Cyfrowe profilowanie przestrzenne w celu scharakteryzowania mikrośrodowiska w rozlanym glejaku naciekającym typu dorosłego

Summary

Dysregulacja proteomiczna odgrywa ważną rolę w rozprzestrzenianiu się glejaków naciekających dynacyjnie, ale kilka istotnych białek pozostaje niezidentyfikowanych. Cyfrowe przetwarzanie przestrzenne (DSP) oferuje wydajne, wysokoprzepustowe podejście do charakteryzowania zróżnicowanej ekspresji białek kandydujących, które mogą przyczyniać się do inwazji i migracji glejaków naciekających.

Abstract

Glejaki naciekające dyfuzyjnie wiążą się z wysoką zachorowalnością i śmiertelnością ze względu na infiltracyjny charakter rozprzestrzeniania się nowotworu. Są to guzy złożone morfologicznie, o wysokim stopniu zmienności proteomicznej zarówno w samym guzie, jak i w jego niejednorodnym mikrośrodowisku. Potencjał złośliwy tych nowotworów jest zwiększony przez rozregulowanie białek zaangażowanych w kilka kluczowych szlaków, w tym procesy utrzymujące stabilność komórkową i zachowujące integralność strukturalną mikrośrodowiska. Chociaż przeprowadzono liczne analizy glejaka masowego i jednokomórkowego, istnieje względny niedostatek stratyfikacji przestrzennej tych danych proteomicznych. Zrozumienie różnic w rozmieszczeniu przestrzennym czynników nowotworowych i populacji komórek odpornościowych między wewnętrznym guzem, inwazyjną krawędzią i mikrośrodowiskiem dostarcza cennych informacji na temat mechanizmów leżących u podstaw proliferacji i propagacji guza. Cyfrowe profilowanie przestrzenne (DSP) to potężna technologia, która może stanowić podstawę dla tych ważnych analiz wielowarstwowych.

DSP to metoda, która skutecznie określa ilościowo ekspresję białek w określonych przez użytkownika regionach przestrzennych w próbce tkanki. DSP idealnie nadaje się do badania zróżnicowanej ekspresji wielu białek w obrębie i między regionami rozróżnienia, umożliwiając analizę na wielu poziomach ilościowych i jakościowych. Protokół DSP jest systematyczny i przyjazny dla użytkownika, co pozwala na dostosowaną do potrzeb analizę przestrzenną danych proteomicznych. W tym eksperymencie mikromacierze tkankowe są konstruowane z archiwalnych biopsji rdzeniowych glejaka. Następnie wybierany jest panel przeciwciał, ukierunkowany na białka będące przedmiotem zainteresowania w próbce. Przeciwciała, które są wstępnie sprzężone z oligonukleotydami DNA dno rozszczepialnymi promieniami UV, są następnie inkubowane z próbką tkanki przez noc. W ramach wizualizacji przeciwciał za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej definiowane są obszary zainteresowania (ROI), w których należy określić ilościowo ekspresję białka. Światło UV jest następnie kierowane na każdy ROI, rozszczepiając oligonukleotydy DNA. Oligonukleotydy są mikroaspirowane i zliczane w ramach każdego ROI, określając ilościowo odpowiednie białko na podstawie przestrzennej.

Introduction

Glejaki naciekające dyfuzyjnie są najczęstszym typem złośliwego guza mózgu u dorosłych i są niezmiennie śmiertelne. Skłonność komórek glejaka do nadmiernej migracji w mózgu jest poważnym wyzwaniem terapeutycznym. Mechanizm, za pomocą którego się rozprzestrzeniają, obejmuje ukierunkowaną migrację i niekontrolowaną inwazję. Wykazano, że inwazyjne komórki glejaka wykazują tropizm i migrację wzdłuż szlaków istoty białej¹, przy czym ostatnie badania sugerują demielinizację tych dróg jako aktywną, protumorygenną cechę². W inwazji pośredniczy przejście nabłonkowe do mezenchymalnego, w którym komórki glejaka uzyskują właściwości mezenchymalne poprzez zmniejszenie ekspresji genów kodujących białka macierzy zewnątrzkomórkowej i cząsteczki adhezyjne komórek, wzmacniając migrację i ułatwiając propagację w mikrośrodowisku guza^3,4,5.

Na poziomie molekularnym wykazano zakłócenie kilku białek, które nadają stabilność komórkową i łączą się z komponentami immunogennymi⁶. Wiadomo, że glejaki naciekowe ulegają supresji białek o właściwościach antyapoptotycznych (np. PTEN)⁷. Wykazują również nadekspresję białek, które sprzyjają unikaniu odpowiedzi immunologicznej gospodarza (np. PD1/PDL1)⁸. Rozregulowanie tych złożonych szlaków zwiększa rakotwórczość i zwiększa potencjał złośliwy.

W próbkach inwazyjnego glejaka, celem było oszacowanie zróżnicowanej ekspresji białek kluczowych dla wzrostu, przeżycia i proliferacji komórek, a także dla integralności strukturalnej mikrośrodowiska między inwazyjnymi i nieinwazyjnymi komponentami. Ponadto staraliśmy się zbadać różnicową regulację białek o aktywnej roli immunogennej, oferując wgląd w mechanizm, dzięki któremu osłabiona obrona immunologiczna gospodarza może zwiększać proliferacyjny i inwazyjny potencjał glejaków. Jest to szczególnie istotne, biorąc pod uwagę niedawny zakres badań pokazujących, w jaki sposób markery immunologiczne i czynniki powodujące rozregulowanie w nowotworach złośliwych mogą służyć jako cele immunoterapii. Identyfikacja realnych celów terapeutycznych wśród wielu białek biorących udział w nadzorze immunologicznym i reaktywności wymaga bardzo czułego i kompleksowego podejścia.

Biorąc pod uwagę szeroki wachlarz potencjalnych białek, które mogą być badane, szukaliśmy metody zbliżonej do immunohistochemii, ale o zwiększonej wydajności przetwarzania danych. W dziedzinie biologii nowotworów DSP stał się potężną technologią o istotnych zaletach w porównaniu z alternatywnymi narzędziami do analizy proteomicznej i kwantyfikacji. Cechą charakterystyczną DSP jest jego zdolność do multipleksowania o wysokiej przepustowości, pozwalająca na jednoczesne badanie kilku różnych białek w próbce, co stanowi istotną różnicę w stosunku do standardowych, ale mniej pleksowych technologii, takich jak immunohistochemia (IHC)^9,10. Funkcja multipleksu DSP nie wpływa negatywnie na jego wierność jako narzędzia ilościowego i analitycznego, jak wykazały badania porównujące DSP z IHC. Na przykład, w przypadku użycia do proteomicznej kwantyfikacji próbek niedrobnokomórkowego raka płuca, wykazano, że DSP ma podobne wyniki do IHC¹¹. Dodatkowo DSP oferuje konfigurowalną specyfikację regionalną, w której użytkownicy mogą ręcznie definiować regiony, w których mają być przeprowadzana analiza proteomiczna. Daje to przewagę nad metodami multipleksu całosekcyjnego^10,12. W jednej rundzie przetwarzania DSP oferuje zatem wiele warstw analizy, badając kilka docelowych białek w wielu regionach zainteresowania.

DSP ma zastosowanie w kilku różnych ustawieniach patologicznych. DSP jest szczególnie korzystny w analizie onkologicznej, ponieważ zmienność przestrzenna może korelować z transformacją komórkową i różnicową ekspresją białek. Na przykład DSP wykorzystano do porównania profilu proteomicznego raka piersi z sąsiednim mikrośrodowiskiem guza. Niesie to ze sobą ważne implikacje dla zrozumienia naturalnej historii tego guza i jego progresji, a także potencjalnej odpowiedzi na leczenie¹³. Dodatkowe konteksty ilustrujące wszechstronność DSP obejmują przestrzenną kwantyfikację różnorodności białek w raku prostaty¹⁴, związek ekspresji markerów komórek odpornościowych z progresją choroby w raku płaskonabłonkowym głowy i szyi¹⁵, oraz wykazanie nabłonkowo-mezenchymalnego gradientu ekspresji białka odróżniającego przerzutowego od pierwotnego raka jasnokomórkowego jajnika¹⁶. Wdrażając DSP, charakteryzujemy topografię przestrzenną białek, które mogą mieć wpływ na nowotworzenie i inwazję glejaków.

Protocol

Protokół opisany poniżej jest zgodny z wytycznymi Komisji Etyki Badań Naukowych Dartmouth-Hitchcock. Uzyskano świadomą zgodę od pacjentów, których próbki tkanek zostały włączone do tego badania. Zapoznaj się z sekcją Tabela materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów, odczynników, sprzętu i oprogramowania używanego w tym protokole.

1. Przygotowanie do slajdów¹⁷

1. Pobrać lub przygotować utrwaloną w formalinie, zatopioną w parafinie tkankę z rozlanych glejaków naciekających u dorosłych ludzi.
   UWAGA: W tym eksperymencie wykorzystano zatopione w parafinie bloki biopsji od trzech pacjentów z glejakiem.
2. Utwórz blok mikromacierzy tkankowej (TMA). Weź kilka 2-milimetrowych rdzeni z każdej biopsji i umieść je w jednym bloku TMA (Ryc. 1, u góry). Wytnij sekcje z bloku TMA na 4 μm i zamontuj na szkiełkach podstawowych. Umieść każdy suwak w uszczelce uchwytu suwaka. Inkubować szkiełko w temperaturze 60 °C przez 30 minut.

2. Półautomatyczne przygotowanie systemu IHC i konfiguracja oprogramowania (do załadunku i uruchamiania slajdów)¹⁷

1. Skonfiguruj odczynniki. Kliknij przycisk Reagent Setup (Ustawienia odczynnika). Kliknij Dodaj na karcie Konfiguracja.
   1. Zarejestruj bufor mycia, wpisując jego nazwę w polu Nazwa. Wybierz opcję Pomocniczy w polu Typ. Kliknij Zapisz.
   2. Zarejestruj roztwór blokujący, powtarzając te same kroki, co powyżej (zmodyfikowane w zależności od potrzeb, np. w polu Nazwa), ale wybierając opcję Przeciwciało pierwszorzędowe w polu Typ. Wybierz żądane protokoły z pól rozwijanych Domyślny protokół barwienia i Domyślny protokół HIER. W razie potrzeby wybierz opcję Domyślny protokół enzymatyczny (to pole pozostało puste w bieżącym protokole). Kliknij Zapisz.
2. Zarejestruj system detekcji, składający się z tacki na pojemnik na odczynniki z kodem kreskowym. Zeskanuj kod kreskowy.
   1. Rozpocznij wprowadzanie szczegółów systemu odczynników w oknie Dodaj system odczynników badawczych. Wpisz nazwę systemu detekcji.
   2. Wpisz datę wygaśnięcia. Podświetl pierwszy wiersz karty odczynników i zeskanuj kod kreskowy nowego pojemnika na odczynniki o pojemności 30 ml, po czym kod kreskowy wypełni wiersz 1.
   3. Umieść pojemnik w pozycji 1 systemu detekcji. Wybierz nazwę bufora myjącego w polu rozwijanym w kolumnie Odczynnik i kliknij Dodaj. Powtórz te kroki, aby dodać dodatkowe odczynniki w kolejnych wierszach, w tym roztwór blokujący.
3. Skonfiguruj Protokół Białkowy dla IHC. Kliknij Ustawienia protokołu. Zaznacz wiersz odpowiadający żądanemu protokołowi i kliknij Kopiuj. Wprowadź nazwę i wypełnij wszystkie inne odpowiednie pola w oknie Edytuj właściwości protokołu.
   1. Zaznacz pole Pokaż kroki mycia. Upewnij się, że pola Inc (min) i DispenseType są poprawne dla każdego odczynnika (10 min dla roztworu blokującego, 0 min dla buforu do przemywania i 150 μl dla każdego typu dozowania). Kliknij Zapisz.
4. Przygotuj badanie. Napełnij pojemnik w pozycji 1 buforem do mycia. Napełnić 150 μl na szkiełko i 5 ml objętości martwej; Pozostaw pokrywę otwartą. Powtórz te kroki dla pojemnika w pozycji 2, który powinien być wypełniony roztworem blokującym. Pojemnik ten powinien mieć 150 μl na szkiełko i 350 μl objętości martwej.
   1. Załaduj tackę na pojemnik na odczynniki do urządzenia. Zezwól systemowi na wykonywanie czynności rozpoznawania kontenerów i potwierdzania woluminu. Kliknij Ustawienia slajdów | Dodaj badanie. Wprowadź identyfikator badania i nazwę badania, a następnie wybierz 150 μl w obszarze Objętość dozowania | żądany protokół w menu rozwijanym Protokół przygotowania (sugerowane jest pieczenie i odwoskowywanie wosku). Podświetl badanie i kliknij Dodaj slajd.
   2. Wybierz tkankę testową w obszarze Typ tkanki | 150 μL w obszarze Objętość dozowania | Pojedynczy i rutynowy z pól rozwijanych Tryb barwienia. Wybierz proces (IHC dla bieżącego badania) | nazwę rozwiązania blokującego w polu rozwijanym pola Znacznik | Protokół IHC DSP w polu Barwienie w zakładce Protokoły | *Pieczenie i odwoskowywanie w celu przygotowania | *HIER 20 min z ER1 dla HIER. Pole Enzym pozostaw puste.
   3. Powtórz ten proces dla każdego slajdu. Kliknij Zamknij po zakończeniu, a następnie kliknij Drukuj etykiety. Zaznacz wszystkie etykiety slajdów, które nie zostały jeszcze wydrukowane dla bieżącego badania i kliknij przycisk Drukuj. Przyklej etykiety na górze slajdów.
5. Załaduj i uruchom slajdy. Załaduj szkiełka na tacę na szkiełka, upewniając się, że próbka i etykieta są skierowane do góry. Umieść płytki okładki na slajdach, upewniając się, że slajdy są zorientowane z zakładkami na dole. Załaduj tace na suwak na instrument.
   1. Naciśnij przycisk LED, aby opuścić tacę i pozwolić instrumentowi rozpocząć skanowanie i rozpoznawanie slajdów. Kliknij przycisk Start, aby rozpocząć eksperyment.
6. Zakończ eksperyment. Naciśnij przycisk LED, gdy zacznie migać na zielono, wskazując zakończenie biegu. Wyjmij tacę z instrumentu i ostrożnie podnieś płytki pokrywy z każdego slajdu. Umieść szkiełka w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), usuń nadmiar buforu i obrysuj każdy fragment tkanki hydrofobowym pisakiem, aby stworzyć hydrofobową barierę.

3. Inkubacja przeciwciał i barwienie jąder¹⁷

1. Wybierz panel przeciwciał, aby zlokalizować interesujące nas antygeny (patrz Tabela 1 dla przeciwciał użytych w tym eksperymencie).
   UWAGA: Każde przeciwciało zostało już sprzężone z oligonukleotydem DNA z segmentem fotorozszczepialnym UV (PC-oligo), który jednoznacznie je identyfikuje (oligonukleotydy indeksujące, Rysunek 2).
2. Sporządzić roboczy roztwór przeciwciała-PC-oligo, dodając na każde szkiełko 8 μl każdego przeciwciała (rozcieńczonego w stosunku 1:40) do panelu. Użyj odczynnika blokującego jako rozcieńczalnika, aby osiągnąć końcową objętość 200 μl na każdy szkiełko. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C (Rysunek 3, Krok 1).
   UWAGA: Na tym etapie do roztworu można również dodać markery morfologiczne, barwniki biologiczne lub przeciwciała znakowane fluorescencyjnie.
3. Następnego dnia umieść szkiełko w słoiku Coplin i umyj 3 x 10 min w 1x TBS-T. Postfix w 4% paraformaldehydzie przez 30 min w temperaturze pokojowej, a następnie 2 x 5 min w 1x TBS-T.
4. Dodaj barwnik jądrowy SYTO13 (rozcieńczony 1:10 w 1x TBS) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Umyj 2x za pomocą 1x TBS-T, a następnie przechowuj szkiełko w 1x TBS-T.

4. Wizualizacja fluorescencji, identyfikacja ROI i fotofiltracja UV na instrumencie DSP¹⁷

1. Po najechaniu kursorem myszy na Zbieranie danych w Centrum sterowania wybierz pozycję Nowy/Kontynuuj uruchamianie.
2. Umieść szkiełko w uchwycie na szkiełka, etykietą skierowaną w stronę użytkownika. Opuść tacę ślizgową clamp, upewniając się, że tkanka jest widoczna w wydłużonym okienku. Dodaj 6 ml buforu S.
3. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi w Centrum sterowania. Powiększaj między różnymi osiami za pomocą suwaków X i Y, aby wyznaczyć region do skanowania. Wybierz opcję Skanuj. Pozwól na kontynuowanie skanowania, dopóki cały zdefiniowany obszar docelowy nie zostanie zobrazowany.
4. Wygeneruj obraz 20x. Zdefiniuj ROI automatycznie lub ręcznie (Rysunek 3, Krok 2). Aby postępować zgodnie z tym protokołem, wybierz trzy okrągłe ROI o jednakowej wielkości (średnica 250 μm) dla każdego rdzenia tkanki (Rysunek 4, na dole).
   UWAGA: Zwrot z inwestycji można dostosować pod względem rozmiaru i kształtu. W każdej sekcji można wybrać kilka ROI. W tym eksperymencie cykliczne ROI są definiowane ręcznie.
5. Zatwierdź zwrot z inwestycji, klikając przycisk Wyjdź z obszaru roboczego skanowania. Poczekaj, aż światło UV odetnie oligonukleotydy od przeciwciał.
6. Po zakończeniu procesu czyszczenia urządzenia wybierz opcję Nowa kolekcja danych, aby kontynuować pracę z bieżącymi slajdami lub płytą. W przeciwnym razie wybierz opcję Usuń szkiełka i mikropłytkę.
7. Otwórz okno Finalizuj płytę, klikając dwukrotnie obszar ikony płyty w prawym dolnym rogu Centrum sterowania. Jeśli znany jest numer partii pakietu kodów hybrydyzacji (Hyb) (#), wprowadź numer i kliknij przycisk Aktualizuj (opcjonalnie na tym etapie). Kliknij Finalizuj.
8. Odłącz uchwyt suwaka i płytkę zbiorczą, postępując zgodnie z instrukcjami. Przechowuj slajdy w TBS-T. Jeśli szkiełka nie będą używane przez dłuższy czas, przykryj je roztworem wodnym i szkiełkiem nakrywkowym.

5. Białko readout¹⁷

1. Użyć przepuszczalnego uszczelnienia i wysuszyć aspiraty w temperaturze 65 °C w termocyklerze z otwartą górą. Dodać 7 μl wody uzdatnionej pirowęglanem dietylu i wymieszać. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie szybko odwiruj.
2. Wybierz odpowiednie równania sondy R i sondy U z tabeli 2, aby pokierować tworzeniem mieszanki sonda/bufor. Opierając się na liczbie kodów Hyb niezbędnych do hybrydyzacji w niniejszym eksperymencie, zastosuj równanie (1) jak poniżej. Szybko wymieszaj i odwiruj.
   # Kody Hyb Sonda R Sonda puli roboczej U Bufor hybrydyzacyjny puli roboczej n = _______ (n × 8 μL) = _____ μL + (n × 8 μL) = ______ μL + (n × 80 μL) = _____ μL (1)
3. Dodaj 84 μl mieszanki sondy/buforu do każdego pakietu kodów Hyb, który ma być użyty. Przesuń, aby zmiksować i obrócić w dół. Na świeżej 96-dołkowej płytce do hybrydyzacji dodaj 8 μl każdej mieszanki Hyb Code Master Mix do wszystkich 12 dołków we wskazanym rzędzie.
4. Przenieść 7 μl z płytki zbiorczej DSP do odpowiedniego dołka w płytce hybrydyzacyjnej. Delikatnie wymieszaj. Zgrzej na gorąco i wykonaj szybkie wirowanie. Następnie inkubować przez noc w temperaturze 67 °C. Schłodzić płytkę na lodzie i szybko zawirować.
5. Zbierz produkty hyb z każdej studzienki w probówce paskowej, delikatnie pipetując każdą studzienkę 5 razy, aby wymieszać. Zakryj rurkę paskową i odwiruj. Zamrozić wszelkie pozostałe produkty hyb w temperaturze -80 °C. Załadować probówki paskowe do systemu analizy.
6. Zapisz plik CDF na dysku USB, a następnie przenieś dane z instrumentu DSP do analizatora cyfrowego. Zakończ konfigurację, wykonując następujące czynności.
   1. Załaduj materiały eksploatacyjne i zebrane próbki do stacji przygotowawczej. Na ekranie naciśnij Rozpocznij przetwarzanie. Wybierz opcję Wysoka czułość, a następnie przycisk Dalej. Naciśnij przycisk Zaznacz wszystko, aby określić liczbę studzienek z próbkami | Wykończenie | Następny w powiadomieniu e-mail | Początek.
   2. Po zakończeniu stacji przygotowawczej uszczelnij wkład i przenieś go do analizatora cyfrowego. Naciśnij Rozpocznij liczenie, wybierz Stage Position, naciśnij Load Existing CDF file i wybierz poprzednio przesłany plik. Naciśnij Gotowe, ponownie wybierz pozycję sceny, naciśnij Gotowe | Zacznij uruchamiać program.
7. Zapisz spakowany plik z plikami konwersji liczby reporterów z systemu analitycznego na dysk USB, a następnie włóż dysk do urządzenia DSP. W Centrum sterowania DSP najedź kursorem na Zbieranie danych, a następnie kliknij Prześlij liczby. Wybierz odpowiedni spakowany plik.

6. Analiza danych¹⁷

1. Kliknij Rekordy w Centrum sterowania DSP. Aby wyświetlić skany w kolejce, wybierz opcję Dodaj wybrane skany do kolejki | Moja kolejka analiz. Wybierz Nowe badanie z kolejki po najechaniu kursorem na opcję Analiza danych w Centrum sterowania.
2. Wybierz opcję QC z opcji paska zadań. Kontynuuj z wartościami domyślnymi lub dostosuj w razie potrzeby. Wybierz pozycję Uruchom kontrolę jakości i przejrzyj siatkę wyników. Kliknij Uruchom kontrolę jakości, aby kontynuować i utworzyć nowy zestaw danych, normalizując wartości do dodatnich kontrolek hybrydyzacji.
3. Zaimportuj nowe tagi do pliku XLSX. Wybierz pozycję Zarządzaj adnotacjami w okienku Skanowania, a następnie pobierz szablon, wstaw znaczniki i zaimportuj plik.
4. OPCJONALNIE: Po uruchomieniu kontroli jakości dostosuj dane dalej, korzystając z innych opcji paska narzędzi. Użyj narzędzi w okienku Wizualizacje, aby wykreślić przekształcone dane.
5. Przejdź do szarego pola listy rozwijanej parametrów, aby skomponować każdy wykres w okienku Wizualizacje. Wybierz określony obszar na wykresie, aby zwizualizować odpowiadające mu wyróżnione segmenty w okienku Skanowania, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wygenerować znaczniki lub grupy. W obszarze Podsumowanie zestawu danych przejrzyj wykresy z normalizacji, skalowania i innych opcji analizy i wyświetlania.
6. Zapisz wizualizację, wybierając ikonę Zapisz; przejrzyj wizualizacje już zapisane w obszarze Podsumowanie. Wybierz przycisk Eksportuj (.svg), aby wyeksportować wizualizację w formacie .svg. Eksportuj dane, na których oparta jest wizualizacja, klikając przycisk Eksportuj (.xlsx). Wyeksportuj wszystkie dane zawarte w określonym zestawie danych, umieszczając kursor na nazwie zestawu danych w drugim okienku i klikając ikonę eksportu.

Results

Rysunek 4 pokazuje reprezentatywne wyniki eksperymentu DSP przeprowadzonego na próbkach glejaka. Prezentowana jest mapa cieplna, ilustrująca jedną z metod wizualnego przechwytywania danych za pomocą oprogramowania DSP. Wiersze reprezentują docelowe białka, a każda kolumna odpowiada regionowi zainteresowania. Zakres kolorów od niebieskiego do czerwonego oznacza odpowiednio niską i wysoką ekspresję. Zmienność koloru w obrębie rzędu odzwierciedla regionalną heterogeniczność białek i sugeruje mo...

Discussion

Biorąc pod uwagę różnorodność białek, które mogą potencjalnie wpływać na agresywność glejaków oraz pogląd, że kilka z tych białek pozostaje nieodkrytych, wysokoprzepustowa metoda kwantyfikacji białek jest idealnym podejściem technologicznym. Dodatkowo, biorąc pod uwagę, że dane przestrzenne w próbkach onkologicznych często korelują ze zróżnicowaną ekspresją¹⁸, włączenie profilowania przestrzennego do podejścia do kwantyfikacji białek pozwala na bardziej efektywną analizę.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
System detekcji badań BOND	Leica Biosystems, Wetzlar, Niemcy	DS9455	Otwarty system detekcji zawierający otwarte pojemniki w tacce na odczynniki
Mycie BOND Leica	Biosystems, Wetzlar, Niemcy	AR950	10X skoncentrowany roztwór buforowy do mycia tkanek utrwalonych
Bufor W	NanoString, Seattle, WA	kontaktowa	odczynnika blokującego
Cy3	Abcam, Cambridge, Wielka Brytania	AB188287	Zestaw do koniugacji przeciwciał fluorescencyjnych Cy3
GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)	NanoString, Seattle, WA	Skontaktuj się z firmą	System do obrazowania i charakteryzowania celów białkowych i RNA
GeoMx DSP Instrument BufferKit	NanoString, Seattle, WA	100471	Zestaw buforowy do GeoMX DSP (w tym do przetwarzania i przygotowania próbek)
GeoMx Hyb Code Pack_Protein	NanoString, Seattle, WA	121300401	Controls do uruchamiania GeoMX DSP experiemtns
GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs)	NanoString, Seattle, WA	121300101	Moduł białkowy z celami dla ludzkich komórek odpornościowych i celów immunoonkologicznych
GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)	NanoString, Seattle, WA	121300105	Moduł białkowy z celami dla wielu typów nowotworów u ludzi oraz dla markerów przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego
GeoMx Protein Slide Prep FFPE	NanoString, Seattle, WA	121300308	Odczynniki do przygotowania próbek do analizy białek GeoMX DSP
LEICA Bond RX	Leica Biosystems, Wetzlar, Niemcy	Skontaktuj się z firmą	W pełni zautomatyzowany zestaw Master Stainer IHC
- 12 reakcji	NanoString, Seattle, WA	100052	Materiały i odczynniki do stosowania z systemem analizy nCounter
System analizy nCounter	NanoString, Seattle, WA	Skontaktuj się	z firmą Zautomatyzowany system do ilościowego oznaczania ekspresji docelowej multipleksu (do użytku z GeoMx DSP)
TMA Master II	3DHistech Ltd., Budapeszt, Węgry		Aby utworzyć blok mikromacierzy tkankowej