Method Article

Kwantyfikacja na poziomie globalnym modyfikacji potranslacyjnych histonów w modelu 3D hodowli komórkowej tkanki wątrobowej

DOI:

10.3791/63606

⸱

May 5th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Albert Einstein College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje, jak trójwymiarowy system hodowli komórkowej może być używany do modelowania, leczenia i analizowania modyfikacji chromatyny w stanie zbliżonym do fizjologicznego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Płaskie hodowle komórek ssaków są szeroko stosowanym podejściem in vitro do zrozumienia fizjologii komórki, ale ten system jest ograniczony w modelowaniu tkanek stałych z powodu nienaturalnie szybkiej replikacji komórek. Jest to szczególnie trudne w przypadku modelowania dojrzałej chromatyny, ponieważ szybko replikujące się komórki są często zaangażowane w replikację DNA i mają niejednorodną populację poliploidalną. Poniżej przedstawiono przepływ pracy do modelowania, leczenia i analizowania modyfikacji chromatyny w stanie spoczynku przy użyciu trójwymiarowego (3D) systemu hodowli komórkowych. Korzystając z tego protokołu, linie komórkowe raka wątrobowokomórkowego są hodowane jako powtarzalne sferoidy 3D w inkubatorze, zapewniając aktywną dyfuzję składników odżywczych i niskie siły ścinające. Leczenie maślanem sodu i bursztynianem sodu powodowało odpowiednio wzrost acetylacji histonów i sukcynylacji. Wzrost poziomu acetylacji histonów i sukcynylacji jest związany z bardziej otwartym stanem chromatyny. Następnie pobiera się sferoidy w celu wyizolowania jąder komórkowych, z których ekstrahuje się białka histonowe w celu analizy ich modyfikacji potranslacyjnych. Analiza histonów jest przeprowadzana za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej online z tandemową spektrometrią mas, a następnie za pomocą wewnętrznego potoku obliczeniowego. Na koniec przedstawiono przykłady reprezentacji danych w celu zbadania częstości i występowania kombinatorycznych znaczników histonowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Od końca XIX wieku systemy hodowli komórkowych są używane jako model do badania wzrostu i rozwoju komórek poza ludzkim ciałem1,2. Ich zastosowanie zostało również rozszerzone o badanie, jak tkanki i narządy funkcjonują zarówno w kontekście zdrowym, jak i chorym1,3. Komórki zawiesinowe (np. komórki krwi) rosną na szalkach Petriego lub kolbach bezproblemowo i zamiennie, ponieważ nie łączą się w trójwymiarowe (3D) struktury in vivo. Komórki pochodzące z narządów stałych mogą rosnąć w dwuwymiarowych (2D) lub 3D systemach hodowli. W hodowli 2D komórki są hodowane w monowarstwie, która przylega do płaskiej powierzchni2,4. Systemy hodowli komórkowych 2D charakteryzują się wykładniczym wzrostem i szybkim czasem podwajania, zwykle od 24 godzin do kilku dni5. Komórki w systemach 3D rosną, tworząc skomplikowane interakcje komórka-komórka, dokładniej modelując konglomeraty tkankopodobne i charakteryzują się zdolnością do osiągnięcia dynamicznej równowagi, w której ich czas podwojenia może osiągnąć 1 miesiąc lub dłużej5.

W tym artykule przedstawiono innowacyjną metodologię hodowli sferoid 3D w obrotowych systemach hodowli komórkowych, które symulują zmniejszoną grawitację6. Jest to uproszczona pochodna systemu hodowli komórkowych wprowadzonego przez NASA w latach 90. XX wieku7. Takie podejście minimalizuje siły ścinające, które występują w istniejących metodach, takich jak kolby przędzalnicze, i zwiększa odtwarzalność sferoidów6. Ponadto obracający się bioreaktor zwiększa aktywną dyfuzję składników odżywczych, minimalizując powstawanie nekrotyczne, które występuje w systemach takich jak hodowla komórek wiszących, gdzie wymiana pożywki jest niepraktyczna6. W ten sposób komórki rosną w większości niezakłócone, co pozwala na tworzenie cech strukturalnych i fizjologicznych związanych z komórkami rosnącymi w tkance. Hepatocyty C3A (HepG2/C3A) hodowane w ten sposób nie tylko miały ultrastrukturalne organelle, ale także wytwarzały ilości ATP, kinazy adenylanowej, mocznika i cholesterolu porównywalne z poziomami obserwowanymi in vivo1,2. Ponadto komórki hodowane w systemach hodowli komórkowych 2D vs. 3D wykazują różne wzorce ekspresji genów8. Analiza ekspresji genów hepatocytów C3A hodowanych jako sferoidy 3D wykazała, że komórki te wyrażają szeroki zakres białek specyficznych dla wątroby, a także geny zaangażowane w kluczowe szlaki regulujące czynność wątroby8. Wcześniejsze publikacje wykazały różnice między proteomami komórek rosnących wykładniczo w hodowli 2D a komórkami w równowadze dynamicznej w hodowlach sferoidalnych 3D5. Różnice te obejmują metabolizm komórkowy, który z kolei wpływa na strukturę, funkcję i fizjologię komórki5. Proteom komórek hodowanych w hodowli 2D był bardziej wzbogacony w białka biorące udział w replikacji komórek, podczas gdy proteom sferoid 3D był bardziej wzbogacony w funkcjonalność wątroby5.

Wolniejsze tempo replikacji komórek wyhodowanych jako sferoidy 3D dokładniej modeluje specyficzne zjawiska związane ze stanem chromatyny i jej modyfikacjami (np. obcinanie histonów9). Obcinanie histonów to nieodwracalna modyfikacja potranslacyjna histonów (PTM), która powoduje proteolityczne rozszczepienie części N-końcowego ogona histonowego. Chociaż jego funkcja biologiczna jest nadal przedmiotem dyskusji10,11,12,13, jasne jest, że jego obecność w komórkach pierwotnych i tkance wątroby jest modelowana przez komórki HepG2/C3A hodowane jako sferoidy, ale nie jako płaskie komórki9. Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ stan chromatyny i modyfikacje regulują odczyt DNA głównie poprzez modulowanie dostępności do genów, a tym samym ich ekspresji14. Histonistyczne PTM wpływają albo bezpośrednio na stan chromatyny, wpływając na ładunek netto nukleosomów, w których histony są składane, albo pośrednio, poprzez rekrutację osób zapisujących, czytających i ścierających chromatynę14. Do tej pory zidentyfikowano setki histonów PTM15, wzmacniając hipotezę, że chromatyna zawiera "kod histonowy" używany przez komórkę do interpretacji DNA16. Jednak zidentyfikowanie niezliczonych kombinacji PTM15 oraz odkrycie, że kombinacje histonów PTM często mają inne funkcje biologiczne niż PTM obecne w izolacji (np. Fischle, et al.17), podkreśla, że potrzeba więcej pracy, aby odszyfrować "kod histonowy".

Obecnie, analiza PTM histonów opiera się na technikach wykorzystujących przeciwciała (np. Western Blots, immunofluorescencja lub immunoprecypitacja chromatyny, a następnie sekwencjonowanie [ChIP-seq]) lub spektrometria mas (MS). Techniki oparte na przeciwciałach mają wysoką czułość i mogą dostarczyć szczegółowych informacji na temat lokalizacji znaczników histonowych w całym genomie, ale często są ograniczone w badaniu rzadkich PTM lub PTM obecnych w kombinacjach18,19,20. MS jest bardziej odpowiedni do wysokoprzepustowej i bezstronnej identyfikacji i kwantyfikacji pojedynczych i współistniejących modyfikacji białek, w szczególności białek histonowych18,19,20. Z tych powodów to i kilka innych laboratoriów zoptymalizowało potok MS do analizy peptydów histonowych (MS od dołu do góry), nienaruszonych ogonów histonów (MS od środka do dołu) i białek histonowych o pełnej długości (MS od góry do dołu)21,22,23.

Poniżej szczegółowo opisano proces uprawy sferoidów HepG2/C3A i przygotowania ich do analizy peptydów histonowych (MS od dołu do góry) za pomocą chromatografii nanocieczowej, sprzężonej online z tandemową spektrometrią mas (nLC-MS/MS). Wyhodowano hodowlę komórkową 2D, a komórki zebrano i przeniesiono do bioreaktora, gdzie zaczęły tworzyć sferoidy (Rysunek 1). Po 18 dniach w hodowli sferoidy traktowano maślanem sodu lub bursztynianem sodu w celu zwiększenia względnej obfitości acetylacji histonów i sukcynylacji. Warto zauważyć, że kultury 3D mogą być traktowane związkami genotoksycznymi tak samo dobrze, jak ich płaskie odpowiedniki hodowlane; w rzeczywistości ostatnie publikacje podkreślają, że odpowiedź toksykologiczna komórek w hodowli 3D jest bardziej podobna do tkanek pierwotnych niż w hodowli płaskiej 2D24,25. Komórki zostały następnie pobrane w określonych punktach czasowych i przeprowadzono izolację jądrową. Następnie histony zostały wyekstrahowane i derywatyzowane bezwodnikiem propionowym przed i po trawieniu trypsyny zgodnie z protokołem opracowanym po raz pierwszy przez Garcia et al.26. Procedura ta generuje peptydy o odpowiedniej wielkości do separacji online za pomocą chromatografii odwróconych faz (C18) i wykrywania za pomocą MS. Na koniec zidentyfikowano peptydy histonowe i określono je ilościowo, a wygenerowane dane przedstawiono na wiele sposobów w celu uzyskania pełniejszej interpretacji biologicznej.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie i odczynników

  1. Pożywka dla wzrostu komórek (dla komórek HepG2/C3A): Dodaj płodową surowicę bydlęcą (FBS) (10% v/v), aminokwasy endogenne (1% v/v), suplement L-glutaminy (1% v/v) i penicylinę/streptomycynę (0,5% v/v) do zmodyfikowanego podłoża Eagle's Medium firmy Dulbecco (DMEM, zawierające 4,5 g/l glukozy). Pożywkę wzrostową przechowuje się w temperaturze 4 °C maksymalnie przez 2 tygodnie.
  2. 200 mM roztwór maślanu sodu (NaBut): Aby przygotować 10 ml, ponownie zawiesić 220,18 mg NaBut w 10 ml ddH2O. Przechowywać 1 ml podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Przed poddaniem komórek należy przefiltrować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 mm i dodać 1 ml przefiltrowanego roztworu do 9 ml pożywki do wzrostu komórek, aby uzyskać stężenie robocze 20 mM.
  3. 100 mM roztwór bursztynianu sodu (NaSuc): Aby przygotować 10 ml, ponownie zawiesić 162,05 mg NaSuc w 10 ml ddH2O. Przechowywać 1 ml podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Przed poddaniem komórek należy przefiltrować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 mm i dodać 1 ml przefiltrowanego roztworu do 9 ml pożywki do wzrostu komórek, aby uzyskać stężenie robocze 10 mM.
  4. Zimno 0,2 M H2SO4: Aby przygotować 1 l, dodaj 10 ml stężonego H2SO4 do 990 ml wody klasy HPLC. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  5. Zimny aceton + 0,1% kwas solny (HCl): Dodać skoncentrowany HCl (0,1% v/v) do acetonu. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  6. 100 mM roztwór NH4HCO3, pH 8,0: Aby przygotować 1 l, ponownie zamieszaj 7,91 g NH4HCO3 w 1 l wody klasy HPLC. Przechowywać 50 ml porcji w temperaturze -20 °C.
  7. 0,1% roztwór kwasu trifluorooctowego (TFA): Dodać stężony TFA (0,1% v/v) do wody klasy HPLC. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  8. 60% acetonitryl/0,1% roztwór TFA: Dodaj acetonitryl klasy HPLC (60% v/v) do wody klasy HPLC. Następnie dodaj do tego roztworu skoncentrowane TFA (0,1% v/v). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  9. 2% acetonitrylu klasy HPLC + 0,1% kwasu mrówkowego: Dodaj acetonitryl klasy HPLC (2% v/v) do wody klasy HPLC. Następnie dodaj stężony kwas mrówkowy (0,1% v/v) do tego roztworu.
  10. 80% acetonitrylu klasy HPLC + 0,1% kwas mrówkowy: Dodać acetonitryl klasy HPLC (80% v/v) do wody klasy HPLC. Następnie dodaj stężony kwas mrówkowy (0,1% v/v) do tego roztworu.

2. Przygotowanie systemu hodowli 3D

UWAGA: Różne komórki, pierwotne lub nieśmiertelne, mają różne właściwości hodowlane, więc tworzenie sferoid może się różnić w zależności od typu komórki. Protokół ten został opracowany do tworzenia sferoidów HepG2/C3A przy użyciu bioreaktorów i innowacyjnego systemu hodowli komórkowych 3D.

  1. Używając standardowych pożywek wzrostowych, hoduj komórki jako monowarstwę, aż osiągną 80% zlewania się.
  2. Przemyć komórki HBSS (5 ml na kolbę o średnicy 75cm2) i inkubować komórki z 5 ml 0,05% trypsyny-EDTA rozcieńczonej w HBSS (rozcieńczenie 1:2) przez 5 minut w temperaturze 37 oC z 5% CO2 .
  3. Sprawdź odwarstwienie komórek pod mikroskopem i zneutralizuj trypsynę, dodając 3 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) lub pożywki wzrostowej (zawierającej 5% -10% FBS).
  4. Policz liczbę komórek i rozcieńcz zawiesinę komórek, aby uzyskać 1 x 106 komórek w maksymalnej objętości 1,5 ml.
  5. Zrównoważyć 24-dołkową okrągłą płytkę denną o bardzo niskim nakładzie (zawierającą wiele mikrodołków na studzienkę), myjąc studzienki 0,5 ml pożywki wzrostowej. Odwirować płytkę przez 5 minut przy 3 000 x g, aby usunąć pęcherzyki powietrza z powierzchni studzienki.
  6. Przenieść zawiesinę komórkową na płytkę i odwirowywać przez 3 minuty przy 120 x g.
  7. Inkubować płytkę przez 24 godziny w temperaturze 37 oC z 5% CO2 w celu wytworzenia sferoidów. W międzyczasie zrównoważ bioreaktor, wypełniając komorę wilgotnościową 25 ml sterylnej wody, a komorę komórkową 9 ml pożywki wzrostowej.
  8. Inkubować bioreaktor, obracając się w inkubatorze klinostatu, przez 24 godziny w temperaturze 37 oC z 5% CO2 .

3. Wzrost sferoidów w bioreaktorach

UWAGA: Aby zachować strukturę sferoid, do obsługi struktur 3D stosuje się końcówki o szerokich otworach.

  1. Odłącz sferoidy od bardzo niskiej płytki mocującej, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą końcówek o szerokim otworze 1 ml i przenieś do naczynia poddanego hodowli tkankowej.
  2. Umyj płytkę 0,5 ml wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej i przenieś do tego samego naczynia.
  3. Oceń jakość sferoid za pomocą mikroskopii i wybierz wystarczająco uformowane sferoidy. Dobrej jakości sferoidy mają jednolity rozmiar, zwartość i okrągłość.
  4. Przenieś sferoidy do zrównoważonych bioreaktorów wypełnionych 5 ml świeżej pożywki wzrostowej. Po przeniesieniu sferoid całkowicie napełnij bioreaktor świeżą pożywką wzrostową.
  5. Umieść bioreaktor w inkubatorze klinostatu i ustaw prędkość obrotową na 10-11 obr./min.
  6. Wymieniaj pożywki wzrostowe co 2-3 dni, usuwając 10 ml starych pożywek i zastępując je 10 ml świeżymi pożywkami.
  7. Dostosuj prędkość obrotową do wzrostu sferoid, zwiększając się wraz ze wzrostem rozmiaru i liczby sferoid.
  8. Po 18 dniach w hodowli sferoidy są gotowe do leczenia i/lub pobrania

4. Leczenie i zbieranie sferoidów

UWAGA: W tym protokole, sferoidy HepG2/C3A są traktowane maślanem sodu (NaBut) i bursztynianem sodu (NaSuc) w celu oceny poziomów znaczników histonowych zawierających odpowiednio acetylację i sukcynylację.

  1. Przygotować pożywkę wzrostową o odpowiednim stężeniu roboczym związku (np. 20 mM NaBut lub 10 mM NaSuc). Wymienić pożywkę w bioreaktorze na pożywkę poddaną obróbce.
    UWAGA: Aby ustalić warunki kontrolne, należy zebrać wystarczającą ilość sferoid do eksperymentów przed dodaniem zabiegu lub wyznaczyć bioreaktor dla sferoid niepoddanych działaniu środka.
  2. Pobrać sferoidy do analizy proteomicznej po upływie wystarczającego czasu leczenia (np. 48 godzin do 1 tygodnia w przypadku leczenia NaSuc lub 48-72 godzin w przypadku leczenia NaBut).
    UWAGA: W celu ekstrakcji histonów przy użyciu tego protokołu zebrano od sześciu do ośmiu sferoid zawierających około 1 x 106 komórek.
    1. Usuń 3-5 ml pożywki z bioreaktora przez górny port.
    2. Otwórz przedni port i użyj końcówki o szerokim otworze 1 ml, aby usunąć sferoidy i umieścić je w probówkach do mikrowirówek.
    3. Odwirować sferoidy przy 100 x g przez 5 minut i wyrzucić pożywkę.
      UWAGA: Pożywki w bioreaktorze można wymienić, a bioreaktor można zwrócić do inkubatora w celu uzyskania dodatkowego czasu na leczenie lub rekonwalescencję.
    4. Przemyć sferoidy 200 μl HBSS w celu usunięcia FBS. Wirować przy 100 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
      UWAGA: Sferoidy można przechowywać w temperaturze -80 oC do czasu przetworzenia.

5. Ekstrakcja histonów

UWAGA: Wiele reszt aminokwasów zasadowych obecnych w histonach pozwala im na ścisłą interakcję z DNA, które ma szkielet kwasu fosforowego. Ponieważ histony są jednymi z najbardziej podstawowych białek w jądrze, po ekstrakcji lodowatym kwasem siarkowym (0,2 M H2SO4) zanieczyszczenie jest minimalne. Białka niehistonowe wytrącą się w mocnym kwasie. Wysoko stężony kwas trójchlorooctowy (TCA) rozcieńczony do końcowego stężenia 33% stosuje się następnie do wytrącania histonów z kwasu siarkowego. Przechowuj wszystkie próbki, probówki i odczynniki na lodzie przez cały czas ekstrakcji histonów.

  1. Dodać pięć objętości (~100 μL) zimnego 0,2 M H2SO4 do osadu komórkowego (~10-20 μL) i pipetować w górę iw dół, aby rozbić osad i uwolnić histony.
  2. Inkubować probówki do 4 godzin przy stałym obrocie lub wytrząsaniu w temperaturze 4 oC.
    UWAGA: W przypadku próbek zawieszonych o objętości większej niż 500 μl, do ekstrakcji histonów wystarczy 2-godzinna inkubacja (dłuższa inkubacja może spowodować ekstrakcję innych podstawowych białek jądrowych). W przypadku próbek zawieszonych o objętości mniejszej niż 200 μl w celu uzyskania lepszej wydajności wymagana jest 4-godzinna inkubacja.
  3. Wirować przy 3 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant do nowej probówki i wyrzucić osad później.
  4. Dodać skoncentrowany na zimno TCA tak, aby stanowił końcowe 25%-33% v/v (np. 40-60 μL zimnego TCA: 120 μl supernatantu) i wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę.
  5. Inkubować probówki przez co najmniej 1 godzinę przy stałym obrocie lub wytrząsaniu w temperaturze 4 oC.
    UWAGA: W przypadku mniejszych początkowych rozmiarów granulek zalecana jest inkubacja przez noc.
  6. Wirować przy 3 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 oC. Odrzucić supernatant przez pipetowanie. Ostrożnie odessać supernatant; Nie dotykaj boków rurki ani granulki.
    UWAGA: Histony osadzają się po obu stronach i na dole tuby. Biały, nierozpuszczalny granulek utworzony na samym dnie probówki zawiera głównie białka niehistonowe i inne biomolekuły.
  7. Umyj probówkę (ścianki i granulat) zimnym acetonem + 0,1% HCl za pomocą szklanej pipety Pasteura (~500 μL/probówkę).
  8. Wirować przy 3 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 oC. Odrzucić supernatant przez odwrócenie probówki.
  9. Umyj probówkę (ścianki i granulat) 100% zimnym acetonem za pomocą szklanej pipety Pasteura (~500 μL/probówkę). Wirować przy 3 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 oC.
  10. Odrzucić supernatant, odwracając probówkę i odpipetować pozostały aceton. Otwórz pokrywę i susz próbkę na powietrzu na stole przez ~20 minut.
  11. Przystąpić do propionylacji lub przechowywać próbki w temperaturze -80 oC do czasu użycia.

6. Pierwsza runda derywatyzacji

UWAGA: Użycie trypsyny do trawienia białek histonowych prowadzi do powstania zbyt małych peptydów, które są trudne do zidentyfikowania przy użyciu tradycyjnych konfiguracji proteomicznych. Z tego powodu bezwodnik propionowy jest stosowany do chemicznego wyprowadzania grup ɛ-aminowych niemodyfikowanych i monometylolizynowych reszt. Ogranicza to proteolizę trypsyny do C-końcowych reszt argininy. W przypadku próbek na płytkach 96-dołkowych zaleca się stosowanie wielokanałowych pipet i zbiorników do pobierania odczynników (Rysunek 2A). Derywatyzacja jest również przeprowadzana po trawieniu w celu znakowania wolnych N-końców peptydów, zwiększając hydrofobowość peptydów, a tym samym retencję chromatograficzną z odwróconymi fazami.

  1. Zawiesić próbki w 20 μl 15%-20% acetonitrylu w 100 mM wodorowęglanu amonu (pH 8,0). Wiruj przez 15 s, a następnie wiruj w dół przy 1,000 x g przez 30 s.
  2. Jeżeli jest osiem lub więcej próbek, każdą z nich należy przenieść do 96-dołkowej płytki.
    UWAGA: Jeśli próbki nie zostały przeniesione na płytkę 96-dołkową, w krokach 6.3-6.7, 7.1-7.5 i 8.1-8.5 można użyć pipety jednokanałowej.
  3. Pod maską dodaj 2 μl bezwodnika propionowego za pomocą pipety wielokanałowej. Mieszać pipetując 5 razy w górę i w dół.
  4. Szybko dodaj 10 μl wodorotlenku amonu za pomocą pipety wielokanałowej. Mieszać pipetując w górę i w dół 5x.
    UWAGA: Kwas propionowy jest produktem reakcji między bezwodnikiem propionowym a wolnymi aminami z peptydów i może obniżać pH próbki. pH 8 można przywrócić, dodając do próbki wodorotlenek amonu w stosunku 1:5 (v/v).
  5. Upewnij się, że pH wynosi 8, używając bibuły testowej pH. Jeśli pH < 8, dostosuj, dodając 1 μl wodorotlenku amonu. Jeśli pH > 8, dostosuj, dodając 1 μl kwasu mrówkowego lub octowego. Gdy pH > 10, możliwe jest znakowanie innych reszt aminokwasowych o wyższym pKa.
  6. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  7. Powtórz kroki 6.3-6.6. Podwójna runda propionylacji histonów zapewnia prawie całkowitą wydajność reakcji.
  8. Wysuszyć płytę w próżni prędkościowej, aż wszystkie studzienki całkowicie wyschną (~9 godzin).
  9. Przystąpić do trawienia trypsyny lub przechowywać próbki w temperaturze -80 oC do czasu użycia.

7. Trawienie histonów

UWAGA: Histony są trawione na peptydy za pomocą trypsyny, która tnie po stronie karboksylowej reszt argininy i lizyny. Ponieważ jednak propionylacja modyfikuje reszty lizyny, rozszczepiane są tylko reszty argininy (Rysunek 2B).

  1. Przygotować roztwór trypsyny (25 ng/μL w 50 mM NH4HCO3, pH 8,0). Dodać 20 μl trypsyny (500 ng) do każdej próbki.
    1. Aby przygotować 50 mM roztwór NH4HCO3, rozcieńczyć 100 mM roztwór NH4HCO3 1:1 v/v wodą klasy HPLC.
  2. Upewnij się, że pH wynosi 8 za pomocą bibuły testowej pH. Jeśli pH < 8, dostosuj, dodając 1 μl wodorotlenku amonu. Jeśli pH > 8, dostosuj, dodając 1 μl kwasu mrówkowego lub octowego.
  3. Trawić w temperaturze pokojowej przez noc lub inkubować w temperaturze 37 oC przez 6-8 godzin.
  4. Jeśli to możliwe, sprawdź pH po ~3 godzinach trawienia, ponieważ mogło się obniżyć. Jeśli pH < 8, dostosuj, dodając 1 μl wodorotlenku amonu.
  5. Dodać dodatkowe 5 μl 50 ng/μl roztworu trypsyny (250 ng) i kontynuować trawienie.
  6. Przejść do drugiej rundy propionylacji lub przechowywać próbki w temperaturze -80 oC do czasu użycia.

8. Derywatyzacja N-końców peptydu

UWAGA: Propionylacja peptydów histonowych na ich N-końcu poprawia zatrzymywanie najkrótszych peptydów metodą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (np. aminokwasy 3-8 histonu H3), ponieważ grupa propionylowa zwiększa hydrofobowość peptydu.

  1. Pod maską dodaj 2 μl bezwodnika propionowego za pomocą pipety wielokanałowej. Mieszać pipetując 5 razy w górę i w dół.
  2. Szybko dodaj 10 μl wodorotlenku amonu za pomocą pipety wielokanałowej. Mieszać pipetując w górę i w dół 5x.
    UWAGA: Kwas propionowy jest produktem reakcji między bezwodnikiem propionowym a wolnymi aminami z peptydów i może obniżać pH próbki. pH 8 można przywrócić, dodając do próbki wodorotlenek amonu w stosunku 1:5 (v/v).
  3. Upewnij się, że pH wynosi 8, używając bibuły testowej pH. Jeśli pH < 8, dostosuj, dodając 1 μl wodorotlenku amonu. Jeśli pH > 8, dostosuj, dodając 1 μl kwasu mrówkowego lub octowego. Gdy pH > 10, możliwe jest znakowanie innych reszt aminokwasowych o wyższym pKa.
  4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  5. Powtórz kroki 8.1-8.4. Podwójna runda propionylacji histonów zapewnia prawie całkowitą wydajność reakcji.
  6. Wysuszyć płytę w próżni prędkościowej, aż wszystkie studzienki całkowicie wyschną (~9 godzin).
  7. Przejść do etapu odsalania lub przechowywać próbki w temperaturze -80 oC do czasu użycia.

9. Odsalanie i oczyszczanie próbek

UWAGA: Sole obecne w próbce zakłócają analizę spektrometrii mas. Sole są również jonizowane podczas elektrorozpylania i mogą tłumić sygnały z peptydów. Sole mogą tworzyć addukty jonowe na peptydach, co powoduje, że przywiedziony peptyd ma inną masę. Zmniejsza to intensywność sygnału peptydu i uniemożliwia prawidłową identyfikację i kwantyfikację. Konfiguracja odsalania jest zilustrowana na Rysunek 2C.

  1. Rozpocznij mieszanie żywicy HLB (50 mg/ml w 100% acetonitrylu) na magnetycznej płytce mieszającej.
  2. Upewnij się, że pod 96-dołkową płytką filtracyjną z polipropylenu znajduje się 96-dołkowa płytka zbiorcza, aby zebrać przepływ.
  3. Dodać 70 μl zawiesiny HLB na studzienkę do płytki filtracyjnej. Delikatnie włącz odkurzacz, aby zapobiec rozpryskiwaniu. Odrzuć przepływ.
  4. Umyj żywicę 100 μl 0,1% TFA. Delikatnie włącz odkurzacz, aby zapobiec rozpryskiwaniu. Odrzuć przepływ.
  5. Zawiesić każdą próbkę w 100 μl 0,1% TFA. Sprawdź pH; Powinno być ~2-3.
  6. Załaduj każdą próbkę do każdej studzienki. Delikatnie włącz odkurzacz, aby zapobiec rozpryskiwaniu. Odrzuć przepływ.
  7. Umyć 100 μL 0,1% TFA. Delikatnie włącz odkurzacz, aby zapobiec rozpryskiwaniu. Odrzuć przepływ.
  8. Wymień płytkę zbiorczą na nową 96-dołkową płytkę zbiorczą.
  9. Dodać 60 μl 60% acetonitrylu/0,1% TFA do dołka. Delikatnie włącz odkurzacz, aby zapobiec rozpryskiwaniu. Zebrać przepływ i wysuszyć w próżni prędkościowej.
  10. Przejdź do LC-MS/MS lub przechowuj próbki w temperaturze -80 oC do czasu użycia.

10. Analiza peptydów histonowych za pomocą chromatografii cieczowej połączonej ze spektrometrią mas

  1. Przygotować fazy ruchome do uruchomienia w wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Faza ruchoma A (MPA): 2% acetonitrylu klasy HPLC + 0,1% kwas mrówkowy. Faza ruchoma B (MPB): 80% acetonitrylu klasy HPLC + 0,1% kwas mrówkowy.
  2. Zaprogramuj metodę HPLC w następujący sposób: (1) 4% -34% MPB przez 30 minut; (2) 34%-90% MPB w ciągu 5 minut; oraz (3) izokratyczny 90% MPB przez 5 min. Stosować następujące zalecane właściwości kolumny: C18 Materiał uszczelniający 3 μm, średnica wewnętrzna 75 μm, długość 20-25 cm. Ustaw natężenie przepływu na 250-300 nL/min dla nanokolumn o średnicy wewnętrznej 75 μm.
    1. W przypadku, gdy HPLC nie jest zaprogramowany do automatyzacji równoważenia kolumny przed załadowaniem próbki, należy uwzględnić (4) 90%-4% MPB przez 1 minutę i (5) izokratyczne 4% MPB przez 10 minut.
  3. Zaprogramuj metodę akwizycji MS.
    1. Upewnij się, że przyrząd wykonuje jeden pełny skan MS na początku każdego cyklu pracy. Zalecane jest oprzyrządowanie o wysokiej rozdzielczości (np. analizatory orbitrap lub analizatory czasu przelotu) ze względu na dokładność masy, którą można wykorzystać podczas ekstrakcji sygnału. Jednak oprzyrządowanie o niskiej rozdzielczości może być również wykorzystywane zgodnie z wcześniejszym opisem27,28.
    2. Upewnij się, że po pełnym skanowaniu MS następuje 16 zdarzeń skanowania MS/MS, z których każde ma szerokość izolacji 50 m/z, obejmujące zakres m/z 300-1100. Na przykład pierwszy skan powinien izolować sygnały na poziomie 300-350 m/z, drugi na poziomie 350-400 m/z itd. Jeśli to możliwe, uzyskaj skany MS/MS również w wysokiej rozdzielczości, ale wystarczająca jest niższa rozdzielczość w porównaniu z pełnym skanem MS (ze względu na mniejsze masy jonów fragmentacyjnych w porównaniu z nienaruszonymi jonami).
    3. Metoda HPLC wygeneruje sygnały chromatograficzne o szerokości pików ~3-40 s; aby zapewnić właściwą kwantyfikację sygnału, należy upewnić się, że spektrometr masowy wykonuje co najmniej 10 cykli pracy na pik chromatograficzny (tj. cykl pracy 3 s lub szybszy).
    4. W przypadku korzystania z analizatora masy typu pułapkowego (orbitrap, pułapka jonowa) upewnij się, że limit czasu wtrysku jonów jest ustawiony na <200 ms; w przypadku innych analizatorów (kwadrupol, czas przelotu) nie stanowi to problemu ze względu na ich szybszy czas skanowania. Może być wymagany wstępny test.
      UWAGA: Więcej szczegółów na temat metod MS do analizy peptydów histonowych można znaleźć w następujących odniesieniach27,28,29.
  4. Zawiesić próbkę w 10 μl MPA, co odpowiada ~1 μg/μL strawionej próbki histonu. Dokładna wielkość ładunku nie jest krytyczna (nie jest też trywialna do oceny), jeśli wszystkie próbki w partii są ładowane przy użyciu podobnych rozcieńczeń i objętości.
  5. Załadować 1 μl próbki do kolumny HPLC.
  6. Uruchom metodę LC-MS/MS zaprogramowaną w krokach 10.1-10.3.

11. Analiza danych

  1. Zaimportuj surowe pliki danych MS do oprogramowania zaprojektowanego do integracji obszaru szczytów.
    UWAGA: EpiProfile30,31 jest używany w obecnym badaniu i jest ogólnie zalecany, ponieważ jest zoptymalizowany pod kątem niezawodnej ekstrakcji obszaru piku znanych peptydów histonowych. Jednak inne ogólnodostępne programy do chromatografii jonów ekstrahowanych, takie jak Skyline32,33 są odpowiednie.
  2. Oblicz względną obfitość danego (nie)zmodyfikowanego peptydu jako powierzchnię pojedynczego peptydu podzieloną przez całkowitą powierzchnię peptydu we wszystkich jego zmodyfikowanych formach. Oprogramowanie takie jak EpiProfile30,31 zawiera już biblioteki peptydów do ekstrakcji sygnałów. W przeciwnym razie wygeneruj bibliotekę interesujących peptydów ręcznie lub poprzez identyfikację peptydów przy użyciu rutynowych potoków proteomicznych.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole, sferoidy HepG2/C3A były traktowane 20 mM NaBut i 10 mM NaSuc, które wpływały na globalne poziomy histonów PTM (Rysunek 3A). Histonowe PTM zostały następnie zidentyfikowane i określone ilościowo na poziomie pojedynczej pozostałości poprzez akwizycję MS/MS (Rysunek 3B).

Gdy próbki są przeprowadzane w powtórzeniach, można przeprowadzić analizę statystyczną, aby ocenić wzbogacenie zmian fałdowania PTM między próbkami, a także odtwarzalność obserwacji. Pokazane dane pokazują, że peptydy zmodyfikowane acetylacjami są wzbogacone w sferoidy poddane działaniu NaBut w porównaniu z kontrolą (Rysunek 3C), podczas gdy próbki poddane działaniu NaSuc mają wyższą względną obfitość peptydów histonowych zmodyfikowanych sukcynylacją lizyny (Rysunek 3D). Obliczenia te zostały wykonane w arkuszu kalkulacyjnym, jak opisano w osobnej publikacji34. Ogólny wzrost danej modyfikacji histonu może być lepiej odwzorowany na wykresach radarowych, gdzie obserwacja większej globalnej obfitości danej modyfikacji staje się bardziej intuicyjna, nawet przy zachowaniu szczegółowych informacji o analizowanych miejscach modyfikacji (Rysunek 3E,F).

Ten protokół generuje peptyd z reszt aminokwasowych histonu H3 9-17, które zawierają często modyfikowane reszty K9, S10 i K14. Przedstawione dane wskazują, że leczenie NaBut zwiększa poziom H3K14ac, ale tylko na histonach współmodyfikowanych z H3K9me2, a nie H3K9me3 (Figura 4A). Częstotliwość współistnienia między dwiema modyfikacjami może być przedstawiona bardziej intuicyjnie jako wykres pierścieniowy, gdzie węzły reprezentują poszczególne modyfikacje, podczas gdy grubość linii łączników reprezentuje częstotliwość współistnienia między dwoma PTM (Rysunek 4B). Czasami częstotliwość współistnienia nie ma wpływu, ale dane przedstawione jako wykresy słupkowe mogą być mylące. Na przykład dane przedstawione w Rysunek 4A wskazują, że kombinacja H3K9me2K14ac jest bardziej obfita w leczeniu NaBut niż w kontroli. Jest to prawda, ale ta dana kombinacja jest najczęstsza niezależnie od leczenia. Rysunek 4B wyraźnie pokazuje, że H3K9me2K14ac i H3K9me3K14ac są najczęstszymi wzorcami kombinatorycznymi, niezależnie od traktowania (grubość linii), ale to globalne poziomy H3K14ac (węzeł) są tym, co naprawdę zmienia się w eksperymencie.

Ten protokół generuje peptyd z reszt histonu H4 4-17, który zawiera modyfikowalne reszty na pozycjach K5, K8, K12 i K16 (głównie przez acetylację). Porównując kontrolę i leczenie NaBut, można zaobserwować wzrost kombinacji acetylacji poprzez przedstawienie danych jako na przykład chmur słów (Rysunek 4C). Ta reprezentacja wyraźnie podkreśla, że niezmodyfikowana wersja histonu H4 występuje najobficiej w próbce kontrolnej, podczas gdy sferoidy potraktowane NaBut są wzbogacone w podwójnie, trzykrotnie i poczwórnie acetylowane proteoformy histonu H4. Jednak chmury słów są ograniczone w wyświetlaniu dokładnych wartości; Względna obfitość kodu histonowego powinna być zdekomplikowana przez rozmiar tekstu, który może być niedokładnie oszacowany. W związku z tym diagramy Venna lub bardziej nowoczesne odpowiedniki, takie jak UpSetR representation35, mogą być użyte do pokazania dokładnej kwantyfikacji współistniejących histonów PTM (Rysunek 4D,E). Przedstawione dane po raz kolejny podkreślają, że wybrane kombinacje acetylacji histonu H4 są stosunkowo bardziej obfite w leczeniu NaBut w porównaniu z kontrolą.

figure-results-1
Rysunek 1: Przebieg pracy do analizy peptydów histonowych sferoidów 3D. Komórki HepG2/C3A są najpierw hodowane w hodowli 2D, aż osiągną 80% konfluencji. Komórki są następnie przenoszone do zrównoważonego bioreaktora i umieszczane w inkubatorze klinostatu, gdzie będą się obracać z prędkością 10-11 obr./min, tworząc sferoidy. Po 18 dniach sferoidy są traktowane 20 mM NaBut lub 10 mM NaSuc i są zbierane po odpowiednich punktach czasowych. Jądra są izolowane z komórek i przeprowadza się ekstrakcję histonów za pomocą 0,2 M H2SO4. Derywatyzacja histonów jest następnie przeprowadzana za pomocą bezwodnika propionowego przed i po trawieniu trypsyny, aby zapewnić zachowanie powstałych krótkich peptydów za pomocą chromatografii cieczowej. Próbki są odsalane, a następnie poddawane działaniu metody LC-MS/MS opisanej w kroku 10, a uzyskane dane są analizowane zgodnie z opisem w kroku 11. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Konfiguracja etapów propionylacji i odsalania. (A) Propionylacja odbywa się w dygestorio, a wszystkie komponenty są ułożone tak, aby można było wykonać kroki w krótkim odstępie czasu. (B) Schemat pierwszej rundy propionylacji, trawienia trypsyny i drugiej rundy propionylacji na ogonie histonu H3.1. (C) Odsalanie odbywa się na stole za pomocą 96-dołkowego kolektora próżniowego i 96-dołkowej polipropylenowej płyty filtracyjnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Reprezentacja indywidualnych modyfikacji histonów. (A) Wykres słupkowy przedstawiający względną obfitość powszechnych globalnych modyfikacji histonów w kontrolnych i traktowanych (20 mM NaBut lub 10 mM NaSuc) sferoidach HepG2/C3A. (B) Wykres słupkowy przedstawiający obfitość pojedynczych histonów PTM występujących na resztach 9-17 peptydu histonu H3 (KSTGGKAPR) w kontrolnych i poddanych działaniu substancji (20 mM NaBut lub 10 mM NaSuc) sferoidach HepG2/C3A. (C,D) Wykresy wulkaniczne przedstawiające zmianę fałdowania i znaczenie zróżnicowanej ekspresji PTM peptydu histonowego po poddaniu działaniu 20 mM NaBut (C) lub 10 mM NaSuc (D). Podświetlone niebieskie i zielone punkty reprezentują odpowiednio acetylowane i sukcynylowane pozostałości. (E,F) Wykresy radarowe przedstawiające obfitość acetylacji (E) lub sukcynylacji pojedynczego peptydu histonowego (F) po podaniu odpowiednio 20 mM NaBut lub 10 mM NaSuc w porównaniu z kontrolą. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Reprezentacja współistniejących modyfikacji histonów. (A) Wykres słupkowy przedstawiający obfitość kombinatorycznych histonów PTM występujących na resztach 9-17 histonu H3 (KSTGGKAPR) w kontrolnych i traktowanych (20 mM NaBut lub 10 mM NaSuc) sferoidach HepG2/C3A. (B) Wykresy pierścieniowe przedstawiające zależność między kombinatorycznymi histonami PTM na resztach 9-17 histonu H3 (KSTGGKAPR) w kontrolnych i traktowanych (20 mM NaBut) sferoidach HepG2/C3A. Intensywność koloru węzła odpowiada obfitości pojedynczego PTM w jego grupie badanej, podczas gdy grubość linii odpowiada częstotliwości współwystępowania PTM. (C) Chmury słów pokazujące częstość kombinatorycznych histonów PTM na resztach histonu H4 w sferoidach HepG2/C3A kontrolnych i poddanych działaniu substancji (20 mM NaBut). Rozmiar tekstu odpowiada obfitości określonego kombinatorycznego PTM. (D,E) Diagram Venna przedstawiający częstość współistniejących modyfikacji reszt peptydowych histonu H4 4-17 w próbkach kontrolnych i 20 mM NaBut traktowanych próbkami. Dane są wyświetlane za pomocą klasy ShinyApp UpSetR35. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca 1: Lista peptydów wykrytych przy użyciu tego protokołu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza histonów PTM zasadniczo różni się od typowego procesu analizy proteomicznej. Większość histonów PTM nadal ma enigmatyczne funkcje biologiczne; w związku z tym adnotacje, takie jak ontologia genów lub bazy danych ścieżek, nie są dostępne. Istnieje kilka zasobów, które wiążą modyfikacje histonów z enzymem odpowiedzialnym za ich katalizę lub białkami zawierającymi domeny, które wiążą te PTM (np. HISTome36). Możliwe jest również spekulowanie na temat ogólnego stanu chromatyny, gdy regulowane są globalne poziomy histonów PTM. Na przykład ogólny wzrost acetylacji histonów lub innych acylacji, takich jak sukcynylacja, jest zwykle związany z dekondensacją chromatyny37,38.

Analiza stwardnienia rozsianego dostarcza bardziej szczegółowych informacji na temat tych modyfikacji, takich jak ich dokładna lokalizacja w sekwencji aminokwasów. W tym protokole akwizycja MS/MS służy do identyfikacji i ilościowego określenia PTM histonów, które mogą mieć kluczowe znaczenie dla interpretacji biologicznej. Na przykład trimetylacja histonu H3 (H3K4me3) na lizynie 4 jest wzbogacona na promotory aktywnie transkrybowanych genów39, podczas gdy ta sama modyfikacja na lizynie 9 (H3K9me3) odpowiada heterochromatynie40. Modyfikacje histonów są obecnie wykorzystywane jako biomarkery w określonych chorobach; W związku z tym analiza histonów może być wykorzystywana do badania patologii choroby oprócz odpowiedzi na leczenie (np. Za pomocą leków epigenetycznych)41,42.

Trudniej jest wizualnie przedstawić interakcje między wieloma PTM niż pojedynczymi PTM. Podczas gdy istniejące wykresy, takie jak wykresy pierścieniowe, mogą pokazywać częstotliwość współistnienia dwóch PTM, nie mogą one reprezentować częstotliwości współistnienia między więcej niż dwoma PTM jednocześnie, ponieważ wymagałoby to trójwymiarowej reprezentacji sieci. Z tego powodu inne reprezentacje mogą być bardziej odpowiednie do podkreślenia zmian w kodach histonów, gdy weźmie się pod uwagę trzy lub więcej PTM. Ogólnie rzecz biorąc, zróżnicowanie reprezentacji danych daje większe szanse na zaobserwowanie znaczących zmian między próbkami. W protokole tym przedstawiono przykłady różnych ilustracji do wyświetlania regulacji histonów PTM i współistniejących PTM.

Chociaż protokół ten generuje stosunkowo małe peptydy histonowe w wyniku trawienia trypsyny (około 4-20 aminokwasów), wybrane peptydy zawierają wiele modyfikowalnych reszt. Analiza tych peptydów pozwala na ilościowe określenie częstości współistnienia PTM, co może ujawnić ważne informacje o tym, które kombinatoryczne znaczniki histonów są regulowane w danym zbiorze danych. Warto zauważyć, że podczas przygotowywania próbki nie ma etapów, w których przeprowadza się kwantyfikację histonów. Są ku temu cztery powody: (1) trypsyna ma szeroki zakres działania i może być stosowana w szerokim zakresie proporcji enzymu do próbki (1:10-1:200). Nawet jeśli eksperymentalna wydajność wyekstrahowanych histonów różni się od oczekiwanej, przy użyciu tego protokołu nie napotkano problemów z trawieniem. (2) Niniejszy protokół jest przeznaczony dla niewielkich ilości materiału, w przypadku których oznaczanie ilościowe histonów może być trudne do przeprowadzenia ze względu na brak czułości. (3) Stosując stałe stężenie trypsyny niezależnie od ilości materiału histonowego, możemy użyć peptydów tryptycznych (gdy trypsyna ulega autolizie) do porównania wydajności chromatografii. Niewielkie różnice w wydajności próbki zostaną znormalizowane przez oprogramowanie do analizy danych (krok 11), które wykorzystuje wszystkie (nie)zmodyfikowane sygnały dla danego peptydu jako mianownik podczas procesu normalizacji. (4) Wreszcie, dramatyczne niedoszacowanie ilości materiału wyjściowego może spowodować problemy z przeciążeniem kolumny chromatograficznej nanoLC. Jednak wykonanie kroku odsalania zgodnie z niniejszym protokołem zapobiega wystąpieniu tego problemu. W przypadku nadmiernych ilości materiału wyjściowego (np. >100 μg) limit pojemności żywicy odsalającej zostanie przekroczony, a nadmiar próbki zostanie zmyty na etapie załadunku.

Należy zauważyć, że nie wszystkie peptydy wykryte w tej analizie zostały wyróżnione na rysunku 3 i rysunku 4. Ponadto nie wszystkie modyfikacje histonów są wykrywalne przy użyciu tych specyficznych metod przygotowania i pozyskiwania próbek. Tabela uzupełniająca 1 zawiera listę wszystkich sygnałów peptydowych, które są ekstrahowane przy użyciu opisanego rurociągu. Kilka dobrze znanych modyfikacji nie jest wymienionych w tabeli, ponieważ opisywane przygotowanie próbki nie nadaje się do ich wykrywania. Godnymi uwagi przykładami są ubikwitynylowane peptydy z histonu H2A i H2B oraz fosforylacja histonu H2A. X (ogólny marker uszkodzenia DNA). Dzieje się tak, ponieważ propionylacja peptydów związanych z tymi PTM prowadzi do zbyt długich peptydów, które nie nadają się do chromatografii C18 i opisanej metody wykrywania MS. Inne modyfikacje, które są obecne w literaturze, ale nie są obecne w Tabeli Uzupełniającej 1 , to modyfikacje o bardzo niskiej liczebności (obecnie wykrywalne tylko przy użyciu SM po strategiach wzbogacania, takich jak immunoprecypitacja lub specyficzne leczenie komórkami), takie jak laktylacja43 lub serotonylacja44. Modyfikacje histonów z nieprzewidywalnymi przesunięciami masy spowodowanymi polimeryzacją lub heterogenicznym kowalencyjnym wiązaniem z sekwencją histonów również nie są brane pod uwagę (np. poli-ADP-rybozylacja45 i glikacja46). Ponadto protokół ten wykorzystuje NaSuc i NaBut do leczenia sferoid HepG2/C3A, ale może być zmodyfikowany do stosowania z innymi lekami/modyfikatorami epigenetycznymi i typami hodowli komórkowych 2D/3D.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laboratorium Sidoli z wdzięcznością dziękuje Fundacji Badań nad Białaczką (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (nagroda Sagol Network GerOmics), Deerfield (nagroda Xseed), Relay Therapeutics, Merck, oraz Biuru Dyrektora NIH (1S10OD030286-01).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,05% roztwór trypsyny-EDTAGibco25300054
0,5-20 &mikro; Końcówki do pipet LBRAND13-889-172 (Fisher Scientific)
Probówki do mikrowirówek 1,5 mlBio-Rad2239480
10 µ Pipeta wielokanałowa LBRANDBR7059000 (Millipore Sigma)
Strzykawka 10 mlHenke Sass Wolf14-817-31 (Fisher Scientific)Końcówka Luer lock, wyskalowana do 12 ml
10, 20, 200 i 1000 &mikro; L pipety jednokanałoweEppendorf14-285-904 (Fisher Scientific)
1000 µ L końcówki do pipetRainin30389164
18 G igła strzykawkowaAir-Tite14-817-100 (Fisher Scientific)Długość 3", średnica 0,05"
200 i mikro; L pipeta wielokanałowaCorning4082
2-200 µ L końcówki do pipetBRANDZ740118 (Millipore Sigma)
24-dołkowa mikropłytka z ultraniskim mocowaniemCorning07-200-602
75 cm2  Kolba do hodowli komórkowych w kształcie litery UCorning461464UNiepoddana obróbce, z nasadką odpowietrzającą
96-dołkowa płytka z osłonąAxygenPCR-96-FS-C (Corning)
AcetonFisher ScientificA949-1Aceton powinien być używany na zimno
Wodorowęglan amonu (NH4HCO3)Sigma-AldrichA6141-25G
Wodorotlenek amonu rozwiązanieFisher ScientificAC423300250
Woda klasy do hodowli komórkowychCorning25-055-CV
ClinoReactorCelVivo10004-12Bioreaktor do hodowli komórkowych 3D
ClinoStarCelVivoN/AInkubator Clinostat CO2 do hodowli komórkowych 3D
Jednostka sterującaCelVivoN/ATabletka do ClinoStar Ustawienia
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Corning17-205-CV1X roztwór z 4,5 g/l glukozy i pirogronianu sodu, bez L-glutaminy i czerwieni fenolowej
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Corning35-010-CV
Kwas mrówkowyThermo Scientific28905
WyciągMottN/AModel 7121000
Szkło Pipeta PasteuraFisher Scientific13-678-8B9", bawełniana, szkło borokrzemowe, niesterylny
suplement GlutagroCorning25-015-CI200 mM L-ananylo-L-glutamina
Hank' s Zrównoważony roztwór soli (HBSS)Corning21-022-CV1X roztwór bez wapnia, magnezu i fenolu czerwony
acetonitryl klasy HPLCFisher ScientificA955-4
Woda klasy HPLCFisher ScientificW6-1
Kwas solny (HCl)Fisher ScientificA481-212
LódN/AN/A
MEM aminokwasy endogenneRoztwór Corning25-025-CI100X
Żywica Oasis HLBWody186007549Żywica hydrofilowo-lipofilowo-zrównoważona (HLB) z 30&mikro; m wielkość cząstek
Spektrometr masowy Orbitrap Fusion Lumos TribridThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFADBMBHQSpektrometr masowy o wysokiej rozdzielczości
Oro-Flex I polipropylenowa płyta filtracyjna OrochemOF110096-dołkowa polipropylenowa płyta filtracyjna z 10 i mikro; M PE fryta
Penicylina-StreptomycynaCorning30-002-CI100X roztwór
Papier pHHydrionZ111848 (Sigma-Aldrich)0-13 Papier testowy pH
Pistolet do pipetEppendorfZ666467 (Millipore Sigma)
PolimikrokapilaMolex50-110-7740 (Fisher Scientific)Elastyczna rurka kapilarna z topionej krzemionki z powłoką polimkową, 75 &mikro; M ID x 363 i mikro; M OD
Polistyren 10 ml pipety serologiczne, sterylneFisher Scientific1367549
Bezwodnik propionowySigma-Aldrich240311-50G
Wirówka z chłodzeniemThermo Scientific75-217-420
Żywica Reprosil-PurMSWILR13. AQ.0003120 & Aring; wielkość porów, faza C18-AQ, 3 &mikro; Rozmiar koralików
M RotatorClay Adams25477 (American Laboratory Trading)Mikser nutatorów 1105
Zmodyfikowana trypsyna klasy sekwencjonowaniaPromegaV5111
Maślan soduThermo ScientificA11079
Bursztynian sodu dwuzasadowySigma-Aldrich14160-100G
Koncentrator próżniowy SpeedVac (probówki do mikrowirówek 1,5 ml)Savant20249 (American Laboratory Trading)
Koncentrator próżniowy SpeedVac (96-dołkowy)Thermo Scientific15308325Savant SPD1010
Sterylny kapturThermo Scientific1375klasa II, typ A2
Kwas siarkowy (H2SO4)Fisher Scientific02-004-375Baker Analizowany odczynnik
ACSNaczynie 100 mm x 20 mm poddane hodowli tkankowejFisher Scientific08-772-23
Kwas trichlorooctowy (TCA)Thermo ScientificAC421451000Zawiesić 100% w/v w wodzie klasy HPLC
Kwas trifluorooctowy (TFA)Fisher ScientificPI28904Stopień sekwencjonowania
Kolektor próżniowy 96-dołkowyMiliporeMAVM0960R
VortexSigma-AldrichZ258415
Kąpiel wodnaFisher ScientificFSGPD10
Końcówki do pipet o szerokim otworze 1000 µ LAxygen14-222-703 (Fisher Scientific)
Końcówki do pipet o szerokim otworze 200 i mikro; LAxygen14-222-730 (Fisher Scientific)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).">Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  2. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).">Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  3. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).">Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).
  4. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology (Bethesda). 32 (4), 266-277 (2017).">Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology (Bethesda). 32 (4), 266-277 (2017).
  5. The cultural divide: exponential growth in classical 2D and metabolic equilibrium in 3D environments. PLoS One. 9 (9), 106973(2014).">Wrzesinski, K., et al. The cultural divide: exponential growth in classical 2D and metabolic equilibrium in 3D environments. PLoS One. 9 (9), 106973(2014).
  6. Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors. Bioengineering (Basel). 5 (1), 22(2018).">Wrzesinski, K., Fey, S. J. Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors. Bioengineering (Basel). 5 (1), 22(2018).
  7. Three-dimensional transgenic cell model to quantify genotoxic effects of space environment. Advances in Space Research. 27 (2), 421-430 (2001).">Gonda, S. R., et al. Three-dimensional transgenic cell model to quantify genotoxic effects of space environment. Advances in Space Research. 27 (2), 421-430 (2001).
  8. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).">Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  9. Top-down and middle-down protein analysis reveals that intact and clipped human histones differ in post-translational modification patterns. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (12), 3142-3153 (2015).">Tvardovskiy, A., et al. Top-down and middle-down protein analysis reveals that intact and clipped human histones differ in post-translational modification patterns. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (12), 3142-3153 (2015).
  10. Modifying chromatin by histone tail clipping. Journal of Molecular Biology. 430 (18), 3051-3067 (2018).">Azad, G. K., et al. Modifying chromatin by histone tail clipping. Journal of Molecular Biology. 430 (18), 3051-3067 (2018).
  11. Heads or tails: histone tail clipping regulates macrophage activity. Nature Immunology. 22 (6), 678-680 (2021).">Kragesteen, B. K., Amit, I. Heads or tails: histone tail clipping regulates macrophage activity. Nature Immunology. 22 (6), 678-680 (2021).
  12. Histone clipping: the punctuation in the histone code. EMBO Reports. 22 (8), 53440(2021).">Dhaenens, M. Histone clipping: the punctuation in the histone code. EMBO Reports. 22 (8), 53440(2021).
  13. Analyses of histone proteoforms using front-end electron transfer dissociation-enabled orbitrap instruments. Molecular and Cellular Proteomics. 15 (3), 975-988 (2016).">Anderson, L. C., et al. Analyses of histone proteoforms using front-end electron transfer dissociation-enabled orbitrap instruments. Molecular and Cellular Proteomics. 15 (3), 975-988 (2016).
  14. Reevaluating the roles of histone-modifying enzymes and their associated chromatin modifications in transcriptional regulation. Nature Genetics. 52 (12), 1271-1281 (2020).">Morgan, M. A. J., Shilatifard, A. Reevaluating the roles of histone-modifying enzymes and their associated chromatin modifications in transcriptional regulation. Nature Genetics. 52 (12), 1271-1281 (2020).
  15. Nothing is yet set in (hi)stone: novel post-translational modifications regulating chromatin function. Trends in Biochemical Sciences. 45 (10), 829-844 (2020).">Chan, J. C., Maze, I. Nothing is yet set in (hi)stone: novel post-translational modifications regulating chromatin function. Trends in Biochemical Sciences. 45 (10), 829-844 (2020).
  16. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).">Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
  17. Molecular basis for the discrimination of repressive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomb and HP1 chromodomains. Genes and Development. 17 (15), 1870-1881 (2003).">Fischle, W., et al. Molecular basis for the discrimination of repressive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomb and HP1 chromodomains. Genes and Development. 17 (15), 1870-1881 (2003).
  18. Progress in epigenetic histone modification analysis by mass spectrometry for clinical investigations. Expert Review of Proteomics. 12 (5), 499-517 (2015).">Onder, O., et al. Progress in epigenetic histone modification analysis by mass spectrometry for clinical investigations. Expert Review of Proteomics. 12 (5), 499-517 (2015).
  19. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. Journal of Proteomics. 75 (12), 3419-3433 (2012).">Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. Journal of Proteomics. 75 (12), 3419-3433 (2012).
  20. An assessment of histone-modification antibody quality. Nature Structural and Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).">Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nature Structural and Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).
  21. The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).">Moradian, A., et al. The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).
  22. Epiproteomics: quantitative analysis of histone marks and codes by mass spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 142-150 (2016).">Zheng, Y., Huang, X., Kelleher, N. L. Epiproteomics: quantitative analysis of histone marks and codes by mass spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 142-150 (2016).
  23. Middle-down proteomics: a still unexploited resource for chromatin biology. Expert Review of Proteomics. 14 (7), 617-626 (2017).">Sidoli, S., Garcia, B. A. Middle-down proteomics: a still unexploited resource for chromatin biology. Expert Review of Proteomics. 14 (7), 617-626 (2017).
  24. Hepatocellular carcinoma (HepG2/C3A) cell-based 3D model for genotoxicity testing of chemicals. Science of the Total Environment. 755, 143255(2021).">Stampar, M., et al. Hepatocellular carcinoma (HepG2/C3A) cell-based 3D model for genotoxicity testing of chemicals. Science of the Total Environment. 755, 143255(2021).
  25. Toxicity and anti-prolific properties of Xysmalobium undulatum water extract during short-term exposure to two-dimensional and three-dimensional spheroid cell cultures. Toxicology Mechanisms and Methods. 28 (9), 641-652 (2018).">Calitz, C., et al. Toxicity and anti-prolific properties of Xysmalobium undulatum water extract during short-term exposure to two-dimensional and three-dimensional spheroid cell cultures. Toxicology Mechanisms and Methods. 28 (9), 641-652 (2018).
  26. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).">Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).
  27. Sequential window acquisition of all theoretical mass spectra (SWATH) analysis for characterization and quantification of histone post-translational modifications. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (9), 2420-2428 (2015).">Sidoli, S., et al. Sequential window acquisition of all theoretical mass spectra (SWATH) analysis for characterization and quantification of histone post-translational modifications. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (9), 2420-2428 (2015).
  28. Low resolution data-independent acquisition in an LTQ-orbitrap allows for simplified and fully untargeted analysis of histone modifications. Analytical Chemistry. 87 (22), 11448-11454 (2015).">Sidoli, S., et al. Low resolution data-independent acquisition in an LTQ-orbitrap allows for simplified and fully untargeted analysis of histone modifications. Analytical Chemistry. 87 (22), 11448-11454 (2015).
  29. Identification and quantification of histone PTMs using high-resolution mass spectrometry. Methods in Enzymology. 574, 3-29 (2016).">Karch, K. R., Sidoli, S., Garcia, B. A. Identification and quantification of histone PTMs using high-resolution mass spectrometry. Methods in Enzymology. 574, 3-29 (2016).
  30. EpiProfile quantifies histone peptides with modifications by extracting retention time and intensity in high-resolution mass spectra. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (6), 1696-1707 (2015).">Yuan, Z. F., et al. EpiProfile quantifies histone peptides with modifications by extracting retention time and intensity in high-resolution mass spectra. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (6), 1696-1707 (2015).
  31. EpiProfile 2.0: a computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2533-2541 (2018).">Yuan, Z. F., et al. EpiProfile 2.0: a computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2533-2541 (2018).
  32. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).">MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
  33. The Skyline ecosystem: Informatics for quantitative mass spectrometry proteomics. Mass Spectrometry Reviews. 39 (3), 229-244 (2020).">Pino, L. K., et al. The Skyline ecosystem: Informatics for quantitative mass spectrometry proteomics. Mass Spectrometry Reviews. 39 (3), 229-244 (2020).
  34. Guide for protein fold change and p-value calculation for non-experts in proteomics. Molecular Omics. 16 (6), 573-582 (2020).">Aguilan, J. T., Kulej, K., Sidoli, S. Guide for protein fold change and p-value calculation for non-experts in proteomics. Molecular Omics. 16 (6), 573-582 (2020).
  35. UpSet: Visualization of intersecting sets. IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 20 (12), 1983-1992 (2014).">Lex, A., et al. UpSet: Visualization of intersecting sets. IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 20 (12), 1983-1992 (2014).
  36. HISTome2: a database of histone proteins, modifiers for multiple organisms and epidrugs. Epigenetics and Chromatin. 13 (1), 31(2020).">Shah, S. G., et al. HISTome2: a database of histone proteins, modifiers for multiple organisms and epidrugs. Epigenetics and Chromatin. 13 (1), 31(2020).
  37. Lysine succinylation and lysine malonylation in histones. Molecular and Cellular Proteomics. 11 (5), 100-107 (2012).">Xie, Z., et al. Lysine succinylation and lysine malonylation in histones. Molecular and Cellular Proteomics. 11 (5), 100-107 (2012).
  38. Histone succinylation and its function on the nucleosome. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (15), 7101-7109 (2021).">Liu, J., et al. Histone succinylation and its function on the nucleosome. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (15), 7101-7109 (2021).
  39. Is H3K4me3 instructive for transcription activation. Bioessays. 39 (1), 1-12 (2017).">Howe, F. S., et al. Is H3K4me3 instructive for transcription activation. Bioessays. 39 (1), 1-12 (2017).
  40. Role of H3K9me3 heterochromatin in cell identity establishment and maintenance. Current Opinion in Genetics and Development. 55, 1-10 (2019).">Nicetto, D., Zaret, K. S. Role of H3K9me3 heterochromatin in cell identity establishment and maintenance. Current Opinion in Genetics and Development. 55, 1-10 (2019).
  41. Histone H3K27 dimethyl loss is highly specific for malignant peripheral nerve sheath tumor and distinguishes true PRC2 loss from isolated H3K27 trimethyl loss. Modern Pathology. 32 (10), 1434-1446 (2019).">Wojcik, J. B., et al. Histone H3K27 dimethyl loss is highly specific for malignant peripheral nerve sheath tumor and distinguishes true PRC2 loss from isolated H3K27 trimethyl loss. Modern Pathology. 32 (10), 1434-1446 (2019).
  42. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).">Sellers, W. R., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
  43. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).">Zhang, D., et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).
  44. Histone serotonylation is a permissive modification that enhances TFIID binding to H3K4me3. Nature. 567 (7749), 535-539 (2019).">Farrelly, L. A., et al. Histone serotonylation is a permissive modification that enhances TFIID binding to H3K4me3. Nature. 567 (7749), 535-539 (2019).
  45. ADP-ribosylation of histone variant H2AX promotes base excision repair. The EMBO Journal. 40 (2), 104542(2021).">Chen, Q., et al. ADP-ribosylation of histone variant H2AX promotes base excision repair. The EMBO Journal. 40 (2), 104542(2021).
  46. Reversible histone glycation is associated with disease-related changes in chromatin architecture. Nature Communications. 10 (1), 1289(2019).">Zheng, Q., et al. Reversible histone glycation is associated with disease-related changes in chromatin architecture. Nature Communications. 10 (1), 1289(2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Histone ModificationsPost Translational Modifications3D Cell CultureHepatic SpheroidsChromatin StateLiquid Chromatography Mass SpectrometryHistone AcetylationHistone SuccinylationSpheroid FormationNuclei Isolation

Related Articles