Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Trójwymiarowy, bezsurowicowy system hodowli komórek macierzystych gruczołów łzowych

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63585

⸱

2 czerwca 2022

 ,  , 
1MOE Key Laboratory of Gene Function and Regulation, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University

W tym artykule

Podsumowanie

Metoda trójwymiarowej, bezsurowicowej hodowli komórek macierzystych dorosłych gruczołów łzowych (LG) jest dobrze znana do indukcji tworzenia i różnicowania organoidów LG w komórki groniaste lub przewodowe.

Streszczenie

Dla podstawowej kultury LGSC, LG od myszy w wieku 6-8 tygodni były trawione za pomocą dispasy, kolagenazy I i trypsyny-EDTA. W sumie 1 × 104 pojedyncze komórki wysiano do 80 μl matrycy żelowo-łzowej pożywki z komórek macierzystych gruczołu łzowego (LGSCM) w każdym dołku 24-dołkowej płytki, wstępnie pokrytej 20 μl matrycy żelowej-LGSCM. Mieszaninę zestalono po inkubacji przez 20 minut w temperaturze 37 °C i dodano 600 μl LGSCM.

W celu utrzymania LGSC, LGSC hodowane przez 7 dni były dezagregowane na pojedyncze komórki za pomocą dypazy i trypsyny-EDTA. Pojedyncze komórki wszczepiono i wyhodowano zgodnie z metodą zastosowaną w hodowli pierwotnej LGSC. LGSC mogą być pasażowane ponad 40 razy i w sposób ciągły eksprymować markery komórek macierzystych/progenitorowych Krt14, Krt5, P63 i nestiny. LGSC hodowane w LGSCM mają zdolność do samoodnawiania się i mogą różnicować się w komórki groniaste lub przewodowe in vitro i in vivo.

Wprowadzenie

Komórki macierzyste gruczołów łzowych (LGSC) utrzymują odnowę komórek gruczołów łzowych (LG) i są źródłem komórek groniastych i przewodowych. Dlatego przeszczep LGSC jest uważany za alternatywne podejście do leczenia ciężkich uszkodzeń zapalnych i zespołu suchego oka z niedoborem wody wodnistej (DODANO)1,2,3. Zastosowano kilka metod hodowli w celu wzbogacenia LGSC. Tiwari i wsp. odseparowali i wyhodowali pierwotne komórki LG przy użyciu kolagenu I i żelu macierzy uzupełnionego kilkoma czynnikami wzrostu; jednak komórki LG nie mogły być hodowane w sposób ciągły4. Korzystając z dwuwymiarowej (2D) hodowli, mysie komórki macierzyste pochodzące z LG zostały wyizolowane przez You i wsp.5 oraz Ackermann i wsp.6, stwierdzono ekspresję genów markerów komórek macierzystych/progenitorowych, Oct4, Sox2, Nanog i nestin, i może być subkulturowany. Nie ma jednak wyraźnych przesłanek, że komórki te mogą różnicować się w komórki groniaste lub przewodowe, nie ma też eksperymentu transplantacyjnego w celu zweryfikowania potencjału różnicowania in vivo.

Niedawno, komórki c-kit+ dim/EpCAM+/Sca1-/CD34-/CD45- zostały wyizolowane z mysich LG za pomocą cytometrii przepływowej, stwierdzono ekspresję markerów komórek progenitorowych LG, takich jak Pax6 i Runx1, i zróżnicowano je w kanaliki i acini in vitro. U myszy z ADD, ortotopowe wstrzyknięcie tych komórek może naprawić uszkodzone LG i przywrócić funkcję wydzielniczą LGs2. Jednak liczba komórek macierzystych wyizolowanych tą metodą była niewielka i nie ma odpowiednich warunków hodowli do namnażania izolowanych LGSC. Podsumowując, należy ustanowić odpowiedni system hodowli, aby skutecznie izolować i hodować dorosłe LGSC ze stabilną i ciągłą ekspansją w celu badania LGSC w leczeniu ADD.

Organoidy pochodzące z komórek macierzystych lub pluripotencjalnych komórek macierzystych to grupa komórek, które są histologicznie podobne do pokrewnych narządów i mogą utrzymywać swoją własną odnowę. Po tym, jak organoid jelita myszy został pomyślnie wyhodowany przez Sato i wsp. w 2009 r. 7, organoidy z innych narządów zostały kolejno wyhodowane, w oparciu o system hodowli Sato, taki jak woreczek żółciowy8, wątroba9, pancreas10, żołądek11, pierś12, lung13, prostata14 i gruczoł ślinowy15. Ze względu na wysoki odsetek dorosłych komórek macierzystych przed różnicowaniem komórek w hodowli organoidów, metoda trójwymiarowej (3D) hodowli organoidów jest uważana za optymalną do izolacji i hodowli dorosłych komórek macierzystych LG.

System hodowli LGSC u dorosłych myszy został stworzony w niniejszym badaniu poprzez optymalizację metody hodowli 3D, bez surowicy. Udowodniono, że LGSC wyhodowane zarówno z myszy normalnych, jak i myszy z DODATKIEM wykazywały stabilną zdolność do samoodnawiania się i proliferacji. Po przeszczepie do mysich LG z ADDED, LGSC skolonizowały upośledzone LG i poprawiły produkcję łez. Ponadto czerwone fluorescencyjne LGSC wyizolowano od myszy ROSA26mT/mG i hodowano. Praca ta stanowi wiarygodne odniesienie dla wzbogacania LGSC in vitro i autoprzeszczepu LGSC w zastosowaniach klinicznych w terapii ADD.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty w tym protokole były zgodne z wytycznymi Komitetu Etyki ds. Prób na Zwierzętach Uniwersytetu Sun Yat-sen. Wszystkie operacje związane z komórkami należy wykonywać na ultraczystym stole warsztatowym w sali operacyjnej komórki. Wszystkie operacje z użyciem ksylenu należy wykonywać w dygestoriach.

1. Podstawowa kultura LGSC

  1. Izolacja LG
    1. Zdobądź 6-8-tygodniowego samca myszy BALB/c i przetnij skórę za uchem, aby odsłonić LG i otaczającą go tkankę łączną. Oderwij tkankę łączną przez rozwarstwienie za pomocą pęsety i usuń LG.
    2. Opłucz LG dwukrotnie 4 ml sterylnego 10 mM roztworu PBS, aby usunąć krew z naczynia o średnicy 6 cm. Zanurz LG w 6 cm naczyniu z 4 ml 75% etanolu na 10 s i natychmiast spłucz 10 mM PBS dwa razy.
  2. Uzyskaj pojedyncze ogniwa LG
    1. Użyj roztworu buforowego HEPES (50 mM HEPES/KOH, pH 7,4; 150 mM NaCl w wodzie ultraczystej) do przygotowania 25 U/ml dypazy. Przygotuj 0,1% roztwór kolagenazy I z ultraczystą wodą.
    2. Pokrój LG na małe fragmenty (około 1 mm3), przenieś je do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i potraktuj tkanki 500 μl 25 U/ml dypazy i 500 μl 0,1% kolagenazy I przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    3. Użyj 10 mM PBS do przygotowania roztworu trypsyny-EDTA (0,05 g/l trypsyny, 0,04 g/l EDTA). Traktować fragmenty LG z kroku 1.2.2 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA przez 10 minut w temperaturze 37 °C i dysocjować fragmenty na pojedyncze komórki przez wielokrotne pipetowanie.
    4. Przefiltrować zawiesinę przez filtr 70 μm, zebrać filtrat do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować przy 150 × g przez 5 minut.
    5. Po odwirowaniu usunąć supernatant, dodać 10 ml 10 mM PBS w celu przepłukania osadu komórkowego i odwirować zawiesinę.
    6. Powtórzyć krok 1.2.5, usunąć supernatant i dodać 1 ml DMEM/F12 (mieszanina 1:1 zmodyfikowanej pożywki Eagle's Dulbecco i Ham's F-12) w celu ponownego zawieszenia granulek komórek.
  3. Kultura podstawowa LGSC
    1. Przygotuj pożywkę z komórek macierzystych gruczołów łzowych (LGSCM) zawierającą DMEM/F12, 1x suplement N2, 1x suplement B27, 2 mM substytut glutaminy, 0,1 mM NEAAs (aminokwasy endogenne), 50 ng/ml mysiego naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), 100 ng/ml czynnika wzrostu fibroblastów 10 (FGF10), 10 ng/ml Wnt3A i 10 μM Y-27632 (inhibitor ROCK).
    2. Dodać 20 μl żelu matrycowego - matrycy LGSCM (żel matrycowy: LGSCM = 1:1) w środku dołka płytki 24-dołkowej. Za pomocą końcówki pipety rozciągnąć ją do okręgu (średnica 6-8 mm) i inkubować mieszaninę przez 20 minut w temperaturze 37 °C, aby wstępnie pokryć dołek.
    3. Użyj licznika komórek, aby określić liczbę komórek i dodaj 40 μl LGSCM w sumie 1 ×10 4 komórek do 40 μl żelu matrycowego. Wymieszaj je delikatnie pipetą, aby uzyskać mieszaninę żelu matrycowego i LGSCM (żel matrycowy: LGSCM= 1:1).
    4. Za pomocą pipety ostrożnie upuść 80 μl mieszaniny na wstępnie pokryty obszar w każdym dołku płytki 24-dołkowej w kroku 1.3.2.
    5. Inkubować mieszaninę przez 20 minut w temperaturze 37 °C i dodać 600 μl LGSCM.
    6. Zmieniaj pożywkę hodowlaną w każdym dołku raz na dwa dni. Po 7 dniach hodowli poszukaj kulek LGSC o średnicy 100-300 μm pod mikroskopem odwróconym (okular: 10x, obiektyw: 4x).
      UWAGA: LGSC mogą być hodowane łącznie dłużej niż 14 dni.
  4. Wyizoluj i hoduj pierwotne LGSC myszy ROSA26mT/mG i myszy DED (NOD/ShiLtJ), wykonując czynności opisane powyżej.

2. Konserwacja i przejście LGSC

  1. Usuń pożywkę hodowlaną z kultury sfery.
  2. Kulki LGSC hodowane przez 7 dni należy rozdzielić przez inkubację w 20 μl 10 U/ml dypazy i 100 μl 10 mM PBS przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  3. Przenieść zawiesinę do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować przy stężeniu 150 × g przez 4 minuty. Usunąć supernatant.
  4. Traktować kulki 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Dodać 1 ml 0,05% inhibitora trypsyny (TI) i kilkakrotnie pipetować, aby zneutralizować trypsynę i zdysocjować kulki na pojedyncze komórki.
  5. Odwirować przy 150 × g przez 5 minut i usunąć supernatant w celu uzyskania LGSC w osadzie. Dodać 1 ml LGSCM, aby ponownie zawiesić osad LGSC.
  6. Umieść pojedyncze komórki na płytce zgodnie z opisem w krokach od 1.3.1 do 1.3.6.

3. Zróżnicowanie LGSC

  1. Procedura 1: Wydłużenie czasu hodowli LGSC z 7 do 14 dni za pomocą systemu hodowli LGSC do losowego różnicowania.
  2. Procedura 2: Zmienić stosunek mieszaniny żelu matrycowego i LGSCM z 1:1 na 1:2 na początku hodowli LGSC w celu różnicowania komórek przewodowych. Zasiaj LGSC w matrycy w celu indukcji przez 14 dni (patrz krok 1.3).
  3. Procedura 3: Po pasażu zastąp LGSCM mieszaniną LGSCM-10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w celu różnicowania komórek groniastych. Indukować różnicowanie przez 14 dni.

4. Odwodnienie tkanek LG

  1. Pobrać tkanki LG (krok 1.1.1) i płukać LG 4 ml sterylnego roztworu 10 mM PBS w naczyniu o średnicy 6 cm przez 2 minuty. Przenieść tkanki do 10% roztworu formaliny w celu utrwalenia przez 24 godziny.
  2. Przepłucz utrwalone tkanki 10 mM PBS przez 2 minuty, aby usunąć formalinę, a następnie przenieś tkankę do pudełka do zatapiania tkanek. Umieść pudełko do osadzania w automatycznej suszarce.
  3. Użyj automatycznego odwadniacza, aby odwodnić tkanki w następujący sposób: 70% etanol, 2 h; 80% etanolu, 2 godziny; 90% etanolu, 30 min; 95% etanolu, 30 min; etanolu absolutnego, 30 min; etanolu absolutnego, 2 h; etanolu bezwzględnego: mieszaniny 100% ksylenu (1: 1), 30 min; 100% ksylenu, 30 min; 100% ksylenu, 2 h; 100% ksylenu: mieszanina parafiny (1: 1), Czas trwania: 30 min; parafina, 2 h; parafina,3 h.

5. Odwodnienie organoidów/kul LG

  1. Otrzymać organoidy/kulki LG (kroki 2.1-2.3) w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przepłukać organoidy/kulki LG 1 ml sterylnego roztworu 10 mM PBS przez 2 minuty.
  2. Wirować przy 100 × g przez 1 minutę i usunąć supernatant.
  3. Przygotować 4% roztwór paraformaldehydu (PFA) w następujący sposób: dodać 20 g PFA do mieszaniny 400 ml 10 mM PBS i 40 μl 1 M NaOH, dobrze wstrząsnąć roztworem i podgrzewać go w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C przez 2 godziny, aż do całkowitego rozpuszczenia PFA. Po schłodzeniu do temperatury pokojowej użyć 10 mM PBS uzupełnić objętość do 500 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Dodać 1 ml 4% PFA do probówki mikrowirówki z osadem organoid/kula i umieścić probówkę w lodówce o temperaturze 4 °C na co najmniej 24 godziny w celu utrwalenia.
  5. Po utrwaleniu odwirować przy 100 × g przez 1 minutę i usunąć supernatant. Dodać 1 ml 10 mM PBS do probówki mikrowirówki z osadem organoid/kulka i delikatnie mieszać pipetując przez 2 minuty, aby spłukać PFA. Powtórz ten krok dwukrotnie.
  6. Wirować przy 100 × g przez 1 minutę i usunąć supernatant.
  7. Podgrzej hydrożel do zatapiania, aby się rozpuścił i dodaj 50-60 μl hydrożelu do zatapiania do osadzania osadzającego się osadu i wymieszaj. Odpipetować mieszaninę na parafilm w postaci kropelki i odczekać 5 minut, aż zastygnie w temperaturze pokojowej.
  8. Odwodnić żel z organoidami/kulkami w nowej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml w następujący sposób.
    1. Dodaj 1 ml 50% etanolu do probówki, odczekaj 30 minut w temperaturze pokojowej i usuń płyn z probówki przez pipetowanie. Powtórz ten krok, zmieniając stężenie etanolu na kolejno 70%, 80%, 90%, 95%.
    2. Dodać 1 ml bezwzględnego etanolu do probówki, odczekać 30 minut w temperaturze pokojowej i usunąć płyn z probówki przez pipetowanie. Powtórz ten krok.
    3. Dodać 1 ml mieszaniny 0,5 ml bezwzględnego etanolu i 0,5 ml 100% ksylenu do probówki, odczekać 30 minut w temperaturze pokojowej i usunąć płyn z probówki przez pipetowanie.
    4. Dodać 1 ml 100% ksylenu do probówki, odczekać 30 minut w temperaturze pokojowej i usunąć płyn z probówki przez pipetowanie. Powtórz ten krok.
      UWAGA: Kroki 5.8.5-5.8.6 należy wykonać w kąpieli metalowej w temperaturze 65 °C.
    5. Dodać 1 ml mieszaniny 0,5 ml parafiny i 0,5 ml 100% ksylenu do probówki, odczekać 30 minut w temperaturze 65 °C i usunąć płyn z probówki za pomocą pipetowania.
    6. Dodać 1 ml parafiny do probówki, odczekać 30 minut w temperaturze 65 °C i usunąć płyn z probówki przez pipetowanie. Powtórz ten krok i wydłuż czas przetwarzania do 1 godziny.

6. Osadzanie i cięcie parafiny

  1. Zatapianie parafiny
    1. Przed zatopieniem włącz maszynę do zatapiania i podgrzej ją, aby stopić wosk parafinowy w zbiorniku parafiny.
    2. Umieść odwodnioną tkankę lub żel organoidowy/kulkowy w rowku żelaznego pudełka do zatapiania i włóż żelazne pudełko do parafiny maszyny do zatapiania.
    3. Zdejmij plastikową pokrywkę i umieść plastikowe pudełko do osadzania na żelaznym pudełku, aby je przykryć. Przenieś pudełko do osadzania na stół chłodzący.
    4. Po skondensowaniu parafiny w bloki w pudełku do zatapiania, wyjmij ją z żelaznego pudełka i pokrój bezpośrednio lub przechowuj tymczasowo w lodówce o temperaturze 4 °C.
  2. Cięcie parafiny
    1. Przed krojeniem parafiny zmontuj krajalnicę do parafiny i dodaj wodę destylowaną do zlewu krajalnicy w celu podgrzania. Rozpocznij krojenie, gdy temperatura wody wzrośnie do 42 °C.
    2. Umieścić próbkę w gnieździe na próbkę krajalnicy parafinowej. Dostosuj grubość przekroju do 5 μm podczas krojenia.
    3. Dziel próbkę w sposób ciągły. Zamocuj całkowicie wyłożoną kafelkami część na prowadnicy antypoślizgowej w zbiorniku krajalnicy.
    4. Po podziale na sekcje umieścić szkiełka z dołączoną próbką tkanki w inkubatorze biochemicznym w temperaturze 37 °C w celu wyschnięcia przez 24 godziny. Tymczasowo przechowywać szkiełka w lodówce w temperaturze 4 °C.

7. Barwienie hematoksyliną i eozyną

  1. Skrawki parafiny rozpuścić w temperaturze 60 °C przez 30 min, namoczyć skrawki w 100% ksylenie przez 15 min i powtórzyć.
  2. Traktuj skrawki absolutnym etanolem na wytrząsarce przez 5 minut.
  3. Potraktuj sekcje 90% etanolem, 80% etanolem i 70% etanolem na shakerze, każda przez 3 minuty.
  4. Traktuj skrawki wodą dejonizowaną na wytrząsarce przez 5 minut i kolejno 2 minuty.
  5. Zabarwić skrawki na mokrym pudełku przez 5 minut roztworem hematoksyliny o stężeniu 4 mg/ml. Opłucz sekcje pod bieżącą wodą przez 10 minut.
  6. Mieszaj skrawki na wytrząsarce najpierw z wodą dejonizowaną przez 2 minuty, a następnie z 0,5%-1% eozyną przez 1 minutę.
  7. Mieszać sekcje z 70% etanolem, 80% etanolem i 90% etanolem na wytrząsarce przez 3 minuty (każda) kolejno. Mieszać skrawki z absolutnym etanolem na wytrząsarce przez 5 minut.
  8. Namocz skrawki w 100% ksylenie przez 15 minut i powtórz namaczanie.
  9. Za pomocą pipety lub zakraplacza dodaj 3-4 krople neutralnego balsamu do szkiełka i powoli przykryj je szkiełkiem podstawowym. Wysuszyć szkiełka na powietrzu w temperaturze pokojowej.

8. Barwienie immunohistochemiczne (IHC)

  1. Skrawki parafiny rozpuścić w temperaturze 60 °C przez 30 minut, namoczyć skrawki w 100% ksylenie na 10 minut i powtórzyć ten krok dwukrotnie.
  2. Mieszaj skrawki na wytrząsarce najpierw z absolutnym etanolem, 90% etanolem i 80% etanolem przez 2 minuty (każda), kolejno, a następnie z wodą dejonizowaną przez 3 minuty. Powtórz mieszanie z wodą dejonizowaną dwukrotnie.
  3. Najpierw mieszać skrawki na wytrząsarce mieszaniną 20 ml 30%H2O2i 180 ml metanolu przez 10 minut, a następnie wodą dejonizowaną przez 5 minut. Powtórz ten krok trzy razy.
  4. Przenieść skrawki do wstępnie przegotowanego buforu kwasu cytrynowego (1 l wody dejonizowanej z 3 g Na3C6H5O7,2H 2O i 0,4 g C6H8O7, pH 6,0), podgrzać w kuchence mikrofalowej przez 10 minut, aby utrzymać je w temperaturze podkrytycznej wrzenia i schłodzić w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Mieszać skrawki wodą dejonizowaną na wytrząsarce przez 5 minut. Powtórz ten krok trzy razy.
  5. Mieszać skrawki z 10 mM PBS na wytrząsarce przez 5 minut i powtórzyć ten krok trzy razy. Owiń obszar tkanki na mokrym pudełku wodoodpornym markerem, dodaj kroplę gotowej do użycia nieimmunologicznej surowicy koziej, aby pokryć próbki i umieść je w temperaturze pokojowej na 1 godzinę.
  6. Usunąć surowicę, dodać przeciwciało pierwszorzędowe do próbek (patrz Tabela Materiałów) i inkubować je przez noc w temperaturze 4 °C. Usunąć przeciwciało pierwszorzędowe, mieszać skrawki z 10 mM PBS na wytrząsarce przez 5 minut i powtórzyć ten etap mieszania z 10 mM PBS trzy razy.
  7. Dodać przeciwciało drugorzędowe (patrz tabela materiałów) w celu przykrycia próbek i inkubować je w wilgotnym pudełku przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Mieszać skrawki z 10 mM PBS na wytrząsarce przez 5 minut i powtórzyć etap mieszania trzy razy.
  8. Dodać świeżo przygotowany 0,03-0,05% roztwór 3,3'-diaminobenzydyny (DAB), aby przykryć próbki na mokrym pudełku i barwić przez 30-90 s. Płukać sekcje bieżącą wodą przez 10 min.
    UWAGA: Kontroluj czas barwienia, obserwując pod mikroskopem świetlnym, aż pojawi się żółty kolor.
  9. Dodać 4 mg/ml roztworu hematoksyliny, aby przykryć próbki, zabarwić przez 5 minut na mokrym pudełku i płukać skrawki bieżącą wodą przez 10 minut.
  10. Mieszać sekcje na wytrząsarce z 80% etanolem, 90% etanolem i etanolem absolutnym przez 2 minuty każda, kolejno i moczyć sekcje w 100% ksylenie przez 30 minut.
  11. Za pomocą pipety lub zakraplacza dodaj 3-4 krople neutralnego balsamu do szkiełka i powoli przykryj je szkiełkiem podstawowym. Wysuszyć szkiełka na powietrzu w temperaturze pokojowej.

9. Globalne barwienie immunofluorescencyjne organoidów/kulek

UWAGA: Zbierz organoidy/kulki utrwalone 4% roztworem PFA w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml (patrz kroki od 5.1 do 5.4). Wykonaj znakowanie fluorescencyjne w następujący sposób.

  1. Odwodnić organoidy/kulki, dodając 1 ml 30% roztworu sacharozy do probówki i inkubować przez noc w lodówce w temperaturze 4 °C.
  2. Dodać 100 μl roztworu PBST (10 mM roztworu PBS z 0,1% Triton X-100) do probówki, aby przepłukać organoidy/kulki przez 5 minut, odwirować probówkę o stężeniu 100 × g przez 1 minutę i zebrać osad. Powtórz ten krok trzy razy.
  3. Dodać 0,5-1 ml gotowej do użycia nieimmunologicznej surowicy koziej do probówki i zamknąć w temperaturze pokojowej na 1 godzinę. Odwirować probówkę o masie 100 × g przez 1 minutę i zebrać osad.
  4. Dodać kilka kropli rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego, aby przykryć osad i inkubować w lodówce w temperaturze 4 °C przez 48 godzin. Odwirować probówkę o stężeniu 100 × g przez 1 minutę i zebrać osad.
  5. Powtórz krok 9.2.
  6. Dodać kilka kropli fluorescencyjnego przeciwciała drugorzędowego i roztworu 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) do probówki, aby po prostu przykryć osad i inkubować w lodówce w temperaturze 4 °C przez 24 godziny, unikając światła.
  7. Powtórz krok 9.2, unikając światła.
  8. Dodać 100 μl roztworu PBST do probówki i przechowywać ją tymczasowo w lodówce o temperaturze 4 °C, z dala od światła. Obserwuj i fotografuj organoidy/kule za pomocą mikroskopu skaningowego z arkuszami świetlnymi.

10. LGSC pLX-mTransfekcja wiśniowa

UWAGA: Produkcja cząstek lentiwirusowych musi odbywać się w komorze bezpieczeństwa biologicznego i czystym stole na poziomie bezpieczeństwa biologicznego BSL2.

  1. Hodować komórkę pakującą lentiwirusa 293T na 6-dołkowej płytce z DMEM + 10% FBS w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 3-5 dni, aby osiągnąć 80% zbieżności komórek.
  2. Transfekcja wektora lentiwirusa pLX-mCherry do LGSCs.
    UWAGA: Przygotowanie odczynnika jest wskazane dla jednego dołka płytki 6-dołkowej.
    1. Przygotuj dwie sterylne probówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml i dodaj 250 μl DMEM/F12 do każdej probówki.
    2. Dodać 7,5 μl odczynnika do transfekcji do jednej probówki i dokładnie wymieszać odczynnik przez pipetowanie.
    3. Dodać 2 μg plazmidu pLX-mCherry bez endotoksyny i pasującego plazmidu do opakowania lentiwirusa do innej probówki i dodać odczynnik do transfekcji (2 μl/μg plazmidu).
    4. Wymieszaj płyn w obu probówkach wirówkowych i odstaw mieszaniny na 5 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Usunąć pożywkę z komórek 293T i dodać mieszaninę z etapu 10.2.4 do komórek 293T. Po 8 godzinach zmień pożywkę hodowlaną na świeży DMEM + 10% FBS.
    6. Po 48 godzinach należy po raz pierwszy zebrać supernatant wirusa i przefiltrować go przez filtr 0,45 μm. Po 72 godzinach zebrać supernatant wirusa po raz drugi i ponownie przefiltrować go przez filtr 0,45 μm.
      UWAGA: Oba przefiltrowane supernatanty należy przechowywać na lodzie do czasu transdukcji lentiwirusa.
  3. Uzyskaj LGSC od myszy DED (NOD/ShiLtJ) (patrz krok 1).
  4. Dodać 1 ml wstępnie zebranego supernatantu lentiwirusa pLX-mCherry w celu ponownego zawieszenia komórek.
  5. Ustawić probówkę wirówkową na wytrząsarce w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C. Wstrząsnąć nią z prędkością 100 obr./min, aby zmaksymalizować kontakt między lentiwirusem a komórkami. Po 8 godzinach odwirować mieszaninę o stężeniu 250 × g przez 4 minuty i usunąć sklarowany nad osadem.
  6. Dodać 1 ml DMEM/F12 w celu ponownego zawieszenia osadu komórkowego. Użyj licznika komórek, aby określić liczbę komórek i zasiać łącznie 1 ×10 4 komórek w 100 μl żelu matrycowego-matrycy LGSCM (żel matrycowy: LGSCM = 1:1) w każdym dołku 24-dołkowej płytki wstępnie pokrytej 20 μl żelu matrycowego-matrycy LGSCM (patrz krok 1.3.2).
  7. Po 7 dniach hodowli (patrz krok 1) wybierz kulki wykazujące czerwoną fluorescencję pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby rozszerzyć hodowlę.

11. Przeszczep ortotopowy LGSC

UWAGA: Wszystkie operacje chirurgiczne są wykonywane w sali operacyjnej SPF, a wszystkie narzędzia chirurgiczne są sterylizowane.

  1. Otrzymaj kulki LGSC od myszy ROSA26mT / mG z czerwoną fluorescencją (td-Tomato) lub transfekcją mCherry hodowanych przez 7 dni (patrz krok 1).
  2. Przed użyciem schłodzić na lodzie probówkę mikrowirówkową o pojemności 1,5 ml zawierającą mieszaninę żelu matrycowego i DMEM/F12 w stosunku 1:1. Kulki LGSC należy strawić na pojedyncze komórki i ponownie zawiesić komórki w gęstości 2 × 106 komórek/ml w probówce.
  3. Znieczulić myszy NOD/ShiLtJ przez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu (50 mg / kg).
    UWAGA: Mysz NOD / ShiLtJ jest idealnym modelem z idiopatycznymi objawami DODATKOWYMI, w tym zmniejszonym wydzielaniem łez, naciekiem zapalnym i owrzodzeniem oczodołu.
  4. Po znieczuleniu użyj soli fizjologicznej lub maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu, a następnie użyj nożyczek okulistycznych, aby wykonać 5-8 mm nacięcie w skórze za uchem (w pobliżu oka) myszy znieczulających, aby odsłonić LGs.
    UWAGA: Jodofor należy stosować wyłącznie do dezynfekcji okolic nacięcia.
  5. Wstrzyknąć 2 × 104 komórki do LG po lewej stronie i wstrzyknąć mieszaninę bez komórek (patrz krok 11.2) do LG po prawej stronie jako kontrolę.
  6. Po wstrzyknięciu przywróć LG do ich pierwotnych pozycji za pomocą kleszczy okulistycznych i zszyj ranę. Karm myszy przez 2 miesiące i obserwuj efekt zabiegu.
    UWAGA: Materiał poduszki klatki musi być również ściśle wysterylizowany po operacji, a materiał poduszki należy wymieniać raz dziennie. Po zszyciu rany tramadol można selektywnie wstrzykiwać do żyły ogonowej myszy w standardowej dawce 2,5 mg/kg w celu uzyskania znieczulenia.
  7. Znieczulenie tych myszy należy przeprowadzić 2 miesiące po eksperymencie (patrz krok 11.3). Sfilmuj objawy okolicy oka.
    1. Podczas znieczulenia zwróć uwagę na następujące objawy: rozluźnienie mięśni szyi i kończyn, głęboki, powolny i jednostajny oddech, zwężenie źrenicy, zanik odruchu rogówkowego.
    2. Podczas znieczulenia i operacji należy utrzymywać temperaturę ciała myszy na poziomie 37 °C. Po zabiegu dodaj odpowiednie antybiotyki do wody pitnej dla myszy, aby zmniejszyć ryzyko zakażenia rany. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyskają wystarczającej przytomności, aby utrzymać leżący mostek. Nie zwracaj myszy, które przeszły operację, do towarzystwa innych myszy, dopóki w pełni nie wyzdrowieją.
    3. Po sfilmowaniu objawów okolicy oka otwórz oprogramowanie ImageJ, kliknij Plik | Otwórz | Zaznaczenia odręczne, przytrzymaj lewy przycisk myszy i wybierz obszar owrzodzenia oczodołu na obrazie. Kliknij Analizuj | Zmierz, aby uzyskać względny obszar owrzodzenia.
  8. Połóż nić bawełnianą z czerwieni fenolowej na bocznym kancie myszy znieczulających na 10 s; zmierz i zapisz długość odbarwionej części nici bawełnianej. Poddaj myszy eutanazji przez zwichnięcie kręgów szyjnych po pomiarze łez.
  9. Przeanalizuj myszy i uzyskaj LG do analizy IHC.

12. Izolacja RNA

UWAGA: Przed eksperymentem należy schłodzić wirówkę do 4 °C i upewnić się, że wszystkie odczynniki i materiały eksploatacyjne są wolne od zanieczyszczenia RNAzą.

  1. Zbierz LGSC lub fragmenty LG w probówce do mikrowirówki. Dodaj 1 ml buforu do lizy komórek i całkowicie zliźuj komórki lub tkanki za pomocą oscylacji wirowej.
  2. Dodać 0,2 ml chloroformu i odstawić w temperaturze pokojowej na 10 minut po oscylacji wirowej przez 1 minutę. Wirować przez 15 minut w temperaturze 4 °C, 12 000 × g,
    UWAGA: Po odwirowaniu ciecz dzieli się na trzy warstwy, a RNA znajduje się w najwyższej przezroczystej fazie wodnej.
  3. Ostrożnie odpipetować górną przezroczystą fazę wodną i przenieść ją do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml bez RNAse.
  4. Dodaj równą objętość alkoholu izopropylowego i delikatnie wymieszaj. Pozostawić mieszaninę w temperaturze pokojowej na 10 minut, a następnie odwirować przez 15 minut w temperaturze 4 °C, 12 000 × g.
  5. Usuń supernatant i dodaj 1 ml 75% etanolu. Odwrócić probówkę, aby przepłukać osad i odwirować przez 5 minut w temperaturze 4 °C, 7 500 × g. Powtórz ten krok.
  6. Ostrożnie usunąć supernatant i umieścić probówkę wirówkową w ultraczystym stole warsztatowym, aby wysuszyć ją przez około 20 minut.
    UWAGA: Przejdź do następnego kroku, gdy biała granulka stanie się przezroczysta. Wszystkie operacje wykonuj na lodzie.
  7. Dodaj 20 μl wody bez RNAse, aby całkowicie rozpuścić osad. Zmierzyć stężenie RNA za pomocą spektrofotometru (patrz tabela materiałów) i przechowywać roztwór RNA w temperaturze -80 °C.

13. PCR

  1. Reakcja odwrotnej transkrypcji
    1. Dodać 1 μg całkowitego RNA (obliczyć objętość dodanego roztworu RNA zgodnie ze stężeniem roztworu RNA) do probówki reakcyjnej PCR i inkubować w temperaturze 65 °C przez 5 minut w celu denaturacji.
    2. Umieść go na lodzie na 1 minutę, a następnie dodaj wodę bez enzymów, aż całkowita objętość osiągnie 12 μl. Dodać 4 μl 4x DNA Master Mix i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
    3. Umieść probówkę na lodzie, dodaj 4 μl 5x RT Master Mix i delikatnie wymieszaj. Ustaw następujące ustawienia PCR: 37 °C przez 15 min, 50 °C przez 5 min, 98 °C przez 5 min, 4 °C przez 1 min.
    4. Przechowywać w temperaturze -20 °C lub przejść do następnego kroku po zakończeniu reakcji odwrotnej transkrypcji.
  2. Reakcja PCR
    1. Przygotować reakcję PCR w probówce PCR w następujący sposób: 14,1 μl wody wolnej od enzymów, 2 μl dNTP, 2 μl 10x buforu, 0,8 μl startera (10 μM, 0,4 μl startera do przodu i 0,4 μl startera odwrotnego, patrz tabela materiałów), 1 μl cDNA z odwrotną transkrypcją (patrz krok 13.1) i 0,1 μl enzymu Taq.
    2. Umieścić przygotowaną reakcję PCR w aparacie PCR do PCR. Zapoznaj się z instrukcją zestawu enzymatycznego Taq dla procedury PCR (patrz Tabela materiałów).
  3. Elektroforeza w żelu agarozowym
    1. Za pomocą wagi analitycznej zważyć 242 g Tris i 37,2 g Na2EDTA·2H2O i dodać je do zlewki o pojemności 1 l. Dodaj ~800 ml wody dejonizowanej i 57,1 ml lodowatego kwasu octowego do zlewki, dobrze wymieszaj, dodaj wodę dejonizowaną do 1 l, aby uzyskać 50-krotny bufor TAE i przechowuj w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Przed użyciem rozcieńczyć 50x bufor TAE wodą dejonizowaną.
    2. Za pomocą wagi analitycznej zważyć 1,2 g agarozy i dodać ją do stożkowej kolby zawierającej 80 ml buforu 1x TAE. Podgrzej go kilkakrotnie w kuchence mikrofalowej, aż do całkowitego rozpuszczenia.
    3. Schłodzić kolbę pod bieżącą wodą z kranu, aż temperatura roztworu spadnie do 60 °C. Dodać 8 μl barwnika kwasu nukleinowego, po dokładnym wymieszaniu wlać roztwór do zbiornika żelatynizującego, umieścić grzebień i odstawić w temperaturze pokojowej na 30 minut.
    4. Wyciągnij grzebień i załaduj produkty PCR do przygotowanego żelu agarozowego. Wykonać elektroforezę przy napięciu 120 V przez 30 min.
    5. Umieść żel w systemie obrazowania ECL Gel i zrób zdjęcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ustanowienie trójwymiarowego (3D), bezzserwatkowego systemu hodowli
W niniejszym badaniu opracowano LGSCM zawierający EGF, Wnt3A, FGF10 oraz Y-27632 dla mysich LGSCs; LGSCs zostały pomyślnie wyizolowane i hodowane metodą hodowli 3D (Rysunek 1A). Przy użyciu tej metody ustanowiono skuteczny 3D, bezzserwatkowy system hodowli LGSCs z myszy C57BL/6, myszy NOD/ShiLtJ, myszy BALB/c oraz myszy ROSA26mT/mG16. W przypadku samca myszy, poprzez dy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Istnieją dobrze znane metody izolacji i hodowli in vitro łzowych komórek macierzystych w celu hodowli łzowych komórek macierzystych i naprawy uszkodzeń LG. Shatos i wsp.17 oraz Ackermanni wsp.6 pomyślnie hodowanych i subhodowanych łzowych komórek macierzystych szczurów i myszy odpowiednio metodami hodowli 2D, co umożliwia przeszczepienie łzowych komórek macierzystych w celu leczenia ADD. Badania na komórkach macierzystych18 i mezenc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 31871413) oraz dwa Programy Nauki i Technologii Guangdong (2017B020230002 i 2016B030231001). Jesteśmy naprawdę wdzięczni naukowcom, którzy pomogli nam podczas badania oraz pracownikom pracującym w centrum dla zwierząt za ich wsparcie w opiece nad zwierzętami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Animal(Mouse)
Bal B/CModel Centrum Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu w Nankinie
C57 BL/6JCentrum Zwierząt Laboratoryjnych Uniwersytetu
NOD/ShiLtJModel Centrum Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu
ROSA26mT/mGModelowe Centrum Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu
Sprzęt
Waga analitycznaSartorius
Automatyczna suszarkaThermo
Komora do liczenia krwiBLAU
Licznik komórekCountStar
Inkubator stałej temperatury CO2System
ECL GEhealthcare
Łaźnia elektryczna do kąpieli wodnejTechnologia
Aparatura do elektroforezyBioRad
Fluorescencyjny ilościowy instrument PCRRoche
Krajalnica do mrożonych tkanekLecia
Wirówka poziomaCENCE
Odwrócony mikroskop fluorescencyjnyNikon
Mikroskop odwróconyOlympus
Laserowy blaszkowy mikroskop skaningowyCarl Zeiss
Pojemnik na ciekły azotThermo
Niska temperatura wysoka wirówka prędkościEppendorf
MicropipettorGilson
Kuchenka mikrofalowaultrafioletowy Panasonic
NanodropPomiartemperatury stężenia
Krajalnica parafinowaWzmacniacz Thermo
PCREppendorf
Tester wartości pHSartorius
4 ° C LodówkaHaier
Termostatyczny oscylator hodowliZHICHENG
Przyrząd do zatapiania parafiny tkankowejTermo
 -80° C Lodówka ultraniskotemperaturowaTermo
 -20° C Lodówka ultraniskotemperaturowaSystem
UltraELGA
u>Reodagent
Animal Experiment
HCGSigma9002-61-3
PMSGSigma14158-65-7
Pentobarbital SodiumSigma57-33-0
Cell Culture
B27Gibco17504044
Collagenase IGibco17018029
DispaseBD354235
DMEMSigmaD6429
DMEM/F12SigmaD0697
DMSOSigma67-68-5
EDTASangon BiotechA500895
Płodowa surowica bydlęcaGibco04-001-1ACS
GlutaMaxGibco35050087
Human FGF10PeproTech100-26
Matrigel (Matrix gel)BD356231
Murine NogginPeproTech250-38
Murine Wnt3APeproTech315-20
Murine EGFPeproTech315-09
NEAAGibco11140050
N2Gibco17502048
R-spondyna 1PeproTech120-38
Inhibitor trypsyny (TI)SigmaT6522Pochodząca z Glycine max; może w mniejszym stopniu hamować trypsynę, chymotrypsynę i plazminazę. Jeden mg hamuje 1,0-3,0 mg trypsyny.
TrypsynaSigma  T4799
Y-27632SelleckS1049
HE barwienie i Barwienie immunologiczne
Alexa Fluor 488 osioł anty-mysie IgGThermoA-21202Stosowane rozcieńczenie: IHC) 2 μ g/ml, (IF) 0,2 μ g / mL
Alexa Fluor 488 osioł anty-królik IgGThermoA-21206Używane rozcieńczenie: (IHC) 2 i mu; g/ml, (jeżeli) 2 i m; g / mL
Alexa Fluor 568 osioł anty-mysz IgGThermoA-10037Używane rozcieńczenie: (IHC) 2 i mu; g/ml, (jeżeli) 2 i m; g / mL
Alexa Fluor 568 osioł anty-królik IgGThermoA-10042Używane rozcieńczenie: (IHC) 2 i mu; g/ml, (IF) 4 &m; g / ml
Przeciwciało królika anty-AQP5Abcamab104751Użyte rozcieńczenie: (IHC) 1 i mu; g/ml, (IF) 0,1 μ g / ml
Przeciwciało anty-E-kadheryny szczuraAbcamab11512Używane rozcieńczenie: (IF)  5 μ g / ml
Przeciwciało królicze anty-Keratyna14Abcamab181595Używane rozcieńczenie: (IHC) 1 i mu; g/ml, (jeżeli) 2 i m; g / mL
przeciwciało królika anty-Ki67Abcamab15580Używane rozcieńczenie: (IHC) 1 μ g/ml, (IF) 1 & m; g / mL
Mysie przeciwciało anty-mCherryAbcamab125096Używane rozcieńczenie: (IHC) 2 μ g/ml, (jeżeli) 2 i m; g / ml
przeciwciało anty-mCherry rabbitAbcamab167453Używane rozcieńczenie: (IF)  2 μ g / ml
C6H8O7Sangon BiotechA501702-0500
Kwas cytrynowySangon Biotech201-069-1
Zestaw DAB (20x)CWBIOCW0125
DAPIThermo62248
EosinBASO68115
Montaż fluorescencyjny MediumDakoS3023
FormalinaSangon BiotechA501912-0500
Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (HRP)Abcamab6789Używane rozcieńczenie: 2 i mu; g / ml
koziego przeciwciała anty-króliczego IgG (HRP)Abcamab6721Używane rozcieńczenie: 2 i mu; g / ml
HematoxylinBASO517-28-2
Histogel (hydrożel do zatapiania)ThermoHG-400-012
30% H2O2Guangzhou ChemistryKD10
30% roztwór nadtlenku wodoruGuangzhou Chemistry7722-84-1
MetanolGuangzhou Chemistry67-56-1
Na3C6H5O7.2H2OSangon BiotechA501293-0500
Neutralny balsamSHANGHAI YIYANGYY-Neutralny balsam
Nieszczepione kozie serumBOSTERAR0009
ParafinaSangon BiotechA601891-0500
ParaformaldehydDAMAO200-001-8
SacharozaGuangzhou Chemistry57-50-1
Cytrynian sodu trójzasadowy dwuwodnySangon Biotech200-675-3
SacharozaGuangzhou ChemistryIB11-AR-500G
Tissue-Tek O.T.C. CompoundSAKURASAKURA.4583
Triton X-100DINGGUO9002-93-1
KsylenGuangzhou Chemia128686-03-3
RT-PCR & qRT-PCR
AgaroseSigma9012-36-6
AlkoholGuangzhou Chemia64-17-5
ChloroformGuangzhou Chemia865-49-6
Bromek etydynySangon Biotech214-984-6
Alkohol izopropylowyGuangzhou Chemia67-63-0
LightCycler 480 SYBR Green I Master MixRoche488735200H
ReverTra Ace qPCR RT Master MixPolimeraza DNA TOYOBO-Taq
TAKARAR10T1
Goldview (kwas nukleinowy bejca)BioSharpBS357A
TRIzolMagenR4801-02
Vector Konstrukcja & Transfekcja komórek
Agar
Sigma69-52-3
ChloramfenikolSigma56-75-7
Zestaw do ekstrakcji plazmidu bez endotoksynThermoA36227
KanamycinSigma25389-94-0
Plazmid Lipo3000 Zestaw do transfekcjiThermoL3000015
Zestaw reakcyjny LRZestaw
TIANGENDP103
Trans5α Chemicznie kompetentna komórkaTRANSGENCD201-01
TrytoneOXID-Ekstrakt
drożdżowyOXID<
strong>Startery i sekwencjaCompany
Primer: AQP5
Sequence:
F: CATGAACCCAGCCCGATCTT
R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC		Synbio Tech
Primer: β-aktyna
Sekwencja:
F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT
R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCTCTT		Synbio Tech
Primer: Epcam
Sequence:
F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT
R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG		Synbio Tech
Primer: Krt5
Sequence:
F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG
R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC		Synbio Tech
Primer: Krt14
Sequence:
F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA
R: GCCACCTCCTCGTGGTTC		Synbio Tech
Primer: Krt19
Sequence:
F: TCTTTTTGAAAAACACTGAACCCTG
R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT		Synbio Tech
Primer: Ltf
Sequence:
F: CACATGCTGTCGTATCCCGA
R: CGATGCCCTGATGGACGA		Synbio Tech
Primer: Nestin
Sequence:
F: GGGGCTACAGGGGGAAAC
R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT		Synbio Tech
Primer: P63
Sequence:
F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA
R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC		Synbio Tech
Vector
pLX302 lentivirus wektor bez obciążeniaAddgene
pENRTY-mLaboratoriumCherry Xiaofeng Qin, Uniwersytet
Sun Yat-senw Nankinie w Nankinie obrazowania żelowego Thermo Yiheng Spektrofotometr RNA oczyszczania wody Thermo < OXID-Ampicillin do ekstrakcji plazmidu Thermo 11791019 Sun Yat-sen

Bibliografia

  1. Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation. Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).
  2. Gromova, A., et al. Lacrimal gland repair using progenitor cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2016).
  3. Buzhor, E., et al. Cell-based therapy approaches: the hope for incurable diseases. Regenerative Medicine. 9 (5), 649-672 (2014).
  4. Tiwari, S., et al. Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function. PLoS One. 7 (1), 29458(2012).
  5. You, S., Kublin, C. L., Avidan, O., Miyasaki, D., Zoukhri, D. Isolation and propagation of mesenchymal stem cells from the lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2087-2094 (2011).
  6. Ackermann, P., et al. Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Lugli, N., et al. R-spondin 1 and noggin facilitate expansion of resident stem cells from non-damaged gallbladders. EMBO Reports. 17 (5), 769-779 (2016).
  9. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1), 299-312 (2015).
  10. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1), 324-338 (2015).
  11. Barker, N., et al. Lgr5+(ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  12. Linnemann, J. R., et al. Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells. Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).
  13. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  14. Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (1), 951-961 (2014).
  15. Maimets, M., et al. Long-term in vitro expansion of salivary gland stem cells driven by Wnt signals. Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).
  16. Xiao, S., Zhang, Y. Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 20(2020).
  17. Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
  18. Mishima, K., et al. Transplantation of side population cells restores the function of damaged exocrine glands through clusterin. Stem Cells. 30 (9), 1925-1937 (2012).
  19. Aluri, H. S., et al. Delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves tear production in a mouse model of sjögren's syndrome. Stem Cells International. 2017, 1-10 (2017).
  20. Dietrich, J., Schrader, S. Towards lacrimal gland regeneration: current concepts and experimental approaches. Current Eye Research. 45 (3), 230-240 (2020).
  21. Sato, T., Clevers, H. SnapShot: growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700(2015).
  22. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
  23. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. Basement membrane matrix (BME) has multiple uses with stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (1), 163-169 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

hodowla trójwymiarowaróżnicowanie komórek macierzystychindukcja komórek acynarnychróżnicowanie komórek przewodowychhodowla w żelu macierzymarkery komórek macierzystychizolacja pierwotnych komórekekspansja komórek macierzystych
Trójwymiarowy, bezsurowicowy system hodowli komórek macierzystych gruczołów łzowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.