Method Article

Pojedyncza komórka wielokrotnego użytku do iteracyjnych analiz epigenomicznych

DOI:

10.3791/63456

⸱

February 11th, 2022

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cellular Oncology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Biostatistics and Data Management Section, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 3CCR Collaborative Bioinformatics Resource (CCBR), Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 4Advanced Biomedical Computational Science, Frederick National Laboratory for Cancer Research sponsored by the National Cancer Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje metodę pojedynczej komórki do iteracyjnych analiz epigenomicznych przy użyciu pojedynczej komórki wielokrotnego użytku. Pojedyncza komórka wielokrotnego użytku umożliwia analizę wielu znaczników epigenetycznych w tej samej pojedynczej komórce i statystyczną walidację wyników.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecne analizy epigenomu pojedynczych komórek są przeznaczone do jednorazowego użytku. Komórka jest wyrzucana po jednorazowym użyciu, co zapobiega analizie wielu znaczników epigenetycznych w jednej komórce i wymaga danych z innych komórek w celu odróżnienia sygnału od eksperymentalnego szumu tła w pojedynczej komórce. W artykule opisano metodę ponownego wykorzystania tej samej pojedynczej komórki do iteracyjnych analiz epigenomicznych.

W tej eksperymentalnej metodzie, białka komórkowe są najpierw zakotwiczone w polimerze poliakrylamidowym, zamiast sieciować je z białkiem i DNA, co łagodzi strukturalne uprzedzenia. Ten krytyczny krok pozwala na wielokrotne eksperymenty z tą samą pojedynczą komórką. Następnie losowy starter z sekwencją rusztowania do ligacji zbliżeniowej jest wyżarzany do genomowego DNA, a sekwencja genomowa jest dodawana do startera przez rozszerzenie za pomocą polimerazy DNA. Następnie przeciwciało przeciwko markerowi epigenetycznemu i kontrolnej IgG, z których każda jest znakowana różnymi sondami DNA, są wiązane z odpowiednimi celami w tej samej pojedynczej komórce.

Ligacja zbliżeniowa jest indukowana między losowym starterem a przeciwciałem poprzez dodanie konektora DNA z komplementarnymi sekwencjami do sekwencji rusztowania losowego startera i sondy przeciwciało-DNA. Podejście to integruje informacje o przeciwciałach i sekwencje pobliskiego genomu w pojedynczym produkcie DNA ligacji zbliżeniowej. Umożliwiając wielokrotne eksperymenty na tej samej pojedynczej komórce, metoda ta pozwala na zwiększenie gęstości danych z rzadkiej komórki i analizę statystyczną przy użyciu tylko danych IgG i przeciwciał z tej samej komórki. Pojedyncze komórki wielokrotnego użytku przygotowane tą metodą mogą być przechowywane przez co najmniej kilka miesięcy i ponownie wykorzystane później w celu poszerzenia charakterystyki epigenetycznej i zwiększenia gęstości danych. Metoda ta zapewnia elastyczność naukowcom i ich projektom.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologia jednokomórkowa wkracza w erę multiomiki jednokomórkowej, która integruje indywidualne technologie porozumień jednokomórkowych1. Ostatnio transkryptomika pojedynczych komórek została połączona z metodami wykrywania dostępności chromatyny (scNMT-seq2 i SHARE-seq3) lub modyfikacji histonów (Paired-seq4 i Paired-Tag5). Niedawno transkryptomika i proteomika pojedynczych komórek została zintegrowana z dostępnością chromatyny (DOGMA-seq6). Metody te wykorzystują tagowanie oparte na transpozazie do wykrywania dostępności chromatyny lub modyfikacji histonów.

Podejścia oparte na transpozazie dzielą genomowe DNA i dodają kod kreskowy DNA na końcu fragmentu genomowego DNA. Każdy rozszczepiony fragment genomu może przyjąć tylko do dwóch kodów kreskowych DNA (= jeden znak epigenetyczny na miejsce rozszczepienia), a genomowe DNA w miejscu rozszczepienia zostaje utracone. W związku z tym podejścia oparte na rozszczepieniu wiążą się z kompromisem między liczbą badanych znaczników epigenetycznych a gęstością sygnału. Utrudnia to analizę wielu znaczników epigenetycznych w tej samej pojedynczej komórce. Aby przezwyciężyć ten problem, opracowano metodę epigenomiczną pojedynczej komórki, która nie rozszczepia genomowego DNA7,8.

Oprócz wspomnianego wyżej problemu związanego z rozszczepieniem, podejścia oparte na transpozazie mają inne ograniczenia. W analizie epigenomu pojedynczej komórki kluczowe znaczenie ma znajomość lokalizacji histonów i białek związanych z DNA w genomie. W obecnych podejściach osiąga się to poprzez wykorzystanie nieutrwalonych pojedynczych komórek i zachowanie interakcji białko-DNA i białko-białko. Powoduje to jednak silne odchylenie w kierunku dostępnych regionów chromatyny, nawet w analizie modyfikacji histonów 9. Lokalizacja histonów i białek związanych z genomem w genomie może być zachowana bez sieciowania białko-DNA i białko-białko, przy użyciu rusztowania poliakrylamidowego7,8. Takie podejście zmniejsza odchylenie strukturalne obserwowane w obecnych podejściach, które zależą od interakcji białko-DNA i białko-białko.

Podejścia oparte na transpozach mogą odbierać sygnały tylko raz z pojedynczej komórki. W związku z tym trudno jest wyznaczyć pełny epigenom pojedynczej komórki ze względu na spadek sygnałów. Pojedyncze komórki wielokrotnego użytku zostały opracowane w celu przezwyciężenia obecnych ograniczeń poprzez umożliwienie iteracyjnej analizy epigenomicznej w tej samej pojedynczej komórce.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Schematyczne przedstawienie metody jest pokazane w Rysunek 1.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie przepływu pracy protokołu. Kroki 7.2-13 są wyjaśnione za pomocą schematycznych przedstawień. Każdy wiersz wskazuje krok w protokole. Białko komórkowe zabarwione na zielono to ludzki nukleosom generowany na podstawie struktury krystalicznej (PDB: 6M4G). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Równowaga kolumn odsalających

UWAGA: Kolumny wirujące do odsalania są równoważone zgodnie z opisem w poniższych krokach. Zrównoważone kolumny odsalające są używane w krokach 2.1, 3.4 i 4.6.

  1. Zdejmij dolne zamknięcie kolumny odsalającej (odcięcie 7 kDa, objętość kulki żywicy 0.5 ml, patrz tabela materiałów) i poluzuj nakrętkę u góry kolumny odsalającej.
  2. Umieścić kolumnę w probówce o niskiej ilości wiązania białka o pojemności 1,5 ml (probówka zbiorcza, patrz tabela materiałów) i odwirować przy 1,500 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, aby usunąć roztwór do przechowywania w kolumnie.
    UWAGA: Użyj wirówki z wirnikiem wahadłowym, aby spłaszczyć górną część łoża koralików.
  3. Usunąć przepływ z probówki o pojemności 1,5 ml i dodać 300 μl 150 mM buforu fosforanowego NaCl/100 mM o pH 8,0 (patrz Tabela 1) na wierzch złoża żywicy.
  4. Odwirować przy 1 500 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i usunąć przepływ z probówki zbiorczej.
  5. Powtórz kroki 1.3-1.4 jeszcze trzy razy.
  6. Wyrzuć bufor z probówki zbiorczej i umieść kolumnę w nowej probówce zbiorczej.
  7. Użyj zrównoważonej kolumny odsalającej w krokach 2.1, 3.4 i 4.4.

2. Wymiana buforowa przeciwciał

UWAGA: Usuń glicerol, argininę i azydek sodu z anty-H3K27ac10, anti-H3K27me310, anti-Med111, oraz anti-Pol II10 (patrz skład bufora pokazany w Tabeli 1). Wszystkie poniższe procedury są wykonywane pod czystym kapturem, aby uniknąć zanieczyszczenia DNazą. Czas: 1 h

  1. Nałożyć roztwór przeciwciała (100 μl, patrz tabela 2) na zrównoważoną kolumnę odsalającą przygotowaną zgodnie z krokiem 1.
  2. Odwirować przy 1 500 × g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C i przenieść przepływ z probówki zbiorczej do probówki o niskiej zawartości białka o pojemności 1,5 ml.
  3. Zmierz stężenie IgG za pomocą absorbancji przy 280 nm12 (użyj spektrofotometru mikroobjętościowego).
  4. Przenieść roztwór przeciwciała do kasety ultrafiltracyjnej (punkt odcięcia masy cząsteczkowej 100 kDa, 0,5 ml, patrz tabela materiałów) i odwirować przy 12 000 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Zmierzyć stężenie IgG, stosując absorbancję przy 280 nm.
  6. Powtarzaj kroki 2,4-2,5, aż stężenie IgG osiągnie 1 mg/ml.

3. Aktywacja przeciwciał

UWAGA: Poniższa procedura jest wykonywana pod czystym kapturem, aby uniknąć zanieczyszczenia DNazą. Czas: 2,5 h

  1. Rozpuścić 1 mg sukcynimidydu 6-hydrazynonikotynianu, hydrazonu acetonu (S-HyNic, patrz tabela materiałów) w 100 μl bezwodnego N,N-dimetyloformamidu (DMF, patrz tabela materiałów).
    UWAGA: DMF jest łatwopalnym rozpuszczalnikiem organicznym i silną toksyną wątrobową wchłanianą przez skórę. Nosić rękawice, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny. Postępuj zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa. Wyrzuć zużyty sprzęt laboratoryjny zgodnie z wytycznymi instytucji.
  2. Dodać 0,6 μl S-HyNic/DMF do 100 μl roztworu przeciwciała (1 mg/ml w 150 mM NaCl/100 mM fosforanu sodu, pH 8,0. Patrz Tabela 2 dla zastosowanych przeciwciał i kontrolnych IgG.
  3. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny (chroniąc przed światłem).
  4. Nałożyć 100 μl przeciwciała reagującego na S-HyNic, aby umieścić je w górnej części zrównoważonej kolumny odsalającej (patrz etap 1) i odwirować przy 1 500 × g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C w celu pobrania próbki.
  5. Po użyciu wyrzuć kolumnę odsalającą.
    UWAGA: Stabilność grup HyNic na białkach i innych biomolekułach jest różna. Zaleca się natychmiastową koniugację biomolekuł modyfikowanych HyNic.

4. Aktywacja sondy DNA

UWAGA: Poniższa procedura jest wykonywana pod czystym kapturem, aby uniknąć zanieczyszczenia DNazą. Czas: 2,5 h

  1. Rozpuścić osad zmodyfikowanej aminą sondy DNA na przeciwciało lub kontrolną IgG (sonda przeciwciał, tabela 3) w 20 μl 150 mM NaCl/100 mM buforu fosforanu sodu o pH 8,0,
    UWAGA: Poszukaj cienkiej, przezroczystej granulki/folii na dnie tuby. Nałożyć bufor bezpośrednio na osad. Jeśli granulka nie jest widoczna, mogła się odczepić i przykleić do ściany lub pokrywy. W takim przypadku odwiruj probówkę i poszukaj osadu na dnie probówki.
  2. Rozpuścić 1 mg 4-formylobenzoesanu sukcynimidylu (S-4FB, patrz tabela materiałów) w 50 μl bezwodnego DMF i dodać 10 μl DMF do rozpuszczonej sondy przeciwciała.
  3. Dodać 4 μl S-4FB/DMF przygotowanego w kroku 4.2, wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny (chroniąc przed światłem).
  4. Nałóż 34 μl sondy przeciwciał reagujących na S-4FB na wierzch zrównoważonej kolumny odsalającej (patrz krok 1).
  5. Nałożyć 15 μl 150 mM NaCl/100 mM buforu fosforanu sodu o pH 8,0 na wierzch złoża żelowego po całkowitym wchłonięciu próbki i odwirować przy 1 500 × g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C w celu zebrania sondy przeciwciał zmodyfikowanej S-4FB.
  6. Wykorzystać przepływ do późniejszej koniugacji, zmierzyć absorbancję przy 260 nm i obliczyć szybkość odzysku sondy przeciwciała.

5. Koniugacja przeciwciała modyfikowanego S-HyNicem i sondy przeciwciała modyfikowanego S-4FB

UWAGA: Poniższa procedura jest wykonywana pod czystym kapturem, aby uniknąć zanieczyszczenia DNazą. Czas: 2 h

  1. Wymieszaj przeciwciało modyfikowane S-HyNic i sondę przeciwciała zmodyfikowaną S-4FB, a następnie pipetuj roztwór w górę iw dół, aby wymieszać.
  2. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (chroniąc przed światłem).
  3. Aby wygasić reakcję, dodać 478,8 μl roztworu do hartowania i przechowywania (patrz Tabela 1).
  4. Przenieść roztwór przeciwciała sprzężony z sondą przeciwciała do kasety ultrafiltracyjnej (odcięcie masy cząsteczkowej 100 kDa).
  5. Wirować przez 5 minut w temperaturze 12 000 × g, 4 °C.
  6. Sprawdzić objętość roztworu wewnątrz kasety za pomocą pipetowania.
  7. Powtarzać kroki 5,5-5,6, aż objętość osiągnie 100 μl i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Stężenie IgG jest mierzone za pomocą testu ELISA13,14,15 przy użyciu wzorca IgG.

6. Przygotowanie rdzenia magnetycznego

UWAGA: W tej metodzie, pojedyncza komórka jest osadzona w dwuwarstwowym koraliku akrylowym (zobacz Rysunek 2). Rdzeń to magnetyczny koralik poliakrylamidowy. Warstwa zewnętrzna to sam poliakrylamid. Rdzenie magnetyczne są generowane w tej sekcji. Ta sekcja nie jest niezbędna w eksperymencie. Czas: 3 h

figure-protocol-2
Rysunek 2: Struktura dwuwarstwowego koralika poliakrylamidowego zapewniająca przejrzystość i łatwą obsługę w eksperymentach REpi-seq. (A) Nanocząstki magnetyczne z kroku 6.6 po odwirowaniu. Nanocząstki magnetyczne są modyfikowane monomerycznym akrylamidem i integrowane z kulką magnetyczną poliakrylamidu pokazaną w B. (B) Schematyczne przedstawienie pojedynczej komórki wielokrotnego użytku z poliakrylamidowym koralikiem magnetycznym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Zmieszać 50 μl 1 M buforu wodorowęglanu sodu o pH 8,5 i 450 μl 40% roztworu akrylamidu.
    UWAGA: Akrylamid jest neurotoksyną. Nosić rękawice, osłonę oczu i fartuch laboratoryjny. Postępuj zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa. Wyrzuć zużyty sprzęt laboratoryjny zgodnie z wytycznymi instytucji.
  2. Zawiesić 1 g funkcjonalizowanego estrem NHS 30 nm proszku tlenku żelaza (patrz tabela materiałów) w buforze akrylamid/wodorowęglan sodu i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
    UWAGA: Ponieważ kulki akrylowe są przezroczyste, może być trudno zobaczyć i manipulować położeniem kulek. Włączenie koralika rdzenia wykonanego z tlenku żelaza poprawia widoczność i ułatwia manipulację, ponieważ położenie koralików można kontrolować za pomocą magnesu. Jeśli jednak użytkownicy są zaznajomieni z eksperymentami REpi-seq, można pominąć stosowanie rdzeniowych magnetycznych kulek poliakrylamidowych.
  3. Przenieść zawiesinę nanokulek do 2 probówek (1,5 ml), odwirować przy 21 300 × g przez 1 godzinę (użyć rotora ustawionego pod kątem) w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
  4. Zawiesić zawiesinę dolną za pomocą 1 ml 40% akryloamidu/bis-akrylamidu (19:1, patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Bis-akrylamid jest neurotoksyną. Nosić rękawice i fartuch laboratoryjny. Postępuj zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa. Wyrzuć zużyty sprzęt laboratoryjny zgodnie z wytycznymi instytucji.
  5. Wirować przy ciśnieniu 21 300 × g przez 1 godzinę (użyć wirnika ustawionego pod kątem) w temperaturze 4 °C.
  6. Wirować przy 5 000 × g przez 30 minut (użyć wirnika obrotowego bez hamulca) w temperaturze 4 °C.
  7. Usunąć supernatant za pomocą pipety P1000 z wolnoobrotowym zasysaniem.
  8. Dostosuj objętość do 400 μl 40% akrylamidu/bis-akrylamidu (19:1, patrz tabela materiałów).
  9. Dodać 25 μl 10% roztworu nadsiarczanu amonu (patrz Tabela 1).
    UWAGA: Nadsiarczan amonu jest silnym utleniaczem. Unoszący się w powietrzu pył zawierający nadsiarczan amonu może podrażniać oczy, nos, gardło, płuca i skórę w kontakcie. Nosić rękawice, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny. Postępuj zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa. Wyrzuć zużyty sprzęt laboratoryjny zgodnie z wytycznymi instytucji.
  10. Aby wytworzyć rdzeniowe magnetyczne kulki poliakrylamidowe, przenieś 0,5 μl zawiesiny tlenku żelaza modyfikowanej akrylamidem do probówki PCR.
  11. Dodać 50 μl 4% N,N,N',N'--tetrametyloetylenodiaminy/oleju mineralnego (TEMED, patrz Tabela 1) i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: TEMED jest rozpuszczalnikiem łatwopalnym. Praca pod maską. Nie wdychać. Przechowywać z dala od otwartego ognia, gorących powierzchni i źródeł zapłonu. Nosić rękawice, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny. Postępuj zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa. Wyrzuć zużyty sprzęt laboratoryjny zgodnie z wytycznymi instytucji.

7. Modyfikacja grupy aminowej białek komórkowych za pomocą monomeru akrylamidu

UWAGA: REpi-seq został zaprojektowany do analizy epigenomu komórek mysich i ludzkich na poziomie pojedynczej komórki. Każdy krok musi być zoptymalizowany podczas stosowania tej metody na komórkach gatunków innych niż mysz lub człowiek.

  1. Pobieranie komórek
    UWAGA: Czas: 30 min
    1. Zmierzyć stężenie komórek i żywotność za pomocą licznika komórek (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Żywotność komórek na tym etapie wpływa na to, ile komórek jest żywymi komórkami w analizie danych.
    2. Dostosuj stężenie komórek do 1 × 105 komórek/ml za pomocą pożywki hodowlanej (*) zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej.
      UWAGA: *Pożywka hodowlana jest optymalnym podłożem hodowlanym dla komórek będących przedmiotem zainteresowania.
    3. Przenieść 1 ml zawiesiny komórek do probówki o pojemności 1,5 ml.
    4. Odwirować zawiesinę komórek o masie 240 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
    5. Dodać 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), wymieszać komórki przez delikatne pipetowanie i odwirować zawiesinę komórek w temperaturze 240 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    6. Usuń supernatant.
      UWAGA: Wszystkie powyższe czynności należy wykonywać w czystym okapie z przepływem laminarnym, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
  2. Modyfikacja grupy aminowej białek komórkowych za pomocą monomerycznego akrylamidu
    UWAGA: Poniższa procedura jest wykonywana pod czystym kapturem, aby uniknąć zanieczyszczenia DNazą. Czas: 1,5 h
    1. Dodać 1 ml roztworu modyfikującego grupy aminowe (patrz Tabela 1) do osadu komórkowego i zawiesić go przez delikatne pipetowanie.
    2. Inkubować probówkę na lodzie przez 1 godzinę i odwirowywać zawiesinę komórkową o masie 240 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki 100 ml 4% akrylamidu/1 mM EDTA/PBS zawierającego barwnik interkalatorowy dla DNA (patrz Tabela 1, 1 komórka/μl).

8. Przygotowanie pojedynczych komórek wielokrotnego użytku

  1. Przygotowanie pojedynczych komórek wielokrotnego użytku (wersja manualna)
    UWAGA: Poniższa procedura jest wykonywana pod czystym kapturem, aby uniknąć zanieczyszczenia DNazą. Czas: 9 h/96 komórek
    1. Zmieszać 1 ml zawiesiny komórkowej (1 komórka/μl) i 199 ml 1 mM EDTA/PBS zawierającego barwnik interkalatorowy dla DNA (patrz Tabela 1).
    2. Przenieść 200 μl zawiesiny komórek do każdej studzienki z 96-dołkowymi płytkami płaskodennymi (łącznie 10 płytek, patrz Tabela Materiałów).
    3. Umieść pokrywę na płytce 96-dołkowej i zeskanuj 10 płytek za pomocą mikroskopu skanującego (patrz Tabela materiałów), aby zidentyfikować studzienki zawierające pojedynczą komórkę.
    4. Przenieść zawartość studzienki zawierającej pojedynczą komórkę do probówki do PCR.
      1. Przechyl płytkę (w kierunku operatora) i odczekaj kilka minut, aż pojedyncza komórka opadnie na dolną krawędź studni.
      2. Umieść końcówkę pipety w dolnym rogu i przenieś pojedynczą komórkę i bufor (zassać 210 μL/studzienkę = 200 μL buforu + 10 μL powietrza) do probówki PCR.
        UWAGA: Pamiętaj, aby użyć końcówki P200 o niskiej retencji.
      3. Sprawdź studnię za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, aby potwierdzić transfer.
      4. Jeśli pojedyncza komórka nadal znajduje się w studzience, dodaj 200 μl / studzienkę 1 mM EDTA/PBS zawierającego barwnik interkalatorowy dla DNA.
      5. Następnie powtórz transfer.
    5. Odwirować probówkę do PCR o sile 240 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C za pomocą wirnika obrotowego bez hamulca.
      UWAGA: Hamowanie powoduje wirowanie przepływu wody w rurze, co zakłóca wytrącanie się pojedynczej komórki. Podczas wirowania z wahliwym wirnikiem bez hamulca, pojedyncza komórka zawsze opada na dno probówki. Jeśli jednak używany jest wirnik kątowy, pojedyncza komórka przyczepia się do bocznej ścianki probówki do PCR i może zostać utracona.
    6. Usunąć 195 μl supernatantu z bardzo małą prędkością pipetowania.
    7. Dodać 195 μl/probówkę roztworu akryloamidu/bis-akrylamidu/APS (patrz tabela 1).
    8. Odwirować probówkę do PCR o sile 240 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C za pomocą wirnika obrotowego bez hamulca.
    9. Usunąć 195 μl supernatantu z bardzo małą prędkością pipetowania.
    10. Przenieś dolne 3 μl do probówki PCR zawierającej 4% TEMED/olej mineralny i magnetyczny kulkę poliakryloamidu (wygenerowaną w kroku 6).
      UWAGA: Pamiętaj, aby użyć końcówki P10 o niskiej retencji. Dozuj ogniwo w pobliżu magnetycznej kulki poliakryloamidu. W oleju mineralnym ciecz zawierająca pojedynczą komórkę przylega do powierzchni magnetycznej kulki poliakryloamidu pod wpływem napięcia powierzchniowego.
    11. Inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: W tym procesie powstaje dwuwarstwowy żel akrylowylamidowy. Rdzeń to magnetyczny koralik żelowy. Zewnętrzna warstwa to żel poliakrylamidowy zawierający pojedynczą komórkę. Pojedyncza komórka jest osadzona w zewnętrznej warstwie żelu. Bezpieczny punkt zatrzymania: Po umyciu pojedynczych komórek wielokrotnego użytku buforem 50% glicerol/1 mM EDTA/0,05% Tween 20/0,5% BSA/TBS, pojedyncze ogniwa wielokrotnego użytku można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.
  2. Przygotowanie pojedynczych komórek wielokrotnego użytku (wersja półautomatyczna)
    UWAGA: Poniższa procedura jest wykonywana pod czystym kapturem, aby uniknąć zanieczyszczenia DNazą. Czas: 3 h/96 komórek
    1. Zmieszać 1 ml zawiesiny komórkowej (1 komórka/μl) i 199 ml 1 mM EDTA/PBS zawierającego barwnik interkalatorowy dla DNA (patrz Tabela 1).
    2. Przenieś 200 μl zawiesiny komórek do każdej studzienki płytki nanodołkowej o pojemności 4 nl (patrz Rysunek 3 i tabela materiałów) i umieść płytkę nanodołkową o pojemności 4 nl na automatycznym robocie do pobierania pojedynczych komórek (patrz Tabela materiałów).
    3. Umieść 96-dołkową płytkę PCR jako płytkę docelową na zautomatyzowanym robocie do pobierania pojedynczych komórek. Upewnij się, że każda studzienka zawiera 200 μl/studzienkę roztworu akryloamidu/bis-akrylamidu/APS (patrz tabela 1).
    4. Przenieś pojedynczą komórkę z nanodołka o pojemności 4 nL do dołka 96-dołkowej płytki PCR (patrz film uzupełniający S1).
    5. Nałożyć pokrywę na 96-dołkową płytkę do PCR i odwirować 96-dołkową płytkę o masie 240 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C za pomocą rotora obrotowego bez hamulca.
    6. Umieść 96-dołkową płytkę PCR na pokładzie automatycznego robota do obsługi cieczy (patrz Tabela materiałów, Rysunek 4 i kod uzupełniający 1).
    7. Przeciągnij i upuść kod uzupełniający 1 do okna oprogramowania (patrz tabela materiałów) robota do obsługi cieczy.
    8. Uruchom program na automatycznym robocie do obsługi cieczy (patrz Film Uzupełniający S2 i Film Uzupełniający S3).
      1. Usunąć 195 μl supernatantu z bardzo małą prędkością pipetowania.
      2. Dodać 50 μl 4% TEMED/oleju mineralnego.
        UWAGA: Kroki 8.2.8.1-8.2.8.2 można wykonać za pomocą pipetowania ręcznego.
    9. Inkubować przez noc w temperaturze pokojowej (Rysunek 5). Bezpieczny punkt zatrzymania: Po umyciu pojedynczych ogniw wielokrotnego użytku buforem 50% glicerol/1 mM EDTA/0,05% Tween 20/0,5% BSA/TBS, należy przechowywać pojedyncze ogniwa wielokrotnego użytku w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Automatyczne pobieranie pojedynczych komórek i transfer do 96-dołkowej płytki PCR w kroku 8.2. (A) Przegląd systemu pobierania pojedynczych komórek. Pojedynczy robot do pobierania komórek znajduje się w okapie z przepływem laminarnym, aby uniknąć zanieczyszczenia. (B) 24-dołkowa płytka z nanodołkami o pojemności 4 nl wewnątrz studzienki. (C) Rozmieszczenie komórek w studzience z płytki 24-dołkowej. Zielone kropki to komórki identyfikowane jako pojedyncza komórka w każdej nanostudzience o pojemności 4 nL. Karmazynowe kropki to komórki identyfikowane jako dublety lub wielokrotności komórek. (D) Obraz w jasnym polu studni w płycie 24-dołkowej. Zielony kwadrat to nanostudzienka o pojemności 4 nl zawierająca pojedynczą komórkę. Purpurowy kwadrat to nanostudzienka o pojemności 4 nl zawierająca wiele komórek. (E) Powiększone pole niektórych nanostudzienek o wielkości 4 nL. Jasne kropki to pojedyncze komórki w nanodołkach o pojemności 4 nL. System pobierania pojedynczych komórek identyfikuje nanostudzienki zawierające pojedynczą komórkę poprzez pozyskiwanie obrazów w jasnym polu i fluorescencji komórek z barwieniem DAPI. Zidentyfikowane pojedyncze komórki przenosi się z nanodołka o pojemności 4 nl do dołka 96-dołkowej płytki PCR. Podziałka = 2 mm (C, D), 100 μm (E). Skrót = DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-4
Rysunek 4: Generowanie pojedynczych komórek wielokrotnego użytku za pomocą robota do obsługi cieczy. (A) Pokład robota do obsługi cieczy. Pokład ma 11 otworów na stojaki na końcówki do pipet (końcówka P300: szczeliny 1-3, końcówka P20: szczeliny 5-6), 2 ml płytki głębokowodnej 96-dołkowej (szczelina 4), dwie 96-dołkowe płytki PCR zawierające pojedynczą komórkę na studzienkę (szczeliny 7 i 10) oraz dwie płaskie płytki 96-dołkowe na odpady płynne (szczeliny 8 i 11). (B) Pokład po umieszczeniu sprzętu laboratoryjnego. (C) Schematyczne przedstawienie pipetowania zrobotyzowanego w kroku 8.8.1. Program usuwa supernatant bez zasysania pojedynczej komórki z dna 96-dołkowej płytki PCR. (D) Pojedyncze ogniwa wielokrotnego użytku wygenerowane przy użyciu kodu uzupełniającego 1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

9. Losowe wyżarzanie i rozszerzanie podkładu

UWAGA: Poniższa procedura jest wykonywana pod czystym kapturem, aby uniknąć zanieczyszczenia DNazą. Gwiazdki (*) w poniższych krokach wskazują, że separator magnetyczny może być używany do kontrolowania położenia kulek poliakrylamidowych zawierających pojedynczą komórkę wielokrotnego użytku w probówce. Jednak zastosowanie separatora magnetycznego nie jest konieczne. Przesuwając się powoli w dół końcówki pipety wzdłuż ścianki probówki, kulki są wypychane do góry w celu umycia lub wymiany bufora. Czas: 9 h

  1. Usunąć olej mineralny pipetując(*) i przemyć (*) 5 razy 200 μl 1x buforu TP Mg(-) (rozcieńczyć 10x bufor TP Mg(-) do 1x buforu wodą ultraczystą, patrz Tabela 1).
  2. Usunąć supernatant (*) i dodać 15 μl buforu do wyżarzania (patrz tabela 1).
  3. Inkubować przez 1 godzinę na lodzie.
    UWAGA: Celem tej inkubacji jest przepuszczalnie błony plazmatyczne i jądrowe oraz dostarczenie losowego startera do jądra komórkowego.
  4. Umieść probówki PCR na termocyklerze i podgrzewaj w temperaturze 94 °C przez 3 min.
    UWAGA: Rozmiar probówki to 0,2 ml. Objętość roztworu wynosi około 20 μl, w tym objętość kulki poliakryloamidowej. Temperatura pokrywy termocyklera wynosi 105 °C.
  5. Przenieść probówki do metalowego bloku chłodzonego lodem i inkubować przez 2 minuty.
  6. Dodać 4 μl mieszaninyMgSO4/NaCl/dNTP (patrz tabela 1) i wymieszać mieszalnikiem wirowym ze średnią prędkością.
  7. Dodać 1 μl polimerazy Bst, duży fragment (patrz tabela materiałów) i wymieszać za pomocą mieszalnika wirowego ze średnią prędkością.
  8. Inkubować przez 4 godziny na wytrząsarce (600 obr./min w 4 °C).
    UWAGA: Celem tej inkubacji jest dostarczenie polimerazy Bst do jądra komórkowego.
  9. Umieść probówkę PCR na termocyklerze i uruchom jeden z następujących programów.
    1. Uruchom program 4 godzinny: 10 °C przez 30 min, 20 °C przez 30 min i 25 °C przez 180 min.
    2. Alternatywnie uruchom program nocny: 4 °C przez 4 godziny, 10 °C przez 2 godziny, 20 °C przez 2 godziny, 25 °C przez 4 godziny i utrzymuj w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Rozmiar probówki to 0,2 ml. Objętość roztworu wynosi około 25 μl, w tym objętość kulki poliakryloamidu. Temperatura pokrywy termocyklera wynosi 105 °C. Bezpieczny punkt zatrzymania: Przerwij eksperyment na okres do 1 dnia, przechowując pojedyncze ogniwa wielokrotnego użytku w temperaturze 4 °C.

10. Wiązanie przeciwciał

UWAGA: Poniższa procedura jest wykonywana pod czystym kapturem, aby uniknąć zanieczyszczenia DNazą. Czas: 1,5 h

  1. Dodać 1,625 μl roztworu NaCl/EDTA/BSA (patrz Tabela 1) i wymieszać przez wirowanie z małą prędkością.
    UWAGA: Ten krok ma na celu 1) ułatwienie chelatacji Mg2+ przez EDTA, 2) ustabilizowanie wiązania rozszerzonego 1. losowego startera przez 300 mM NaCl oraz 3) zablokowanie niespecyficznego wiązania przeciwciał za pomocą albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w późniejszej reakcji.
  2. Inkubować przez 1 godzinę na lodzie i dodać po 0,1 μg/ml przeciwciała i kontrolnej IgG sprzężonej z sondą przeciwciał (przygotowaną w kroku 5).
  3. Inkubować przez noc na lodzie, delikatnie potrząsając na shakerze.

11. Ligacja zbliżeniowa sondy przeciwciała i proksymalnie przedłużonego startera losowego

UWAGA: Poniższa procedura jest wykonywana pod czystym kapturem, aby uniknąć zanieczyszczenia DNazą. Gwiazdki (*) w poniższych krokach wskazują, gdzie można zastosować separator magnetyczny do kontrolowania położenia kulek poliakryloamidowych zawierających pojedynczą komórkę wielokrotnego użytku w probówce. Jednak zastosowanie separatora magnetycznego nie jest konieczne. Przesuwając powoli w dół końcówki pipety wzdłuż ścianki probówki, kulki można wypchnąć do góry w celu umycia lub wymiany bufora. Czas: 6 h

  1. Przemyć (*) dwukrotnie 200 μl 1x buforu TPM-T (20 minut inkubacji w każdym przemyciu) na lodzie. Rozcieńczyć 10x bufor TPM-T (Tris-HCl/Chlorek potasu/Siarczan magnezu/Triton X-100) do 1x ultraczystą wodą).
  2. Usunąć (*) supernatant i przemyć (*) raz 1x buforem ligazy DNA T4 (patrz Tabela Materiałów).
  3. Usunąć (*) supernatant i dodać 19 μl roztworu adaptera do ligacji (patrz Tabela 1).
  4. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C.
  5. Dodać 1 μl ligazy DNA T4 (patrz tabela materiałów) i wymieszać probówkę w mieszalniku wirowym ze średnią prędkością.
  6. Umieść probówkę na termocyklerze i uruchom następujący program: program ligacji zbliżeniowej, 4 h w temperaturze 16 °C i 30 min w temperaturze 25 °C.
    UWAGA: Rozmiar probówki to 0,2 ml. Objętość roztworu wynosi około 25 μl, w tym objętość kulki poliakryloamidu. Temperatura pokrywy termocyklera jest temperaturą pokojową.
  7. Przemyć (*) dwa razy krótko 200 μl 1x Bst Mg(-) buforu EDTA(+) (patrz Tabela 1; przygotować 1x bufor z 10x buforu podstawowego) i przechowywać komórkę w temperaturze 4 °C przez noc. Bezpieczny punkt zatrzymania: Przerwij eksperyment w tym miejscu na okres do 1 dnia, przechowując pojedyncze ogniwa wielokrotnego użytku w temperaturze 4 °C.

12. Pełne rozszerzenie pierwszego losowego startera

UWAGA: Poniższa procedura jest wykonywana pod czystym kapturem, aby uniknąć zanieczyszczenia DNazą. Czas: 4,5 h

  1. Przemyć dwukrotnie 200 μL 1x Bst Mg(-) EDTA(-) bufor (patrz Tabela 1, przygotować 1x bufor z 10x buforu podstawowego), usunąć supernatant i dodać 20 μL mieszaniny Bst/dNTPs/MgSO4 (patrz Tabela 1).
  2. Wymieszać mieszalnikiem wirowym ze średnią prędkością i inkubować przez 4 godziny na wytrząsarce orbitalnej (w temperaturze 6 °C i 500 obr./min).
  3. Umieść rurkę na termocyklerze i uruchom następujący program: program pełnego wysuwu: 10 °C przez 1 h, 20 °C przez 1 h, 30 °C przez 1 h, 40 °C przez 1 h, 50 °C przez 1 h, 65 °C przez 1 h, 94 °C przez 10 min, i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Bezpieczny punkt zatrzymania: Eksperyment można zatrzymać w tym miejscu na okres do 1 dnia, przechowując pojedyncze ogniwa wielokrotnego użytku w temperaturze 4 °C.

13. Wielokrotne wzmocnienie przemieszczenia

UWAGA: Poniższa procedura jest wykonywana pod czystym kapturem, aby uniknąć zanieczyszczenia DNazą. Czas: 2,5 h (kroki 13.1-13.2) + 15 min (kroki 13.3-13.4) + 1 dzień (kroki 13.5-13.10)

  1. Dodać 0,4 μl 100 μM 2 losowowyrywkowego startera (patrz Tabela 3) i wymieszać mieszadłem wirowym ze średnią prędkością.
  2. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 6 °C i prędkości 500 obr./min na wytrząsarce orbitalnej, następnie umieścić probówkę na termocyklerze i ogrzewać w temperaturze 94 °C przez 3 min.
    UWAGA: Rozmiar probówki to 0,2 ml. Objętość roztworu wynosi około 25,4 μl, w tym objętość kulki poliakrylamidowej. Temperatura pokrywy termocyklera wynosi 105 °C.
  3. Umieść probówki w metalowym bloku chłodzonym lodem i dodaj 1 μl/probówkę polimerazy DNA Bst.
  4. Wiruj z małą prędkością, umieść rurki na termocyklerze i uruchom następujący program:
    4 °C przez 4 godziny, 10 °C przez 30 min, 20 °C przez 30 min, 30 °C przez 30 min, 40 °C przez 30 min, 50 °C przez 30 min, 65 °C przez 60 min, 94 °C przez 3 min i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Rozmiar probówki to 0,2 ml. Objętość roztworu wynosi około 26,4 μl, w tym objętość kulki poliakrylamidowej. Temperatura pokrywy termocyklera wynosi 105 °C. Bezpieczny punkt zatrzymania: Przerwij eksperyment na okres do 1 dnia, przechowując pojedyncze ogniwa wielokrotnego użytku w temperaturze 4 °C.
  5. Zebrać supernatant (około 20 μl) i przenieść go do probówki do PCR.
  6. Zebrać supernatant przechowywać w temperaturze -80 °C.
  7. Dodać 20 μl/probówkę 0,05% buforu Tween 20/0,1x TE do probówki PCR zawierającej pojedynczą komórkę wielokrotnego użytku (patrz Tabela 1) i inkubować pojedynczą komórkę wielokrotnego użytku w temperaturze 4 °C przez noc. Bezpieczny punkt zatrzymania: Przerwij eksperyment na kilka dni, wydłużając czas inkubacji.
  8. Zebrać supernatant i połączyć go z próbką pobraną w kroku 13.5.
  9. Powtórz kroki 13.7-13.8 jeszcze raz. Namocz pojedynczą komórkę wielokrotnego użytku w buforze 50% glicerol/5 mM EDTA/0,5% BSA/0,05% Tween20/TBS i inkubuj ją przez 30 minut na wytrząsarce orbitalnej (4 °C, 600 obr./min). Przechowuj pojedynczą komórkę wielokrotnego użytku w temperaturze -20 °C do następnego eksperymentu.
  10. Dodać 40 μl mieszanki Exo-master (patrz tabela 1) i umieścić probówkę na termocyklerze i uruchomić następujący program: i) 95 °C przez 5 min, ii) 95 °C przez 30 s, iii) 60 °C 30 s, iv) 72 °C przez 30 s, v) powtórzyć kroki II-IV 19 razy, vi) 72 °C przez 5 min, vii) utrzymywać w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Rozmiar probówki to 0,2 ml. Objętość roztworu wynosi około 45 μl, w tym objętość kulki poliakryloamidowej. Temperatura pokrywy termocyklera wynosi 105 °C. Bezpieczny punkt zatrzymania: Eksperyment można przerwać na co najmniej kilka dni, przechowując próbkę w temperaturze -80 °C.

14. Oczyszczanie fenolu i chloroformu i wytrącanie glikolu polietylenowego

UWAGA: Poniższa procedura jest wykonywana pod czystym kapturem, aby uniknąć zanieczyszczenia DNazą. Czas: 1,5 h

  1. Przenieś produkt do probówki o niskim stopniu wiązania DNA o pojemności 0,5 ml i dodaj 100 μl fenolu: chloroformu: alkoholu izoamylowego.
    UWAGA: Fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy powoduje podrażnienia i możliwe oparzenia przez kontakt. Nosić rękawice, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny. Używaj tylko przy odpowiedniej wentylacji lub noś odpowiednią maskę oddechową. Postępuj zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa. Wyrzuć zużyty sprzęt laboratoryjny zgodnie z wytycznymi instytucji.
  2. Wstrząsać ręcznie przez 30 s i odwirowywać w temperaturze 12 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Zebrać fazę wodną (80 μl) do probówki o niskim stopniu wiązania DNA o pojemności 0,5 ml i dodać 40,84 μl/probówkę mieszaniny liniowego akrylamidu/MgCl2 (patrz Tabela 1).
  4. Dodać 47,06 μl/probówkę z 50% (w/v) PEG8000 (bez RNaz) i wymieszać pipetując.
  5. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej i wirować przy 240 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Usunąć supernatant i dodać 400 μl/probówkę 80% etanolu (EtOH).
  7. Przemyć 80% EtOH, usunąć supernatant za pomocą aspiratora i wysuszyć granulkę na powietrzu.
  8. Zawiesić osad z 20 μl 1 mM EDTA/10 mM buforu Tris-HCl, pH 7,4 i przechowywać roztwór w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Zmierz stężenie DNA za pomocą dwuniciowego barwnika interkalatorowego specyficznego dla DNA (patrz Tabela materiałów). Bezpieczny punkt zatrzymania: Eksperyment można tu bezpiecznie przerwać na co najmniej tydzień.

15. Transkrypcja in vitro

UWAGA: Poniższa procedura jest wykonywana pod czystym kapturem, aby uniknąć zanieczyszczenia DNazą i RNazą. Czas: 5 h

  1. Rozmrozić DNA produktów pochodzących z jednej komórki (z kroku 14) i przygotować mieszaną bibliotekę produktów pochodzących z jednej komórki, mieszając 2 μl/komórkę produktów DNA (całkowita objętość 20 μl).
  2. Dodać 26 μl głównej mieszanki do transkrypcji in vitro (patrz Tabela Materiałów i Protokół producenta) i wymieszać przez pipetowanie.
  3. Umieścić probówkę PCR na termocyklerze i inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Rozmiar probówki to 0,2 ml. Objętość roztworu wynosi 46 μl. Temperatura pokrywy termocyklera wynosi 105 °C.
  4. Dodać 5 μl 10x buforu DNazy I (patrz Tabela materiałów) i dodać 4 μL DNazy I (bez RNazy, 4 U, patrz Tabela Materiałów).
  5. Mieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C, a następnie przenieść próbkę do probówki o pojemności 0,5 ml.
  6. Dodać 300 μl/probówkę tiocyjanianu guanidyny-fenolu-chloroformu (patrz tabela materiałów) i wymieszać przez delikatne wirowanie.
    UWAGA: Tiocyjanian guanidyny-fenol-chloroform może prowadzić do poważnych oparzeń chemicznych przez kontakt. Nosić rękawice, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny. Używaj tylko przy odpowiedniej wentylacji lub noś odpowiednią maskę oddechową. Postępuj zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa. Wyrzuć zużyty sprzęt laboratoryjny zgodnie z wytycznymi instytucji.
  7. Inkubować przez 5 minut w temperaturze R.T. na wytrząsarce, a następnie przechowywać próbki w temperaturze -80 °C przez okres do 3 dni.
    UWAGA: Bezpieczny punkt zatrzymania: Eksperyment można tu bezpiecznie zatrzymać na okres do 3 dni.

16. Oczyszczanie RNA

UWAGA: Poniższa procedura jest wykonywana pod czystym kapturem, aby uniknąć zanieczyszczenia DNazą i RNazą. Czas: 2 h

  1. Dodać 80 μl/probówkę chloroformu do próbki z kroku 15.7 i energicznie wstrząsać probówką ręcznie przez 15 s.
  2. Inkubować przez 2-15 minut w temperaturze pokojowej i odwirowywać próbkę o masie 12 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Zebrać i przenieść fazę wodną próbki (~200 μL) do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
  4. Dodać 600 μl/probówkę tiocyjanianu guanidyny-fenolu-chloroformu i przenieść próbkę do probówki o pojemności 1,5 ml.
  5. Dodać 180 μl/probówkę chloroformu i energicznie wstrząsać probówką ręcznie przez 15 sekund.
  6. Odwirować próbkę o masie 12 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Zebrać i przenieść fazę wodną próbki (~450 μL) do probówki o pojemności 1,5 ml.
  8. Dodać 60 μl/probówkę liniowego akrylamidu (5 μg/μl) i dodać 400 μl/probówkę 100% izopropanolu do fazy wodnej.
  9. Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut i odwirowywać ją w temperaturze 12 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  10. Ostrożnie usunąć supernatant.
  11. Umyj osad RNA 3 razy 200 μl 75% etanolu (woda wolna od EtOH/RNaz), usuń supernatant i wysusz na powietrzu osad RNA.
    UWAGA: Nie dopuścić do całkowitego wyschnięcia RNA, ponieważ osad może stracić rozpuszczalność.
  12. Zawiesić osad RNA w 20 μl wody wolnej od RNaz zawierającej inhibitor RNAzy (1 μl/20 μl) i rozpuścić osad przez pipetowanie.
  13. Zmierzyć absorbancję przy 260 nm.

17. Odwrotna transkrypcja

UWAGA: Poniższa procedura jest wykonywana pod czystym kapturem, aby uniknąć zanieczyszczenia DNazą. Czas: 1 h

  1. Dodać 7 μl/probówkę startera do odwrotnej transkrypcji + mieszanki dNTP (patrz Tabela 1 i Tabela 3) i umieścić probówki na termocyklerze.
    UWAGA: Rozmiar probówki to 0,2 ml. Objętość roztworu wynosi 27 μl. Temperatura pokrywy termocyklera wynosi 105 °C.
  2. Podgrzewać w temperaturze 65 °C przez 5 minut i umieścić probówki na lodzie na co najmniej 1 minutę.
  3. Dodać 14 μl/probówkę głównej mieszanki odwrotnej transkryptazy (patrz Tabela 1) i wymieszać pipetując.
  4. Umieścić probówki na termocyklerze i inkubować je w temperaturze 55 °C przez 10 minut, a następnie w temperaturze 80 °C przez 10 minut
    UWAGA: Rozmiar probówki to 0,2 ml. Objętość roztworu wynosi 60 μl. Temperatura pokrywy termocyklera wynosi 105 °C.

18. Synteza drugiej nici

UWAGA: Poniższa procedura jest wykonywana pod czystym kapturem, aby uniknąć zanieczyszczenia DNazą. Czas: 2,5 h

  1. Dodać 40 μl/probówkę ultraczystej wody i podzielić 100 μl roztworu na dwie probówki PCR o pojemności 0,2 ml (50 μl/probówkę).
  2. Dodać 60 μl/probówkę mieszanki do syntezy drugiej nici (patrz Tabela 1) i umieścić probówki na termocyklerze i uruchomić następujący program: i) 95 °C przez 5 min, ii) 95 °C przez 30 s, iii) 60 °C przez 30 s, iv) 72 °C przez 30 s, v) powtórzyć kroki II-IV 20 razy, oraz vi) utrzymywać w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Rozmiar probówki to 0,2 ml. Objętość roztworu wynosi 110 μl. Temperatura pokrywy termocyklera wynosi 105 °C.
  3. Dodać 4,4 μl/probówkę 0,5 M EDTA (końcowe 20 mM) i przechowywać w temperaturze -80 °C przez noc.
    UWAGA: Bezpieczny punkt zatrzymania: Eksperyment można tu bezpiecznie przerwać na okres do kilku dni.
  4. Oczyszczanie DNA przez oczyszczanie fenolowo-chloroformowe i wytrącanie glikolu polietylenowego (opisane w kroku 14).
    UWAGA: Bezpieczny punkt zatrzymania: Eksperyment można bezpiecznie przerwać w tym miejscu na co najmniej tydzień.

19. Trawienie enzymem restrykcyjnym i wybór wielkości

UWAGA: Poniższa procedura jest wykonywana pod czystym kapturem, aby uniknąć zanieczyszczenia DNazą. Czas: 3 h (kroki 19.1-19.7)

  1. Zmierzyć stężenie DNA w oczyszczonym DNA (od kroku 18.4), mierząc absorbancję przy 260 nm.
  2. Przenieś 6 μg DNA do probówki PCR, dodaj 30 μl 10x buforu wytrawiającego i dostosuj objętość do 294 μl ultraczystą wodą.
  3. Dodać 6 μl enzymu restrykcyjnego BciVI i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  4. Przeprowadzić wytrącanie EtOH za pomocą liniowego poliakrylamidu.
    1. Dodać 60 μl/probówkę 3 M octanu sodu (pH 5,2), a następnie dodać 40 μl/probówkę liniowego akrylamidu (5 mg/ml, patrz tabela materiałów).
    2. Dodać 400 μl/probówkę EtOH i inkubować przez noc w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Bezpieczny punkt zatrzymania: Eksperyment można tu bezpiecznie zatrzymać na jeden dzień.
    3. Odwirować 12 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
    4. Umyj granulkę dwukrotnie 80% EtOH i wysusz osad.
    5. Rozpuść osad w 20 μL buforu 1xTE i dodaj 4 μL/probówkę świeżego buforu 6x Gel Loading.
  5. Załadować próbkę do 5% żelu agarozowego/0,5x buforu TAE i przeprowadzić elektroforezę (50 V przez 40 min).
  6. Wytnij i zbierz żel przez 50 pz (patrz Rysunek 6) i wyekstrahuj DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu.
    UWAGA: Bezpieczny punkt zatrzymania: Eksperyment można bezpiecznie przerwać w tym miejscu na co najmniej tydzień.
  7. Skonstruuj bibliotekę sekwencjonowania, korzystając z zestawu do przygotowania biblioteki DNA (patrz Tabela materiałów)16,17.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pojedyncze komórki K562 zostały wygenerowane przy użyciu protokołu opisanego w kroku 8 (patrz Rysunek 5). Pojedyncze komórki zostały zatopione w zewnętrznej warstwie kulki poliakrylowoamidowej. DNA komórki barwiono i wizualizowano przy użyciu barwnika interkalatorowego do barwienia DNA.

figure-results-1
Rysunek 5: Wygenerowane ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule opisano krok po kroku protokół dla niedawno zgłoszonej analizy multiepigenomicznej pojedynczych komórek przy użyciu pojedynczych komórek wielokrotnego użytku7. W kolejnych akapitach omawiamy punkty krytyczne, podkreślając potencjalne ograniczenia w protokole.

Jednym z krytycznych punktów w całym protokole (z kroków 7.2-13) jest unikanie zanieczyszczenia DNazą. Pojedyncza komórka ma tylko dwie kopie genomowego DNA. Dlatego uszkodzenie genomowego DNA kryty...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doktorzy Ohnuki i Tosato są współtwórcami patentu zatytułowanego "Metody przygotowania pojedynczej komórki wielokrotnego użytku oraz metody analizy epigenomu, transkryptomu i genomu pojedynczej komórki" (EP3619307 i US20200102604). Wniosek patentowy został złożony częściowo w oparciu o wstępne wyniki związane z technologią opisaną w niniejszym manuskrypcie. Wynalazek lub wynalazki opisane i zastrzeżone w niniejszym zgłoszeniu patentowym zostały dokonane, gdy wynalazcy byli pełnoetatowymi pracownikami rządu Stanów Zjednoczonych. W związku z tym, zgodnie z 45 Kodeksem Przepisów Federalnych, część 7, wszystkie prawa, tytuły i udziały w tym zgłoszeniu patentowym zostały lub powinny być zgodnie z prawem przeniesione na rząd Stanów Zjednoczonych. Rząd Stanów Zjednoczonych przekazuje część otrzymywanych przez siebie tantiem, na rzecz swoich pracowników-wynalazców zgodnie z 15 Kodeksem Stanów Zjednoczonych § 3710c.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy doktorom Davidowi Sanchezowi-Martinowi i Christopherowi B. Buckowi za komentarze na etapie konceptualizacji projektu. Dziękujemy również Genomics Core, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health za pomoc we wstępnych eksperymentach oraz Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH za porady w zakresie analizy obliczeniowej. Dziękujemy Pani Annie Word za pomoc w optymalizacji polimeraz DNA wykorzystywanych w metodzie. W pracy wykorzystano zasoby obliczeniowe klastra NIHHPC Biowulf (http://hpc.nih.gov). Projekt ten jest wspierany przez Program Stacjonarny Centrum Badań nad Rakiem, National Cancer Institute, National Institutes of Health, NCI Director's Innovation Award (#397172) oraz fundusze federalne z National Cancer Institute w ramach umowy nr. HHSN261200800001E. Dziękujemy doktorom Tomowi Misteli, Carol Thiele, Douglasowi R. Lowe'emu i wszystkim członkom Laboratorium Onkologii Komórkowej za owocne komentarze.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x Bufor CutSmartNew England BioLabsB600410x Bufor do wytrawiania
200 proof etanolWarner-Graham Company200 proofEthanol
5-hydroksymetylocytozyna (5-hmC) Przeciwciało monoklonalne [HMC/4D9]EpigentekA-1018-100Anti-5hmC
Acridine Orange/Propidium Jodek BejcaLogos BiosystemsF23001Licznik komórek
Roztwór akryloamidu, 40% w H2O, do biologii molekularnejMilliporeSigma01697-500ML40% roztwór akryloamidu
Mikroskop fluorescencyjny typu "wszystko w jednym" BZ-X710Mikroskop skaningowyKeyenceBZ-X710
odśrodkowy Amicon Ultra-0,5MilliporeSigmaUFC510024Kaseta ultrafiltracyjna
Nadsiarczan amonu do biologii molekularnejMilliporeSigmaA3678-100GNadsiarczan amonu w proszku
Bezwodny DMFLaboratoria wektoroweS-4001-005Bezwodny N,N-dimetyloformamid (DMF)
Polimeraza anty-RNA II Powtórzenie CTD YSPTSPS (fosfo S5) przeciwciało [4H8]Abcamab5408Przeciwciało anty-Pol II
Anti-TRAP220/MED1 (fosfo T1457)Abcamab60950Anti-Med1
BciVINew England BioLabsR0596LBciVI
Roztwór albuminy surowicy bydlęcej, 20 mg / ml w H2O, niskie obciążenie biologiczne, bez proteazy, do biologii molekularnejMilliporeSigmaB8667-5ML20% BSA (Tabela 7)
Polimeraza DNA Bst, duży fragmentNew England BioLabsM0275LBst Polimeraza DNA
BT10 Seria 10 i mikro; l Końcówka barierowaKońcówka NEPTUNEBT10P10 o niskiej retencji
CellCelectorAutomated Lab SolutionsN/AZautomatyzowany robot do pobierania pojedynczych komórek
CellCelector 4 nl nanowell płytki do klonowania pojedynczych komórek, Płytka S200-100 100K, 24 dołki, ULAAutomated Lab SolutionsCC0079nL płytka nanowell
ChloroformMilliporeSigmaChloroform
Corning Costar 96-Well, Poddana hodowli komórkowej, płaska płytka mikropłytkowaCorning3596Płaskie 96-dołkowe płytki
Deep Vent (egzo-) Polimeraza DNANew England BioLabsM0259LExo- Probówki
LoBind, 0,5 mlEppendorf301080350,5 ml rurki o niskim poziomie wiązania DNA
Oligo, 1. losowy starterZintegrowane technologie DNA N/ A, patrz Tabela 31. losowy starter
DNA Oligo, 2. losowy starter Komórka#01Zintegrowane technologie DNANie dotyczy, patrz Tabela 3.
starter DNA Oligo, 2. losowy starter Komórka#02Zintegrowane technologie DNA Niedotyczy, patrz Tabela 32. losowy starter
DNA Oligo, 2. losowy starter Komórka#03Zintegrowane technologie DNANie dotyczy, patrz Tabela 32. losowy starter
Oligo DNA, 2. losowy starter Komórka#04Zintegrowane technologie DNANie dotyczy, patrz Tabela 32. losowy starter
DNA Oligo, 2. losowy starter Komórka#05Zintegrowane technologie DNANie dotyczy, patrz Tabela 32. losowy starter
DNA Oligo, 2. losowy starter Komórka#06Zintegrowane technologie DNANie dotyczy, patrz Tabela 3Drugi losowy starter
DNA Oligo, Drugi losowy starter Komórka#07Zintegrowane technologie DNANie dotyczy, patrz Tabela 32.
DNA Oligo, 2. losowy starter Komórka#08Zintegrowane technologie DNANie dotyczy, patrz Tabela 32.
DNA Oligo, 2. losowy starter Komórka#09Zintegrowane technologie DNANie dotyczy, patrz Tabela 32. losowy starter
DNA Oligo, 2. losowy starter Komórka#10Zintegrowane technologieDNANie dotyczy, patrz Tabela 32. losowy starter
DNA Oligo, 2. losowy starter Komórka#11Zintegrowane technologie DNANie dotyczy, patrz Tabela 32. losowy starter
DNA Oligo, 2. losowy starter Komórka#12Zintegrowane technologie DNA Niedotyczy, patrz Tabela 32. losowy starter
DNA Oligo, 2. starter syntezyZintegrowane technologie DNA Niedotyczy, patrz Tabela 3Drugi starter
syntezyDNA Oligo, Adaptor do ligacjiZintegrowane technologie DNA Nie, patrz Tabela 3Adaptor do ligacji
DNA Oligo, starter do odwrotnej transkrypcjiZintegrowane technologie DNA Nie, patrz Tabela 3Starter odwrotnej transkrypcji
DNaza I (bez RNazy)New England BioLabsM0303LDNaza I (bez RNazy, 4 U).
Bufor reakcyjny DNazy INew England BioLabsB0303S10x bufor DNazy I (NEB)
Mieszanka dNTP (10 mM każdy)Thermo FisherR019210 mM dNTPs
Surowica bydlęca płodu, pochodzenie z USA, inaktywowana termicznieMilliporeSigmaF4135-500MLPłodowa surowica bydlęca
HiScribe T7 Zestaw do syntezy RNA o wysokiej wydajnościEngland BioLabsE2040SMistrzowska mieszanka transkrypcji in vitro
Przeciwciało Histone H3K27acMotyw aktywny39133Anty-H3K27ac
Przeciwciało Histone H3K27me3Motyw aktywny39155Anty-H3K27me3
IgG z surowicy królikaMillipore SigmaI5006-10MGControl IgG
Nanoproszek magnetyczny tlenku żelaza(II,III), średnia wielkość części 30 nm (TEM), funkcjonalizowany estrem NHSMilliporeSigma747467-1GNHS funkcjonalizowany estrem 30 nm proszek tlenku żelaza
K-562Kolekcja kultur typu amerykańskiego (ATCC)KomórkiCCL-243
Liniowy akryloamid (5 mg / ml)Thermo FisherAM9520Liniowy akryloamid
LUNA-FL Licznik komórek z podwójną fluorescencjąLogo BiosystemsL20001Licznik komórek
LUNA Szkiełka do liczenia komórek, 50 slajdówLogo BiosystemsL12001Licznik komórek
Olej mineralny, Bioodczynnik, do biologii molekularnej, olej lekkiMilliporeSigmaM5904-500MLOlej mineralny
N,N,N′,N′-Tetrametyloetylenodiamina do biologii molekularnejMilliporeSigmaT7024-100MLN,N,N′,N′-Tetramethyloethelenodiamine
NaCl (5 M), bez RNazThermo FisherAM9760G5M NaCl
NanoDrop LiteThermo Fisher2516  Spektrofotometr mikroobjętościowy
NEST 2 ml 96-dołkowa płytka głębinowa, V BottomOpentronsN/AmL głęboka płytka 96-dołkowa
osłonki 96-dołkowa płytka PCRGenesee Scientific27-40596-dołkowa płytka do PCR
NuSive GTG AgarozaLonza50081Agaroza
OmniPur Akrylamid: Bis-akrylamid 19:1, 40% roztwórMiliporeSigma1300-500ML40% Akrylamid/Bis-akryloamid
Robot laboratoryjny OT-2OpentronsOT2Zautomatyzowany robot do obsługi cieczy
Paraformaldehyd, klasa EM, oczyszczona, 20% roztwór wodnyMikroskopia elektronowa Sciences1571320% aldehyd pararmały
PBS (10x), pH 7,4Thermo Fisher7001104410x PBS
Pipeta PIPETMAN Classic P1000GILSONF123602A P1000
Probówki białkowe LoBind, 1,5 mlEppendorf9250000901,5 ml rurka o niskim poziomie wiązania białka
Zestaw do ekstrakcji żelu QIAgen Pipeta Qiagen28706A P1000
Quant-iT PicoGreen dsDNATest Thermo FisherP11495  Specyficzny dla DNA barwnik interkalatorowy
Zestaw do szybkiego ligowaniaNew England BioLabsM2200LT4 Ligaza DNA (NEB)
RNaseOUT Rekombinowany inhibitor rybonukleazyThermo Fisher10777019Inhibitor RNAzy
S-4FB Środek sieciujący (rozpuszczalny w DMF)Laboratoria wektoroweS-1004-105Succinimidylo4-formylobenzoesan (S-4FB)
S-HyNicLaboratoriawektoroweS-1002-1056-hydrazynonikotynian sukcynimidylu hydrazon acetonu (S-HyNic)
Octan sodu, 3 M, pH 5,2, klasa biologii molekularnejMilliporeSigma567422-100ML3M Octan sodu (pH 5,2)
Wodorowęglan sodu, roztwór buforowy 1M, pH 8,5Alfa AesarJ604081M bufor wodorowęglanu sodu, pH 8,5
Fosforan sodu dwuzasadowy do biologii molekularnejMilliporeSigmaS3264-250GNa2HPO4
Fosforan sodu monozasadowy dla biologii molekularnejMilliporeSigmaS3139-250GNaH2PO4
SuperScript IV Odwrotna transkryptazaThermo Fisher18090050Odwrotna transkryptaza
SYBR Gold Barwnik żelowy z kwasem nukleinowym (10 000x Koncentrat w DMSO)Thermo FisherS11494Barwnik interkalatorowy dla DNA
T4 Bufor reakcyjny ligazy DNANew England BioLabsB0202S10x T4 Bufor reakcyjny ligazy DNA
Pakiet reakcyjnych ThermoPol NewEngland BioLabsB9004S10x bufor TPM-T (Tris-HCl/chlorek potasu/siarczan magnezu/Triton X-100)
Odczynnik TRIzol LSThermo Fisher10296-028Ekstrakcja tiocyjanianianem guanidyny, fenolem i chloroformem
Zestaw do przygotowania biblioteki TruSeq Nano DNAIllumina20015965Zestaw do przygotowania biblioteki DNA (patrz również instrukcja producenta)
Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005Integrated DNA TechnologiesN/A, patrz Tabela 3Sonda DNA modyfikowana aminami pod kątem przeciwciała
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002Integrated DNA TechnologiesN/A, patrz Tabela 3Sonda DNA modyfikowana aminami na przeciwciało
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003Integrated DNA TechnologiesN/A, patrz Tabela 3Sonda DNA modyfikowana aminami dla przeciwciała
Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004Integrated DNA TechnologiesN/A, patrz Tabela 3Sonda DNA modyfikowana aminą dla przeciwciała
Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006Integrated DNA TechnologiesN/A, patrz Tabela 3Sonda DNA modyfikowana aminą dla przeciwciał
Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001Zintegrowane technologie DNANie dotyczy, patrz Tabela 3Sonda DNA modyfikowana aminami do kontroli IgG
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher155750200,5 M EDTA, pH 8,0
UltraPure Woda destylowana bez DNazy/RNazThermo Fisher10977023Ultraczysta woda
Kolumny odsalające Zeba Splin, 7K MWCO, 0,5 mlThermo Fisher89882Kolumna odsalająca
Filtr 4 DNA Eppendorf 2 losowy losowy starter losowy starter dotyczy dotyczy New 2 bez

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Perkel, J. M. Single-cell analysis enters the multiomics age. Nature. 595 (7868), 614-616 (2021).
  2. Clark, S. J., et al. scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells. Nature Communications. 9 (1), 781(2018).
  3. Ma, S., et al. Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and Chromatin. Cell. 183 (4), 1103-1116 (2020).
  4. Zhu, C., et al. An ultra high-throughput method for single-cell joint analysis of open chromatin and transcriptome. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 1063-1070 (2019).
  5. Zhu, C., et al. Joint profiling of histone modifications and transcriptome in single cells from mouse brain. Nature Methods. 18 (3), 283-292 (2021).
  6. Mimitou, E. P., et al. Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells. Nature Biotechnology. 39 (10), 1246-1258 (2021).
  7. Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Iterative epigenomic analyses in the same single cell. Genome Research. 31 (10), 1819-1830 (2021).
  8. Tosato, G., Ohnuki, H. Methods of preparing a re-usable single cell and methods fro analyzing the epigenome, transcriptome, and genome of a single cell. , EP 3619307, US 202001026704 (2021).
  9. Harada, A., et al. A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input. Nature Cell Biology. 21 (2), 287-296 (2019).
  10. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).
  11. Marina, R. J., et al. TET-catalyzed oxidation of intragenic 5-methylcytosine regulates CTCF-dependent alternative splicing. EMBO Journal. 35 (3), 335-355 (2016).
  12. Weast, R. C., et al. Handbook of chemistry and physics: a ready-reference book of chemical and physical data. 56th edn. Weast, R. C., Astle, M. J., Beyer, W. H. , Chemical Rubber Company Press. (1975).
  13. Aydin, S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides. 72, 4-15 (2015).
  14. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133 (9), 12(2013).
  15. Porstmann, T., Kiessig, S. T. Enzyme immunoassay techniques. An overview. Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).
  16. Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).
  17. Song, Y., et al. A comparative analysis of library prep approaches for sequencing low input translatome samples. BMC Genomics. 19 (1), 696(2018).
  18. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  19. Ku, W. L., et al. Single-cell chromatin immunocleavage sequencing (scChIC-seq) to profile histone modification. Nature Methods. 16 (4), 323-325 (2019).
  20. Carter, B., et al. Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq). Nature Communications. 10 (1), 3747(2019).
  21. Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Reusable Single CellIterative Epigenomic AnalysisSingle Cell EpigenomeProximity LigationPolyacrylamide EmbeddingAntibody DNA ProbeHistone ModificationsMultiple Displacement AmplificationCapillary ElectrophoresisMultiomics Analysis

Related Articles