Profilowanie całego genomu interakcji wiążących czynnik transkrypcyjny-DNA u Candida albicans: kompleksowa metoda CUT&RUN i przepływ pracy analizy danych

Mohammad N. Qasim; Ashley Valle Arevalo; Akshay D. Paropkari; Craig L. Ennis; Suzanne S. Sindi; Clarissa J. Nobile; Aaron D. Hernday

doi:10.3791/63655

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Profilowanie całego genomu interakcji wiążących czynnik transkrypcyjny-DNA u Candida albicans: kompleksowa metoda CUT&RUN i przepływ pracy analizy danych

3.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63655

⸱

1 kwietnia 2022

Mohammad N. Qasim^*¹^,² , Ashley Valle Arevalo^*¹^,² , Akshay D. Paropkari^*¹^,² , Craig L. Ennis¹^,²^,⁴ , Suzanne S. Sindi³ , Clarissa J. Nobile¹^,⁴ , Aaron D. Hernday¹^,⁴

¹Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Merced, ²Quantitative and Systems Biology Graduate Program, University of California, Merced, ³Department of Applied Mathematics, University of California, Merced, ⁴Health Sciences Research Institute, University of California, Merced

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje eksperymentalną metodę i proces analizy danych dla rozszczepienia pod celami i uwolnienia za pomocą nukleazy (CUT&RUN) w ludzkim patogenie grzybowym Candida albicans.

Streszczenie

Regulacyjne czynniki transkrypcyjne kontrolują wiele ważnych procesów biologicznych, w tym różnicowanie komórek, reakcje na perturbacje i stresy środowiskowe oraz interakcje gospodarz-patogen. Określenie powiązania regulatorowych czynników transkrypcyjnych z DNA w całym genomie ma zasadnicze znaczenie dla zrozumienia funkcji czynników transkrypcyjnych w tych często złożonych procesach biologicznych. Rozszczepienie pod celami i uwolnienie za pomocą nukleazy (CUT&RUN) to nowoczesna metoda mapowania całego genomu interakcji wiążących białko-DNA in vivo, która stanowi atrakcyjną alternatywę dla tradycyjnej i szeroko stosowanej metody immunoprecypitacji chromatyny, a następnie sekwencjonowania (ChIP-seq). CUT&RUN nadaje się do eksperymentalnej konfiguracji o wyższej przepustowości i ma znacznie wyższy zakres dynamiki przy niższych kosztach sekwencjonowania na próbkę niż sekwencja ChIP. W tym miejscu opisano kompleksowy protokół CUT&RUN i towarzyszący mu proces analizy danych dostosowany do analizy całego genomu interakcji wiążących czynnik transkrypcyjny i DNA w ludzkim patogenie grzybowym Candida albicans. Ten szczegółowy protokół obejmuje wszystkie niezbędne procedury eksperymentalne, od znakowania epitopami genów kodujących czynnik transkrypcyjny po przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania; dodatkowo zawiera dostosowany przepływ pracy obliczeniowej do analizy danych CUT&RUN.

Wprowadzenie

Candida albicans to klinicznie istotny, polimorficzny ludzki patogen grzybiczy, który występuje w wielu różnych trybach wzrostu, takich jak planktonowy (swobodnie pływający) sposób wzrostu i jako społeczności ściśle przylegających komórek chronionych przez macierz zewnątrzkomórkową, znaną jako tryb wzrostu biofilmu^1,²^,³. Podobnie jak w przypadku innych procesów rozwojowych i komórkowych, rozwój biofilmu jest ważną cechą wirulencji C. albicans, o której wiadomo, że jest kontrolowana na poziomie transkrypcyjnym przez regulatorowe czynniki transkrypcyjne (TF), które wiążą się z DNA w sposób specyficzny dla sekwencji⁴. Ostatnio regulatory chromatyny i modyfikatory histonów okazały się również ważnymi regulatorami tworzenia biofilmu C. albicans⁵ i morfogenezy⁶ poprzez pośredniczenie w dostępności DNA. Aby zrozumieć złożoną biologię tego ważnego patogenu grzybowego, cenne są skuteczne metody określania lokalizacji określonych TF w całym genomie podczas różnych procesów rozwojowych i komórkowych.

Immunoprecypitacja chromatyny, po której następuje sekwencjonowanie (ChIP-seq) jest szeroko stosowaną metodą badania interakcji białko-DNA w C. albicans5^,⁶ i w dużej mierze zastąpiła bardziej klasyczną immunoprecypitację chromatyny, po której następuje mikromacierz (chip ChIP)⁹ metoda. Zarówno metoda ChIP-seq, jak i ChIP-chip wymagają jednak dużej liczby komórek wejściowych¹⁰, co może być czynnikiem komplikującym podczas badania TF w kontekście określonych próbek i sposobów wzrostu, takich jak biofilmy pobrane od pacjentów lub zwierzęce modele infekcji. Ponadto test immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) często daje znaczną ilość sygnału tła w całym genomie, co wymaga wysokiego poziomu wzbogacenia, aby cel zainteresowania mógł wystarczająco oddzielić sygnał od szumu. Chociaż test ChIP-chip jest obecnie w dużej mierze przestarzały, głębokość sekwencjonowania niezbędna do sekwencjonowania ChIP sprawia, że test ten jest zbyt drogi dla wielu badaczy, szczególnie tych, którzy badają wiele TF i / lub białek związanych z chromatyną.

Rozszczepienie pod celami i uwolnienie za pomocą nukleazy (CUT&RUN) jest atrakcyjną alternatywą dla ChIP-seq. Został opracowany przez laboratorium Henikoff w 2017 roku w celu obejścia ograniczeń związanych z endogennym rozszczepieniem ChIP-seq i chromatyny, a następnie sekwencjonowaniem ChEC-seq¹¹^,¹², inna metoda identyfikacji interakcji białko-DNA na poziomie całego genomu, zapewniając jednocześnie mapowanie TF i białek związanych z chromatyną w całej rozdzielczości w całej rozdzielczości¹³. CUT&RUN opiera się na ukierunkowanym trawieniu chromatyny w permeabilizowanych jądrach za pomocą nukleaz mikrokokowych na uwięzi, a następnie sekwencjonowaniu strawionych fragmentów DNA⁹^,¹⁰. Ponieważ fragmenty DNA są generowane specyficznie w loci, które są związane przez białko będące przedmiotem zainteresowania, a nie są generowane w całym genomie poprzez losową fragmentację, jak w testach ChIP, podejście CUT&RUN skutkuje znacznie zmniejszonymi sygnałami tła, a zatem wymaga 1/10 głębokości sekwencjonowania w porównaniu z klasą ChIP-seq11^,¹³^,¹⁴. Ulepszenia te ostatecznie prowadzą do znacznego obniżenia kosztów sekwencjonowania i zmniejszenia całkowitej liczby komórek wejściowych potrzebnych jako materiał wyjściowy dla każdej próbki.

Tutaj opisany jest solidny protokół CUT&RUN, który został dostosowany i zoptymalizowany do określenia lokalizacji TF w całym genomie w komórkach C. albicans wyizolowanych z biofilmów i kultur planktonowych. Przedstawiono również dokładny potok analizy danych, który umożliwia przetwarzanie i analizę wynikowych danych sekwencyjnych i wymaga od użytkowników minimalnej wiedzy specjalistycznej w zakresie kodowania lub bioinformatyki. Krótko mówiąc, protokół ten opisuje znakowanie epitopami genów kodujących TF, zbieranie biofilmu i komórek planktonowych, izolację nienaruszonych permeabilizowanych jąder, inkubację z pierwotnymi przeciwciałami przeciwko specyficznemu białku lub białku znakowanemu epitopem, wiązanie białek fuzyjnych chimerycznej nukleazy A / G-mikrokokowej (pAG-MNazy) z przeciwciałami pierwotnymi, odzyskiwanie genomowego DNA po trawieniu chromatyny oraz przygotowanie bibliotek genomowego DNA do sekwencjonowania.

Eksperymentalny protokół CUT&RUN jest poprzedzony specjalnie zaprojektowanym potokiem analizy danych, który pobiera odczyty sekwencjonowania surowego DNA w formacie FASTQ i wdraża wszystkie wymagane kroki przetwarzania, aby dostarczyć pełną listę znacznie wzbogaconych loci związanych przez TF będący przedmiotem zainteresowania (ukierunkowany na pierwotne przeciwciało). Należy zauważyć, że wiele etapów opisanego protokołu przygotowania biblioteki zostało specjalnie dostosowanych i zoptymalizowanych pod kątem analizy CUT&RUN TF (w przeciwieństwie do nukleosomów). Podczas gdy dane przedstawione w tym manuskrypcie zostały wygenerowane przy użyciu specyficznych dla TF adaptacji komercyjnego zestawu CUT&RUN, protokoły te zostały również zweryfikowane przy użyciu indywidualnie pozyskiwanych komponentów (tj. enzymu pAG-MNazy i magnetycznych kulek oczyszczających DNA) oraz przygotowanych przez siebie, co może znacznie obniżyć koszty eksperymentów. Kompleksowe protokoły eksperymentalne i analizy danych są szczegółowo opisane poniżej w formacie krok po kroku. Wszystkie odczynniki i krytyczny sprzęt, a także receptury i pożywek są wymienione odpowiednio w Tabeli materiałów i Pliku Uzupełniającym 1.