Ten protokół opisuje, jak trójwymiarowy system hodowli komórkowej może być używany do modelowania, leczenia i analizowania modyfikacji chromatyny w stanie zbliżonym do fizjologicznego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Kwantyfikacja na poziomie globalnym modyfikacji potranslacyjnych histonów w modelu 3D hodowli komórkowej tkanki wątrobowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Płaskie hodowle komórek ssaków są szeroko stosowanym podejściem in vitro do zrozumienia fizjologii komórki, ale ten system jest ograniczony w modelowaniu tkanek stałych z powodu nienaturalnie szybkiej replikacji komórek. Jest to szczególnie trudne w przypadku modelowania dojrzałej chromatyny, ponieważ szybko replikujące się komórki są często zaangażowane w replikację DNA i mają niejednorodną populację poliploidalną. Poniżej przedstawiono przepływ pracy do modelowania, leczenia i analizowania modyfikacji chromatyny w stanie spoczynku przy użyciu trójwymiarowego (3D) systemu hodowli komórkowych. Korzystając z tego protokołu, linie komórkowe raka wątrobowokomórkowego są hodowane jako powtarzalne sferoidy 3D w inkubatorze, zapewniając aktywną dyfuzję składników odżywczych i niskie siły ścinające. Leczenie maślanem sodu i bursztynianem sodu powodowało odpowiednio wzrost acetylacji histonów i sukcynylacji. Wzrost poziomu acetylacji histonów i sukcynylacji jest związany z bardziej otwartym stanem chromatyny. Następnie pobiera się sferoidy w celu wyizolowania jąder komórkowych, z których ekstrahuje się białka histonowe w celu analizy ich modyfikacji potranslacyjnych. Analiza histonów jest przeprowadzana za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej online z tandemową spektrometrią mas, a następnie za pomocą wewnętrznego potoku obliczeniowego. Na koniec przedstawiono przykłady reprezentacji danych w celu zbadania częstości i występowania kombinatorycznych znaczników histonowych.
Wprowadzenie
Od końca XIX wieku systemy hodowli komórkowych są używane jako model do badania wzrostu i rozwoju komórek poza ludzkim ciałem1,2. Ich zastosowanie zostało również rozszerzone o badanie, jak tkanki i narządy funkcjonują zarówno w kontekście zdrowym, jak i chorym1,3. Komórki zawiesinowe (np. komórki krwi) rosną na szalkach Petriego lub kolbach bezproblemowo i zamiennie, ponieważ nie łączą się w trójwymiarowe (3D) struktury in vivo. Komórki pochodzące z narządów stałych mogą rosnąć w dwuwymiarowych (2D) lub 3D systemach hodowli. W hodo....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie i odczynników
- Pożywka dla wzrostu komórek (dla komórek HepG2/C3A): Dodaj płodową surowicę bydlęcą (FBS) (10% v/v), aminokwasy endogenne (1% v/v), suplement L-glutaminy (1% v/v) i penicylinę/streptomycynę (0,5% v/v) do zmodyfikowanego podłoża Eagle's Medium firmy Dulbecco (DMEM, zawierające 4,5 g/l glukozy). Pożywkę wzrostową przechowuje się w temperaturze 4 °C maksymalnie przez 2 tygodnie.
- 200 mM roztwór maślanu sodu (NaBut): Aby przygotować 10 ml, ponownie zawiesić 220,18 mg NaBut w 10 ml ddH2O. Przechowywać 1 ml podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Przed poddaniem komórek należy przefiltrować roz....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W niniejszym protokole sferoidy HepG2/C3A poddano działaniu 20 mM NaBut oraz 10 mM NaSuc, z których oba wpłynęły na globalne poziomy PTM histonów (Rysunek 3A). Następnie zidentyfikowano i ilościowo określono PTM histonów na poziomie pojedynczych reszt poprzez akwizycję MS/MS (Rysunek 3B).
Gdy próbki są analizowane w powtórzeniach, można przeprowadzić analizę statystyczną w celu oceny krotności zmiany (fold change) wzbogacenia.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Analiza histonów PTM zasadniczo różni się od typowego procesu analizy proteomicznej. Większość histonów PTM nadal ma enigmatyczne funkcje biologiczne; w związku z tym adnotacje, takie jak ontologia genów lub bazy danych ścieżek, nie są dostępne. Istnieje kilka zasobów, które wiążą modyfikacje histonów z enzymem odpowiedzialnym za ich katalizę lub białkami zawierającymi domeny, które wiążą te PTM (np. HISTome36). Możliwe jest również spekulowanie na temat ogólnego stanu chromatyny, gdy regulowane s.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Laboratorium Sidoli z wdzięcznością dziękuje Fundacji Badań nad Białaczką (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (nagroda Sagol Network GerOmics), Deerfield (nagroda Xseed), Relay Therapeutics, Merck, oraz Biuru Dyrektora NIH (1S10OD030286-01).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,05% roztwór trypsyny-EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 0,5-20 &mikro; Końcówki do pipet L | BRAND | 13-889-172 (Fisher Scientific) | |
| Probówki do mikrowirówek 1,5 ml | Bio-Rad | 2239480 | |
| 10 µ Pipeta wielokanałowa L | BRAND | BR7059000 (Millipore Sigma) | |
| Strzykawka 10 ml | Henke Sass Wolf | 14-817-31 (Fisher Scientific) | Końcówka Luer lock, wyskalowana do 12 ml |
| 10, 20, 200 i 1000 &mikro; L pipety jednokanałowe | Eppendorf | 14-285-904 (Fisher Scientific) | |
| 1000 µ L końcówki do pipet | Rainin | 30389164 | |
| 18 G igła strzykawkowa | Air-Tite | 14-817-100 (Fisher Scientific) | Długość 3", średnica 0,05" |
| 200 i mikro; L pipeta wielokanałowa | Corning | 4082 | |
| 2-200 µ L końcówki do pipet | BRAND | Z740118 (Millipore Sigma) | |
| 24-dołkowa mikropłytka z ultraniskim mocowaniem | Corning | 07-200-602 | |
| 75 cm2 Kolba do hodowli komórkowych w kształcie litery U | Corning | 461464U | Niepoddana obróbce, z nasadką odpowietrzającą |
| 96-dołkowa płytka z osłoną | Axygen | PCR-96-FS-C (Corning) | |
| Aceton | Fisher Scientific | A949-1 | Aceton powinien być używany na zimno |
| Wodorowęglan amonu (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | A6141-25G | |
| Wodorotlenek amonu rozwiązanie | Fisher Scientific | AC423300250 | |
| Woda klasy do hodowli komórkowych | Corning | 25-055-CV | |
| ClinoReactor | CelVivo | 10004-12 | Bioreaktor do hodowli komórkowych 3D |
| ClinoStar | CelVivo | N/A | Inkubator Clinostat CO2 do hodowli komórkowych 3D |
| Jednostka sterująca | CelVivo | N/A | Tabletka do ClinoStar Ustawienia |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 17-205-CV | 1X roztwór z 4,5 g/l glukozy i pirogronianu sodu, bez L-glutaminy i czerwieni fenolowej |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Kwas mrówkowy | Thermo Scientific | 28905 | |
| Wyciąg | Mott | N/A | Model 7121000 |
| Szkło Pipeta Pasteura | Fisher Scientific | 13-678-8B | 9", bawełniana, szkło borokrzemowe, niesterylny |
| suplement Glutagro | Corning | 25-015-CI | 200 mM L-ananylo-L-glutamina |
| Hank' s Zrównoważony roztwór soli (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1X roztwór bez wapnia, magnezu i fenolu czerwony |
| acetonitryl klasy HPLC | Fisher Scientific | A955-4 | |
| Woda klasy HPLC | Fisher Scientific | W6-1 | |
| Kwas solny (HCl) | Fisher Scientific | A481-212 | |
| Lód | N/A | N/A | |
| MEM aminokwasy endogenne | Roztwór Corning | 25-025-CI | 100X |
| Żywica Oasis HLB | Wody | 186007549 | Żywica hydrofilowo-lipofilowo-zrównoważona (HLB) z 30&mikro; m wielkość cząstek |
| Spektrometr masowy Orbitrap Fusion Lumos Tribrid | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | Spektrometr masowy o wysokiej rozdzielczości |
| Oro-Flex I polipropylenowa płyta filtracyjna Orochem | OF1100 | 96-dołkowa polipropylenowa płyta filtracyjna z 10 i mikro; M PE fryta | |
| Penicylina-Streptomycyna | Corning | 30-002-CI | 100X roztwór |
| Papier pH | Hydrion | Z111848 (Sigma-Aldrich) | 0-13 Papier testowy pH |
| Pistolet do pipet | Eppendorf | Z666467 (Millipore Sigma) | |
| Polimikrokapila | Molex | 50-110-7740 (Fisher Scientific) | Elastyczna rurka kapilarna z topionej krzemionki z powłoką polimkową, 75 &mikro; M ID x 363 i mikro; M OD |
| Polistyren 10 ml pipety serologiczne, sterylne | Fisher Scientific | 1367549 | |
| Bezwodnik propionowy | Sigma-Aldrich | 240311-50G | |
| Wirówka z chłodzeniem | Thermo Scientific | 75-217-420 | |
| Żywica Reprosil-Pur | MSWIL | R13. AQ.0003 | 120 & Aring; wielkość porów, faza C18-AQ, 3 &mikro; Rozmiar koralików |
| M Rotator | Clay Adams | 25477 (American Laboratory Trading) | Mikser nutatorów 1105 |
| Zmodyfikowana trypsyna klasy sekwencjonowania | Promega | V5111 | |
| Maślan sodu | Thermo Scientific | A11079 | |
| Bursztynian sodu dwuzasadowy | Sigma-Aldrich | 14160-100G | |
| Koncentrator próżniowy SpeedVac (probówki do mikrowirówek 1,5 ml) | Savant | 20249 (American Laboratory Trading) | |
| Koncentrator próżniowy SpeedVac (96-dołkowy) | Thermo Scientific | 15308325 | Savant SPD1010 |
| Sterylny kaptur | Thermo Scientific | 1375 | klasa II, typ A2 |
| Kwas siarkowy (H2SO4) | Fisher Scientific | 02-004-375 | Baker Analizowany odczynnik |
| ACSNaczynie 100 mm x 20 mm poddane hodowli tkankowej | Fisher Scientific | 08-772-23 | |
| Kwas trichlorooctowy (TCA) | Thermo Scientific | AC421451000 | Zawiesić 100% w/v w wodzie klasy HPLC |
| Kwas trifluorooctowy (TFA) | Fisher Scientific | PI28904 | Stopień sekwencjonowania |
| Kolektor próżniowy 96-dołkowy | Milipore | MAVM0960R | |
| Vortex | Sigma-Aldrich | Z258415 | |
| Kąpiel wodna | Fisher Scientific | FSGPD10 | |
| Końcówki do pipet o szerokim otworze 1000 µ L | Axygen | 14-222-703 (Fisher Scientific) | |
| Końcówki do pipet o szerokim otworze 200 i mikro; L | Axygen | 14-222-730 (Fisher Scientific) |
Bibliografia
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing lin....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
