Method Article

Zintegrowany proces identyfikacji i kwantyfikacji nieukierunkowanego metabolomu opartego na kontroli FDR

DOI:

10.3791/63625

⸱

September 20th, 2022

 ,  ,  , 
1Key Laboratory of Functional Protein Research of Guangdong Higher Education Institutes and MOE Key Laboratory of Tumor Molecular Biology, Institute of Life and Health Engineering, College of Life Science and Technology, Jinan University, 2Chi-Biotech Co. Ltd.

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skonstruowaliśmy nieukierunkowany przepływ metabolomiczny, który zintegrował XY-Meta i metaX razem. W tym protokole pokazaliśmy, jak używać XY-Meta do generowania wabikowej biblioteki spektralnej na podstawie odniesienia do widm w otwartym dostępie, a następnie przeprowadziliśmy kontrolę FDR i użyliśmy metaX do ilościowego określenia metabolitów po zidentyfikowaniu widm metabolomicznych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Techniki metabolomiki nieukierunkowanej są szeroko stosowane w ostatnich latach. Jednak szybko rosnąca przepustowość i liczba próbek tworzą ogromną ilość widm, co stanowi wyzwanie dla kontroli jakości widm spektrometrii mas. Aby zmniejszyć liczbę wyników fałszywie dodatnich, konieczna jest kontrola jakości wskaźnika fałszywych wykryć (FDR). Niedawno opracowaliśmy oprogramowanie do kontroli FDR identyfikacji nieukierunkowanego metabolomu, które opiera się na strategii Target-Decoy o nazwie XY-Meta. Tutaj zademonstrowaliśmy kompletny potok analizy, który integruje ze sobą XY-Meta i metaX. Protokół ten pokazuje, jak używać XY-meta do generowania bazy danych wabików z istniejącej referencyjnej bazy danych i wykonywania kontroli FDR przy użyciu strategii Target-Decoy do identyfikacji metabolomu na dużą skalę na otwartym zbiorze danych. Analizę różnicową i adnotację metabolitów przeprowadzono po uruchomieniu metaX w celu wykrycia pików metabolitów i oceny ilościowej. Aby pomóc większej liczbie badaczy, opracowaliśmy również przyjazną dla użytkownika platformę analityczną opartą na chmurze do tych analiz, bez konieczności posiadania umiejętności bioinformatycznych lub znajomości języków komputerowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metabolity odgrywają ważną rolę w procesach biologicznych. Metabolity są często regulatorami różnych procesów, takich jak transfer energii, regulacja hormonów, regulacja neuroprzekaźników, komunikacja komórkowa i modyfikacje potranslacyjne białek itp1,2,3,4. Metabolomika nieukierunkowana zapewnia globalny wgląd w liczne metabolity5,6. Dzięki postępom w technologii spektrometrii mas i chromatografii, przepustowość widm metabolomu MS/MS gwałtownie rośnie w ostatnich latach7,8,9,10,11. Aby zidentyfikować metabolity na podstawie tych ogromnych zbiorów danych, opracowano różne programy adnotacyjne11, takie jak MZmine12, MS-FINDER13, CFM-ID14, MetFrag15 i SLAW16. Jednak te identyfikatory często zawierają wiele fałszywych alarmów. Powody są następujące: (1) Widma MS/MS zawierają losowy szum, który może zmylić dopasowanie pików. (2) Izomery i różnice w energiach fragmentacji powodują wielokrotne odciski palców widm, a tym samym zwiększają objętość biblioteki referencyjnej. (3) Jakość bibliotek referencyjnych jest zróżnicowana. Potrzebny jest odpowiedni standard do zbudowania dobrej referencyjnej biblioteki spektralnej. W związku z tym systematyczna kontrola wskaźnika fałszywych odkryć (FDR) dla metabolomiki nieukierunkowanej jest niezbędna do badań nad funkcjonalnym metabolomem7,8,9,17.

Zarówno empiryczne podejście Bayesa, jak i strategia Target-Decoy ogólnie rozwiązały problem kontroli FDR. Kerstin Scheubert i wsp. wykazali, że strategia Target-Decoy na bazie danych wabików wygenerowanej metodą opartą na drzewie fragmentacji jest najlepszą metodą dla kontroli FDR9. Xusheng Wang i in. zaprojektowali metodę generowania wabików w oparciu o regułę oktetu w chemii i poprawili precyzję szacowania FDR17. Biblioteka spektralna do generowania bazy danych wabików została zademonstrowana w celu uzyskania lepszej wydajności18. W tym przypadku ulepszyliśmy metodę opartą na bibliotece spektralnej i opracowaliśmy oprogramowanie o nazwie XY-Meta19, które może jeszcze bardziej poprawić precyzję szacowania FDR. Wykorzystuje istniejącą referencyjną bibliotekę spektralną do wygenerowania biblioteki wabików dla sterowania FDR w schemacie Target-Decoy. XY-Meta obsługuje własne algorytmy dopasowywania widm i podobieństwa cosinusowego. Umożliwia konwencjonalne tryby wyszukiwania i wyszukiwania iteracyjnego. Na etapie oceny FDR obsługuje tryb konkatenacyjny Target-Decoy i tryb oddzielony. Dla większej elastyczności, XY-Meta akceptuje zewnętrzne biblioteki wabików.

Wykrywanie pików i kwantyfikacja metabolitów jest również ważnym krokiem w nieukierunkowanej analizie metabolomu. Wykrywanie pików jest główną metodą identyfikacji metabolomu. Ogólnie rzecz biorąc, na dokładność wykrywania pików metabolitów miało wpływ wiele czynników, takich jak sygnały szumu spektrometrii mas, niska obfitość metabolitów, zanieczyszczenia i produkty degradacji metabolitów20. Gdy liczba próbek jest zbyt duża lub kolumna chromatografii cieczowej została zastąpiona w eksperymentach z nieukierunkowanym metabolomem, mogą pojawić się niezwykłe efekty wsadowe, co jest głównym wyzwaniem dla kwantyfikacji metabolomu21,22,23. Obecnie oprogramowanie takie jak XCMS24, Workflow4Metabolomic25, iMet-Q26 i metaX19 może wykonywać wykrywanie pików i kwantyfikację nieukierunkowanego metabolomu, ale sugerujemy, że potok metaX jest bardziej kompletny i łatwiejszy w użyciu. W tym miejscu demonstrujemy proces identyfikacji i kontroli FDR dla publicznie dostępnego zestawu danych msv000084112 przy użyciu XY-Meta oraz wykrywanie pików i kwantyfikację metabolitów za pomocą metaX. Ten przepływ pracy wymaga tylko dwóch grup, a każda grupa potrzebuje co najmniej dwóch próbek. Dane widm MS / MS są potrzebne, niezależnie od platformy spektrometru mas, trybu jonizacji, trybu ładowania i typu próbki, a także mogą obsługiwać normalizację opartą na próbce i normalizację opartą na pikach. Idąc tym przykładem, naukowcy mogą przeprowadzić identyfikację metabolomiczną i kwantyfikację w łatwy do opanowania sposób. Korzystanie z tego potoku wymaga możliwości programowania w języku R. Aby pomóc badaczom bez wiedzy programistycznej, opracowaliśmy również platformę analizy w chmurze do analizy metabolomicznej. Zademonstrowaliśmy tę platformę analizy chmury w materiale uzupełniającym 5.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie zestawów danych metabolomicznych do analizy

UWAGA: W tej demonstracji używamy zestawów danych metabolomicznych bez próbki QC. Potrzebne są dane dla grup klinicznych i kontrolnych. Do demonstracji używamy publicznego zestawu danych w bazie danych GNPS27.

  1. Przejdź do strony internetowej https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/static/gnps-splash.jsp. Kliknij przycisk Przeglądaj zestawy danych.
  2. Wyszukaj słowo kluczowe "msv000084112" w kolumnie Tytuł. Kliknij numer identyfikacyjny zestawu danych, aby uzyskać szczegółowe informacje, a następnie pobierz zestaw danych za pomocą protokołu FTP.
  3. Umieść nieprzetworzone dane w folderze /msv000084112.
    UWAGA: Ten zestaw danych został pozyskany przy użyciu C18 RP-UHPLC na platformie Q Exactive w trybie dodatnim. Reprezentuje kohortę z niescharakteryzowaną chorobą metabolizmu próbek moczu, w tym 33 próbki zdrowych ludzi, 12 próbek ślepych, dwie próbki mieszane i 82 próbki pacjentów28 (Materiał uzupełniający 8). Aby zademonstrować przepływ pracy, losowo wybraliśmy sześć próbek zdrowych osób (NH) jako grupę kontrolną i sześć próbek z chorobą (NT) jako grupę przypadków do wykonania przepływu pracy.

2. Konwersja formatu danych

UWAGA: Jeśli zbiór danych to surowe dane wygenerowane bezpośrednio ze spektrometru masowego, to zazwyczaj w formacie .raw, .wiff lub .cdf. Powinny być one przekonwertowane do formatów mzXML i mgf. Tutaj używamy narzędzia msconvert w pakiecie ProteoWizard29, aby wykonać konwersję formatu.

  1. Pobierz ProteoWizard z https://proteowizard.sourceforge.io/download.html i zainstaluj go.
  2. Przekonwertuj format danych za pomocą msconvert.exe w ścieżce instalacji ProteoWizard.
    1. Przekonwertuj surowe dane do formatu mzXML i zapisz je w folderze /mzXML:/msconvert.exe /raw/*.raw -o /raw/mzXML/ --filter "peakPicking true [1,2]" --filter "zeroSamples removeExtra" --mzML --zlib --mz64 --filter "msLevel 1-2" --filter "titleMaker ... ".
    2. Przekonwertuj dane raw/mzXML do formatu mgf i zapisz je w folderze /mgf:/msconvert.exe /msv000084112/*.raw -o /msv000084112/mgf/ --filter "peakPicking true [1,2]" --filter "zeroSamples removeExtra" --mgf --mz64 --filter "msLevel 1-2" --filter "titleMaker ... ".

3. Przygotuj referencyjną bibliotekę spektralną dla metabolitów

UWAGA: XY-meta obsługuje referencyjne biblioteki spektralne tylko w formacie mgf.

  1. Przejdź do strony internetowej https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/libraries.jsp. Wyszukaj słowo kluczowe "NIST", aby znaleźć przedmiot. Kliknij Widok, aby uzyskać szczegółowe informacje i pobrać bibliotekę.
    UWAGA: Publiczne Biblioteki Spektralne GNPS zgromadziły wiele bibliotek metabolitów, uporządkowanych według typu, pochodzenia, gatunków i trybów zbierania. Chociaż tylko niewielka część tych bibliotek jest tworzona przy użyciu standardowych materiałów, zwykle wystarczają one do większości badań podstawowych.
  2. Umieść pobraną bibliotekę GNPS-NIST14-MATCHES.mgf w folderze /database.

4. Identyfikacja metabolitów i kontrola FDR

  1. Pobierz XY-meta (wersja dla systemu Windows). Znajdź plik konfiguracyjny parametru parameter.default w folderze /XY-Meta-Win/config/. Zmień jego zawartość zgodnie z materiałem uzupełniającym 1.
    UWAGA: W roztworze metabolity często tworzą addukty z anionami lub kationami, co prowadzi do przesunięcia masy jonów macierzystych. Dlatego konieczne jest ustawienie typów przywodzeń. Dostarczyliśmy listy adduktów dla kolumny jonowymiennej i odwróconych kolumn analitycznych w trybie ładunku dodatniego i trybie ładunku ujemnego w folderze /adduct. Użytkownicy mogą również edytować własną listę przywodzeń zgodnie ze swoim projektem badawczym. Lista przywodzeń powinna być w tym samym formacie, co podana lista.
  2. Przeprowadź identyfikację metabolitów i kontrolę FDR za pomocą XY-Meta:XY-Meta.exe -S /XY-Meta-Win/config/parameter.default -D /msv000084112/ pos_wt-1_a.mgf -R /database/GNPS-NIST14-MATCHES.mgf.
    UWAGA: XY-Meta nie obsługuje symboli wieloznacznych w parametrach. W związku z tym do przetworzenia każdego pliku mgf należy użyć jednego polecenia. W przypadku dużej liczby plików zalecany jest plik wsadowy.

5. Analiza różnicowa

UWAGA: metaX to pakiet R o otwartym kodzie źródłowym. Zainstaluj go zgodnie z instrukcją na https://github.com/wenbostar/metaX. Do tej analizy wymagane jest 8 GB pamięci RAM.

  1. Edytuj plik sampleList.txt, aby określić próbkę i odpowiadające jej dane MS. Proszę zapoznać się z materiałem uzupełniającym 2.
    UWAGA: metaX obsługuje analizę ilościową dla zestawów danych z próbkami QC. W przypadku korzystania z próbek kontroli jakości należy zmodyfikować właściwość klasy na NA dla próbek kontroli jakości.
  2. Utwórz folder /output do przechowywania wyników analizy ilościowej. Użyj języka R, aby uruchomić skrypt w materiale uzupełniającym 3, aby użyć metaX do ilościowego określenia grup MOCK i WT.
    UWAGA: Przed uruchomieniem skryptu w materiale uzupełniającym 3 zmodyfikuj ścieżki w skrypcie do rzeczywistych ścieżek lokalnych.

6. Integracja wyników jakościowych i ilościowych

  1. Uruchom skrypt języka R w materiale uzupełniającym 4, aby dodać adnotacje do pików w analizie jakościowej i ilościowej przy użyciu identyfikacji metabolitów.
    UWAGA: Przed uruchomieniem skryptu w Materiałach uzupełniających 4 zmodyfikuj ścieżki w skrypcie do rzeczywistych ścieżek lokalnych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Surowe dane msv000084112 zostały przekonwertowane przez msconvert.exe i wygenerowane pliki mgf (Materiał uzupełniający S6).

XY-Meta wygenerował plik GNPS-NIST14-MATCHES_Decoy.mgf w folderze /database. Jest to biblioteka zwodząca wygenerowana z oryginalnej referencyjnej biblioteki spektralnej GNPS-NIST14-MATCHES.mgf. Ta biblioteka wabików może być ponownie wykorzystana. Podczas ponownego korzystania z tej biblioteki zwodzików, użytkownik powinien ustawić decoy_pattern na 1 w pl...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kontrola niedocelowych metabolitów przez FDR była wielkim wyzwaniem. W tym miejscu zademonstrowaliśmy kompletny zestaw wielkoskalowych, nieukierunkowanych analiz metabolomicznych (jakościowych i ilościowych) z kontrolą FDR. To skutecznie zmniejsza liczbę fałszywych alarmów, które są bardzo powszechne w analizie stwardnienia rozsianego.

Przygotowanie odpowiedniej referencyjnej biblioteki spektralnej do badania jest kluczowym punktem. Skuteczna i czuła identyfikacja MS/MS wymaga nie tylko odpowi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest wspierana przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy (2018YFC0910200/2017YFA0505001) oraz Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Guangdong (2019B020226001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
GNPSopen sourcen/ahttps://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/static/gnps-splash.jsp
XY-Metaopen sourcenie dotyczyhttps://github.com/DLI-ShenZhen/XY-Meta
metaXopen sourceniedotyczy https://github.com/wenbostar/metaX
ProteoWizarddo pobrania za darmo3.0.22116.18c918b-x86_64https://proteowizard.sourceforge.io/download.html
CHI. Klientdo pobrania za darmondp48-x86-x64-allos-enuhttp://www.chi-biotech.com/technology.html?ty=ypt

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Misra, B. B., Fahrmann, J. F., Grapov, D. Review of emerging metabolomic tools and resources: 2015-2016. Electrophoresis. 38 (18), 2257-2274 (2017).
  2. Idle, J. R., Gonzalez, F. J. Metabolomics. Cell Metabolism. 6 (5), 348-351 (2007).
  3. Fiehn, O. Metabolomics — the link between genotypes and phenotypes. Functional Genomics. Town, C. , Springer. Netherlands. Dordrecht. 155-171 (2002).
  4. Functional Genomics. Town, C. , Springer. Netherlands. Dordrecht. (2002).
  5. Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass Spectrometry Reviews. 26 (1), 51-78 (2007).
  6. Vinayavekhin, N., Saghatelian, A. Untargeted metabolomics. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 30, Unit 30.1 1-24 (2010).
  7. Chaleckis, R., Meister, I., Zhang, P., Wheelock, C. E. Challenges, progress and promises of metabolite annotation for LC-MS-based metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 55, 44-50 (2019).
  8. Palmer, A., et al. FDR-controlled metabolite annotation for high-resolution imaging mass spectrometry. Nature Methods. 14 (1), 57-60 (2017).
  9. Scheubert, K., et al. Significance estimation for large scale metabolomics annotations by spectral matching. Nature Communications. 8 (1), 1494(2017).
  10. Schrimpe-Rutledge, A. C., Codreanu, S. G., Sherrod, S. D., McLean, J. A. Untargeted metabolomics strategies-challenges and emerging directions. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (12), 1897-1905 (2016).
  11. Blaženović, I., Kind, T., Ji, J., Fiehn, O. Software tools and approaches for compound identification of LC-MS/MS data in metabolomics. Metabolites. 8 (2), (2018).
  12. Katajamaa, M., Miettinen, J., Oresic, M. MZmine: toolbox for processing and visualization of mass spectrometry based molecular profile data. Bioinformatics. 22 (5), Oxford, England. 634-636 (2006).
  13. Tsugawa, H., et al. Hydrogen rearrangement rules: computational MS/MS fragmentation and structure elucidation using MS-FINDER software. Analytical chemistry. 88 (16), 7946-7958 (2016).
  14. Wang, F., et al. CFM-ID 4.0: More accurate ESI-MS/MS spectral prediction and compound identification. Analytical Chemistry. 93 (34), 11692-11700 (2021).
  15. Ruttkies, C., Schymanski, E. L., Wolf, S., Hollender, J., Neumann, S. MetFrag relaunched: incorporating strategies beyond in silico fragmentation. Journal of Cheminformatics. 8, 3(2016).
  16. Delabriere, A., Warmer, P., Brennsteiner, V., Zamboni, N. SLAW: A scalable and self-optimizing processing workflow for untargeted LC-MS. Analytical chemistry. 93 (45), 15024-15032 (2021).
  17. Wang, X., et al. Target-decoy-based false discovery rate estimation for large-scale metabolite identification. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2328-2334 (2018).
  18. Li, D., et al. XY-Meta: a high-efficiency search engine for large-scale metabolome annotation with accurate FDR estimation. Analytical Chemistry. 92 (8), 5701-5707 (2020).
  19. Wen, B., Mei, Z., Zeng, C., Liu, S. metaX: a flexible and comprehensive software for processing metabolomics data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 183(2017).
  20. Aberg, K. M., Torgrip, R. J. O., Kolmert, J., Schuppe-Koistinen, I., Lindberg, J. Feature detection and alignment of hyphenated chromatographic-mass spectrometric data. Extraction of pure ion chromatograms using Kalman tracking. Journal of Chromatography. A. 1192 (1), 139-146 (2008).
  21. Liu, Q., et al. Addressing the batch effect issue for LC/MS metabolomics data in data preprocessing. Scientific Reports. 10 (1), 13856(2020).
  22. Han, W., Li, L. Evaluating and minimizing batch effects in metabolomics. Mass Spectrometry Reviews. 41 (3), 421-442 (2022).
  23. Fei, F., Bowdish, D. M. E., McCarry, B. E. Comprehensive and simultaneous coverage of lipid and polar metabolites for endogenous cellular metabolomics using HILIC-TOF-MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (15), 3723-3733 (2014).
  24. Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification. Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).
  25. Giacomoni, F., et al. Workflow4Metabolomics: a collaborative research infrastructure for computational metabolomics. Bioinformatics. 31 (9), Oxford, England. 1493-1495 (2015).
  26. Chang, H. -Y., et al. iMet-Q: A user-friendly tool for label-free metabolomics quantitation using dynamic peak-width determination. PloS One. 11 (1), 0146112(2016).
  27. Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
  28. Schmid, R., et al. Ion identity molecular networking for mass spectrometry-based metabolomics in the GNPS environment. Nature Communications. 12 (1), 3832(2021).
  29. Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), Oxford, England. 2534-2536 (2008).
  30. Johnson, S. R., Lange, B. M. Open-access metabolomics databases for natural product research: present capabilities and future potential. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 22(2015).
  31. Horai, H., et al. MassBank: a public repository for sharing mass spectral data for life sciences. Journal of Mass Spectrometry: JMS. 45 (7), 703-714 (2010).
  32. Rawlinson, C., et al. Hierarchical clustering of MS/MS spectra from the firefly metabolome identifies new lucibufagin compounds. Scientific Reports. 10 (1), 6043(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Untargeted MetabolomicsFDR ControlTarget Decoy StrategyMetabolite IdentificationMass SpectrometrySpectral LibraryMetabolite QuantificationPrincipal Component AnalysisDifferential Metabolite AnalysisQuality Control

Related Articles