Artykuł metodologiczny

Profilowanie całego genomu interakcji wiążących czynnik transkrypcyjny-DNA u Candida albicans: kompleksowa metoda CUT&RUN i przepływ pracy analizy danych

DOI:

10.3791/63655

⸱

1 kwietnia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Merced, 2Quantitative and Systems Biology Graduate Program, University of California, Merced, 3Department of Applied Mathematics, University of California, Merced, 4Health Sciences Research Institute, University of California, Merced

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje eksperymentalną metodę i proces analizy danych dla rozszczepienia pod celami i uwolnienia za pomocą nukleazy (CUT&RUN) w ludzkim patogenie grzybowym Candida albicans.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Regulacyjne czynniki transkrypcyjne kontrolują wiele ważnych procesów biologicznych, w tym różnicowanie komórek, reakcje na perturbacje i stresy środowiskowe oraz interakcje gospodarz-patogen. Określenie powiązania regulatorowych czynników transkrypcyjnych z DNA w całym genomie ma zasadnicze znaczenie dla zrozumienia funkcji czynników transkrypcyjnych w tych często złożonych procesach biologicznych. Rozszczepienie pod celami i uwolnienie za pomocą nukleazy (CUT&RUN) to nowoczesna metoda mapowania całego genomu interakcji wiążących białko-DNA in vivo, która stanowi atrakcyjną alternatywę dla tradycyjnej i szeroko stosowanej metody immunoprecypitacji chromatyny, a następnie sekwencjonowania (ChIP-seq). CUT&RUN nadaje się do eksperymentalnej konfiguracji o wyższej przepustowości i ma znacznie wyższy zakres dynamiki przy niższych kosztach sekwencjonowania na próbkę niż sekwencja ChIP. W tym miejscu opisano kompleksowy protokół CUT&RUN i towarzyszący mu proces analizy danych dostosowany do analizy całego genomu interakcji wiążących czynnik transkrypcyjny i DNA w ludzkim patogenie grzybowym Candida albicans. Ten szczegółowy protokół obejmuje wszystkie niezbędne procedury eksperymentalne, od znakowania epitopami genów kodujących czynnik transkrypcyjny po przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania; dodatkowo zawiera dostosowany przepływ pracy obliczeniowej do analizy danych CUT&RUN.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Candida albicans to klinicznie istotny, polimorficzny ludzki patogen grzybiczy, który występuje w wielu różnych trybach wzrostu, takich jak planktonowy (swobodnie pływający) sposób wzrostu i jako społeczności ściśle przylegających komórek chronionych przez macierz zewnątrzkomórkową, znaną jako tryb wzrostu biofilmu1,2,3. Podobnie jak w przypadku innych procesów rozwojowych i komórkowych, rozwój biofilmu jest ważną cechą wirulencji C. albicans, o której wiadomo, że jest kontrolowana na poziomie transkrypcyjnym przez regulatorowe czynniki transkrypcyjne (TF), które wiążą się z DNA w sposób specyficzny dla sekwencji4. Ostatnio regulatory chromatyny i modyfikatory histonów okazały się również ważnymi regulatorami tworzenia biofilmu C. albicans5 i morfogenezy6 poprzez pośredniczenie w dostępności DNA. Aby zrozumieć złożoną biologię tego ważnego patogenu grzybowego, cenne są skuteczne metody określania lokalizacji określonych TF w całym genomie podczas różnych procesów rozwojowych i komórkowych.

Immunoprecypitacja chromatyny, po której następuje sekwencjonowanie (ChIP-seq) jest szeroko stosowaną metodą badania interakcji białko-DNA w C. albicans5,6 i w dużej mierze zastąpiła bardziej klasyczną immunoprecypitację chromatyny, po której następuje mikromacierz (chip ChIP)9 metoda. Zarówno metoda ChIP-seq, jak i ChIP-chip wymagają jednak dużej liczby komórek wejściowych10, co może być czynnikiem komplikującym podczas badania TF w kontekście określonych próbek i sposobów wzrostu, takich jak biofilmy pobrane od pacjentów lub zwierzęce modele infekcji. Ponadto test immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) często daje znaczną ilość sygnału tła w całym genomie, co wymaga wysokiego poziomu wzbogacenia, aby cel zainteresowania mógł wystarczająco oddzielić sygnał od szumu. Chociaż test ChIP-chip jest obecnie w dużej mierze przestarzały, głębokość sekwencjonowania niezbędna do sekwencjonowania ChIP sprawia, że test ten jest zbyt drogi dla wielu badaczy, szczególnie tych, którzy badają wiele TF i / lub białek związanych z chromatyną.

Rozszczepienie pod celami i uwolnienie za pomocą nukleazy (CUT&RUN) jest atrakcyjną alternatywą dla ChIP-seq. Został opracowany przez laboratorium Henikoff w 2017 roku w celu obejścia ograniczeń związanych z endogennym rozszczepieniem ChIP-seq i chromatyny, a następnie sekwencjonowaniem ChEC-seq11,12, inna metoda identyfikacji interakcji białko-DNA na poziomie całego genomu, zapewniając jednocześnie mapowanie TF i białek związanych z chromatyną w całej rozdzielczości w całej rozdzielczości13. CUT&RUN opiera się na ukierunkowanym trawieniu chromatyny w permeabilizowanych jądrach za pomocą nukleaz mikrokokowych na uwięzi, a następnie sekwencjonowaniu strawionych fragmentów DNA9,10. Ponieważ fragmenty DNA są generowane specyficznie w loci, które są związane przez białko będące przedmiotem zainteresowania, a nie są generowane w całym genomie poprzez losową fragmentację, jak w testach ChIP, podejście CUT&RUN skutkuje znacznie zmniejszonymi sygnałami tła, a zatem wymaga 1/10 głębokości sekwencjonowania w porównaniu z klasą ChIP-seq11, 13,14. Ulepszenia te ostatecznie prowadzą do znacznego obniżenia kosztów sekwencjonowania i zmniejszenia całkowitej liczby komórek wejściowych potrzebnych jako materiał wyjściowy dla każdej próbki.

Tutaj opisany jest solidny protokół CUT&RUN, który został dostosowany i zoptymalizowany do określenia lokalizacji TF w całym genomie w komórkach C. albicans wyizolowanych z biofilmów i kultur planktonowych. Przedstawiono również dokładny potok analizy danych, który umożliwia przetwarzanie i analizę wynikowych danych sekwencyjnych i wymaga od użytkowników minimalnej wiedzy specjalistycznej w zakresie kodowania lub bioinformatyki. Krótko mówiąc, protokół ten opisuje znakowanie epitopami genów kodujących TF, zbieranie biofilmu i komórek planktonowych, izolację nienaruszonych permeabilizowanych jąder, inkubację z pierwotnymi przeciwciałami przeciwko specyficznemu białku lub białku znakowanemu epitopem, wiązanie białek fuzyjnych chimerycznej nukleazy A / G-mikrokokowej (pAG-MNazy) z przeciwciałami pierwotnymi, odzyskiwanie genomowego DNA po trawieniu chromatyny oraz przygotowanie bibliotek genomowego DNA do sekwencjonowania.

Eksperymentalny protokół CUT&RUN jest poprzedzony specjalnie zaprojektowanym potokiem analizy danych, który pobiera odczyty sekwencjonowania surowego DNA w formacie FASTQ i wdraża wszystkie wymagane kroki przetwarzania, aby dostarczyć pełną listę znacznie wzbogaconych loci związanych przez TF będący przedmiotem zainteresowania (ukierunkowany na pierwotne przeciwciało). Należy zauważyć, że wiele etapów opisanego protokołu przygotowania biblioteki zostało specjalnie dostosowanych i zoptymalizowanych pod kątem analizy CUT&RUN TF (w przeciwieństwie do nukleosomów). Podczas gdy dane przedstawione w tym manuskrypcie zostały wygenerowane przy użyciu specyficznych dla TF adaptacji komercyjnego zestawu CUT&RUN, protokoły te zostały również zweryfikowane przy użyciu indywidualnie pozyskiwanych komponentów (tj. enzymu pAG-MNazy i magnetycznych kulek oczyszczających DNA) oraz przygotowanych przez siebie, co może znacznie obniżyć koszty eksperymentów. Kompleksowe protokoły eksperymentalne i analizy danych są szczegółowo opisane poniżej w formacie krok po kroku. Wszystkie odczynniki i krytyczny sprzęt, a także receptury i pożywek są wymienione odpowiednio w Tabeli materiałów i Pliku Uzupełniającym 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Epitope Tagging of C. albicans strains

  1. Upload the gene of interest, along with its 1 kb upstream and downstream flanking sequences, from the Candida Genome Database to the primer design tool (see the Table of Materials). Design a guide RNA (gRNA) by highlighting 50 bp upstream and downstream from the stop codon, and click the gRNA selection tool on the right. Select Design and Analyze Guides. Use the Ca22 (Candida albicans SC5314 Assembly 22 (diploid)) genome and an NGG (SpCas9, 3' side) protospacer adjacent motif (PAM) for the guide parameters, and click Finish. Figure 1 describes the workflow for epitope tagging a C. albicans gene of interest with enhanced green fluorescent protein (eGFP).
    1. On the subsequent page, confirm the target region for gRNA design and press the green button. Sort gRNAs by the On-Target Score.
      NOTE: The primer design tool computes on-target and off-target scores to quantify the specificity of the gRNAs. An ideal guide has an on-target score of >60, an off-target score of ~33, and overlaps the stop codon. This enables high gRNA specificity while ablating gRNA targeting after GFP integration. A gRNA with an off-target score of ~50 indicates allelic variation; thus, only one allele will be recognized by the gRNA.
    2. Add the sequences (5'-CGTAAACTATTTTTAATTTG-3') and (5'-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3') to the 5' and 3' ends, respectively, of the 20 bp gRNA target sequence, creating a 60 bp primer/oligonucleotide. Alternatively, copy the 20 bp sequence to the gRNA calculator supplied by Nguyen et al.15. Order the 60 bp custom gRNA oligonucleotide.
    3. Amplify the "universal A fragment" with 100 mM AHO1096 (5'-GACGGCACGGCCACGCGTTTAAACCGCC-3') and 100 mM AHO1098 (5'-CAAATTAAAAATAGTTTACGCAAG-3') and the "unique B fragment" with the custom 60 bp gRNA oligonucleotide (100 mM) from step 1.1.2. and 100 mM AHO1097 (5'-CCCGCCAGGCGCTGGGGTTTAAACACCG-3') using pADH110 (plasmid repository ID# 90982) and pADH139 (plasmid repository ID# 90987), respectively, as template DNA. Use the PCR reaction and cycling conditions provided in Table 1.
      NOTE: pADH139 is specific to strains that carry the heterologous Candida maltosa LEU2 marker. If using a strain with a single copy of the C. albicans LEU2 gene, substitute pADH119 (plasmid repository ID# 90985) in place of pADH139.
    4. Confirm successful amplification by checking 5 µL of the PCR on a 1% agarose gel. Look for ~1 kb A and B fragment amplicons.
    5. Mix 1 µL each of A and B fragments and stitch them together using the PCR reaction and cycling conditions provided in Table 2 to create a full-length C fragment.
    6. Add 0.5 µL of 100 mM AHO1237 (5'-AGGTGATGCTGAAGCTATTGAAG-3') and 0.5 µL of 100 mM AHO1453 (5'-ATTTTAGTAACAGCTTCGACAATCG-3') to each PCR reaction, mix well by pipetting, and complete the cycling conditions listed in Table 3.
      NOTE: If using pADH119 in place of pADH139, substitute AHO1238 (5'-TGTATTTTGTTTTAAAATTTTAGTGACTGTTTC-3') in place of AHO1453.
    7. Confirm proper stitching and amplification of the C fragment by checking 5 µL of the PCR on a 1% agarose gel. Look for a ~2 kb amplicon. Store the C fragment at -20 °C until ready for use.
      NOTE: If stitching and amplification results in multiple, nonspecific bands or smearing, perform a PCR cleanup of the A and B fragments and repeat from step 1.1.5.
  2. Add the entire CTG-optimized monomeric eGFP with linker sequence (RIPLING)16 (pCE1, plasmid repository ID# 174434) immediately upstream of the stop codon of the gene of interest using the primer design tool, creating a C-terminal translational fusion. Use this construct to design oligonucleotides for amplifying the donor DNA (dDNA) from pCE1.
    1. Design a forward oligonucleotide with 18-22 bp homology to the linker sequence and >50 bp homology to the 3' end of the open reading frame (ORF).
      NOTE: The 18-22 bp homology creates an annealing temperature for amplification between 55 °C and 58 °C. If the full-length oligonucleotide forms primer dimers, adjust homology to the linker sequence/GFP or the genome accordingly.
    2. Create a reverse oligonucleotide with 18-22 bp homology to the 3' end of GFP and >50 bp homology to the downstream noncoding sequence of the ORF to be tagged.
    3. Order these oligonucleotides and amplify the dDNA using the provided touchdown PCR cycling conditions in Table 4.
  3. Design two sets of colony PCR (cPCR) oligonucleotides for confirming the integration of GFP by amplifying across the flanking integration sites. First, select the forward dDNA oligonucleotide using the primer design tool and click the Primer button on the right.
    1. Click Create Primers | Wizard | Tm Param and confirm that the algorithm is set to SantaLucia 1998. Click Use Selection to input the coordinates of the forward oligonucleotide designed in 1.2.1 as the target sequence.
    2. Set the optimal primer temperature to 55 °C and the maximum amplicon size to 900 bp, and click the Generate Primers button at the top right.
    3. Select the oligonucleotide pair with the lowest penalty score and confirm that the primers amplify across the 5' integration site. Ensure that the forward cPCR primer lies upstream of the forward dDNA primer sequence and the reverse cPCR primer fully within the eGFP tag or the linker sequence.
    4. Repeat steps 1.3-1.3.3. with the reverse dDNA oligonucleotide to create the second set of cPCR oligonucleotides that amplify across the 3' integration site. Ensure that the forward cPCR primer lies entirely within the eGFP tag or the linker sequence and the reverse cPCR primer downstream of the reverse dDNA primer sequence.
    5. Order these oligonucleotides.
  4. Digest 2,500 ng of pADH140, which contains Cas9 (plasmid repository ID# 90988), with restriction enzyme for each gene to be GFP-tagged. Set the total volume of each digestion at

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten solidny protokół CUT&RUN został dostosowany i zoptymalizowany do badania lokalizacji specyficznych TF w całym genomie w biofilmach C. albicans i kulturach planktonowych (zobacz Rysunek 2, aby zapoznać się z przeglądem podejścia eksperymentalnego). Dołączony jest również dokładny potok analizy danych, który ułatwia analizę wynikowych danych sekwencjonowania CUT&RUN i wymaga od użytkowników minimalnej wiedzy specjalistycznej w zakresie kodowania lub bioinformatyki (zobacz ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten przedstawia kompleksowy proces eksperymentalny i obliczeniowy do lokalizacji regulatorowych TF w całym genomie u C. albicans. Został zaprojektowany tak, aby był łatwo dostępny dla każdego, kto ma standardowe szkolenie z mikrobiologii i biologii molekularnej. Wykorzystując wysoki zakres dynamiki i niskie wymagania dotyczące wprowadzania próbek w teście CUT&RUN oraz uwzględniając optymalizacje lokalizacji interakcji wiążących TF-DNA w kulturach biofilmu i planktonu C. albicans, protokół ten s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Clarissa J. Nobile jest współzałożycielką BioSynesis, Inc., firmy zajmującej się diagnostyką i terapią zakażeń biofilmem.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy wszystkim byłym i obecnym członkom laboratoriów Nobile i Hernday za opinie na temat manuskryptu. Ta praca została wsparta przez National Institutes of Health (NIH) National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) numer R35GM124594 oraz przez rodzinę Kamangar w formie ufundowanej katedry dla C.J.N. Praca ta była również wspierana przez NIH National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) nagroda numer R15AI137975 dla A.D.H. C.L.E. była wspierana przez stypendium NIH National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) numer F31DE028488. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie reprezentują one poglądów fundatorów. Fundatorzy nie odegrali żadnej roli w projektowaniu badania; w gromadzeniu, analizie lub interpretacji danych; w pisaniu rękopisu; lub w decyzji o publikacji wyników.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &m; Millipore SigmaSLGPM33RS
0,65 mL probówki o niskiej przyczepnościVWR490003-190
1 M CaCl2Fisher Scientific50-152-341
1 M FisherScientificAAJ61224AK
12-dołkowe płytki do hodowli komórkowych bez obróbkiCorning351143
2-merkaptoetanolSigma-Aldrich60-24-2
2% digitoninaFisher ScientificCHR103MI
50 ml probówki stożkoweVWR89039-658
5x bufor HF PhusionFisher ScientificF530SPozycja wchodząca w skład polimerazy DNA o wysokiej wierności Phusion; określana w tekście jako "bufor polimerazy DNA"
Kryterium agaroweC5001
Koraliki magnetyczne Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63880
Bioanalizator AgilentAgilentG2939BAOkreślany w tekście jako "przyrząd do elektroforezy kapilarnej"; zależne od użytkownika
paski reakcyjne Amplitube PCR z dołączonymi nasadkami, Simport ScientificVWR89133-910
Bacto peptonBD Biosciences211677
Narzędzie do projektowania podkładu ławkowegoBenchlinghttps://www.benchling.com/molecular-biology/; Określany w tekście jako "narzędzie do projektowania podkładu"
BetaineFisher ScientificAAJ77507AB
Calcofluor biała plamaSigma-Aldrich18909-100ML-F
Candida Baza danychhttp://www.candidagenome.org/
Sprzężone koraliki paramagnetyczne konkanawaliny A (ConA)Polysciences  86057-3
Oprogramowaniehttps://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html
narzędziehttp://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_
chromosomes.fasta.gz
CUTANA ChIC/CUT& Zestaw RUNEpicypher14-1048Określany w tekście jako "CUT& Zestaw RUN"
Mieszanina roztworów deoksynukleotydów (dNTP) (10 mM)New England BiolabsN0447S
Dekstroza (D-glukoza)Fisher ScientificD163
Difco D-mannitol  BD Biosciences217020
Kuwety jednorazoweFisher Scientific14-955-127
Jednorazowe pipety transferoweFisher Scientific13-711-20
Barwnik ładujący żel DNA (6x)Fisher ScientificR0611
DreamTaq zielona polimeraza DNAFisher ScientificEP0713Określany w tekście jako "polimeraza DNA cPCR"
Zielony bufor polimerazy DNA DreamTaqFisher ScientificEP0713Pozycja wchodząca w skład zielonej polimerazy DNA DreamTaq; określana w tekście jako "bufor polimerazy DNA cPCR"
E. coli spike-in DNAEpicypher18-1401
Inkubator mikropłytek ELMIELMITRMS-04Określany w tekście jako "inkubator mikropłytek"
Przygotowanie końcowe Enzyme MixElement część zestawu do przygotowania biblioteki DNA NEBNext Ultra II
End Prep Reaction BufferElement części zestawu NEBNext Ultra II DNA Library Prep Etanol
200 proofVWR89125-170
FastDigest MssIFisher ScientificFD1344Określany w tekście jako "enzym restrykcyjny"
FastDigest MssI BufferFisher ScientificFD1344Pozycja wchodząca w skład zestawu FastDigest MssI; określana w tekście jako "bufor enzymu restrykcyjnego"
Ficoll 400Fisher BioReagentsBP525-25
Mikroskopzależny od użytkownika
Aparatod użytkownika
GeneRuler niskiego zasięgu drabinka DNAFisher Scientific
przepływ pracyhttps://gitforwindows.org/
Kodhttps://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis
HEPES-KOH pH 7,5Boston BioProductsBBH-75-K
Wirówkaod użytkownika
IsopropanolSigma-AldrichPX1830-4
Papier do soczewekVWR52846-001
Ligation EnhancerElement wchodzący w skład biblioteki DNA NEBNext Ultra II Zestaw przygotowawczy
Octan litu dwuwodnyMP Biomedicals215525683
Living Colors Pełnowymiarowe przeciwciało poliklonalne GFPTakara632592Zależne od użytkownika
MACS2https://pypi.org/project/MACS2/
Stojak do separacji magnetycznej, probówki 0,2 mlEpicypher10-0008
Stojak do separacji magnetycznej, probówki 1,5 mlFisher ScientificMR02
MgCl2Sigma-AldrichM8266
Probówki do mikrowirówek 1,5 mlFisher Scientific05-408-129
Mikropłytka i kuweta spektrofotometrBioTekEPOCH2TCOkreślany w tekście jako "spektrofotometr"; zależny od użytkownika
MochiViewhttp://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads
MOPSSigma-AldrichM3183
NaClVWR470302-522
NaOHFisher ScientificS318-500
NCBI GEOhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
NEBNext Adaptor for IlluminaItem część NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); określany w tekście jako "Adapter"
NEBNext Index X Primer for IlluminaItem część NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); określany w tekście jako "Reverse Uniquely Indexed Library Elementarz amplifikacji"
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1)New England BiolabsE7335S
NEBNext Ultra II DNA Library Preparation kitNew England BiolabsE7645SOkreślany w tekście jako "zestaw do przygotowania biblioteki"
NEBNext Universal PCR Primer dla IlluminaPozycja wchodząca w skład NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); określany w tekście jako "Universal Forward Library Amplification Primer"
Siarczan nourseotrycyny (NAT)GoldbioN-500-2
Novex TBE Żele, 10%, 15 dołkówFisher Scientific EC62755BOX
Mieszalnik nutującyVWR82007-202
Bulion odżywczyKryteriumC6471
pADH110Addgene90982Określany w tekście jako "identyfikator repozytorium plazmidu# 90982"
pADH119Addgene90985określany w tekście jako "identyfikator repozytorium plazmidu# 90985"
pADH137Addgene90986określany w tekście jako "identyfikator repozytorium plazmidu# 90986"
pADH139Addgene90987określany w tekście jako "identyfikator repozytorium plazmidu# 90987"
pADH140Addgene90988Określany w tekście jako "identyfikator repozytorium plazmidów# 90988"
pAG-MNaseEpicypher15-1016 lub 15-111650 rxn lub 250 rxn
pCE1Addgene174434Określany w tekście jako "identyfikator repozytorium plazmidów# 174434"
Szalki Petriego z przezroczystą pokrywkąFisher ScientificFB0875712
Polimeraza DNA o wysokiej wierności PhusionFisher ScientificF530SOkreślany w tekście jako "polimeraza DNA"
Glikol polietylenowy (PEG) 3350VWR10791-816
Fosforan potasu jednozasadowyFisher ScientificP285-500
Qubit 1x zestaw do oznaczania DSDDNA HSInvitrogenQ33230
Fluorometr kubitowyLife TechnologiesQ33216Określany w tekście jako "fluorometr"; zależne od użytkownika
przeciwciało kontroli negatywnej IgG królikaEpicypher13-0042
RNaza ASigma-Aldrich10109169001
Roche Kompletny inhibitor proteazy (wolny od EDTA) tabletkiSigma-Aldrich5056489001
RPMI-1640Sigma-AldrichR6504
Inkubator z wytrząsaniemEppendorfM12820004Zależne od użytkownika
SorbitolSigma-AldrichS1876-500G
FisherScientific07-200-385
Sterylne pętle inokulacyjneVWR30002-094
SYBR Złoty barwnik żelowy z kwasem nukleinowymFisher ScientificS11494
Barwienie kwasem nukleinowym SYTO 13Fisher ScientificS7575Określane w tekście jako "barwienie żelem kwasu nukleinowego"
Termocyklerzależny od użytkownika
ThermoMixer CEppendorf5382000023
Tris (hydroksymetylo)aminometanSigma-Aldrich252859-100G
Ultra II Ligation Master MixElement wchodzący w skład zestawu NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit; określany w tekście jako "Ligation Master Mix"
Ultra II Q5 Master MixElement wchodzący w skład zestawu NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; określany w tekście jako "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix"
UltraPure roztwór DNA plemników łososiaInvitrogen15632011
USER EnzymeElement wchodzący w skład zestawu NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit; określany w tekście jako "Enzym wycinający uracyl"
Mieszalnik wirowyVWR10153-834
narzędzie wgethttp://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_
chromosomes.fasta.gz
Ekstrakt drożdżowyKryteriumC7341
Zymoliaza 100T (litikaza, enzym lityczny drożdży)Fisher ScientificNC0439194
m filtr genomu Conda do zwijania fluorescencyjny do elektroforezy żelowej zależny FERSM1192 GitBash źródłowy GitHub szybkoobrotowa zależna filtry rurkowe do wirówek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  2. Lohse, M. B., Gulati, M., Johnson, A. D., Nobile, C. J. Development and regulation of single-and multi-species Candida albicans biofilms. Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 19-31 (2018).
  3. Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans biofilms and human disease. Annual Review of Microbiology. 69 (1), 71-92 (2015).
  4. Nobile, C. J., et al. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).
  5. Iracane, E., Vega-Estévez, S., Buscaino, A. On and off: epigenetic regulation of C. albicans morphological switches. Pathogens. 10 (11), 1463(2021).
  6. Qasim, M. N., Valle Arevalo, A., Nobile, C. J., Hernday, A. D. The roles of chromatin accessibility in regulating the Candida albicans white-opaque phenotypic switch. Journal of Fungi. 7 (1), 37(2021).
  7. Mancera, E., et al. Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in candida species. eLife. 10, 64682(2021).
  8. Lohse, M. B., Johnson, A. D. Identification and characterization of Wor4, a new transcriptional regulator of white-opaque switching. G3: Genes, Genomes, Genetics. 6 (3), 721-729 (2016).
  9. Hernday, A. D., Noble, S. M., Mitrovich, Q. M., Johnson, A. D. Genetics and molecular biology in Candida albicans. Methods in Enzymology. 470, 737-758 (2010).
  10. Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location. Nature Protocols. 1 (2), 729-748 (2006).
  11. Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nature Communications. 6, 8733(2015).
  12. Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. ChIC and ChEC: Genomic mapping of chromatin proteins. Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
  13. Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, 21856(2017).
  14. Skene, P. J., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers. Nature Protocols. 13 (5), 1006-1019 (2018).
  15. Nguyen, N., Quail, M. M. F., Hernday, A. D. An efficient, rapid, and recyclable system for CRISPR-mediated genome editing in Candida albicans. American Society For Microbiology. 2 (2), 00149(2017).
  16. Ennis, C. L., Hernday, A. D., Nobile, C. J. A markerless CRISPR-mediated system for genome editing in Candida auris reveals a conserved role for Cas5 in the caspofungin response. Microbiology Spectrum. 9 (3), 0182021(2021).
  17. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, 46314(2019).
  18. Skrzypek, M. S., et al. The Candida Genome Database (CGD): Incorporation of Assembly 22, systematic identifiers and visualization of high throughput sequencing data. Nucleic Acids Research. 45, 592-596 (2017).
  19. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  20. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  21. Boyd, J., Rodriguez, P., Schjerven, H., Frietze, S. ssvQC: an integrated CUT&RUN quality control workflow for histone modifications and transcription factors. BMC Research Notes. 14 (1), 366(2021).
  22. Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
  23. Homann, O. R., Johnson, A. D. MochiView: Versatile software for genome browsing and DNA motif analysis. BMC Biology. 8, 49(2010).
  24. Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85(2019).
  25. Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930(2019).
  26. Rodriguez, D. L., Quail, M. M., Hernday, A. D., Nobile, C. J. Transcriptional circuits regulating developmental processes in Candida albicans. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 605711(2020).
  27. Zhu, Q., Liu, N., Orkin, S. H., Yuan, G. -C. CUT&RUNTools: a flexible pipeline for CUT&RUN processing and footprint analysis. Genome Biology. 20 (1), 192(2019).
  28. Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., Van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), 18602-18607 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

CUT And Runwi zanie czynnik w transkrypcyjnychoddzia ywania bia ko DNAznakowanie epitopoweprzygotowanie bibliotekmikroskopia fluorescencyjnatworzenie biofilmu

Powiązane artykuły