Artykuł metodologiczny

Wytrącanie białek na bazie rozpuszczalnika organicznego do solidnej oczyszczania proteomu przed spektrometrią mas

DOI:

10.3791/63503

⸱

7 lutego 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Dalhousie University, 2Proteoform Scientific Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy protokół opisuje wytrącanie białek na bazie rozpuszczalnika w kontrolowanych warunkach, co zapewnia solidne i szybkie odzyskiwanie oraz oczyszczanie próbek proteomu przed spektrometrią mas.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż liczne postępy w instrumentach spektrometrii mas (MS) poprawiły jakościową i ilościową analizę proteomów, bardziej niezawodne podejścia front-end do izolowania, wzbogacania i przetwarzania białek przed MS są kluczowe dla skutecznej charakterystyki proteomu. Niski, nieregularny odzysk białek oraz resztkowe zanieczyszczenia, takie jak surfaktanty, są szkodliwe dla analizy SM. Wytrącanie białek jest często uważane za zawodne, czasochłonne i technicznie trudne w porównaniu z innymi strategiami przygotowania próbek. Te obawy można przezwyciężyć poprzez zastosowanie optymalnych protokołów wytrącenia białek. W przypadku wytrącania acetonem kluczowe jest połączenie konkretnych soli, kontrola temperatury, skład rozpuszczalnika oraz czas wytrącenia, natomiast efektywność wytrącania chloroformu/metanolu/wody zależy od prawidłowego pipetowania i manipulacji fiolkami. Alternatywnie, te protokoły opadów są uproszczone i półautomatyczne w jednorazowym wkładzie wirującym. Oczekiwane wyniki wytrącenia białek na bazie rozpuszczalnika w konwencjonalnym formacie oraz przy użyciu jednorazowego, dwustopniowego wkładu filtracyjnego i ekstrakcyjnego zostały przedstawione w niniejszej pracy. Obejmuje to szczegółową charakterystykę mieszanin proteomicznych za pomocą analizy LC-MS/MS od dołu do góry. Lepsza wydajność przepływów opartych na SDS jest również wykazywana w porównaniu do białek nieskażonych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza proteomu za pomocą spektrometrii masowej stała się coraz bardziej rygorystyczna dzięki zwiększonej czułości, rozdzielczości, szybkości skanowania i wszechstronności nowoczesnych instrumentów MS. Postępy w MS przyczyniają się do większej efektywności identyfikacji białek oraz dokładniejszej ilościowejanalizy 1,2,3,4,5. Dzięki ulepszonej instrumentacji MS badacze wymagają odpowiednio spójnej strategii przygotowania próbki na początku i na początku, zdolnej do ilościowego odzyskania białek o wysokiej czystości w minimalnym czasie na wszystkich etapach przepływu pracy 6,7,8,9,10,11 . Aby dokładnie odzwierciedlić status proteomu układu biologicznego, białka muszą być izolowane z natywnej matrycy próbki w sposób efektywny i obiektywny. W tym celu dołączenie denaturującego surfaktantu, takiego jak siarczan sodu dodecylowy (SDS), zapewnia efektywną ekstrakcję białek i rozpuszczanie12. Jednak SDS silnie zakłóca jonizację elektrosprayową, powodując poważne tłumienie sygnału MS, jeśli nie zostanie prawidłowo wyeliminowana13.

Dostępne są różne strategie zubożania SDS do późniejszych analiz proteomowych, takie jak zatrzymanie białek powyżej filtra granicznego masy cząsteczkowej zawartego w jednorazowych wkładach spinowych 14,15,16. Preferowana jest metoda wspomaganego przygotowywania próbek filtrem (FASP), ponieważ skutecznie zmniejsza poziom SDS poniżej 10 ppm, ułatwiając optymalne MS. Jednak odzyskiwanie białek przy użyciu FASP jest zmienne, co skłoniło do eksploracji innych technik. Podejścia chromatograficzne, które selektywnie wychwytują białko (lub surfaktant), ewoluowały w różne wygodne wkłady lub formaty oparte na kulkach 17,18,19,20,21. Biorąc pod uwagę te proste i (idealnie) spójne strategie oczyszczania białek, klasyczne podejście polegające na wytrącaniu białek za pomocą rozpuszczalników organicznych jest często pomijane jako obiecująca metoda izolacji białek. Chociaż wykazano, że wytrącanie rozpuszczalnika skutecznie wyczerpuje SDS poniżej krytycznych poziomów, odzyskiwanie białek jest od dawna zastrzeżonym problemem tego podejścia. Wiele grup zaobserwowało błąd odzysku białek, z nieakceptowalnie niskimi wydajnościami wydzielin w zależności od stężenia białka, masy cząsteczkowej i hydrofobiczności22,23. Ze względu na różnorodność protokołów opadów opisanych w literaturze, opracowano ustandaryzowane warunki opadowe. W 2013 roku Crowell i in. jako pierwsi opisali zależność siły jonowej od efektywności wydzielania białek w 80% acetonie24. Dla wszystkich badanych białek dodanie do 30 mM chlorku sodu okazało się niezbędne do maksymalizacji plonów (do 100% odzysku). Niedawno Nickerson i in. wykazali, że połączenie jeszcze wyższej siły jonowej (do 100 mM) z podwyższoną temperaturą (20 °C) podczas opadów acetonu dało niemal ilościowe odzyskanie w 2-5 min25. Zaobserwowano niewielki spadek odzysku białek o niskiej masie cząsteczkowej (LMW). Dlatego kolejny raport Baghalabadi i in. wykazał skuteczną zdolność odzyskiwania białek i peptydów LMW (≤5 kDa) poprzez połączenie konkretnych soli, szczególnie siarczanu cynku, z wyższym poziomem rozpuszczalnika organicznego (97% acetonu)26.

Choć udoskonalenie protokołu wytrącenia zapewnia bardziej wiarygodną strategię oczyszczania białek w proteomice opartej na rozsianym rozsianym rozstrzygnięciu (MS), sukces konwencjonalnego wytrącenia w dużej mierze zależy od techniki użytkownika. Głównym celem tych prac jest przedstawienie solidnej strategii wytrącenia, która ułatwi izolację granulki białkowej od zanieczyszczającego supernatantu. Opracowano jednorazowy wkład filtracyjny do eliminacji pipetowania poprzez izolację zagregowanego białka powyżej porowatego filtra membranowego PTFE27. Elementy interferujące z MS w supernatancie są skutecznie usuwane w krótkim, niskoobrotowym kroku wirowania. Jednorazowy wkład filtrujący oferuje także wymienny wkład SPE, który umożliwia późniejsze czyszczenie próbek po resolubilizacji i opcjonalnym trawieniu białek, przed zastosowaniem spektrometrii masowej.

Przedstawiono tutaj szereg zalecanych przepływów opadania proteomu, w tym modyfikowane protokoły acetonu i chloroformu/metanolu/wody28 , w formacie konwencjonalnym (na bazie fiolki) oraz półautomatycznym w jednorazowym wkładzie dwustanowym filtracji i ekstrakcji. Wyróżnione są uzyskane efekty odzyskiwania białek i efektywności wyczerpania SDS, wraz z pokryciem proteomu LC-MS/MS oddolnie nawigowanym, aby pokazać oczekiwany efekt każdego protokołu. Omówione są praktyczne zalety i wady każdego podejścia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Rozważania materialne i przygotowanie próbki

  1. Używaj wyłącznie rozpuszczalników o wysokiej czystości (aceton, chloroform, metanol) (>99,5%) oraz chemikaliów, wolnych od nadmiaru wilgoci.
  2. Przygotuj roztwory chlorku sodu i siarczanu cynku (1 M) w wodzie.
    UWAGA: Roztwory soli można przechowywać w nieskończoność w temperaturze pokojowej, pod warunkiem że są wolne od zanieczyszczeń lub rozwoju mikroorganizmów.
  3. Użyj najmniejszej fiolki mikrowirówki z polipropylenu (PP), wystarczającej do zatrzymania wymaganej objętości próbki oraz rozpuszczalników do wytrącenia się z wytrącenia.
  4. Upewnij się, że stężenie SDS w próbce wytrącanej nie przekracza 2% (w/v). Jeśli SDS jest wyższy, rozcieńcz próbkę wodą.
  5. Dla optymalnej efektywności wydzielania białka należy zapewnić stężenie białka w zakresie od 0,01 do 10 g/L.
    UWAGA: Optymalna masa opadów wynosi od 1 do 100 μg białka.
  6. Upewnij się, że wszystkie rozpuszczalniki i roztwory są wolne od cząstek stałych przed użyciem. Wykonaj albo filtrację (<0,5 μm), albo etap wirowania (10 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej), aby usunąć nierozpuszczone cząstki.
  7. Jeśli konieczna jest redukcja wiązań dwusiarczkowych i alkilacja, należy wykonać te kroki przed wytrąceniem białka. Nadmiar reagentów redukujących i alkilujących zostanie usunięty w procesie wytrącenia.
  8. Wytrącaj białka, wybierając i wykonując jeden z protokołów (kroki 2, 3, 4 lub 5).

2. Szybkie wytrącanie białek (na bazie fiolki) za pomocą acetonu

  1. Pipet 90 μL (bezcząstkowo-cząstkowo-białkowego) roztworu białka lub proteomu do rurki mikrowirówki PP. Następnie dodaj 10 μL 1 M wodnego NaCl.
    UWAGA: Jeśli stężenie jonowe ekstraktu proteomowego przekracza już 100 mM, nie jest potrzebna dodatkowa sól.
  2. Pipet 400 μL acetonu do próbki. Zakręć fiolkę i delikatnie stuknij w nią, aby połączyć rozpuszczalniki. Nie jest wymagane intensywne mieszanie.
    UWAGA: Objętość białka, soli i acetonu można zwiększać, o ile utrzymuje się względny stosunek każdego z nich.
  3. Pozwól fiolce wysiąść w temperaturze pokojowej, bez zakłóceń, przez co najmniej 2 minuty.
    UWAGA: Dłuższe inkubacje, w tym te w obniżonej temperaturze (np. konwencjonalne wytrącanie acetonu wykorzystuje nocne opady w zamrażarce), mogą prowadzić do powstawania większych (widocznych) zagregowanych cząstek białka (Rysunek 1A), które zazwyczaj nie poprawiają całkowitej regeneracji białka.
  4. Po inkubacji włóż próbki do wirówki, notując orientację fiolki. Wiruj przez minimum 2 minuty, w temperaturze pokojowej 10 000 x g lub wyższej.
  5. Odkręć fiolkę i delikatnie przelewając supernatant, powoli odwracając fiolkę do pojemnika na odpady. Dotknij odwróconej fiolki ręcznikiem papierowym, aby pobrać resztki rozpuszczalnika z fiolki.
    UWAGA: Rozpuszczalniki odpadowe należy zachować i wyrzucać zgodnie z odpowiednimi protokołami.
  6. W przypadku próbek zawierających SDS należy podać 400 μL świeżego acetonu, uważając, aby nie naruszyć granulki.
    UWAGA: Krok 2.6 jest opcjonalny.
    1. Natychmiast odwiruj próbkę (10 000 x g lub więcej przez 1 minutę w temperaturze pokojowej), umieszczając fiolkę w wirniku w tej samej orientacji, co początkowy obrót. Przelej rozpuszczalnik do mycia zgodnie z krokiem 2.5.
  7. Pozwól próbce całkowicie wyschnąć z otwartą nakręciłem (~1 min). Ponownie zakap fiolkę i przystąpi do rozpuszczania granulatów (krok 6).

3. Wytrącanie peptydów o niskiej masie cząsteczkowej (LMW) (ZnSO4 + aceton)

  1. Podaję 54 μL ekstraktu proteomowego do fiolki PP o pojemności 2 mL, a następnie dodaj 6 μL 1 M ZnSO4.
    UWAGA: Optymalne odzyskanie peptydów LMW (≤5 kDa) uzyskuje się przez dodanie acetonu do końcowych 97% objętości. Zakładając fiolkę PP o pojemności 2 mL, maksymalna początkowa objętość próbki wynosi 54 μL.
  2. Dodaj 1940 μL acetonu do końcowych 97% objętości. Delikatnie mieszaj i zostaw na blacie przez co najmniej 2 minuty.
  3. Wiruj (10 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej) i usuń supernatant, odwracając fiolkę, a następnie dotykając fiolki ręcznikiem papierowym.
  4. W przypadku próbek zawierających SDS należy podać 400 μL świeżego acetonu, uważając, aby nie naruszyć granulki.
    UWAGA: Krok 3.4 jest opcjonalny.
    1. Natychmiast odwiruj próbkę zgodnie z krokiem 3.3, umieszczając fiolkę w wirniku w tej samej orientacji co początkowy obrót. Przelej rozpuszczalnik do mycia zgodnie z krokiem 3.3.
  5. Ponownie rozpuszcza powstały suchy pellet w wodnym rozpuszczalniku z krótkim wirowaniem lub sonikacją (~5 min).

4. Wytrącanie białek za pomocą chloroformu/metanolu/wody (CMW)

  1. Podaj 100 μL roztworu białka lub proteomu do fiolki PP. Dodaj 400 μL metanolu, a następnie 100 μL chloroformu. Zakręć fiolkę i krótko wymieszać wir.
    UWAGA: Do opadów CMW preferowane są fiolki o pojemności 1,5 mL o wąskim dnie (Rysunek 2A).
    UWAGA: Rozpuszczalnik chloroformowy należy obchodzić się w odpowiednim okapie wentylacyjnym. Wszystkie rozpuszczalniki mające kontakt z chloroformem powinny być traktowane jako odpady halogenowane po utylizacji.
  2. Szybko wylej 300 μL wody bezpośrednio do środka fiolki. Zakręć fiolkę. Pozwól próbce stać na blacie stołu niezakłóconym przez 1 minutę.
    UWAGA: Rozwiązanie natychmiast będzie wyglądać na mętnobiałe. Unikaj mieszania fiolki po dodaniu wody.
  3. Umieść fiolkę z PP w wirówce i obróć przez minimum 5 minut (10 000 x g lub więcej w temperaturze pokojowej).
    UWAGA: Po odwirowaniu powstają dwie widoczne warstwy rozpuszczalnika (warstwa górna = metanol/woda; dolna = chloroform). Na granicy rozpuszczalnika powstaje stały pellet białkowy (Rysunek 2A).
  4. Używając dużej (1 mL) mikropipety i trzymając fiolkę pod kątem ~45°, usuń ~700 μL rozpuszczalnika z górnej warstwy w równym tempie.
  5. Użyj mniejszej (200 μL) mikropipety, aby kontynuować usuwanie górnej warstwy rozpuszczalnika z fiolki przechylonej o ~45°. Pipet w jednym ciągłym ruchu, aż górna warstwa rozpuszczalnika utworzy kulkę w fiolce.
  6. Dodaj 400 μL świeżego metanolu do fiolki próbki, nie naruszając granulki, rozpuszczalnik rozpuszczając wzdłuż krawędzi fiolki.
  7. Zakręć fiolkę. Połącz warstwy rozpuszczalnika, delikatnie kołysząc fiolkę, aby rozpuszczalniki się mieszały razem.
    UWAGA: Ważne jest, aby nie zakłócać granulek. Nie wiruj fiolki.
  8. Zwracając uwagę na orientację fiolki w wirniku, wiruj przez minimum 10 minut (10 000 x g w temperaturze pokojowej). Granulka białkowa przylega do dna fiolki (Rysunek 2B).
  9. Przechyl fiolkę pod kątem 45°, tak że granulka jest skierowana w dół. Umieść końcówkę pipety wzdłuż górnej krawędzi fiolki i usuń supernatant za pomocą końcówki mikropipety o pojemności 1 mL, powoli, ale w miarę ciągłości. Zachowaj ~20 μL rozpuszczalnika w fiolce.
  10. Przemyj granulki białkowe dla próbek zawierających SDS, powoli podawając 400 μl świeżego metanolu. Nie wiruj fiolki.
    1. Bezpośrednio przeprowadzić wirowanie (10 000 x g przez 2 minuty w temperaturze), umieszczając fiolkę w wirniku z taką samą orientacją, jak początkowy obrót.
  11. Usuń rozpuszczalnik, zgodnie z krokiem 4.9. Pozwól próbce wyschnąć na powietrzu w warstwie oparowej, aż resztki rozpuszczalnika wyparują.
  12. Zapoznaj się z zalecanymi procedurami resolubilizacji w kroku 6.

5. Wytrącanie białek z użyciem jednorazowego wkładu filtracyjnego

UWAGA: Każdy protokół wytrącenia na bazie rozpuszczalnika opisany w krokach 2-5 może być wykonany w dwustopniowym wkładzie filtracyjnym i ekstrakcyjnym (patrz Tabela materiałów).

  1. Po przymocowaniu korka do górnej wkładki filtracyjnej (Rysunek 3A) należy podać pożądaną objętość wyekstrahowanego proteomu, soli i rozpuszczalnika, zgodnie z jedną z trzech poniższych opcji.
    1. (Opcja 1) Do wytrącania białek acetonem połącz 90 μL białka lub roztworu proteomowego, 10 μL 1 M wodnego NaCl oraz 400 μL acetonu. Inkubuj przez minimum 2 minuty na blacie stołowym.
      UWAGA: Widoczny osad pojawi się dla skoncentrowanych próbek białek (1 g/L) (Rysunek 3B).
    2. (Opcja 2) Do wytrącania peptydów LMW połącz 15 μL próbki, 1,5 μL 1 M ZnSO4 oraz 485 μL acetonu. Inkubuj przez minimum 2 minuty na blacie stołowym.
      UWAGA: Stężenie soli 90 mM w próbce wodnej nie wpłynie na odzysk w porównaniu do zalecanych 100 mM w kroku 3.
    3. (Opcja 3) Do wytrącenia CMW należy dodać 50 μL ekstraktu proteomowego, 200 μL metanolu i 50 μL chloroformu. Zakręć fiolkę i krótko zawij w wirze, żeby połączyć.
      1. Szybko wylej 150 μL wody bezpośrednio do środka fiolki. Inkubuj przez 1 minutę na blacie.
  2. Wirówka przez 2 minuty w temperaturze 2500 x g w temperaturze pokojowej, z korkiem nadal podłączonym do wkładki filtracyjnej.
  3. Odwróć wkład, a następnie odkręć i wyjmij korek z podstawy wkładu.
  4. Włóż wkład filtracyjny do czystej fiolki i wróć do wirówki. Wiruj przez 3 minuty w temperaturze 500 x g w temperaturze pokojowej. Wyrzuć rozpuszczalnik przepływowy z dolnej fiolki.
    UWAGA: Jeśli w górnej części wkładu filtracyjnego pozostaje rozpuszczalnik, należy wrócić do wirówki i wykonać dodatkowy obrót.
  5. Przemyj granulat białkowy, dodając 400 μL acetonu do wkładu filtracyjnego (dla wytrącenia CMW, krok 5.1.3, dodaj 400 μL metanolu).
  6. Wirówka przez 3 minuty w temperaturze 500 x g w temperaturze pokojowej lub aż w górnej części wkładu nie pozostanie żaden rozpuszczalnik.
  7. Ponownie rozpuszczaj granulat wydzielający zgodnie z krokiem 6.

6. Resolubilizacja granulatu białkowego

  1. Membranę u podstawy wkładki filtracyjnej zwilż się, podawając 2-5 μL izopropanolu bezpośrednio do błony tuż przed opisanymi poniżej protokołami resolubilizacji.
  2. Stosuj jedną z poniższych metod resolubilizacyjnych.
    1. (Opcja 1) Do wkładu filtracyjnego dodaj co najmniej 20 μL buforu wodnego zawierającego ≥2% SDS. Cape i vortex energicznie (~1 min). Alternatywnie, sonikować (>10 min), aby rozproszyć granulki białkowe.
      1. Podgrzej próbkę w temperaturze 95 °C przez 5 minut). Powtórz proces mieszania po podgrzewaniu.
        UWAGA: Bufor ładowania żelu Laemmli może ponownie rozpuszczać granulki białkowe. Jednak próbki zawierające SDS są niekompatybilne z trawieniem trypsyny oraz z odwróconą fazą LC i MS.
    2. (Opcja 2) Przygotuj roztwór 80% kwasu mrówkowego (v/v) w wodzie. Wstępnie schłodzić roztwór kwasowy (-20 °C) oraz wkład filtracyjny zawierający wytrącone białko.
      1. Do wkładu należy podać 50 μL zimnego kwasu mrówkowego; Cap i Vortex przez 30 sekund. Wróć do zamrażarki (-20 °C) na 10 minut.
      2. Ponownie przełącz kartridż przez 30 sekund. Następnie powtórz cykl schładzania i mieszania jeszcze raz (10 min, -20 °C, 30 s wiru).
      3. Dodaj wodę do końcowych 500 μL, rozcieńczając kwas mrówkowy do 8%.
        UWAGA: Protokół z zimnym kwasem mrówkowym jest niezgodny z późniejszym trawieniem trypsyny, ale jest kompatybilny z LC-MS.
    3. (Opcja 3) Dodaj 50 μL świeżo przygotowanej 8 M mocznika w wodzie do wkładu filtracyjnego. Sonikat przez 30 minut.
      1. Pozwól wkładowi inkubować na blacie stołowym przez 1 godzinę (do końca na noc).
      2. Rozcieńcz mocznik o wielkości 8 m co najmniej 5-krotnie wodą lub odpowiednim buforem.
        UWAGA: Po rozcieńczeniu protokół rozpuszczalności mocznika jest kompatybilny z dalszym trawieniem trypsyny, a także z LC-MS.

7. Trawienie białek

  1. Do analizy SM od dołu do góry poddaj ponownie rozpuszczone białka trawieniu enzymatycznemu przy użyciu jednej z dwóch wymienionych poniżej metod.
    1. (Opcja 1) Do resolubilizacji kwasem mrówkowym należy zmniejszyć początkową objętość kwasu mrówkowego o 80% w kroku 6.2.2.1 do 25 μL. W kroku 6.2.2.3 użyj 375 μL wody, aby rozcieńczyć kwas mrówkowy do 5% (v/v).
    2. Pepsynę podawaj do wkładu w stosunku białka do enzymu 50:1. Z zatyczką podłączoną do wkładu filtracyjnego, inkubuj próbkę przez noc w temperaturze pokojowej.
  2. (Opcja 2) Aby rozpuścić mocznik, należy ustalić pH w zakresie od 8 do 8,3, dodając 100 mM Trisochloru lub wodorowęglanu amonu w kroku 6.2.3.2.
    1. Dodaj trypsynę w stosunku masy białka do enzymu wynoszącym 50:1. Z korkiem przymocowanym do wkładu inkubuj próbkę przez noc w ciepłej kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C.
    2. Zakończ trawienie poprzez zakwaszenie roztworu 10% TFA do ostatecznego 1%.
  3. Odzyskaj białko strawione przez pepsynę lub trypsynę, wyjmując korek z podstawy filtra i wirując wkład umieszczony w czystej fiolce (2 min, 5000 x g, temperatura pokojowa).

8. Czyszczenie SPE

UWAGA: W przypadku dodatkowego odsolonienia próbki po strawieniu lub wymianie rozpuszczalnika, próbka może być poddana oczyszczaniu w odwróconej fazie, jak opisano.

  1. Wkład SPE (patrz Tabela materiałów) zapełnij przez przepuszczenie 300 μL metanolu (2 min, 400 x g), a następnie 300 μL 5% acetonitrylu/0,1% TFA (2 min, 400 x g).
  2. Podłącz wkład SPE z zaparowanym wkładem do podstawy wkładu filtracyjnego zawierającego ponownie rozpuszczone lub strawione białko.
  3. Przekręć białko przez wkład SPE (5 min, 800 x g w temperaturze pokojowej). Jeśli rozpuszczalnik pozostaje w górnej wkładce, należy ją zwrócić do wirówki i powtórzyć obrót.
    UWAGA: Ponowne przepuszczenie próbki przez wkład SPE może poprawić proces odzysku.
  4. Dodaj 300 μL 5% acetonitrylu/0,1% TFA w wodzie do wkładu. Do prania przepuszczaj wkład SPE (2 min, 2000 x g). Zrezygnuj z przepływu.
  5. W przypadku białek LMW lub strawionych peptydów eluuj próbkę, przepływając 300 μL 50% acetonitrylu/0,1% TFA (5 min, 2500 x g).
  6. W przypadku białek nienaruszonych należy przejść krok 8.5 z dodatkowym krokiem elucijnym, używając 300 μL 75% acetonitrylu/0,1% TFA. Połącz oba powstałe fragmenty.
    UWAGA: Krok 8.6 jest opcjonalny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 4 podsumowuje oczekiwane wyczerpanie SDS po wytrąceniu białek z fiolki lub wkładów w jednorazowym wkładzie filtracyjnym z użyciem acetonu. Konwencjonalna inkubacja nocna (-20 °C) w acetonie jest porównywana z protokołem szybkiego wytrącania acetonu w temperaturze pokojowej (krok 2), a także z wytrącaniem CMW (krok 4). Pozostałe SDS zostało zmierzone ilościowo za pomocą testu aktywnych substancji methylenowych (MBAS)29. Krótko mówiąc, próbkę 100 μL połączono z ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optymalna charakterystyka SM osiąga się, gdy resztkowy SDS jest wyczerpany poniżej 10 ppm. Podczas gdy alternatywne podejścia, takie jak FASP i trawienie na kulkach, oferują ilościowe wyczerpanie SDS przy zmiennej odzysku 31,32,33, głównym celem wydzielania jest jednoczesne zmaksymalizowanie czystości i wydajności. Zależy to od skutecznej izolacji supernatantu (zawierającego SDS) bez zakłócania granulki białkowej. W przypadku wy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laboratorium Doucette opracowało i opatentowało ProTrap XG użyty w tym badaniu. AAD jest także współzałożycielem Proteoform Scientific, która skomercjalizowała wkład do przygotowania próbek.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te zostały sfinansowane przez Kanadyjską Radę ds. Nauk Przyrodniczych i Inżynierii. Autorzy dziękują Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Kanada) oraz SPARC BioCentre (Molecular Analysis) w Hospital for Sick Children (Toronto, Kanada) za ich wkład w pozyskiwanie danych o SM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AcetonFisher ScientificAC177170010≤ 0,002 % aldehydu
AcetonitrylFisher ScientificA998-4Klasa HPLC
Wodorowęglan amonuMillipore SigmaA6141-1KGsolidny
Merkaptoetanol beta-betaMillipore SigmaM3148-25MLStopień biologii molekularnej
Błękit bromofenolowyMillipore SigmaB8026-5GBromofenol z niebieskim sodem
ChloroformFisher ScientificC298-400Chloroform
Kwas mrówkowyHoneywell56302Dodatek Eluent dla LC-MS
Spektrometr mas Fusion LumosThermoFisher Scientificdo analizy standardowej mieszaniny białek
GlicerolMillipore Sigma356352-1L-MW biologii molekularnej > 99%
IzopropanolFisher ScientificA4641Klasa HPLC
MetanolFisher ScientificA452SK-4Klasa HPLC
MikrowirówkaFisher Scientific75-400-102do 21 000 xg
Rurka mikrowirówki (1,5 mL)Fisher Scientific05-408-130Zwężane dno
Rurka mikrowirówkowa                 (2 mL)Fisher Scientific02-681-321zaokrąglone dno
Wskazówki do mikropipet;               (0,1-10 μ L)Fisher Scientific21-197-28Uniwersalna końcówka pipety, niesterylna
Wskazówki do mikropipet;               (1-200 μ L)Fisher Scientific07-200-302Uniwersalna końcówka pipety, niesterylna
Wskazówki do mikropipet;             (200-1000 i mu; L)Fisher Scientific07-200-303Uniwersalna końcówka pipety, niesterylna
MikropipetyFisher Scientific13-710-903Pakiet Micropipet Trio
PepsynaMillipore SigmaP0525000Liofilizowany proszek,                     >3200 jednostek/mg
ProTrap XGProteoform ScientificPXG-000250 kompletnych jednostek na pudełko
Chlorek soduMillipore SigmaS9888-1KGOdczynnik ACS, >99%
Siarczan dodecylosiarczan soduThermoFisher Scientific28312Sproszkowany stały
Spektrometr mas timsTOF ProBrukerdo analizy ekstraktu z proteomu wątroby
Kwas trifluorooctowyThermoFisher ScientificL06374. AP99%
TrisFisher ScientificBP152-500Stopień biologii molekularnej
TrypsynaMillipore Sigma9002-07-7Z trzustki bydła, leczonej TPCK
MocznikBio-Rad1610731solidny
Woda (dejonizowana)System oczyszczania wody Sartorius Arium Mini76307-662Typ 1 ultrapure (18,2 MΩ cm)
Siarczan cynkuMillipore Sigma307491-100Gsolidny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kilpatrick, L. E., Kilpatrick, E. L. Optimizing high-resolution mass spectrometry for the identification of low-abundance post-translational modifications of intact proteins. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3255-3265 (2017).
  2. Scheffler, K., Viner, R., Damoc, E. High resolution top-down experimental strategies on the Orbitrap platform. Journal of Proteomics. 175, 42-55 (2018).
  3. Quaranta, A., et al. N -Glycosylation profiling of intact target proteins by high-resolution mass spectrometry (MS) and glycan analysis using ion mobility-MS/MS. Analyst. 145 (5), 1737-1748 (2020).
  4. Van Der Burgt, Y. E. M., et al. Structural analysis of monoclonal antibodies by ultrahigh resolution MALDI in-source decay FT-ICR mass spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (3), 2079-2085 (2019).
  5. Anderson, L. C., et al. Identification and characterization of human proteoforms by top-down LC-21 Tesla FT-ICR mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (2), 1087-1096 (2017).
  6. Nickerson, J. L., et al. Recent advances in top-down proteome sample processing ahead of MS analysis. Mass Spectrometry Reviews. , (2021).
  7. Kelly, R. T. Single-cell Proteomics: Progress and Prospects. Molecular and Cellular Proteomics. 19 (11), 1739-1748 (2020).
  8. Alexovič, M., Sabo, J., Longuespée, R. Microproteomic sample preparation. Proteomics. 21 (9), 2000318(2021).
  9. Shishkova, E., Coon, J. J. Rapid preparation of human blood plasma for bottom-up proteomics analysis. STAR Protocols. 2 (4), 100856(2021).
  10. Duong, V. A., Park, J. M., Lee, H. Review of three-dimensional liquid chromatography platforms for bottom-up proteomics. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1524(2020).
  11. Gan, G., et al. SCASP: A simple and robust SDS-aided sample preparation method for proteomic research. Molecular and Cellular Proteomics. 20, 100051(2021).
  12. Kachuk, C., Doucette, A. A. The benefits (and misfortunes) of SDS in top-down proteomics. Journal of Proteomics. 175, 75-86 (2018).
  13. Rundlett, K. L., Armstrong, D. W. Mechanism of signal suppression by anionic surfactants in capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 68 (19), 3493-3497 (1996).
  14. Wis, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
  15. Ni, M., et al. Modified filter-aided sample preparation (FASP) method increases peptide and protein identifications for shotgun proteomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 31 (2), 171-178 (2017).
  16. Zhao, Q., et al. imFASP: An integrated approach combining in-situ filter-aided sample pretreatment with microwave-assisted protein digestion for fast and efficient proteome sample preparation. Analytica Chimica Acta. 912, 58-64 (2016).
  17. Kanshin, E., et al. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology. Molecular Systems Biology. 10 (10), 757(2014).
  18. Hughes, C. S., et al. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
  19. Dagley, L. F., Infusini, G., Larsen, R. H., Sandow, J. J., Webb, A. I. Universal solid-phase protein preparation (USP3) for bottom-up and top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (7), 2915-2924 (2019).
  20. Hengel, S. M., et al. Evaluation of SDS depletion using an affinity spin column and IMS-MS detection. Proteomics. 12 (21), 3138-3142 (2012).
  21. Zougman, A., Selby, P. J., Banks, R. E. Suspension trapping (STrap) sample preparation method for bottom-up proteomics analysis. PROTEOMICS. 14 (9), 1006-1010 (2014).
  22. Thongboonkerd, V., McLeish, K. R., Arthur, J. M., Klein, J. B. Proteomic analysis of normal human urinary proteins isolated by acetone precipitation or ultracentrifugation. Kidney International. 62 (4), 1461-1469 (2002).
  23. Klont, F., et al. Assessment of sample preparation bias in mass spectrometry-based proteomics. Analytical Chemistry. 90 (8), 5405-5413 (2018).
  24. Crowell, A. M. J., Wall, M. J., Doucette, A. A. Maximizing recovery of water-soluble proteins through acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 796, 48-54 (2013).
  25. Nickerson, J. L., Doucette, A. A. Rapid and quantitative protein precipitation for proteome analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 19 (5), 2035-2042 (2020).
  26. Baghalabadi, V., Doucette, A. A. Mass spectrometry profiling of low molecular weight proteins and peptides isolated by acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 1138, 38-48 (2020).
  27. Crowell, A. M. J., MacLellan, D. L., Doucette, A. A. A two-stage spin cartridge for integrated protein precipitation, digestion and SDS removal in a comparative bottom-up proteomics workflow. Journal of Proteomics. 118, 140-150 (2015).
  28. Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
  29. Arand, M., Friedberg, T., Oesch, F. Colorimetric quantitation of trace amounts of sodium lauryl sulfate in the presence of nucleic acids and proteins. Analytical Biochemistry. 207 (1), 73-75 (1992).
  30. Tukey, J. W. Exploratory data analysis. Biometrics. 33, at http://www.jstor.org/stable/2529486 768(1977).
  31. Ludwig, K. R., Schroll, M. M., Hummon, A. B. Comparison of in-solution, FASP, and S-Trap based digestion methods for bottom-up proteomic studies. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2480-2490 (2018).
  32. Sielaff, M., et al. Evaluation of FASP, SP3, and iST protocols for proteomic sample preparation in the low microgram range. Journal of Proteome Research. 16 (11), 4060-4072 (2017).
  33. Supasri, K. M., et al. Evaluation of filter, paramagnetic, and STAGETips aided workflows for proteome profiling of symbiodiniaceae. Processes. 9 (6), 983(2021).
  34. Botelho, D., et al. Top-down and bottom-up proteomics of SDS-containing solutions following mass-based separation. Journal of Proteome Research. 9 (6), 2863-2870 (2010).
  35. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).
  36. Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. Journal of Chromatography A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
  37. Bryzgunova, O., et al. A reliable method to concentrate circulating DNA. Analytical Biochemistry. 408 (2), 354-356 (2011).
  38. Asakura, T., Adachi, K., Schwartz, E. Stabilizing effect of various organic solvents on protein. Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6423-6425 (1978).
  39. Loo, J. A., Loo, R. R. O., Udseth, H. R., Edmonds, C. G., Smith, R. D. Solvent-induced conformational changes of polypeptides probed by electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (3), 101-105 (1991).
  40. Simpson, D. M., Beynon, R. J. Acetone precipitation of proteins and the modification of peptides. Journal of Proteome Research. 9 (1), 444-450 (2010).
  41. Güray, M. Z., Zheng, S., Doucette, A. A. Mass spectrometry of intact proteins reveals +98 u chemical artifacts following precipitation in acetone. Journal of Proteome Research. 16 (2), 889-897 (2017).
  42. Doucette, A. A., Vieira, D. B., Orton, D. J., Wall, M. J. Resolubilization of precipitated intact membrane proteins with cold formic acid for analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6001-6012 (2014).
  43. Beavis, R. C., Chait, B. T. Rapid, sensitive analysis of protein mixtures by mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (17), 6873-6877 (1992).
  44. Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's β-Amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. Journal of Neurochemistry. 54 (6), 2050-2056 (1990).
  45. Vuckovic, D., Dagley, L. F., Purcell, A. W., Emili, A. Membrane proteomics by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Analytical approaches and challenges. Proteomics. 13 (3-4), 404-423 (2013).
  46. Smith, L. M., et al. The human proteoform project: Defining the human proteome. Science Advances. 7 (46), (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wytr canie rozpuszczalnikami organicznymiwytr canie acetonemwytr canie chloroformem i metanolemkartrid do wirowaniausuwanie SDSproteomika bottom upodzysk bia ek

Powiązane artykuły