Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zewnątrzkomórkowy zubożenie glukozy jako pośrednia miara wychwytu glukozy w komórkach i tkankach ex vivo

2.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63681

⸱

6 kwietnia 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Human Sciences, The Ohio State University

W tym artykule

Podsumowanie

Zewnątrzkomórkowe wyczerpanie fluorescencyjnie znakowanej glukozy koreluje z wychwytem glukozy i może być wykorzystane do wysokoprzepustowych badań przesiewowych wychwytu glukozy w wyciętych organach i hodowlach komórkowych.

Streszczenie

Trwająca na całym świecie epidemia cukrzycy zwiększa zapotrzebowanie na identyfikację czynników środowiskowych, żywieniowych, endokrynologicznych, genetycznych i epigenetycznych wpływających na wychwyt glukozy. Pomiar fluorescencji wewnątrzkomórkowej jest szeroko stosowaną metodą badania wychwytu glukozy znakowanej fluorescencyjnie (FD-glukozy) w komórkach in vitro lub do obrazowania tkanek zużywających glukozę in vivo. Ten test ocenia wychwyt glukozy w wybranym punkcie czasowym. Analiza wewnątrzkomórkowa zakłada, że metabolizm FD-glukozy jest wolniejszy niż endogennej glukozy, która uczestniczy w reakcjach katabolicznych i anabolicznych oraz sygnalizacji. Jednak dynamiczny metabolizm glukozy zmienia również mechanizmy wychwytu, co wymagałoby pomiarów kinetycznych wychwytu glukozy w odpowiedzi na różne czynniki. W artykule opisano metodę pomiaru zewnątrzkomórkowego wyczerpania glukozy FD-glucose i potwierdzono jej korelację z wewnątrzkomórkowym wychwytem FD-glukozy w komórkach i tkankach ex vivo. Zewnątrzkomórkowe wyczerpanie glukozy może być potencjalnie przydatne w wysokoprzepustowych badaniach kinetycznych i zależnych od dawki, a także w identyfikacji związków o aktywności glikemicznej i ich swoistym dla tkanek działaniu.

Wprowadzenie

Zapotrzebowanie na pomiar wychwytu glukozy rośnie wraz z krytyczną potrzebą rozwiązania problemu epidemicznego wzrostu wielu chorób zależnych od metabolizmu glukozy. Mechanizmy leżące u podstaw zwyrodnieniowych chorób metabolicznych, zaburzeń neurologicznych i poznawczych1, zapalne2 i choroby zakaźne3, cancer4,5, a także aging6, zależą od metabolizmu glukozy w celu uzyskania energii i jej magazynowania, procesów anabolicznych, modyfikacji białek i genów, sygnalizacji, regulacji genów i syntezy kwasów nukleinowych oraz replication7,8,9. Cukrzyca (DM) jest bezpośrednio związana z nieprawidłową regulacją wychwytu glukozy. Cukrzyca to spektrum chorób przewlekłych, takich jak cukrzyca typu 1, -2 i -3, cukrzyca ciążowa, cukrzyca wieku dojrzałego u dzieci i inne rodzaje tej choroby wywołane czynnikami środowiskowymi i/lub genetycznymi. W 2016 r. pierwszy globalny raport WHO na temat cukrzycy wykazał, że liczba dorosłych żyjących z najbardziej rozpowszechnioną cukrzycą wzrosła prawie czterokrotnie od 1980 r. do 422 milionów dorosłych10, a liczba pacjentów z cukrzycą rośnie wykładniczo w ciągu ostatnich kilku dekad. Szacuje się, że tylko w 2019 roku 1,5 miliona zgonów było bezpośrednio spowodowanych przez DM10. Ten dramatyczny wzrost jest spowodowany wzrostem cukrzycy typu 2 i warunkami, które go napędzają, w tym nadwagą i otyłością10. Pandemia COVID-19 ujawniła dwukrotny wzrost śmiertelności u pacjentów z cukrzycą w porównaniu z populacją ogólną, co sugeruje głęboką, ale słabo poznaną rolę metabolizmu glukozy w obronie immunologicznej3. Profilaktyka, wczesna diagnoza i leczenie cukrzycy, otyłości i innych chorób wymagają optymalizacji pomiarów wychwytu glukozy przez różne tkanki oraz identyfikacji czynników środowiskowych11, nutritional12, endocrine13, genetic14 oraz epigenetic15 czynników wpływających na wychwyt glukozy.

W badaniach, wewnątrzkomórkowy i/lub tkankowy wychwyt glukozy jest zwykle mierzony za pomocą fluorescencyjnie znakowanej glukozy (FD-glukozy) in vitro16,17,18 i in vivo19. FD-glucose stała się preferowaną metodą w porównaniu z bardziej precyzyjnymi metodami wykorzystującymi radioaktywnie znakowaną glukozę20, analityczna spektroskopia mas analysis21, metabolomics22, metody magnetycznego rezonansu jądrowego23, oraz pozytonowa tomografia emisyjna/tomografia komputerowa (PET/CT)5,24. W przeciwieństwie do wychwytu glukozy FD, metody analityczne wymagające większej ilości materiału biologicznego mogą obejmować wieloetapowe przygotowanie próbki, drogie instrumenty i złożoną analizę danych. Skuteczne i niedrogie pomiary wychwytu glukozy FD-glucose w hodowlach komórkowych zostały wykorzystane w eksperymentach potwierdzających słuszność koncepcji i mogą wymagać walidacji innymi metodami.

Podstawą zastosowania FD-glucose do badań nad absorpcją glukozy jest zmniejszony metabolizm glukozy FD w porównaniu do glukozy endogennej 25. Niemniej jednak zarówno endogenna glukoza, jak i FD-glukoza są dynamicznie dystrybuowane we wszystkich przedziałach komórkowych do stosowania w procesach anabolicznych, katabolicznych i sygnalizacyjnych. Podział na przedziały i przetwarzanie zależne od czasu25 FD-glucose zakłócają pomiary fluorescencji i stanowią główne czynniki ograniczające zastosowanie tego testu w wysokoprzepustowych eksperymentach przesiewowych, analizie kinetycznej, hodowli komórkowych 3D, kokulturach i eksperymentach z eksplantatami tkanek. W tym miejscu przedstawiamy dane wykazujące wysoką korelację między zewnątrzkomórkowym zubożeniem FD-glukozy a jej wewnątrzkomórkowym wychwytem, co sugeruje zewnątrzkomórkowe wyczerpanie FD-glukozy jako zastępczy pomiar wewnątrzkomórkowego wychwytu glukozy. Pomiar zewnątrzkomórkowego wyczerpania glukozy zastosowano w celu walidacji specyficznych dla tkanek różnic w wychwytywaniu glukozy u myszy leczonych insuliną i eksperymentalnym lekiem18, aby zapewnić dowód słuszności tej metody.

Obecny protokół opisuje wewnątrzkomórkowe i zewnątrzkomórkowe (Rysunek 1) pomiary wychwytu glukozy FD w komórkach 3T3-L1. Sekcje 1-7 protokołu wyjaśniają hodowlę i wzrost komórek przez 48 godzin; głód komórek, stymulacja i wyjściowe pomiary zewnątrzkomórkowe; oraz pomiary po stymulacji zewnątrzkomórkowej FD-glukozy i wewnątrzkomórkowe pomiary FD-glukozy i białka. Sekcja 8 protokołu opisuje pomiar ex vivo zewnątrzkomórkowego wychwytu FD-glukozy w tkankach wypreparowanych od myszy ob / ob w obecności i bez insuliny i związku aminokwasowego 2 (AAC2) opisanego w innym miejscu18.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Stanowego Ohio (OSU, protokół 2007A0262-R4).

UWAGA: Wszystkie procedury muszą być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II, przy włączonej dmuchawie i zgaszonym świetle.

1. Przygotowanie materiałów

UWAGA: Wszystkie materiały są wymienione w Tabeli Materiałów.

  1. Przygotować pożywkę 1, pożywkę wirującą 2 oraz roztwory do przechowywania i robocze fluorescencyjnego 2-deoksy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoksadiazol-4-ylo)amino]-D-glukozy (2-NBDG lub FD-glukozy) zgodnie z tabelą 1 w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II. Chroń FD-glucose przed światłem przez cały czas trwania eksperymentu, wyłączając wszystkie światła pod maską.
  2. Używaj gotowych do użycia odczynników do hodowli komórkowych: Trypsyna-EDTA, sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) oraz bezglukozowa i pozbawiona czerwieni fenolowej pożywka Dulbecco's Modified Eagle Medium (zwana dalej DMEM bez glukozy).
  3. Użyj 20 ml buforu do lizy testu radioimmunoprecypitacji (RIPA).
    UWAGA: W poniższych sekcjach porównano zubożenie zewnątrzkomórkowe i wewnątrzkomórkowy wychwyt różnych dawek FD-glukozy w fibroblastach 3T3-L1 ze stymulacją insuliny i bez niej (Rysunek 2).

2. Hodowla i utrzymanie komórek 3T3-L1

  1. Hodowla mysich fibroblastów 3T3-L1 przez posiew 1 x 106 komórek rozcieńczonych w 20 ml pożywki 1 na dwóch 96-dołkowych płytkach. Na dołek należy podać 100 μl zawiesiny komórek, zapewniając utrzymanie jednorodności tej zawiesiny przez mieszanie. Hoduj komórki przez 48 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C (5%CO2 i 95% wilgotności) bez zmiany pożywki do około 70%-80% zgryzu.
  2. Utrzymuj komórki zlewające się i na czczo, hodując je w tym samym podłożu przez 48 godzin. Zmieniaj czas inkubacji od 24 do 72 godzin w zależności od pożądanego stanu katabolicznego na czczo.

3. Głód komórek 3T3-L1

  1. Dekantacja pożywki z komórek w płytkach 96-dołkowych. Wchłonąć pozostały płyn za pomocą sterylnych ręczników papierowych.
  2. Opłucz 96-dołkową płytkę 100 μl PBS na studzienkę i wchłonij pozostały płyn sterylnymi ręcznikami papierowymi.
  3. Dodać 100 μl bezglukozowego DMEM do dołka i inkubować przez 40 minut. Dostosuj czas inkubacji w zależności od typu komórki, bodźców i pożądanego poziomu postu.
    UWAGA: Czas inkubacji może wymagać optymalizacji w zależności od pory roku.

4. Przygotowanie roztworów FD-glucose o różnych stężeniach

UWAGA: Eksperyment w Rysunek 2 bada pożywki zewnątrzkomórkowe i międzykomórkowe ze stymulacją insuliną i bez niej.

  1. Użyć ośmiu powtórzeń (jeden rząd na płytce 96-dołkowej) dla każdego warunku stymulacji. W związku z tym należy przygotować 1 ml dla każdego warunku stymulacji (określonego w Tabeli 2 i poniżej).
  2. Użyj ośmiu warunków stymulacji bez insuliny: FD-glukoza 2,5 μg/ml, 1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 0,2 μg/ml, 0,1 μg/mL, 0,05 μg/ml i 0 μg/ml (kontrola bez FD-glukozy) na jednej 96-dołkowej płytce.
  3. Użyj ośmiu warunków stymulacji insuliną (10 μg/ml, stężenie końcowe): FD-glukoza 2,5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,1 μg/mL, 0,05 μg/ml i 0 μg/ml (kontrola bez FD-glukozy) na innej 96-dołkowej płytce.
  4. Aby przygotować warunki stymulacji, rozcieńczyć 1 μl roztworu roboczego FD-glukozy o stężeniu 5 mg/ml (Tabela 1) w 999 μl DMEM bez glukozy, aby otrzymać 1 ml roboczego roztworu podstawowego (rozcieńczenie 1:1000 lub 5 μg/ml).
    1. Korzystając z tego roboczego roztworu podstawowego, przygotuj 1:2000, 1:5000, 1:10 000, 1:25 000, 1:50 000 i 1:100 000 rozcieńczenia FD-glukozy w celu uzyskania 2,5 μg / ml, 1 μg / ml, 0,5 μg / ml, 0,2 μg / mL, 0,1 μg / ml i 0,05 μg / ml (Tabela 2) w probówkach o pojemności 2 ml bezpośrednio przed eksperymentami w komorze bezpieczeństwa biologicznego bez świateł.
  5. Powtórzyć krok 4.4 i dodać 1 μl insuliny (10 mg/ml, stężenie końcowe) do każdego z warunków określonych powyżej.
    UWAGA: Końcowe stężenie insuliny w tych próbkach wynosi 10 μg/ml = 1,7 nmol/ml. Aby uzyskać homogenizację, dodaj insulinę do probówek przed dodaniem innych roztworów.

5. Leczenie wygłodzonych komórek 3T3-L1

  1. Po 40 minutach inkubacji zdekantować wolny od glukozy DMEM z każdej studzienki na 96-dołkowe płytki i wchłonąć pozostały płyn sterylnymi ręcznikami papierowymi.
  2. Dodać po 100 μl (na studzienkę) z różnych warunków uzdatniania opisanych powyżej do studzienek wzdłuż jednej kolumny i 100 μl (na studzienkę) z tego samego stanu uzdatniania do studzienek wzdłuż rzędu (osiem powtórzeń) w obu płytkach 96-dołkowych. Oznacz płytki, na których wykorzystano warunki, z insuliną i bez insuliny. Dodać sam DMEM bez glukozy do studzienek kontrolnych (n = 8).
  3. Inkubować płytkę przez 40 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 i 95% wilgotności) w ciemności.

6. Pomiary zewnątrzkomórkowe i międzykomórkowe dla stymulowanych komórek 3T3-L1

  1. Po stymulacji komórek przez 40 minut, przenieś pożywkę stymulacyjną z obu płytek na nowe 96-dołkowe płytki, zachowując ten sam układ eksperymentalny.
  2. Zdekantować pozostały roztwór z oryginalnie stymulowanych 96-dołkowych płytek z komórkami na sterylnych ręcznikach papierowych.
  3. Opcjonalnie umyj komórki PBS. Usuń PBS i zdekantuj pozostały roztwór na sterylnych ręcznikach papierowych.
  4. Dodać 100 μl buforu do lizy RIPA do każdej studzienki. Opcjonalnie dodaj inhibitor proteazy do buforu RIPA w celu ochrony białek. Umieść płytki zawierające RIPA w shakerze na 30 minut.
  5. Za pomocą czytnika mikropłytek (tabela materiałów) zmierz fluorescencję przy długościach fal wzbudzenia (Ex) i emisji (Em) odpowiednio 485 i 535 nm, najpierw w pożywce zawierającej zewnątrzkomórkową FD-glukozę, a następnie na płytce z komórkami zmielonymi lizą RIPA pod koniec 30-minutowej inkubacji (patrz krok 6.4).

7. Wewnątrzkomórkowy wychwyt glukozy oparty na białku

UWAGA: Wewnątrzkomórkowy wychwyt glukozy FD zależy od liczby komórek. Poziomy białka w lizatach komórkowych są proporcjonalne do liczby komórek, które pozwalają na normalizację wewnątrzkomórkowego poziomu glukozy FD do liczby komórek w każdym dołku.

  1. Wykonaj test białka BCA zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów). Określić ilościowo stężenia białka w każdym studzience zawierającej komórki poddane lizie RIPA.
  2. Użyj 10 μl homogenatu RIPA i zmierz stężenia białka w trzech powtórzeniach, aby zwiększyć dokładność pomiarów na płytkach 96-dołkowych.
  3. Określ ilościowo białko na podstawie wzorców białka (0, 10, 20, 30, 40, 50 i 60 μg/ml białka) analizowanych razem z próbkami na każdej 96-dołkowej płytce.
  4. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 562 nm i określić ilościowo stężenia białka w każdej próbce na podstawie wzoru na regresję liniową otrzymanego dla wzorca białka.
  5. Normalizuj poziomy wewnątrzkomórkowej FD-glukozy, używając wartości fluorescencyjnej/stężenia białka w każdym dołku. Zewnątrzkomórkowy ubytek glukozy FD nie wymaga normalizacji.
  6. Opcjonalnie należy użyć średnich wartości wyjściowych w próbkach kontrolnych w celu dodatkowej normalizacji (100%).

8. Pomiar ex vivo zewnątrzkomórkowego wyczerpania glukozy FD w narządach

  1. Wstępnie potraktuj myszy związkami stymulującymi metabolizm glukozy przed rozwarstwieniem narządu, w następujący sposób.
  2. Użyj dziewięciotygodniowych samców myszy Lepob (n = 11). Przed eksperymentem nakarm wszystkie myszy regularną dietą żywieniową.
  3. Losowo przypisz myszy do trzech grup do wstrzyknięć dootrzewnowych (i.p.).
    1. Myszy z grupy kontrolnej Lepob należy wstrzyknąć 0,1 ml sterylnego PBS (n = 4).
    2. Myszom z grupy insuliny Lepob wstrzyknąć 0,1 ml sterylnego PBS, zawierającego 12 j.m. insuliny ludzkiej na gram masy ciała (BW) (n = 3).
    3. Wstrzyknąć myszom z grupy AAC2 Lepob 0,1 ml sterylnego PBS, zawierającego 0,1 nmol AAC2 na gram masy ciała (BW) (n = 4).
  4. Po 15 minutach poddaj myszy inhalacji 5% izofluranu i krwi wykrwawiającej przez nakłucie serca od znieczulonych zwierząt26.
  5. Wypreparuj trzewną, nakdydimalną białą tkankę tłuszczową (200 mg), wątrobę (200 mg) i cały mózg każdego zwierzęcia. Do obchodzenia się z tkankami należy używać kaptura bezpieczeństwa biologicznego klasy II.
  6. Przygotować roztwór roboczy FD-glucose (0,29 mM) w bezglukozowym DMEM w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II bez światła.
  7. Zmierzyć fluorescencję roztworu roboczego FD-glukozy (0,29 mM) przy długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 485 i 535 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
  8. Inkubować pobrane tkanki/narządy na 6-dołkowej płytce zawierającej PBS przez 1 minutę. Każdą tkankę lub narząd należy umieścić w oddzielnym dołku.
  9. Po 1 minucie umieść każdą chusteczkę na sterylnym ręczniku papierowym, aby wchłonął PBS. Przenieś tkanki/narządy na oddzielną 6-dołkową płytkę zawierającą 4 000 μl bezglukozowego DMEM i inkubuj przez 2 minuty.
  10. Po 2 minutach wyjąć i przenieść tkanki do studzienek 6-dołkowej płytki zawierającej 0,29 mM roztworu roboczego FD-glukozy (1 ml / dołek). Inkubować 6-dołkowe płytki zawierające tkanki w roztworze roboczym FD-glukozy w temperaturze 37 °C (5% CO2 i 95% wilgotności).
  11. Zebrać 100 μl roztworu roboczego FD-glukozy z każdego dołka po 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 i 120 minutach inkubacji, aby przeanalizować kinetykę zewnątrzkomórkowego wyczerpania glukozy FD. Wstrząsnąć przed i po pobraniu.
  12. Przenieść 100 μl roztworu roboczego FD-glukozy do 96-dołkowych płytek w celu zmierzenia fluorescencji przy długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 485 i 535 nm, za pomocą czytnika mikropłytek.
  13. Znormalizuj fluorescencję do wartości 0 min (100%) dla każdego narządu u każdego zwierzęcia (Rysunek 3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wewnątrzkomórkowy pobór i zewnątrzkomórkowe wyczerpanie glukozy zmierzono w preadipocytach 3T3-L1 w odpowiedzi na różne stężenia FD-glucose (Rysunek 2) z i bez stymulacji insuliną. Rysunek 2A wykazuje zależny od dawki wzrost wewnątrzkomórkowego poboru FD-glucose, który był znacząco zwiększony w obecności insuliny. Towarzyszący temu spadek poziomu zewnątrzkomórkowej FD-glucose w tych samych komórkach przedstawiono na Rysunku 2B, gdzi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Bezpośrednie porównanie zewnątrzkomórkowego wyczerpania glukozy FD ze znormalizowanym wewnątrzkomórkowym wychwytem glukozy w hodowli komórkowej wykazało wysoką korelację, co sugeruje, że zewnątrzkomórkowe wyczerpanie glukozy może być zastępczym pomiarem do oceny wychwytu glukozy. Pomiar zewnątrzkomórkowej FD-glukozy może wykorzystywać szeroki zakres stężeń glukozy FD, również 0,5-2,5 μg FD-glukozy/ml wydaje się zapewniać optymalny zakres. Zewnątrzkomórkowa FD-glukoza nie wymaga normalizacji liczby komórek lub stężeń biał...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych problemów do ujawnienia i nie mają konfliktu interesów.

Podziękowania

Projekt był wspierany przez Ralph and Marian Falk Medical Research Catalyst Award oraz Kathleen Kelly Award. Inne wsparcie obejmowało Narodowe Centrum Zasobów Badawczych UL1RR025755 i NCI P30CA16058 (OSUCCC), Mapę drogową NIH dla badań medycznych. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie reprezentują one oficjalnych poglądów Narodowego Centrum Zasobów Badawczych ani NIH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mysie fibroblasty 3T3-L1 ATCCCL-173Linia komórkowa
96-dołkowe płytkiFalcon353227Wyroby z tworzywa sztucznego
B6. Samce myszy V-Lepob/J NumermagazynowyJackson Laboratory
Myszy Modułowy wielomodowy czytnik mikropłytek BioTek Synergy H1 (Fisher Scientific, USA)Fisher Scientific, US  Urządzenie B-SHT
Surowica bydlęcaGibco/ThermoFisher161790-060Hodowla komórkowa
Surowica cielęcaGibco/ThermoFisher26010-066Hodowla komórkowa
Inkubator komórkowyFormaSeries II Urządzenie z kurtką wodną
Dieta (dieta myszy/szczurów, napromieniowana)EnvigoTeklad LM-485Dieta
dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma LifeScienceD2650-100mLOdczynnik
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco/ThermoFisher  11965-092Hodowla komórkowa
EtanolSigma AldrichE7023-500mLOdczynnik
Fluorescencyjny 2-deoksy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoksadiazol-4-ylo)amino]-D-glukoza)Sigma72987-1MGTest
Bez glukozy i bez czerwieni fenolowej DMEMGibco/ThermoFisherA14430-01Hodowla komórkowa
Insulina ludzka 10 mg/mlMilliporeSigma, Cat N 91077CCat N 91077COdczynnik
Izofluran, 5%Henry ScheinNDC 11695-6776-2Penicylina anestetyczna
/ streptomycyna (P / S)Gibco / ThermoFisher15140-122Hodowla komórkowa
Roztwór buforowany fosforanamiSigma-AldrichDA537-500 mlHodowla komórkowa
Test białka kwasu bicynowego pierce'a (BCA)Test ThermoFisherCat N23225
Bufor do lizy do testów radioimmunoimmunoprecypitacyjnychSanta Cruz Biotechnologysc-24948Test
Trypsyna-EDTA (0,05%)Gibco/ThermoFisher  25300-054Hodowla komórkowa
000632

Bibliografia

  1. Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 15, 568(2021).
  2. Garcia-Carbonell, R., et al. Critical role of glucose metabolism in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes. Arthritis Rheumatology. 68 (7), 1614-1626 (2016).
  3. Kumar, A., et al. Is diabetes mellitus associated with mortality and severity of COVID-19? A meta-analysis. Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical Research & Review. 14 (4), 535-545 (2020).
  4. Lee, J. H., et al. Different prognostic impact of glucose uptake in visceral adipose tissue according to sex in patients with colorectal cancer. Scientific Reports. 11 (1), 21556(2021).
  5. Miner, M. W. G., et al. Comparison of: (2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine, [(11)C]Methionine, and 2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose and two small-animal PET/CT systems imaging rat gliomas. Frontiers in Oncology. 11 (18), 730358(2021).
  6. Gumbiner, B., Thorburn, A. W., Ditzler, T. M., Bulacan, F., Henry, R. R. Role of impaired intracellular glucose metabolism in the insulin resistance of aging. Metabolism. 41 (10), 1115-1121 (1992).
  7. Ebrahimi, A. G., et al. Beta cell identity changes with mild hyperglycemia: Implications for function, growth, and vulnerability. Molecular Metabolism. 35, 100959(2020).
  8. Ruberto, A. A., et al. KLF10 integrates circadian timing and sugar signaling to coordinate hepatic metabolism. Elife. 10, 65574(2021).
  9. Stocks, B., Zierath, J. R. Post-translational modifications: The signals at the intersection of exercise, glucose uptake, and insulin sensitivity. Endocrinology Reviews. , (2021).
  10. World Health Organization. Global report on diabetes. World Health Organization. , (2016).
  11. Kolb, H., Martin, S. Environmental/lifestyle factors in the pathogenesis and prevention of type 2 diabetes. BMC Medicine. 15 (1), 131(2017).
  12. Galicia-Garcia, U., et al. Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus. International Journal of Molecular Science. 21 (17), 6275(2020).
  13. Petrov, M. S., Basina, M. DIAGNOSIS OF ENDOCRINE DISEASE: Diagnosing and classifying diabetes in diseases of the exocrine pancreas. European Journal of Endocrinology. 184 (4), 151-163 (2021).
  14. Sirdah, M. M., Reading, N. S. Genetic predisposition in type 2 diabetes: A promising approach toward a personalized management of diabetes. Clinical Genetics. 98 (6), 525-547 (2020).
  15. Ramos-Lopez, O., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Martinez, J. A. Epigenetic signatures underlying inflammation: an interplay of nutrition, physical activity, metabolic diseases, and environmental factors for personalized nutrition. Inflammation Research. 70 (1), 29-49 (2021).
  16. Yamamoto, N., et al. Measurement of glucose uptake in cultured cells. Current Protocols in Pharmacology. 71 (1), 12-14 (2015).
  17. Yang, L., et al. A sensitive and simple HPLC-FLD-based method for the measurement of intracellular glucose uptake. Food Chemistry. 372, 131218(2021).
  18. Lee, A., et al. Amino acid-based compound activates atypical PKC and leptin receptor pathways to improve glycemia and anxiety like behavior in diabetic mice. Biomaterials. 239, 119839(2020).
  19. Shukla, S. K., Mulder, S. E., Singh, P. K. Hypoxia-mediated in vivo tumor glucose uptake measurement and analysis. Methods in Molecular Biology. 1742, 107-113 (2018).
  20. Jakson, I., Ujvari, D., Brusell Gidlof, S., Linden Hirschberg, A. Insulin regulation of solute carrier family 2 member 1 (glucose transporter 1) expression and glucose uptake in decidualizing human endometrial stromal cells: an in vitro study. Reproductive Biology and Endocrinology. 18 (1), 117(2020).
  21. Saparbaev, E., et al. Identification and quantification of any isoforms of carbohydrates by 2D UV-MS fingerprinting of cold ions. Analytical Chemistry. 92 (21), 14624-14632 (2020).
  22. Schulz, A., et al. Targeted metabolomics of pellicle and saliva in children with different caries activity. Scientific Reports. 10 (1), 697(2020).
  23. Shulman, R. G. Nuclear magnetic resonance studies of glucose metabolism in non-insulin-dependent diabetes mellitus subjects. Molecular Medicine. 2 (5), 533-540 (1996).
  24. Cochran, B. J., et al. In vivo PET imaging with [(18)F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes. Diabetologia. 59 (18), 1977-1984 (2016).
  25. Lloyd, P. G., Hardin, C. D., Sturek, M. Examining glucose transport in single vascular smooth muscle cells with a fluorescent glucose analog. Physiological Research. 48 (6), 401-410 (1999).
  26. Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture. Journal of Visualized Experiments. (7), e266(2007).
  27. DiSilvestro, D. J., et al. Leptin production by encapsulated adipocytes increases brown fat, decreases resistin, and improves glucose intolerance in obese mice. PLoS One. 11 (4), 0153198(2016).
  28. Friedman, J. M. Leptin and the endocrine control of energy balance. Nature Metabolism. 1 (8), 754-764 (2019).
  29. Guillam, M. T., Burcelin, R., Thorens, B. Normal hepatic glucose production in the absence of GLUT2 reveals an alternative pathway for glucose release from hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (21), USA. 12317-12321 (1998).
  30. Guillam, M. T., et al. Early diabetes and abnormal postnatal pancreatic islet development in mice lacking Glut-2. Nature Genetics. 17 (3), 327-330 (1997).
  31. Barros, L. F., et al. Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes. Journal of Neurochemistry. 109, 94-100 (2009).
  32. Sprinz, C., et al. Effects of blood glucose level on 18F-FDG uptake for PET/CT in normal organs: A systematic review. PLoS One. 13 (2), 0193140(2018).
  33. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  34. de Urquiza, A. M., et al. Docosahexaenoic acid, a ligand for the retinoid X receptor in mouse brain. Science. 290 (5499), 2140-2144 (2000).
  35. Olson, A. L., Pessin, J. E. Structure, function, and regulation of the mammalian facilitative glucose transporter gene family. Annual Review of Nutrition. 16 (1), 235-256 (1996).
  36. Muhanna, D., Arnipalli, S. R., Kumar, S. B., Ziouzenkova, O. Osmotic adaptation by Na(+)-dependent transporters and ACE2: correlation with hemostatic crisis in COVID-19. Biomedicines. 8 (11), 460(2020).
  37. Ligasova, A., Koberna, K. DNA dyes-highly sensitive reporters of cell quantification: comparison with other cell quantification methods. Molecules. 26 (18), 5515(2021).
  38. DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. American Journal of Physiology. 237 (3), 214-223 (1979).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Analiza stężenia glukozy FDanaliza wysokoprzepustowastymulacja insulinąDMEM bezglukozowyczytnik mikropłytekkwantyfikacja białkapobieranie zależne od dawkieksplanty tkanek
Zewnątrzkomórkowy zubożenie glukozy jako pośrednia miara wychwytu glukozy w komórkach i tkankach ex vivo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.