Artykuł metodologiczny

Standaryzacja i utrzymanie 3D kultur organoidowych wątroby i jelit psów do wykorzystania w badaniach biomedycznych

8.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63515

⸱

31 stycznia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, College of Veterinary Medicine, Iowa State University, 2Department of Veterinary Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Iowa State University, 33D Health Solutions Inc., 4Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano eksperymentalne metody pobierania dorosłych komórek macierzystych z tkanek jelitowych i wątrobowych psów w celu stworzenia kultur organoidowych 3D. Ponadto omówiono techniki laboratoryjne zapewniające stały wzrost i standardowe procedury operacyjne w celu zbioru, biobanku i ożywienia kultur organoidów jelitowych i wątrobowych psów.

Streszczenie

Psy rozwijają złożone, wieloczynnikowe choroby analogiczne do ludzkich, w tym choroby zapalne, choroby metaboliczne i raka. W związku z tym reprezentują one odpowiednie duże modele zwierzęce o potencjale translacyjnym dla medycyny ludzkiej. Organoidy to trójwymiarowe (3D), samoorganizujące się struktury pochodzące z komórek macierzystych, które naśladują mikroanatomię i fizjologię narządu, z którego pochodzą. Te translacyjne modele in vitro mogą być wykorzystywane do zastosowań związanych z przepuszczalnością i odkrywaniem leków, oceną toksykologiczną oraz do zapewnienia mechanistycznego zrozumienia patofizjologii wieloczynnikowych chorób przewlekłych. Co więcej, organoidy psów mogą poprawić jakość życia psów towarzyszących, dostarczając informacji w różnych obszarach badań weterynaryjnych i ułatwiając spersonalizowane zastosowania lecznicze w medycynie weterynaryjnej. Niewielka grupa dawców może stworzyć biobank próbek organoidów, zmniejszając potrzebę ciągłego pobierania tkanek, ponieważ linie komórek organoidowych mogą być hodowane w nieskończoność. W niniejszym artykule przedstawiono trzy protokoły, które koncentrują się na hodowli organoidów jelitowych i wątrobowych psów pochodzących z dorosłych komórek macierzystych. Protokół izolacji organoidów psów określa metody przetwarzania tkanek i osadzania izolatu komórkowego w macierzy podporowej (rozpuszczona macierz błony zewnątrzkomórkowej). Protokół konserwacji organoidów u psów opisuje wzrost i konserwację organoidów, w tym czyszczenie i pasażowanie wraz z odpowiednim czasem na ekspansję. Protokół Organoid Harvesting and Biobanking Protocol opisuje sposoby ekstrakcji, zamrażania i przechowywania organoidów do dalszej analizy.

Wprowadzenie

Gryzonie są najczęściej wykorzystywanym modelem zwierzęcym do badań biomedycznych i translacyjnych1. Są one wyjątkowo przydatne do badania podstawowej molekularnej patogenezy chorób, chociaż ich kliniczne znaczenie dla przewlekłych chorób wieloczynnikowych zostało ostatnio zakwestionowane2. Model psa ma kilka zalet w porównaniu z gryzoniami3,4. Psy i ludzie mają podobieństwa w metabolomice i mikrobiomie jelitowym, które rozwinęły się w wyniku spożywania diety człowieka w różnych okresach ich udomowienia5,6,7. Podobieństwa między anatomią i fizjologią przewodu pokarmowego psów i ludzi to kolejny z przykładów8.

Dodatkowo, psy często dzielą podobne środowisko i styl życia ze swoimi właścicielami9. Dłuższa długość życia psów w porównaniu z gryzoniami pozwala na naturalny rozwój wielu chorób przewlekłych10. Nieswoiste zapalenie jelit lub zespół metaboliczny to przykłady wieloczynnikowych chorób przewlekłych, które mają istotne podobieństwa między ludźmi a psami11,12. Badania przedkliniczne psów z udziałem psów z naturalnie występującymi chorobami mogą generować bardziej wiarygodne dane niż te uzyskane z modeli gryzoni13. Jednakże, aby zminimalizować wykorzystanie badań na żywych zwierzętach i zachować zgodność z zasadami 3R (Reduce, Refine, Replace)14, pojawiły się alternatywy dla badań in vivo z wykorzystaniem organoidów 3D in vitro psów15.

Organoidy to samoorganizujące się struktury 3D pochodzące z komórek macierzystych, które podsumowują fizjologię i mikroanatomię swoich oryginalnych organów16,17. Technologia ta została po raz pierwszy opisana przez Sato i in. w 2009 roku17 i pozwoliła na bardziej translacyjne badania in vitro na liniach komórek nabłonkowych, niż było to wcześniej możliwe przy użyciu hodowli komórek nowotworowych 2D18,19,20. Organoidy są przydatne w modelach in vitro w wielu dyscyplinach biomedycznych, takich jak przedkliniczne badania toksykologiczne21,22,23, absorpcja lub metabolizm24,25,26,27,28, a także w spersonalizowanych podejściach medycznych29,30,31. Udana hodowla organoidów jelitowych psów została opisana po raz pierwszy w 201912, podczas gdy organoidy wątrobowe pochodzące od psa zostały po raz pierwszy opisane przez Nantasanti i in. w 201532. Od tego czasu organoidy psów są z powodzeniem stosowane w badaniach nad przewlekłymi enteropatiami psów, guzami podścieliskowymi przewodu pokarmowego, gruczolakorakiem jelita grubego12 i chorobą Wilsona33,34.

Podczas gdy dorosłe komórki macierzyste mogą być pozyskiwane metodą sekcji zwłok, technologia organoidów nie zawsze wymaga poświęcania zwierząt. Biopsje endoskopowe i laparoskopowe, a nawet aspiraty cienkoigłowe narządów35, są realnym źródłem dorosłych komórek macierzystych do izolacji organoidów nabłonkowych12. Powszechne stosowanie takich nieinwazyjnych technik w praktyce weterynaryjnej ułatwia opcje badań translacyjnych odwrotnych (translacja informacji z weterynaryjnej praktyki klinicznej na praktykę kliniczną u ludzi i odwrotnie)15. Dalszy postęp technologii organoidów można zapewnić poprzez standaryzację metod hodowli organoidów i konserwacji. Przedstawiony tutaj protokół organoidowy jest częściowo oparty na wcześniej opublikowanej pracy Saxeny i wsp. z 201536, a metody zostały dostosowane do specyfiki hodowli organoidów jelitowych i wątrobowych psów. Ogólny przebieg procesów protokołów organoidowych psów jest przedstawiony na Rysunek 1.

Protokół Izolacji Organoidów Psów wprowadza metody pobierania próbek z biopsji endoskopowych, laparoskopowych i chirurgicznych, a także sekcji zwłok. Przedstawiono w nim wstępną obróbkę próbek tkanek oraz metodologie stosowane do transportu do laboratorium. Materiały i odczynniki potrzebne do izolacji organoidów podsumowano w sekcji "Przygotowanie do izolacji". Szczegółowo opisano proces izolacji dorosłych komórek macierzystych z próbek tkanek. Na koniec omówiono proces posiewania organoidów w struktury przypominające kopułę przy użyciu rozpuszczonej macierzy błony zewnątrzkomórkowej.

Drugi protokół, Protokół Utrzymania Organoidów Psów, opisuje metody dokumentowania i hodowli organoidów. Zmiany w mediach i ich częstotliwość są omówione w tej sekcji. Ponadto opisano procedury laboratoryjne, takie jak pasażowanie i czyszczenie kultur komórkowych, które są niezbędne do zapewnienia pomyślnego utrzymania organoidów 3D psów. Odpowiednie pasażowanie jest krytycznym krokiem protokołu, a możliwe korekty i rozwiązywanie problemów związanych z tym krokiem omówiono w dalszej części manuskryptu.

Ostatnim protokołem jest Protokół Zbierania Organoidów Psów i Biobankowania zawierający metody przygotowania w pełni rozwiniętych organoidów do zatapiania parafiny i konserwacji RNA. Opisano tu również metody biobankowania próbek organoidów w magazynie ciekłego azotu. Na koniec omówiono sposoby rozmrażania zamrożonych próbek i wspomagania ich wzrostu.

Podsumowując, ten artykuł ma na celu zapewnienie spójnych procedur hodowli organoidów u psów poprzez standaryzację protokołów międzylaboratoryjnych. W ten sposób manuskrypt ma na celu ułatwienie odtwarzalności danych pochodzących z modeli organoidów psów w celu zwiększenia ich znaczenia w translacyjnych badaniach biomedycznych.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Przebieg pracy protokołów organoidowych u psów. Protokół izolacji organoidów psów opisuje przygotowanie materiałów potrzebnych do izolacji organoidów, pobranie próbki tkanki (za pomocą sekcji zwłok, biopsji endoskopowych, laparoskopowych i chirurgicznych) oraz wytyczne dotyczące dysocjacji i posiewu komórek populacji komórkowej. Protokół konserwacji organoidów u psów omawia czyszczenie i pasażowanie kultur organoidów. Protokół Pozyskiwania i Biobankowania Organoidów omawia przygotowanie próbek organoidów do zatapiania w parafinie i dalszą charakterystykę organoidów. Omówiono również metody biobankowania kultur organoidów i ich przywracania z przechowywania w ciekłym azocie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

Badania zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Stanowego Iowa (IACUC-19-337; IACUC-18-065; IACUC-19-017).

UWAGA: Poniższa sekcja (kroki 1-3) opisuje Protokół Izolacji Organoidów Psów.

1. Przygotowanie do izolacji

  1. Probówki transportowe: Przed izolacją organoidów (zwykle 24 godziny wcześniej) napełnij stożkową probówkę o pojemności 50 ml 10 ml zmodyfikowanej mieszanki Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 firmy Dulbecco (Advanced DMEM/F12) wzbogaconej 0,2 ml Pen Strep.
  2. Do biopsji laparoskopowej, naciętej lub wycinającej przygotuj trzy dodatkowe stożkowe probówki o pojemności 50 ml. Napełnić te probówki 10 ml kompletnego roztworu chelatującego (1x CCS; patrz Tabela 1).
    UWAGA: W kroku 1.2 2 mM N-acetylocysteiny (NAC) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) można również użyć jako tradycyjnego roztworu stosowanego do pobierania komórek macierzystych. Nie zaobserwowano różnic w przypadku stosowania 1x CCS lub NAC w PBS. Oba roztwory są dodawane w celu uwolnienia komórek w roztworze.
  3. Utrzymuj probówki w temperaturze 4 °C przez noc i transportuj probówki na lodzie do końca protokołu.
  4. Przygotuj pięć probówek wirówkowych o pojemności 15 ml z 5 ml 1x CCS, jedną probówkę wirówkową o pojemności 15 ml z 3 ml 1x CCS, jedną pustą probówkę wirówkową o pojemności 15 ml (probówka supernatantu) i jedną probówkę wirówkową o pojemności 15 ml z 5 ml 1x CCS i 2 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
    UWAGA: Powyższe można przygotować przed dniem izolacji, jeśli przetwarzanych będzie wiele próbek. Aby to zilustrować, zobacz układ rurki izolacyjnej w Rysunek 2.
  5. W dniu izolacji przygotuj szalkę Petriego, skalpel, wiaderko na lód i zimny Advanced DMEM/F12 w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Umieścić wymaganą liczbę 24-dołkowych płytek do hodowli komórkowych w inkubatorze (37 °C; 5% atmosfery CO2 ) w celu wstępnego ogrzania.
  6. Umieść rozpuszczoną macierz błony zewnątrzkomórkowej (ECM; patrz tabela materiałów) na lodzie, aby rozpocząć rozmrażanie.
    UWAGA: Zanurzenie w lodzie chroni przed szybkim rozmrożeniem i pomaga uniknąć zestalenia. Pudełko z końcówkami do pipet można umieścić w zamrażarce, aby pomóc w powlekaniu rozpuszczonego ECM.
  7. Schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C.
  8. Przenieść kompletne podłoża z czynnikami wzrostu "CMGF+" lub "pożywkami organoidowymi" (zob. skład w tabeli 1) z zamrażarki/lodówki do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Jeśli to możliwe, unikaj bezpośredniej ekspozycji na światło.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Układ rurki izolacyjnej. Zalecana konfiguracja do pobierania tkanek obejmuje 10 ml Advanced DMEM/F12 i 0,2 ml Pen Strep w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Dodatkowo do biopsji chirurgicznej lub sekcji zwłok wymagane są trzy probówki o pojemności 50 ml wypełnione 10 ml 1x CCS. Zalecany układ probówek dla etapów izolacji obejmuje pięć probówek zawierających 5 ml 1x CCS do stosowania podczas etapów mycia CCS. Pierwsza probówka jest używana jako probówka zawierająca zmieloną tkankę, a pozostałe probówki służą jako zbiorniki 1x CCS, które należy dodać do pierwszej probówki. Szósta probówka zawiera 3 ml 1x CCS do przepłukiwania pozostałej tkanki z probówki z próbką podczas przenoszenia na płytkę 6-dołkową. Te sześć probówek zostanie użytych przed etapem inkubacji EDTA. Probówka z 5 ml 1x CCS i 2 ml FBS służy jako probówka na próbkę po inkubacji EDTA, a supernatant z tej probówki jest przenoszony z komórkami macierzystymi do pustej probówki na resztę izolacji. Utrzymać probówki w temperaturze 4 °C przed rozpoczęciem izolacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Pobieranie tkanek

  1. Biopsje endoskopowe jelita i biopsje laparoskopowe (średnica 2,8 mm) można uzyskać za pomocą dużych kleszczy biopsyjnych. Zbierz co najmniej osiem próbek endoskopowych na każde miejsce jelita.
  2. Pobrać próbki bezpośrednio do probówek transportowych i umieścić je na lodzie.
  3. W przypadku biopsji chirurgicznej i sekcji zwłok należy pobrać fragmenty tkanek o wymiarach 0,5 cm x 0,5 cm i umieścić je w pierwszej probówce 1x CCS.
    UWAGA: W przypadku biopsji jelita należy usunąć pozostałą zawartość jelita i zeskrobać warstwę błony śluzowej skalpelem, aby usunąć kosmki. Jeśli próbek jest dużo, można pobrać dodatkowe biopsje w kriowiach zawierających odczynnik do przechowywania RNA (1 ml) lub zatopioną parafinę w celu przyszłego porównania organoidów i ich tkanki, z której pochodzą. W przypadku pobierania biopsji do analizy TEM nie należy zeskrobywać kosmków i przechowywać próbkę w środku konserwującym (3% paraformaldehydu i 3% aldehydu glutarowego w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)) i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Potrząsaj energicznie 1x probówką CCS przez ~30 s, a następnie przenieś próbkę do nowej 1x probówki CCS za pomocą kleszczy. Powtórz ten proces dwukrotnie.
  5. Przenieś próbkę z ostatniej probówki 1x CCS do probówki transportowej (Advanced DMEM/F12 + Pen Strep) i przynieś próbkę z powrotem do laboratorium.
    UWAGA: Próbki poddane takiej obróbce mogą być również wysyłane w nocy na lodzie (nie należy wysyłać na suchym lodzie).

3. Izolacja organoidów

UWAGA: Wykonaj izolację przy użyciu technik aseptycznych w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Zobacz Rysunek 3 dla przebiegu procesu izolacji organoidów psów.

  1. Potrząsać próbką tkanki w probówce transportowej przez ~30 s i usunąć nadmiar supernatantu, aż w probówce pozostanie 0,5 ml poprzez powolne pipetowanie w pobliżu powierzchni płynu. Pamiętaj, aby nie wyrzucać żadnej chusteczki.
  2. Przenieść tkankę i pozostały supernatant na sterylną szalkę Petriego. Za pomocą jednorazowego skalpela (lub wysterylizowanych kleszczy i nożyczek) pokrój i zmiel tkankę na mniejsze kawałki (wielkość 1mm2) o konsystencji zacieru przez około 5 minut.
  3. Odpipetować zmieloną tkankę z płynem z płytki Petriego do pierwszej probówki CCS. Dodać 2 ml Advanced DMEM/F12 do szalki Petriego, przepłukać pozostałą tkankę i przenieść do pierwszej probówki CCS.
  4. Wiruj rurkę 1x CCS przez 5 s około pięć razy. Pozwolić, aby biopsje osiadły na dnie probówki o pojemności 15 ml (około 1 minuty) i usunąć supernatant do momentu, aż w probówce pozostanie 5 ml. Przenieś 1x CCS z nowej probówki do probówki na próbkę.
  5. Powtórz poprzedni krok dla następnych dwóch probówek. W ostatnich dwóch płukaniach usunąć supernatant do 3 ml pozostałego w probówce.
  6. Przenieś biopsje i 1x CCS z probówki z próbką do jednego dołka na płytce 6-dołkowej. Następnie dodaj 3 ml 1x CCS do probówki z próbką, delikatnie zamieszaj, aby zebrać pozostałą tkankę i przenieś do tego samego dołka płytki.
  7. Dodaj 150 μl 0,5 M EDTA (aby uzyskać całkowitą objętość 6,15 ml w studzience). Umieścić 6-dołkową płytkę na mieszalniku nutacyjnym o temperaturze 20° i prędkości obrotowej 24 obr./min w temperaturze 4 °C. Próbki wątroby inkubować przez 10 minut, a próbki jelitowe przez 1 godzinę na ruchomym kołysku.
  8. Przetransportować 6-dołkową płytkę z powrotem do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Przenieś zmieloną tkankę i płyn do 1x probówki CCS/FBS i pozwól tkankom się uspokoić. Przetransportować supernatant (ta część zawiera teraz wolne komórki macierzyste) i około 0,2 ml górnej części tkanki do pustej probówki.
  9. Odwirować probówkę z próbką (700 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C). Komórki macierzyste są teraz granulowane wraz z tkanką mieloną. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant, aby nie naruszyć osadu.
  10. Zawiesić osad w Advanced DMEM/F12 i ponownie obrócić probówkę (700 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C). Odessać supernatant i nie naruszać osadu.
  11. Oblicz objętość rozpuszczonego ECM potrzebną do wysiewu zdysocjowanych komórek i tkanki. Użyj 30 μl rozpuszczonego ECM na dołek 24-dołkowej płytki, aby uzyskać odpowiednią gęstość wysiewu.
    UWAGA: Umieść próbkę po izolacji w 4 do 6 dołkach 24-dołkowej płytki (tj. w oparciu o ilość zmielonej tkanki w próbce).
  12. Dodaj obliczoną objętość rozpuszczonego ECM do probówki z próbką i powoli pipetuj w górę iw dół, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków. Zasiej zawiesinę w środku studzienek, tak aby rozpuszczony ECM mógł utworzyć strukturę przypominającą kopułę.
    UWAGA: Używanie końcówek do pipet z zamrażarki o temperaturze -20 °C pomaga w powlekaniu rozpuszczonego ECM. Jeśli kawałki tkanki są większe niż końcówka pipety P200, użyj szerokich zimnych końcówek lub odetnij zimne końcówki P1000, aby pomóc w powlekaniu. O ile to możliwe, próbkę z rozpuszczonym ECM należy przechowywać na lodzie.
  13. Przetransportować płytkę do inkubatora (37 °C; 5% atmosfery CO2 ) i pozostawić rozpuszczony ECM do zestalenia się przez ~30 min.
  14. Wymieszaj inhibitor ROCK i GSK3β w CMGF+ (stężenia w tabeli 1). Dodaj 500 μl tego roztworu (CMGF+ R/G) do każdej studzienki. Umieścić płytkę w inkubatorze (37 °C; 5% atmosferyCO2
    15. ).

figure-protocol-2
Rysunek 3: Proces izolacji organoidów psów. Pobraną próbkę tkanki przenosi się na szalkę Petriego i odpowiednio miele. Próbka jest następnie przenoszona do 1x probówki CCS i wykonywane są etapy mycia. Do inkubacji EDTA na płytce 6-dołkowej, próbka jest następnie przenoszona do probówki zawierającej 1x CCS i FBS. Po ustabilizowaniu się tkanki supernatant z niewielką ilością tkanki przenosi się do pustej probówki. Próbka jest następnie wirowana, supernatant jest usuwany, a osad jest ponownie zawieszany w Advanced DMEM/F12. Rurka jest ponownie wirowana, a supernatant jest zasysany i odrzucany. Rozpuszczony ECM dodaje się do probówki, miesza, a próbkę posiewa się na 24-dołkowej płytce. Następnie płytkę inkubuje się (37 °C; 5% atmosfery CO2 ) przez 30 minut, a następnie dodaje się pożywkę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

UWAGA: Poniższa sekcja (kroki 4 i 5) opisuje Protokół Konserwacji Organoidów Psów. Zmieniaj pożywki zgodnie z tabelą 2 i codziennie sprawdzaj organoidy pod kątem oznak apoptozy, zanieczyszczenia, przepełnienia i oderwania rozpuszczonego ECM. Codzienne notatki muszą być sporządzane zgodnie z Rysunek 4, aby dokładnie monitorować warunki i efekty eksperymentalne na kulturach. W tabeli uzupełniającej 1 przedstawiono szablon umożliwiający dokładne i powtarzalne sporządzanie notatek związanych z hodowlą organoidów. W przypadku organoidów wątrobowych należy użyć CMGF+ wzmocnionego inhibitorem ROCK i GSK3β.

figure-protocol-3
Rysunek 4: Przewodnik po rozmiarach i gęstości organoidów. (A) Tabela rozmiarów organoidów do dokładnego śledzenia wzrostu organoidów. Przewodnik po rozmiarach zawiera kategorie bardzo małych (XS), małych (S), średnich (M), dużych (L) i bardzo dużych (XL). (B) Przewodnik po gęstości składa się z kategorii o bardzo niskiej gęstości (VLD), niskiej gęstości (LD), średniej gęstości (MD), wysokiej gęstości (HD) i bardzo wysokiej gęstości (VHD). (C) Reprezentatywne obrazy zanieczyszczenia bakteryjnego i grzybiczego próbki organoidu. (D) Reprezentatywne obrazy przeludnienia organoidów i apoptozy. Powiększenie obiektywu jest wskazane w każdym panelu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Zalecenie zmiany mediów
PoniedziałekWtorekŚrodaCzwartekPiątekSobotaNiedziela
500 μLN/a500 μLN/a750 μLN/aN/a

Tabela 2: Zalecenie zmiany mediów. Zalecany harmonogram cotygodniowych zmian mediów. Pożywki (500 μl CMGF+ w przypadku organoidów jelitowych lub 500 μl CMGF+ R/G w przypadku organoidów wątrobowych) zaleca się zmieniać co drugi dzień. Aby zrekompensować dodatkowe godziny w weekend, w piątkowe popołudnia dodawane jest 750 μl nośników, a w poniedziałki rano są one odświeżane.

4. Czyszczenie organoidów

UWAGA: Czyszczenie lub pasowanie organoidów musi być wykonywane regularnie, aby utrzymać zdrowie hodowli organoidów. Procedurę czyszczenia należy wykonać za każdym razem, gdy zauważy się apoptozę w kulturze, obecność zanieczyszczeń, przepełnienie organoidów lub oderwanie się rozpuszczonego ECM. Patrz Rysunek 4D.

  1. Wyjmij pożywkę z dołków, przechylając płytkę, aby uniknąć zniszczenia rozpuszczonego ECM.
    UWAGA: Jeśli oderwanie rozpuszczonego ECM jest znaczne, zaleca się przeniesienie pożywki do probówki o pojemności 15 ml, aby uniknąć utraty fragmentów rozpuszczonego ECM zawierającego próbkę.
  2. Dodaj 0,5 ml wstępnie schłodzonego Advanced DMEM/F12 do każdej studzienki, aby rozpuścić kopułki matrycy przez wielokrotne pipetowanie przy użyciu końcówki P1000 (unikaj tworzenia nadmiernych pęcherzyków). Przenieść rozpuszczoną matrycę zawierającą organoidy do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Trzymaj probówkę na lodzie i jeśli objętość jest mniejsza niż 6 ml, powoli napełnij probówkę Advanced DMEM/F12, aby osiągnąć całkowitą objętość 6 ml.
  3. Odwirować probówkę (700 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C) i usunąć cały supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu.
  4. Dodać wymaganą objętość rozpuszczonego ECM (30 μl na studzienkę, aby uzyskać odpowiednią gęstość wysiewu) i powoli ponownie zawiesić osad przez mieszanie pipetą. Umieść zawiesinę na środku 24-dołkowej płytki, aby utworzyć kopułę.
  5. Umieścić płytkę w inkubatorze (37 °C; 5% atmosfery CO2 ) na ~30 min, a następnie dodać odpowiednią objętość pożywki (Tabela 2).

5. Pasaż organoidowy

UWAGA: Pasażowanie jest zazwyczaj wykonywane 5-7 dni po początkowej hodowli w celu rozszerzenia linii komórek organoidowych. Hodowle organoidów można zazwyczaj rozrastać w stosunku 1:3. Obrazy zdrowych kultur gotowych do przejścia można zobaczyć w Rysunek 4. Organoidy muszą być co najmniej średniej wielkości.

  1. Wykonaj kroki od 4.1 do 4.3.
  2. Usunąć supernatant, pozostawiając 0,5 ml w probówce. Uważaj, aby nie naruszyć pelletu.
  3. Dodać 0,5 ml proteazy trypsynopodobnej (patrz tabela materiałów), odpowiednio wymieszać przez zasysanie pipetą i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C (inkubować organoidy jelitowe przez 8 minut lub organoidy wątrobowe przez 10 minut). Kontynuować mieszanie roztworu, kilkakrotnie przesuwając probówkę w połowie czasu inkubacji.
  4. Przenieś probówkę zawierającą próbkę z powrotem do komory bezpieczeństwa biologicznego i powoli dodaj 6 ml wstępnie schłodzonego Advanced DMEM/F12, aby dezaktywować proteazę podobną do trypsyny i zatrzymać dysocjację komórek.
  5. Wirować probówkę (700 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C) i usunąć supernatant. Uważaj, aby nie naruszyć pelletu.
  6. Wykonaj kroki 4.4. i 4.5.
    UWAGA: Poniższa sekcja (kroki 6-9) opisuje Protokół Pozyskiwania Organoidów i Biobankowania. Hodowle organoidów muszą być wolne od tkanek, które zostały usunięte podczas poprzednich pasaży. Kultury powinny być również zdrowe, co najmniej duże i o średniej lub wysokiej gęstości. Obrazy zdrowych kultur gotowych do dalszych zastosowań można zobaczyć w Rysunek 4. Dalsze działania związane z konserwacją i zbiorem nieoptymalnych kultur organoidów mogą negatywnie wpłynąć na wyniki charakterystyki i rentowność biobanku. Zapoznaj się z zalecanym układem płytek 24-dołkowych w Rysunek 5.

figure-protocol-4
Rysunek 5: Zalecany układ płytek 24-dołkowych. Zalecany układ płytki 24-dołkowej do podstawowej charakterystyki po namnażaniu kultury organoidowej. Osadzanie parafiny w sześciu studzienkach (średnie i duże organoidy o średniej lub dużej gęstości) zazwyczaj pozwala na uzyskanie wysokiego stężenia organoidów w bloku histologicznym. Cztery dołki organoidów można połączyć w jeden kriowial z odczynnikiem do przechowywania RNA do dalszych zastosowań. Czternaście studzienek służy do biobankowania próbek organoidów i dostarcza materiału do siedmiu kriokonserwowanych fiolek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Utrwalanie organoidów

  1. Wyjmij media ze studni i upewnij się, że nie naruszają rozpuszczonej kopuły ECM.
  2. Dodać 500 μl roztworu formalina-kwas octowy-alkohol służącego jako utrwalacz (FAA; skład w tabeli 1).
  3. Organoidy należy przechowywać w temperaturze pokojowej. Po 24 godzinach odessać FAA i napełnić studzienkę 70% etanolem. Owiń płytki laboratoryjną elastyczną taśmą foliową (patrz tabela materiałów), aby uniknąć szybkiego parowania. Organoidy są teraz gotowe do zatapiania w parafinie. Osadzanie parafiny w kulturze organoidów odbywa się w tradycyjnych metalowych formach bazowych.

7. Zachowanie RNA

  1. Usuń media z dołków i upewnij się, że nie naruszają rozpuszczonej kopuły ECM.
  2. Użyj 0,5 ml wstępnie schłodzonego Advanced DMEM/F12 na studzienkę, aby rozpuścić rozpuszczone kopułki ECM poprzez wielokrotne pipetowanie w górę iw dół (unikaj tworzenia nadmiernych pęcherzyków). Przenieść organoidy do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Trzymaj probówkę na lodzie i jeśli objętość jest mniejsza niż 6 ml, powoli napełnij probówkę Advanced DMEM/F12, aby osiągnąć 6 ml całkowitej objętości.
  3. Wirować probówkę (700 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C) i usunąć cały supernatant. Uważaj, aby nie naruszyć pelletu.
  4. Dodać 100 μl PBS do probówki z próbką i ponownie zawiesić osad przez delikatne pipetowanie. Przenieść zawartość probówki z próbką do kriowialu.
  5. Dodać 900 μl odczynnika do przechowywania RNA (patrz tabela materiałów) do probówki z próbką i wymieszać w celu zebrania pozostałych organoidów. Przenieść te pozostałości organoidów do kriowialu i przechowywać je w temperaturze -80 °C (zazwyczaj cztery studzienki połączone w jeden kriowial wystarczą do dalszych zastosowań, w tym sekwencjonowania qPCR i RNA).
    UWAGA: Jeden kriowial zazwyczaj wytwarza w sumie 4,000 ng RNA (mierzone za pomocą analizy spektrofotometrycznej).

8. Biobankowanie organoidów

UWAGA: Biobankowanie zwykle pojawia się 3-4 dni po przejściu. Oznaki apoptozy nie powinny być obecne w kulturze, aby wykonać tę metodę. Zapoznaj się z Rysunek 4, aby zapoznać się z rozmiarem i gęstością odpowiednią do zamrażania. Biobank średnie i bardzo duże organoidy o średniej i bardzo dużej gęstości. Etap awaryjnego zamrażania może być zastosowany, jeśli linia komórek organoidowych jest szczególnie rzadka lub dalsza żywotność nie jest gwarantowana. Wykonaj te same kroki dla normalnego biobankowania organoidów (kroki od 8.1 do 8.4). Zamrażanie awaryjne odbywa się w przypadku mniejszych i mniej gęstych kultur. Zbierz jak najwięcej studzienek rosnących organoidów w jeden kriowial, wykonując kroki od 8.1 do 8.4. Należy pamiętać, że wystarczająca liczba organoidów musi być utrzymywana przy życiu, aby można było rozszerzyć hodowlę (zamrażanie awaryjne jest po prostu procedurą zapasową w celu ochrony przed możliwą utratą kultury w wyniku zanieczyszczenia lub innych nieoczekiwanych zdarzeń).

  1. Wykonaj kroki od 7.1 do 7.3.
  2. Dodać 1 ml pożywki do zamrażania na kriowial (skład w tabeli 1) do probówki z próbką i delikatnie zawiesić osad przez pipetowanie w górę i w dół.
  3. Przenieść 1 ml roztworu do jednego kriowialu (stosunek dwóch studzienek/kriowial) i trzymać kriowiale na lodzie.
  4. Przenieść kriowiale z lodu do pojemnika do zamrażania (regularnie napełniać zbiornik izopropanolem) i natychmiast przenieść do temperatury -80 °C. Przenieść próbki do ciekłego azotu (-196 °C) w celu długotrwałego przechowywania po 24 h.
    UWAGA: Zamiast tradycyjnego pojemnika do zamrażania komórek można również użyć bezalkoholowego pojemnika do zamrażania komórek. Upewnij się, że próbki nie rozmrażają się podczas transportu z temperatury -80 °C do długotrwałego przechowywania ciekłego azotu. Wielokrotne rozmrażanie zmniejsza żywotność kultury komórkowej.

9. Odrodzenie z magazynowania ciekłego azotu

UWAGA: Decydując się na rozmrożenie linii organoidów, podzbiór ożywionych organoidów musi zostać ponownie zamrożony i zastąpiony w biobanku tak szybko, jak to możliwe, co najmniej jednym (najlepiej więcej) kriowialami.

  1. Umieść rozpuszczony ECM na lodzie do powolnego rozmrażania, umieść 24-dołkową płytkę w inkubatorze (37 °C; 5% atmosfery CO2 ) i przygotuj wymagane odczynniki, takie jak probówka 15 ml i Advanced DMEM/F12.
  2. Odzyskać kriowial zawierający próbkę organoidu z magazynu ciekłego azotu i natychmiast przenieść ją do łaźni grzewczej (37 °C) na 2 minuty.
  3. Przenieść zawartość kriowialu do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Powoli dodawaj wstępnie schłodzony Advanced DMEM/F12, aż do uzyskania całkowitej objętości 6 ml.
  4. Wirować probówkę (700 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C). Usunąć supernatant i upewnić się, że nie naruszyć osadu.
  5. Dodać 180 μl (30 μl na studzienkę) rozpuszczonego ECM do osadu i umieścić tę zawiesinę na wstępnie podgrzanej płytce 24-dołkowej. Jeden kriowial można posiać do sześciu dołków na płytce 24-dołkowej.
  6. Umieścić 24-dołkową płytkę w inkubatorze (37 °C; 5% atmosfery CO2 ) na ~30 minut i dodać CMGF+ R/G (w przypadku organoidów jelitowych przejść na CMGF+ w ciągu 24 do 48 godzin).
    UWAGA: Gdy próbka jest posiewana i rośnie na płytce 24-dołkowej, należy jej pozwolić na regenerację przez co najmniej 2 dni przed pasażowaniem, aby zwiększyć żywotność.

Wyniki

Protokół organoidów psów zazwyczaj generuje ~50 000 do ~150 000 komórek jelitowych lub wątrobowych na studzienkę 24-dołkowej płytki. Reprezentatywne organoidy można zobaczyć w Rysunek 6.

figure-results-1
Rysunek 6: Reprezentatywne obrazy psich organoidów. Przedstawiono obrazy organoidów wyizolowanych przy użyciu tego protokołu. Panie przewodniczący, panie i panowie! Organoidy jelitowe pochodzące z dwunastnicy (pobrane przy 10-krotnym i 5-krotnym powiększeniu obiektywu). Zwróć uwagę na obecność starszych pączkujących organoidów i młodszych sferoidów. (C,D) Enteroidy psów z dolnej części jelita czczego (wykonane przy 10-krotnym i 20-krotnym powiększeniu obiektywu). (E,F) Enteroidy jelita krętego (wykonane przy 20-krotnym i 5-krotnym powiększeniu obiektywu) oraz kolonoidy (G,H) (wykonane przy 10-krotnym powiększeniu obiektywu). (I) Reprezentatywny obraz organoidów wątrobowych wykonany przy 20-krotnym powiększeniu obiektywu. Większość organoidów jest w formie pączkowania. Na zdjęciu widać również młodsze sferoidy wątroby. (J) Reprezentatywne zdjęcie przedstawiające organoid rzadkiej wątroby, który tworzy strukturę przypominającą przewód (wykonane przy 10-krotnym powiększeniu obiektywu). Podziałka liniowa (500 μm) znajduje się w lewym górnym rogu każdego obrazu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Enteroidy i kolonoidy uzyskane za pomocą tego protokołu zostały wcześniej scharakteryzowane przez Chandra et al. w 2019 roku12. Organoidy jelitowe psów składają się z regularnej populacji komórkowej nabłonka jelitowego. Wykorzystując hybrydyzację RNA in situ, ekspresję biomarkerów komórek macierzystych (powtórzenia bogate w leucynę zawierające receptor 5 sprzężony z białkiem G - LGR5 i czynnik transkrypcyjny SRY-Box 9 - SOX9), biomarker komórek Panetha (receptor efryny typu B 2 - EPHB2), markery absorpcyjnych komórek nabłonka (fosfataza alkaliczna - ALP) i marker enteroendokrynny (Neurogenina-3 - Neuro G3)12 została potwierdzona. Barwienie Alcian Blue przeprowadzono na szkiełkach zatopionych w parafinie, aby potwierdzić obecność komórek kubkowych. Ponadto przeprowadzono testy funkcjonalne, takie jak optyczne obrazowanie metaboliczne (OMI) lub test obrzęku przezbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy (CFTR), aby potwierdzić aktywność metaboliczną organoidów. Organoidy psów od psów, u których zdiagnozowano nieswoiste zapalenie jelit, guzy podścieliskowe przewodu pokarmowego (GIST) lub gruczolakorak jelita grubego zostały również wyizolowane przy użyciu tego protokołu12.

Po izolacji komórek macierzystych, organoidy wątrobowe psów rozpoczynają swój cykl życiowy jako rozszerzające się sferoidy, a po ~7 dniach zamieniają się w pączkujące i różnicujące się organoidy. Sferoidy wątrobowe psów wyizolowane i wyhodowane zgodnie z tym protokołem zostały zmierzone w celu ilościowego określenia ich wzrostu i określenia idealnego czasu na pasaż. Sferoidy pochodzące z laparoskopowych biopsji wątroby zdrowych dorosłych psów (n = 7) mierzono w ciągu pierwszych 7 dni hodowli. Wykonano reprezentatywne obrazy, a podłużny (a) i ukośny (b) promień sferoid (n = 845) zmierzono w całej hodowli. Obliczono objętość (V), pole powierzchni (P), pole elipsy 2D (A) i obwód (C) sferoid. Obliczenia i wyniki eksperymentu są podsumowane w Rysunek 7. Obszar i obwód elipsy 2D wykorzystano do oceny stanu zdrowia kultury organoidów za pomocą mikroskopii świetlnej. Wartości te mogą służyć jako przewodnik przy podejmowaniu decyzji dotyczących utrzymania kultury.

Krótko mówiąc, sferoidy gwałtownie zwiększyły swoją objętość, powierzchnię, obszar elipsy 2D i obwód. Dane pomiarowe z siedmiu beagle zostały uśrednione dla poniższych obliczeń. Wolumen wzrósł o 479% (±6%) od 2 do 3 dnia. W tym samym czasie powierzchnia sferoidy i powierzchnia elipsy 2D wzrosły odpowiednio o 211% (±208%) i 209% (±198%). Obwód elipsy 2D zwiększył się od 2 do 3 dnia o 73% (±57%). Wzrost ogólnej objętości organoidów wątrobowych od 2 do 7 dni był ponad 365 razy, powierzchnia i powierzchnia elipsy 2D zwiększyły się 49 razy, a obwód elipsy 2D zwiększył się sześciokrotnie.

Następnie, sferoidy pochodzące z dwóch próbek od dorosłych psów były dalej hodowane po pasażu i zbierane codziennie (dzień 2-7) pod kątem hybrydyzacji RNA in situ (RNA ISH). Zaprojektowano sondy dla psów (lista sond znajduje się w tabeli uzupełniającej 2), a ekspresję mRNA oceniono pod kątem markerów komórek macierzystych (LGR5), markerów specyficznych dla cholangiocytów (cytokeratyna 7 - KRT-7 i akwaporyna 1 - AQP1), a także markerów hepatocytów (białko A1 - FOXA1; i cytochrom P450 3A12 - CYP3A12). Ekspresję markerów oceniano w sposób półilościowy (reprezentatywne obrazy w Rysunek 8). Sferoidy preferencyjnie wyrażały marker cholangiocytów KRT-7 w zakresie od 1% do 26% w obszarze sygnału/całkowitej powierzchni komórek. AQP1 nie ulegał ekspresji w próbkach organoidów, prawdopodobnie dlatego, że jego obecność w próbkach wątroby psów jest rzadka. Ekspresja markerów komórek macierzystych (LGR5) wahała się od 0,17% do 0,78%, podczas gdy markery hepatocytów ulegały ekspresji w mniejszym stopniu na poziomie 0,05%-0,34% dla FOXA1 i 0,03%-0,28% dla CYP3A12.

figure-results-2
Rysunek 7: Pomiary sferoidów wątroby. (A) Wzrost sferoidów wątroby obserwowano codziennie w hodowlach od 2 do 7 dnia. Sferoidy po raz pierwszy uformowały się w dniu 2, a ostatnie sferoidy rozpoczęły proces pączkowania w dniu 7. W kolejnym eksperymencie wykorzystano dwie psie linie organoidowe po przejściu do codziennego zbierania sferoid w celu zatopienia parafiny w celu wykonania RNA ISH (obraz dnia 2 został wykonany przy 40x, obraz dnia 6 przy 10x, a reszta obrazów została wykonana przy 20-krotnym powiększeniu). (B) Pokazano skupisko sferoidalne wątroby przyczepione do fragmentu tkanki osadzonego w rozpuszczonym ECM 4 dni po izolacji. Zmierzono promienie podłużne i ukośne sferoid (zdjęcie wykonane przy powiększeniu 10x). Panel (C) przedstawia wzór używany do obliczeń w celu wyznaczenia objętości (V), pola powierzchni (P), pola elipsy 2D (A) i obwodu (C). Do tych obliczeń założono, że sferoidy wątroby psów są sferoidami idealnymi. Wyniki pomiarów objętości sferoid wątrobowych, pola powierzchni, pola elipsy 2D i obwodu elipsy 2D dla poszczególnych dni wzrostu przedstawiono w panelu (D). Słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej (SEM). (E) ekspresję mRNA KRT-7, LGR5, FOXA1 i CYP3A12 mierzono w próbkach sferoid wątrobowych psów po przejściu dnia 2 do dnia 7. AQP1 nie był wyrażany w tych próbkach. Podziałka liniowa (5x: 500 μm; 10x: 200 μm; 20x: 100 μm; 40x: 50 μm) znajduje się w lewym górnym rogu każdego obrazu. Zauważono powiększenie obiektywu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Organoidy rzadko nie rozpadały się podczas procesu pasażu zgodnie z tą standardową techniką. Jeśli dysocjacja nie nastąpi, czasy pasażu można dostosować, aby osiągnąć optymalny rozpad klastra komórkowego. Jednak długotrwała ekspozycja na proteazę podobną do trypsyny może negatywnie wpłynąć na wzrost organoidów. Organoidy wątrobowe wykorzystano w kolejnym eksperymencie w celu zbadania optymalnego czasu dysocjacji i ustalenia właściwej metody pasażowania. Krótko mówiąc, organoidy wątrobowe od dwóch zdrowych psów (po 6 dobrze powtórzonych każdy) były pasażowane z proteazą podobną do trypsyny przez 12 minut i 24 minuty. Próbki mieszano co 6 minut. Pod koniec punktu czasowego dysocjacji do roztworu dodano 6 ml lodowatego Advanced DMEM/F12 i odwirowano próbki (700 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C). Supernatant (Advanced DMEM/F12 z rozcieńczoną proteazą trypsynopodobną) usunięto, a osady osadzono w rozpuszczonym ECM, jak opisano powyżej (kroki 4.4-4.5). Po 12 godzinach hodowli w rozpuszczonym ECM i CMGF+ R/G zaobserwowano różnice w obu próbkach. 12-minutowa inkubacja z proteazą podobną do trypsyny nie zahamowała wzrostu organoidów. Jednak wzrost organoidów miał negatywny wpływ (patrz Rysunek 9) przy użyciu 24-minutowej inkubacji.

figure-results-3
Rysunek 9: Eksperyment z organoidami wątrobowymi u psów. Reprezentatywne obrazy organoidów pochodzących od dwóch psów (D_1 i D_2) pasażowanych metodą inkubacji proteazy trypsynopodobnej przez 12 minut lub 24 minuty. Próbki kontrolne pasażowano z proteazą podobną do trypsyny przez 10 minut. Pasek skali (μm) znajduje się w lewym górnym rogu każdego obrazu i reprezentuje 500 μm (5-krotne powiększenie obiektywu). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Następnie przeprowadzono badanie dotyczące przeżywalności organoidów wątrobowych psów pochodzących z tego protokołu w niekorzystnym środowisku (pozbawienie wsparcia strukturalnego i odżywiania). Badania koncentrowały się na określeniu objętości pożywki organoidowej i macierzy podstawnej potrzebnej do pomyślnego wzrostu i przetrwania organoidów wątrobowych, a także na ustaleniu wpływu tych warunków na hodowlę organoidów. Przeżywalność mierzono na 96-dołkowej płytce z ograniczoną liczbą organoidów. Organoidy od dwóch psów pasażowano zgodnie z powyższym opisem i osadzono (12 powtórzeń) w różnych objętościach rozpuszczonego ECM (10 μl lub 15 μl). Komórki posiano w stężeniu 400 komórek/10 μl studzienki i 600 komórek/15 μl studzienki, co odpowiada 40 000 komórek/ml. Dodano dwa typy pożywek (CMGF+ lub CMGF+ R/G) w różnych objętościach (25 μL, 30 μL lub 35 μL). Media nigdy nie były wymieniane i nie wykonywano żadnych procedur konserwacyjnych. Przeżywalność organoidów była monitorowana każdego dnia. Śmierć organoidów zdefiniowano jako rozpuszczenie ponad 50% struktur organoidowych. Wskaźnik przeżycia organoidów w tych warunkach wahał się od 12,9 (±2,3) dnia do 18 (±1,5) dnia, a wyniki podsumowano w Tabeli 3. Dwie próbki, które przetrwały najdłużej, to organoidy pochodzące od psów zanurzone w 15 μl rozpuszczonego ECM i 30 μl pożywki CMGF+. Obie próbki umieszczono w rozpuszczonym ECM (30 μl) i świeżym pożywce (500 μl) w standardowej 24-dołkowej płytce po 18 dniach deprywacji, aby zapewnić, że ekspansja organoidów jest nadal możliwa (Ryc. 10).

) pkt. ) pkt. pkt. ) pkt. .
Typ nośnikaŚrednia (dni, które przeżyły)medianaWskaźnik zaopatrzenia (CV%)Średnia (dni, które przeżyły)medianaWskaźnik zaopatrzenia (CV%)Średnia (dni, które przeżyły)medianaWskaźnik zaopatrzenia (CV%)Średnia (dni, które przeżyły)medianaWskaźnik zaopatrzenia (CV%)
Media (μL)30253530
ECM (μL)10101015
D_1CMGF+ R/Ggodz. 12.5013Godzina 11.57Godzina 12,8313Godzina 4,50Godzina 11,83Pytanie 11,5Godzina 12,91Godzina 12.0813Godzina 12.46
CMGF+ (Biblioteka CMGF+Godzina 17.0817Godzina 16.26godz. 18.50Rozdział 19Godzina 4,89godz. 18.42Rozdział 19O godz. 14.54godz. 17.82Rozdział 198,99
D_2CMGF+ R/Ggodz. 13.6714godz. 13.36godz. 13.0013godz. 12.70godz. 14.0014,5godz. 17.23Rozdział 13.0813Godzina 8,90
CMGF+ (Biblioteka CMGF+godz. 15.5015godz. 18.56godz. 17.50Rozdział 18Godzina 10.48godz. 17.50Rozdział 19Godzina 20,89godz. 17.0017godz. 14.41
RAZEMCMGF+ R/GRozdział 13.0813Godzina 13.1312,9213Godzina 9,3912,9213godz. 17.52Godzina 12.5813Godzina 11,22
CMGF+ (Biblioteka CMGF+Godzina 16.29Rozdział 16,5godz. 17.69godz. 18.0018,5Godzina 8,35Godzina 17,96Rozdział 19godz. 17.65Godzina 17.4317godz. 11.70
śmierć= ponad 50% masy organoidów jest niezdolnych do życia

Tabela 3: Wyniki eksperymentu przeżywalności. Eksperyment opierał się na pozbawieniu dwóch kultur organoidów wsparcia strukturalnego lub odżywiania. Wyniki obejmują średnią, medianę i odchylenie standardowe (CV%) poszczególnych stężeń rozpuszczonego ECM i pożywki u poszczególnych psów.

figure-results-4
Rysunek 10: Deprywacja żywieniowa i strukturalna organoidów. Organoidy ponownie platerowano na 24-dołkowych płytkach, aby potwierdzić zdolność do ekspansji po deprywacji (A). Reprezentatywne obrazy z 4 i 7 dnia po ponownym poszyciu pokazują ekspansję organoidów, potwierdzając zdolność do wizualnej identyfikacji żywotnych organoidów (obrazy są wykonywane przy 5-krotnym powiększeniu obiektywu). Reprezentatywne obrazy organoidów uznanych za żywe lub martwe są widoczne w (B). Zdjęcia są wykonywane przy 5-krotnym powiększeniu obiektywu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 8: Obrazy reprezentatywne dla hybrydyzacji RNA w wątrobie sferoidów in situ. Reprezentatywne obrazy markerów LGR5, KRT7, FOXA1 i CYP3A12 wykonano przy 60-krotnym powiększeniu obiektywu próbek z 2-7 dnia po pasażu. Dodatnie cząsteczki mRNA barwią się na czerwono. AQP1 nie był wyrażany w próbkach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

cyfrowa . .
Skład niekompletnego roztworu chelatującego (ICS)Końcowe stężenie
500 ml H2Onie
2,49 g Na2HPO4-2H 2O4,98 mg/ml
2,7 g KH2PO45,4 mg/ml
14 g NaCl28 mg/ml
0,3 g KCl0,6 mg/ml
37,5 g sacharozy75 mg/ml
25 g D-sorbitolu50 mg/ml
Kompletny skład roztworu chelatującego (CCS)V/V % lub stężenie końcowe
Niekompletny roztwór chelatacyjny20%
Sterylne H2O80%
Naziemna telewizja520 μM
Pióro StrepPióro: 196 U/ml; Paciorkowiec 196 ug/ml
Skład pożywki organoidowejKońcowe stężenie
Zaawansowany DMEM/F12nie
FBS (Sieć Usługowa8 proc
Glutamax (Glutamax)2 mM
HEPESY10 mM
Primocin100 μg/ml
Suplement witaminy B271x
Suplement N21x
N-acetylo-L-cysteina1 mM
Mysz EGF50 ng/ml
Mysi Noggin100 ng/ml
Ludzka R-Spondin-1500 ng/ml
Mysz Wnt-3a100 ng/ml
[Leu15]-Gastrin I człowiek10 nM
Nikotynamid10 mM
A-83-01500 nM
SB202190 (inhibitor P38)10 μM
TMS (trimetoprim sulfametoksazol)10 μg/ml
Dodatkowe komponentyKońcowe stężenie
Inhibitor ROCK (Y-27632)10 μM
CHIR99021 stemolekułowy (GSK3β)2,5 μM
Skład podłoża do zamrażaniaProcent V/V
Pożywki organoidowe i inhibitor ROCK50%
FBS (Sieć Usługowa40 proc
Dimetylosulfotlenek (DMSO)10%
Skład FAAProcent V/V
Etanol (100%)50%
Kwas octowy, lodowcowy5 proc.
Formaldehyd (37%)10%
woda destylowana35%

Tabela 1: Skład roztworów i mediów. Wykaz składników i stężeń niekompletnych i kompletnych roztworów chelatujących, CMGF+ (pożywki organoidowe), pożywki do zamrażania i FAA.

Tabela uzupełniająca 1: Szablon pielęgnacji organoidów. Ten szablon pozwala na dokładne i powtarzalne sporządzanie notatek organoidowych na każdy dzień. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 2: Sondy hybrydyzacji RNA in situ. Lista sond specjalnie zaprojektowanych dla celów mRNA psów przez producenta technologii do wykonywania techniki hybrydyzacji RNA in situ. Znajdują się na niej informacje o znaczeniu poszczególnych markerów, nazwa sondy, jej numer referencyjny oraz region docelowy. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Obecnie brakuje znormalizowanych protokołów izolacji i utrzymania organoidów wątrobowych i jelitowych psów. Ustanowienie standardowych procedur operacyjnych dla kultur organoidowych jest uzasadnione, aby model ten mógł być stosowany w różnych warunkach laboratoryjnych. W szczególności zapewnienie ustandaryzowanych protokołów operacyjnych dla hodowli tych modeli organoidów psów jest kluczem do scharakteryzowania normalnego wzrostu organoidów podczas hodowli i pasażowania w celu wyznaczenia optymalnych punktów czasowych dla ekspansji i konserwacji. Organoidy jelitowe psów hodowane przy użyciu protokołu zostały wcześniej scharakteryzowane przez Chandra i wsp.12.

Jednym z najbardziej krytycznych etapów protokołu jest pasażowanie organoidów. Optymalny czas na pierwsze pasaże sferoid wątrobowych określono na 7 dzień po izolacji na podstawie pomiarów sferoidów wątrobowych. Maksymalną objętość sferoid osiągnięto w 7 dniu, a jednocześnie sferoidy zaczęły pączkować i tworzyć organoidy wątrobowe. Wzrost ogólnej objętości organoidów od 2 do 7 dnia po izolacji był ponad 365 razy, co sugeruje, że optymalny czas pasażu jest dłuższy niż w przypadku hodowli organoidów jelitowych psów. Po 7 dniach w hodowli nie zaobserwowano żadnych poważnych oznak apoptozy komórkowej w sferoidalnym wątrobie, nawet bez czyszczenia lub pasażowania (ryc. 7). Pasażowanie organoidów jelitowych i wątrobowych może być trudne, ponieważ procedura może prowadzić do utraty komórek i zmiany żywotności. Wyniki wskazują, że długotrwała inkubacja organoidów wątrobowych z proteazą podobną do trypsyny (do 12 min) nie wpływa negatywnie na subkulturę. Inkubacja organoidów w proteazie podobnej do trypsyny przez okres dłuższy niż 24 minuty może być szkodliwa dla późniejszej subkultury organoidów.

W przypadku nieoptymalnego pękania w skupiskach komórek z pasażem organoidowym, dysocjacja mechaniczna zamiast długotrwałej inkubacji z proteazą podobną do trypsyny może być bardziej korzystna. W przypadku napotkania problemów z prawidłową dysocjacją organoidów, można podjąć próbę krótkiego wirowania próbek w celu zwiększenia wydajności przejścia. Z drugiej strony, wirowanie może zrujnować kulturę i uszkodzić komórki, dlatego powinno być stosowane tylko wtedy, gdy inne procedury wielokrotnie zawodziły. Rozbijanie organoidów wątrobowych na pojedyncze komórki obniża tempo wzrostu organoidów, podczas gdy rozbijanie ich na skupiska komórek może znacznie poprawić ich żywotność. Jako czas inkubacji dla protokołu organoidowego wybrano dziesięć minut. 12-minutowy punkt czasowy inkubacji został uznany za niecytotoksyczny w porównaniu z 24-minutową inkubacją w eksperymencie z proteazą podobną do trypsyny.

Eksperyment przeżywalności potwierdził, że organoidy wątrobowe psów mogą przetrwać do 19,5 dnia w niesprzyjających warunkach (wyczerpanie strukturalne i żywieniowe). Organoidy, które przetrwały te warunki najdłużej, były hodowane za pomocą pożywek CMGF+. Obserwacja ta mogła być spowodowana wolniejszym wzrostem organoidów wątrobowych w pożywkach nieuzupełnionych inhibitorem Rock i GSK3β. Hodowle organoidów z CMGF+ R/G rosły szybciej i mogły szybciej wyczerpywać swoje zasoby. Eksperyment ten otwiera możliwości miniaturyzacji hodowli organoidów psów w celu osiągnięcia wysokoprzepustowej konwersji systemu. Taka technologia może ułatwić odkrywanie leków lub prowadzenie badań toksykologicznych przy znacznie obniżonych kosztach.

Niektóre typowe problemy napotykane podczas utrzymywania hodowli organoidów psów to niewłaściwe krzepnięcie próbki podczas posiewu, zanieczyszczenie hodowli oraz ustalenie odpowiedniej gęstości i wielkości organoidów. Jeśli rozpuszczony ECM przedwcześnie zestala się podczas powlekania, natychmiast umieść go na lodzie na 10 minut. Jeśli rozpuszczony ECM nie tworzy struktur przypominających kopułę, jest prawdopodobne, że z próbki nie usunięto wystarczającej ilości pożywki. W takim przypadku należy rozcieńczyć próbkę bardziej rozpuszczonym ECM, aż do powstania kopułek.

W przypadku stwierdzenia zanieczyszczenia grzybiczego lub bakteryjnego na całej płytce (patrz rysunek 4), najlepszym rozwiązaniem jest wyrzucenie płytki. Można próbować leczenia lekami przeciwgrzybiczymi lub antybiotykami, ale powodzenie takiej próby jest bardzo niskie. Jeśli pojedynczy studzienka jest zanieczyszczona w płycie, żywotne i nienaruszone studzienki można oczyścić (wykonaj kroki od 4.1 do 4.5) do nowej płytki i ściśle monitorować. Jeśli próbka została już zamrożona w trybie awaryjnym, zaleca się wyrzucenie całej próbki, ponieważ rozmrożenie próbki naraża inkubator na dodatkowe ryzyko zanieczyszczenia.

Zdrowa hodowla organoidów powinna należeć co najmniej do kategorii średniej wielkości i średniej gęstości lub większej. Optymalna gęstość ma kluczowe znaczenie dla wzrostu kultur organoidowych. Niższą gęstość należy skorygować poprzez oczyszczenie organoidów do średniej gęstości. Jeśli wystąpi sytuacja ekstremalnego zagęszczenia (przeludnienie), organoidy należy rozszerzyć na więcej studni. Poważne oznaki apoptozy komórkowej często towarzyszą zarówno przeludnieniu, jak i niskiej gęstości hodowli organoidów. Jeśli te problemy nie zostaną naprawione na czas, cała kultura organoidów przejdzie w apoptozę w ciągu kilku dni. Jeśli organoidy osiągają bardzo duże rozmiary lub bardzo dużą gęstość, kulturę należy wykorzystać do eksperymentu, zamrażania lub utrwalania.

Pożywka organoidowa zawiera obecnie 17 składników, a dodanie czynników wzrostu potrzebnych do utrzymania i ekspansji organoidów może być kosztowne. Problem ten można rozwiązać, hodując hodowle komórkowe 2D, które syntetyzują czynniki wzrostu w celu wytworzenia kondycjonowanego CMGF+. Hodowla komórkowa L-WRN wytwarza czynniki wzrostu Wnt-3a, R-Spondin-3 i Noggin37. Kolonia komórkowa wykorzystuje 90% pożywek hodowlanych DMEM/F12 i 10% FBS. Gdy kultura osiągnie 90-procentową konfluencję, pożywka jest zbierana codziennie przez 1 tydzień. Zebrane podłoże jest następnie mieszane z 2x CMGF+ (bez tych czynników wzrostu). Podczas gdy kultury 2D mogą wytworzyć potrzebne czynniki wzrostu za ułamek kosztów, należy spodziewać się dodatkowego czasu i przygotowań do produkcji pożywki. Stężenia czynników wzrostu między partiami kondycjonowanych pożywek mogą się również różnić37,38.

Hodowle organoidów pochodzących z dorosłych psów z komórek macierzystych są unikalnym modelem biomedycznym, który może pomóc w osiągnięciu celów Inicjatywy "Jedno Zdrowie"39. Technologia organoidów może być stosowana w wielu podstawowych i biomedycznych obszarach badań, począwszy od biologii rozwojowej, patofizjologii, odkrywania i testowania leków, toksykologii po badania chorób zakaźnychi medycyny regeneracyjnej. Badania translacyjne i odwrotne translacyjne to obszary, w których organoidy psów mają zastosowanie15. Psy były wykorzystywane od wieków w translacyjnych warunkach eksperymentalnych, a ich status zwierzęcia towarzyszącego ułatwił im również pozycję jednego z najbardziej zbadanych gatunków w medycynie weterynaryjnej.

Podsumowując, manuskrypt ten zawiera ustandaryzowane protokoły operacyjne dotyczące izolacji, utrzymania, zbierania i biobankowania organoidów wątrobowych i jelitowych psów, aby ułatwić zastosowanie tego modelu w różnych dziedzinach biomedycznych. Model ten jest wyjątkowo odpowiedni do promowania badań translacyjnych jako narzędzia inicjatywy "Jedno zdrowie" w celu promowania inter- i intradyscyplinarnego dzielenia się wiedzą.

Oświadczenia

K. Allenspach jest współzałożycielem LifEngine Animal Health i 3D Health Solutions. Pełni funkcję konsultanta w Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics i Mars. J. P. Mochel jest współzałożycielem LifEngine Animal Health i 3D Health Solutions. Dr Mochel pełni funkcję konsultanta w Ceva Animal Health i Ethos Animal Health. Pozostali autorzy nie mają do zadeklarowania żadnego konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy pragną wyrazić wdzięczność pracownikom Weterynaryjnego Laboratorium Diagnostycznego Uniwersytetu Stanowego Iowa, a mianowicie Haley M. Lambert, Emily Rahe, Rosalyn M. Branaman, Victorii J. Green i Jennifer M. Groeltz-Thrush, za terminowe przetworzenie dostarczonych próbek. Autorzy pragną podziękować za wsparcie ze strony Faculty Startup, ISU VPR Miller Award, ISU VPR Miller Award oraz podnagrody NSF SBIR dla ISU # 1912948.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwór chelatujący
D-SorbitolFisher ChemicalBP439-500
DTTPromegaV3151
KClFisher ChemicalP217-500
KH2PO4SigmaP5655-100G
Na2HPO4-2H2OSigmaS5136-100G
NaClFisher ChemicalS271-500
Pen StrepGibco15140-122
SacharozaFisher ChemicalS5-500
Organoid podłoża
Leu15]-Gastrin I człowiekSigmaG9145-.5MG
A-83-01PeproTech9094360
Zaawansowany DMEM/F12Gibco12634-010
B27suplement Gibco17504-044
FBSCorning35-010-CV
GlutamaxGibco35050-061
HEPESVWR Life ScienceJ848-500ML
Human R-Spondin-1PeproTech120-38-500UG
Murine EGFPeproTech315-09-1MG
Murine NogginPeproTech250-38-250UG
Murine Wnt-3aPeproTech315-20-10UG
N2suplement Gibco17502-048
N-acetylo-L-cysteinaSigmaA9165-25G
NikotynamidSigmaN0636-100G
PrimocinInvivoGenant-pm-1
ROCK inhibitor (Y-27632)EMD Millipore Corp.SCM 075
SB202190 (inhibitor P38)SigmaS7067-25MG
Stemolecule CHIR99021 (GSK3β)Reprocell04-0004-base
TrimethoprimSigmaT7883-5G
SulfametoksazolSigma-AldrichS7507-10G
Odczynniki
Acetic Acid, GlacialFisher ChemicalA38-500
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Fisher ChemicalsD128-500
EDTA, pH 8,0, 0,5 MInvitrogen15575-038
Formaldehyd (37%)Fisher ChemicalF79P-4
Roztwór aldehydu glutarowegoSigmaG5882
Matrigel Matrix do hodowli organoidówCorning356255Macierz błony zewnątrzkomórkowej
Paraformaldehyd, 97%AlfaAesar A11313
PBS, 1X (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)Corning21-040-CM
PBS, 1X (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)Corning21-040-CM
RNApóźniej Soln.InvitrogenAM7021Odczynnik do przechowywania RNA
TrypLE ExpressGibco12604-021Proteaza trypsyna podobna
< silna>Inne< / silna>
6 Płytka do hodowli komórkowych WellCorning3516
ACD Hybez II System hybrydyzacjiACD marki biotechne321710
Probówka wirówkowa, 15 mlCorning430766
CoolCell LXFiolkiBCS-405MC
Jednorazowa probówka wirówkowa
Żyroskop Mini Mikser nutacyjny (rocker)LabnetS0500-230V-EU
Łaźnia cieplnaLab-Line Instruments3000
Pojemnik do zamrażania Mr. FrostyThermoFisher Scientific5100-0001
NanoDrop 2000ThermoFisher Scientific ND2000CLAPTOPSpektrofotometr Analiza
Inkubator PanasonicPanasonicMCO-170ML-PA
Parafilm M Folia do pakowaniaBemis Company IncPM996 / EMDLaboratoryjna elastyczna taśma foliowa
chroniona jednorazowa SkalpeleBard-Parker239844
Test RNAscope 2.5 HD – REDACD to biotechne marki322350
RNAscope H2O2 & Odczynniki Protease PlusACD marka biotechne322330
RNAscope Target Retrieval Repleeval ReagentsACD marka biotechne322000
RNAscope Wash Buffer ReagentsACD marka biotechne310091
Tissue Culture DishDot Scientific6676621
Tissue Culture Plate 24 dołkiFisherbrandFB012929
[ kriogeniczne Corning Corning 430488 (50 ml)Fisherbrand 05-539-13

Bibliografia

  1. Hickman, D. L., Johnson, J., Vemulapalli, T. H., Crisler, J. R., Shepherd, R. Commonly used animal models. Principles of Animal Research for Graduate and Undergraduate Students. , 117-175 (2017).
  2. De Jong, M., Maina, T. Of mice and humans: Are they the same? - Implications in cancer translational research. Journal of Nuclear Medicine. 51 (4), 501-504 (2010).
  3. Cannarozzi, G., Schneider, A., Gonnet, G. A phylogenomic study of human, dog, and mouse. PLoS Computational Biology. 3 (1), 0009-0014 (2007).
  4. Jacob, J. A. Researchers turn to canine clinical trials to advance cancer therapies. JAMA - Journal of the American Medical Association. 315 (15), 1550-1552 (2016).
  5. Ziegler, A., Gonzalez, L., Blikslager, A. Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (6), 716-724 (2016).
  6. Swanson, K. S., et al. Phylogenetic and gene-centric metagenomics of the canine intestinal microbiome reveals similarities with humans and mice. ISME Journal. 5 (4), 639-649 (2011).
  7. Coelho, L. P., et al. Similarity of the dog and human gut microbiomes in gene content and response to diet. Microbiome. 6 (1), 72(2018).
  8. Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
  9. Bontempo, V. Nutrition and health of dogs and cats: Evolution of petfood. Veterinary Research Communications. 29, 45-50 (2005).
  10. Allenspach, K., Gaschen, F. Canine chronic enteropathies: A review. Schweizer Archiv fur Tierheilkunde. 145 (5), 209-222 (2003).
  11. Tribuddharatana, T., Kongpiromchean, Y., Sribhen, K., Sribhen, C. Biochemical alterations and their relationships with the metabolic syndrome components in canine obesity. Kasetsart Journal - Natural Science. 45 (4), 622-628 (2011).
  12. Chandra, L., et al. Derivation of adult canine intestinal organoids for translational research in gastroenterology. BMC Biology. 17 (1), 33(2019).
  13. Schaefer, K., Rensing, S., Hillen, H., Burkhardt, J. E., Germann, P. G. Is Science the only driver in species selection? An internal study to evaluate compound requirements in the minipig compared to the dog in preclinical studies. Toxicologic Pathology. 44 (3), 474-479 (2016).
  14. MacArthur Clark, J. The 3Rs in research: A contemporary approach to replacement, reduction and refinement. British Journal of Nutrition. 120, 1-7 (2018).
  15. Schneider, B., et al. Model-based reverse translation between veterinary and human medicine: The one health initiative. CPT: Pharmacometrics and Systems Pharmacology. 7 (2), 65-68 (2018).
  16. Lehmann, R., et al. Human organoids: A new dimension in cell biology. Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1129-1137 (2019).
  17. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  18. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
  19. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33(2020).
  20. Ho, B. X., Pek, N. M. Q., Soh, B. S. Disease modeling using 3D organoids derived from human induced pluripotent stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 936(2018).
  21. Truskey, G. A. Human microphysiological systems and organoids as in vitro models for toxicological studies. Frontiers in Public Health. 6, 185(2018).
  22. Caipa Garcia, A. L., Arlt, V. M., Phillips, D. H. Organoids for toxicology and genetic toxicology: applications with drugs and prospects for environmental carcinogenesis. Mutagenesis. , (2021).
  23. Augustyniak, J., et al. Organoids are promising tools for species-specific in vitro toxicological studies. Journal of Applied Toxicology. 39 (12), 1610-1622 (2019).
  24. Zietek, T., et al. Organoids to study intestinal nutrient transport, drug uptake and metabolism - Update to the human model and expansion of applications. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 577656(2020).
  25. Zietek, T., Rath, E., Haller, D., Daniel, H. Intestinal organoids for assessing nutrient transport, sensing and incretin secretion. Scientific Reports. 5 (1), 1-10 (2015).
  26. Kar, S. K., et al. Organoids: a promising new in vitro platform in livestock and veterinary research. Veterinary Research. 52 (1), 1-17 (2021).
  27. Borcherding, D. C., et al. Sa1976 polyphenols reverse the pathologic effects of palmitic acid and high fat diet in canine enteroids. Gastroenterology. 158 (6), 486(2020).
  28. Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS ONE. 15 (4), 0231423(2020).
  29. Zdyrski, C., et al. Su124 homology directed repair in canine duodenal enteroids to mimic the wild-type P-glycoprotein mutation. Gastroenterology. 160 (6), 625(2021).
  30. Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. Organoid based personalized medicine: from bench to bedside. Cell Regeneration. 9 (1), 21(2020).
  31. Kurr, L. A., Allenspach, K., Jergens, A., Mochel, J. P. Harnessing the biology of intestinal organoids to accelerate drug discovery in inflammatory bowel disease: A one health approach. The FASEB Journal. 34, 1(2020).
  32. Nantasanti, S., et al. Disease modeling and gene therapy of copper storage disease in canine hepatic organoids. Stem Cell Reports. 5 (5), 895-907 (2015).
  33. Favier, R. P., et al. COMMD1-Deficient dogs accumulate copper in hepatocytes and provide a good model for chronic hepatitis and fibrosis. PLoS ONE. 7 (8), 42158(2012).
  34. Kruitwagen, H. S., et al. Long-term survival of transplanted autologous canine liver organoids in a COMMD1-deficient dog model of metabolic liver disease. Cells. 9 (2), 410(2020).
  35. Vilgelm, A. E., et al. Fine-needle aspiration-based patient-derived cancer organoids. iScience. 23 (8), 101408(2020).
  36. Saxena, K., et al. Human intestinal enteroids: A new model to study human rotavirus infection, host restriction, and pathophysiology. Journal of Virology. 90 (1), 43-56 (2016).
  37. VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Research. 37, 101430(2019).
  38. Powell, R. H., Behnke, M. S. WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals. Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).
  39. Mackenzie, J. S., Jeggo, M. The one health approach-why is it so important. Tropical Medicine and Infectious Disease. 4 (2), 88(2019).
  40. Artegiani, B., Clevers, H. Use and application of 3D-organoid technology. Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Organoidy psiehodowla organoid worganoidy w troboweorganoidy jelitoweizolacja organoid wutrzymanie organoid wbiobankowanie organoid wizolacja kom rek macierzystychmacierz zewn trzkom rkowamarkery organoid w
Standaryzacja i utrzymanie 3D kultur organoidowych wątroby i jelit psów do wykorzystania w badaniach biomedycznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.