "wszystko w jednym" BZ-X710Mikroskop skaningowyKeyenceBZ-X710
odśrodkowy Amicon Ultra-0,5MilliporeSigmaUFC510024Kaseta ultrafiltracyjna
Nadsiarczan amonu do biologii molekularnejMilliporeSigmaA3678-100GNadsiarczan amonu w proszku
Bezwodny DMFLaboratoria wektoroweS-4001-005Bezwodny N,N-dimetyloformamid (DMF)
Polimeraza anty-RNA II Powtórzenie CTD YSPTSPS (fosfo S5) przeciwciało [4H8]Abcamab5408Przeciwciało anty-Pol II
Anti-TRAP220/MED1 (fosfo T1457)Abcamab60950Anti-Med1
BciVINew England BioLabsR0596LBciVI
Roztwór albuminy surowicy bydlęcej, 20 mg / ml w H2O, niskie obciążenie biologiczne, bez proteazy, do biologii molekularnejMilliporeSigmaB8667-5ML20% BSA (Tabela 7)
Polimeraza DNA Bst, duży fragmentNew England BioLabsM0275LBst Polimeraza DNA
BT10 Seria 10 i mikro; l Końcówka barierowaKońcówka NEPTUNEBT10P10 o niskiej retencji
CellCelectorAutomated Lab SolutionsN/AZautomatyzowany robot do pobierania pojedynczych komórek
CellCelector 4 nl nanowell płytki do klonowania pojedynczych komórek, Płytka S200-100 100K, 24 dołki, ULAAutomated Lab SolutionsCC0079nL płytka nanowell
ChloroformMilliporeSigmaChloroform
Corning Costar 96-Well, Poddana hodowli komórkowej, płaska płytka mikropłytkowaCorning3596Płaskie 96-dołkowe płytki
Deep Vent (egzo-) Polimeraza DNANew England BioLabsM0259LExo- Probówki
LoBind, 0,5 mlEppendorf301080350,5 ml rurki o niskim poziomie wiązania DNA
Oligo, 1. losowy starterZintegrowane technologie DNA N/ A, patrz Tabela 31. losowy starter
DNA Oligo, 2. losowy starter Komórka#01Zintegrowane technologie DNANie dotyczy, patrz Tabela 3.
starter DNA Oligo, 2. losowy starter Komórka#02Zintegrowane technologie DNA Niedotyczy, patrz Tabela 32. losowy starter
DNA Oligo, 2. losowy starter Komórka#03Zintegrowane technologie DNANie dotyczy, patrz Tabela 32. losowy starter
Oligo DNA, 2. losowy starter Komórka#04Zintegrowane technologie DNANie dotyczy, patrz Tabela 32. losowy starter
DNA Oligo, 2. losowy starter Komórka#05Zintegrowane technologie DNANie dotyczy, patrz Tabela 32. losowy starter
DNA Oligo, 2. losowy starter Komórka#06Zintegrowane technologie DNANie dotyczy, patrz Tabela 3Drugi losowy starter
DNA Oligo, Drugi losowy starter Komórka#07Zintegrowane technologie DNANie dotyczy, patrz Tabela 32.
DNA Oligo, 2. losowy starter Komórka#08Zintegrowane technologie DNANie dotyczy, patrz Tabela 32.
DNA Oligo, 2. losowy starter Komórka#09Zintegrowane technologie DNANie dotyczy, patrz Tabela 32. losowy starter
DNA Oligo, 2. losowy starter Komórka#10Zintegrowane technologieDNANie dotyczy, patrz Tabela 32. losowy starter
DNA Oligo, 2. losowy starter Komórka#11Zintegrowane technologie DNANie dotyczy, patrz Tabela 32. losowy starter
DNA Oligo, 2. losowy starter Komórka#12Zintegrowane technologie DNA Niedotyczy, patrz Tabela 32. losowy starter
DNA Oligo, 2. starter syntezyZintegrowane technologie DNA Niedotyczy, patrz Tabela 3Drugi starter
syntezyDNA Oligo, Adaptor do ligacjiZintegrowane technologie DNA Nie, patrz Tabela 3Adaptor do ligacji
DNA Oligo, starter do odwrotnej transkrypcjiZintegrowane technologie DNA Nie, patrz Tabela 3Starter odwrotnej transkrypcji
DNaza I (bez RNazy)New England BioLabsM0303LDNaza I (bez RNazy, 4 U).
Bufor reakcyjny DNazy INew England BioLabsB0303S10x bufor DNazy I (NEB)
Mieszanka dNTP (10 mM każdy)Thermo FisherR019210 mM dNTPs
Surowica bydlęca płodu, pochodzenie z USA, inaktywowana termicznieMilliporeSigmaF4135-500MLPłodowa surowica bydlęca
HiScribe T7 Zestaw do syntezy RNA o wysokiej wydajnościEngland BioLabsE2040SMistrzowska mieszanka transkrypcji in vitro
Przeciwciało Histone H3K27acMotyw aktywny39133Anty-H3K27ac
Przeciwciało Histone H3K27me3Motyw aktywny39155Anty-H3K27me3
IgG z surowicy królikaMillipore SigmaI5006-10MGControl IgG
Nanoproszek magnetyczny tlenku żelaza(II,III), średnia wielkość części 30 nm (TEM), funkcjonalizowany estrem NHSMilliporeSigma747467-1GNHS funkcjonalizowany estrem 30 nm proszek tlenku żelaza
K-562Kolekcja kultur typu amerykańskiego (ATCC)KomórkiCCL-243
Liniowy akryloamid (5 mg / ml)Thermo FisherAM9520Liniowy akryloamid
LUNA-FL Licznik komórek z podwójną fluorescencjąLogo BiosystemsL20001Licznik komórek
LUNA Szkiełka do liczenia komórek, 50 slajdówLogo BiosystemsL12001Licznik komórek
Olej mineralny, Bioodczynnik, do biologii molekularnej, olej lekkiMilliporeSigmaM5904-500MLOlej mineralny
N,N,N′,N′-Tetrametyloetylenodiamina do biologii molekularnejMilliporeSigmaT7024-100MLN,N,N′,N′-Tetramethyloethelenodiamine
NaCl (5 M), bez RNazThermo FisherAM9760G5M NaCl
NanoDrop LiteThermo Fisher2516  Spektrofotometr mikroobjętościowy
NEST 2 ml 96-dołkowa płytka głębinowa, V BottomOpentronsN/AmL głęboka płytka 96-dołkowa
osłonki 96-dołkowa płytka PCRGenesee Scientific27-40596-dołkowa płytka do PCR
NuSive GTG AgarozaLonza50081Agaroza
OmniPur Akrylamid: Bis-akrylamid 19:1, 40% roztwórMiliporeSigma1300-500ML40% Akrylamid/Bis-akryloamid
Robot laboratoryjny OT-2OpentronsOT2Zautomatyzowany robot do obsługi cieczy
Paraformaldehyd, klasa EM, oczyszczona, 20% roztwór wodnyMikroskopia elektronowa Sciences1571320% aldehyd pararmały
PBS (10x), pH 7,4Thermo Fisher7001104410x PBS
Pipeta PIPETMAN Classic P1000GILSONF123602A P1000
Probówki białkowe LoBind, 1,5 mlEppendorf9250000901,5 ml rurka o niskim poziomie wiązania białka
Zestaw do ekstrakcji żelu QIAgen Pipeta Qiagen28706A P1000
Quant-iT PicoGreen dsDNATest Thermo FisherP11495  Specyficzny dla DNA barwnik interkalatorowy
Zestaw do szybkiego ligowaniaNew England BioLabsM2200LT4 Ligaza DNA (NEB)
RNaseOUT Rekombinowany inhibitor rybonukleazyThermo Fisher10777019Inhibitor RNAzy
S-4FB Środek sieciujący (rozpuszczalny w DMF)Laboratoria wektoroweS-1004-105Succinimidylo4-formylobenzoesan (S-4FB)
S-HyNicLaboratoriawektoroweS-1002-1056-hydrazynonikotynian sukcynimidylu hydrazon acetonu (S-HyNic)
Octan sodu, 3 M, pH 5,2, klasa biologii molekularnejMilliporeSigma567422-100ML3M Octan sodu (pH 5,2)
Wodorowęglan sodu, roztwór buforowy 1M, pH 8,5Alfa AesarJ604081M bufor wodorowęglanu sodu, pH 8,5
Fosforan sodu dwuzasadowy do biologii molekularnejMilliporeSigmaS3264-250GNa2HPO4
Fosforan sodu monozasadowy dla biologii molekularnejMilliporeSigmaS3139-250GNaH2PO4
SuperScript IV Odwrotna transkryptazaThermo Fisher18090050Odwrotna transkryptaza
SYBR Gold Barwnik żelowy z kwasem nukleinowym (10 000x Koncentrat w DMSO)Thermo FisherS11494Barwnik interkalatorowy dla DNA
T4 Bufor reakcyjny ligazy DNANew England BioLabsB0202S10x T4 Bufor reakcyjny ligazy DNA
Pakiet reakcyjnych ThermoPol NewEngland BioLabsB9004S10x bufor TPM-T (Tris-HCl/chlorek potasu/siarczan magnezu/Triton X-100)
Odczynnik TRIzol LSThermo Fisher10296-028Ekstrakcja tiocyjanianianem guanidyny, fenolem i chloroformem
Zestaw do przygotowania biblioteki TruSeq Nano DNAIllumina20015965Zestaw do przygotowania biblioteki DNA (patrz również instrukcja producenta)
Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005Integrated DNA TechnologiesN/A, patrz Tabela 3Sonda DNA modyfikowana aminami pod kątem przeciwciała
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002Integrated DNA TechnologiesN/A, patrz Tabela 3Sonda DNA modyfikowana aminami na przeciwciało
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003Integrated DNA TechnologiesN/A, patrz Tabela 3Sonda DNA modyfikowana aminami dla przeciwciała
Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004Integrated DNA TechnologiesN/A, patrz Tabela 3Sonda DNA modyfikowana aminą dla przeciwciała
Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006Integrated DNA TechnologiesN/A, patrz Tabela 3Sonda DNA modyfikowana aminą dla przeciwciał
Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001Zintegrowane technologie DNANie dotyczy, patrz Tabela 3Sonda DNA modyfikowana aminami do kontroli IgG
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher155750200,5 M EDTA, pH 8,0
UltraPure Woda destylowana bez DNazy/RNazThermo Fisher10977023Ultraczysta woda
Kolumny odsalające Zeba Splin, 7K MWCO, 0,5 mlThermo Fisher89882Kolumna odsalająca
Filtr 4 DNA Eppendorf 2 losowy losowy starter losowy starter dotyczy dotyczy New 2 bez

Bibliografia

  1. Perkel, J. M. Single-cell analysis enters the multiomics age. Nature. 595 (7868), 614-616 (2021).
  2. Clark, S. J., et al. scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells. Nature Communications. 9 (1), 781(2018).
  3. Ma, S., et al. Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and Chromatin. Cell. 183 (4), 1103-1116 (2020).
  4. Zhu, C., et al. An ultra high-throughput method for single-cell joint analysis of open chromatin and transcriptome. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 1063-1070 (2019).
  5. Zhu, C., et al. Joint profiling of histone modifications and transcriptome in single cells from mouse brain. Nature Methods. 18 (3), 283-292 (2021).
  6. Mimitou, E. P., et al. Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells. Nature Biotechnology. 39 (10), 1246-1258 (2021).
  7. Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Iterative epigenomic analyses in the same single cell. Genome Research. 31 (10), 1819-1830 (2021).
  8. Tosato, G., Ohnuki, H. Methods of preparing a re-usable single cell and methods fro analyzing the epigenome, transcriptome, and genome of a single cell. , EP 3619307, US 202001026704 (2021).
  9. Harada, A., et al. A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input. Nature Cell Biology. 21 (2), 287-296 (2019).
  10. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).
  11. Marina, R. J., et al. TET-catalyzed oxidation of intragenic 5-methylcytosine regulates CTCF-dependent alternative splicing. EMBO Journal. 35 (3), 335-355 (2016).
  12. Weast, R. C., et al. Handbook of chemistry and physics: a ready-reference book of chemical and physical data. 56th edn. Weast, R. C., Astle, M. J., Beyer, W. H. , Chemical Rubber Company Press. (1975).
  13. Aydin, S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides. 72, 4-15 (2015).
  14. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133 (9), 12(2013).
  15. Porstmann, T., Kiessig, S. T. Enzyme immunoassay techniques. An overview. Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).
  16. Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).
  17. Song, Y., et al. A comparative analysis of library prep approaches for sequencing low input translatome samples. BMC Genomics. 19 (1), 696(2018).
  18. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  19. Ku, W. L., et al. Single-cell chromatin immunocleavage sequencing (scChIC-seq) to profile histone modification. Nature Methods. 16 (4), 323-325 (2019).
  20. Carter, B., et al. Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq). Nature Communications. 10 (1), 3747(2019).
  21. Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Iteracyjna analiza epigenomicznaepigenom pojedynczej komórkiligacja bliskościzatapianie w poliakryloamidzieprzeciwciało z sondą DNAmodyfikacje histonówwielokrotna amplifikacja z wypieraniemelektroforeza kapilarnaanaliza multiomiczna
Pojedyncza komórka wielokrotnego użytku do iteracyjnych analiz epigenomicznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.