Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Poprawa unerwienia nerek łagodziła nadciśnienie indukowane przez infuzję angiotensyny II

4.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63719

⸱

26 maja 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Huadong Hospital Affiliated to Fudan University, 2Shanghai Key Laboratory of Clinical Geriatric Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół odnerwienia współczulnego nerek (RDN) u myszy z nadciśnieniem wywołanym infuzją angiotensyny II. Zabieg jest powtarzalny, wygodny i pozwala na zbadanie mechanizmów regulacyjnych RDN na nadciśnienie tętnicze i przerost mięśnia sercowego.

Streszczenie

Korzyści płynące z odnerwienia współczulnego nerek (RDN) na ciśnienie krwi zostały udowodnione w wielu badaniach klinicznych w ostatnich latach. Jednak mechanizm regulacyjny RDN na nadciśnienie pozostaje nieuchwytny. Dlatego ważne jest, aby ustalić prostszy model RDN u myszy. W tym badaniu mini pompy osmotyczne wypełnione angiotensyną II wszczepiono 14-tygodniowym myszom C57BL/6. Tydzień po wszczepieniu minipompy osmotycznej przeprowadzono zmodyfikowaną procedurę RDN na obustronnych tętnicach nerkowych myszy przy użyciu fenolu. Myszom dopasowanym pod względem wieku i płci podawano sól fizjologiczną i podawano jako grupę pozorowaną. Ciśnienie krwi mierzono na początku badania, a następnie co tydzień przez 21 dni. Następnie pobrano tętnicę nerkową, aortę brzuszną i serce do badania histologicznego za pomocą barwienia H&E i Massona. W tym badaniu przedstawiamy prosty, praktyczny, powtarzalny i ustandaryzowany model RDN, który może kontrolować nadciśnienie tętnicze i łagodzić przerost mięśnia sercowego. Technika ta może denerwować obwodowe nerwy współczulne nerek bez uszkodzenia tętnicy nerkowej. W porównaniu z poprzednimi modelami, zmodyfikowany RDN ułatwia badanie patobiologii i patofizjologii nadciśnienia tętniczego.

Wprowadzenie

Nadciśnienie jest główną przewlekłą chorobą sercowo-naczyniową na całym świecie. Niekontrolowane nadciśnienie może uszkodzić narządy docelowe i przyczynić się do niewydolności serca, udaru mózgu i przewlekłych chorób nerek1,2,3. Częstość występowania nadciśnienia tętniczego wzrosła w Chinach z 20% do 31% w latach 1991-2007. Liczba dorosłych z nadciśnieniem tętniczym w Chinach może się podwoić po niedawnej rewizji kryteriów diagnostycznych nadciśnienia (130/80 mmHg)4. Nadciśnienie tętnicze można kontrolować za pomocą leków, jednak około 20% pacjentów nie jest w stanie kontrolować nadciśnienia, nawet jeśli otrzymują co najmniej trzy leki przeciwnadciśnieniowe (w tym jeden moczopędny) w maksymalnej tolerowanej dawce, co może prowadzić do rozwoju nadciśnienia lekoopornego5.

Udowodniono, że denerwacja współczulna nerek (RDN) jest potencjalnym sposobem leczenia nadciśnienia. W 2009 roku Krum i współpracownicy po raz pierwszy poinformowali o leczeniu opornego nadciśnienia tętniczego za pomocą RDN. Stwierdzono, że przezskórna ablacja tętnicy nerkowej może skutecznie powodować trwałe obniżenie ciśnienia krwi u pacjentów6. Jednak niepowodzenie badania Symplicity Hypertension 3 (HTN-3) utrudniło zastosowanie RDN7, przekształcając RDN w kontrowersyjną terapię. Niemniej jednak perspektywa RDN nie została jeszcze wykluczona. Ostatnie badania kliniczne, w tym RADIANCE-HTN SOLO, SPYRAL HTN-OFF MED/ON MED i SPYRAL HTN-OFF MED Pivotal, potwierdziły skuteczność RDN w leczeniu nadciśnienia tętniczego8,9,10,11,12. W związku z tym konieczne jest przeprowadzenie bardziej szczegółowych badań mechanistycznych, aby zbadać wpływ RDN.

Ogólnym celem tego badania jest pokazanie, jak RDN u myszy może być zmodyfikowany, aby uzyskać prostszą i bardziej stabilną operację. W wielu eksperymentach badano różne podejścia RDN, takie jak krioablacja wewnątrznaczyniowa, ultradźwięki pozaustrojowe i miejscowe zastosowanie substancji chemicznej lub neurotoksyny w różnych modelach zwierzęcych13,14,15,16,17. Model RDN wygenerowany przy użyciu ablacji chemicznej fenolem jest dobrze ugruntowanym modelem eksperymentalnym do badania patogenezy aktywacji układu współczulnego w nadciśnieniu. Model ten jest generowany przez chemiczną korozję nerkowych nerek współczulnych za pomocą 10% roztworu fenolu/etanolu za pomocą wacika bawełnianego18. Z jednej strony konwencjonalny RDN potencjalnie hamuje aktywność współczulną nerek, co z kolei zmniejsza wydzielanie reniny i wchłanianie zwrotne sodu oraz zwiększa przepływ krwi przez nerki. Z drugiej strony hamuje układ renina-angiotensyna-aldosteron19. W ten sposób RDN ma korzystny wpływ na nadciśnienie. Jednak w modelu RDN generowanym przez ablację chemiczną brakuje kryteriów ablacji i czasu ablacji, a szczegóły procedury eksperymentalnej są jeszcze niejasne. Ponadto nie ma dostępnych raportów technicznych. W tym raporcie opisujemy protokół chirurgiczny generowania modelu RDN z fenolem przy użyciu papieru do ważenia w nadciśnieniu indukowanym angiotensyną II (Ang II) u myszy C57BL / 6. Owijamy tętnicę nerkową bibułą wagową zawierającą fenol i ujednolicamy czas ablacji, co pomaga ustalić bardziej powtarzalny, wiarygodny model RDN. Ten eksperymentalny model ma na celu ocenę wpływu RDN na nadciśnienie tętnicze.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne na zwierzętach były zgodne z odpowiednim Przewodnikiem etycznym dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (publikacja NIH nr 85-23, poprawiona w 2011 roku) i zostały zatwierdzone przez komitety ds. badań na zwierzętach szpitala Huadong afiliowanego przy Uniwersytecie Fudan. Czternastotygodniowe samce myszy C57BL/6 (28-30g) zostały losowo podzielone na cztery grupy: grupa Sham, grupa Sham+Ang II, grupa RDN, grupa RDN+Ang II, n = 6 w każdej grupie. Wszystkie zwierzęta utrzymywano w określonych zamkniętych warunkach wolnych od czynników chorobotwórczych w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze 24 ± 1 °C z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności i swobodnym dostępem do standardowej karmy dla gryzoni i wody ad libitum.

1. Przygotowanie pola operacyjnego

  1. Zdezynfekuj stół operacyjny 70% etanolem. Ustaw temperaturę poduszki grzewczej na 37 °C.
  2. Upewnij się, że wszystkie narzędzia chirurgiczne są sterylizowane przed zabiegiem w temperaturze 121 °C przez 30 minut lub innymi metodami. Ta procedura wymaga mikronożyczek chirurgicznych, dwóch cienkich prostych kleszczy, dwóch cienkich zakrzywionych kleszczy, kleszczyków hemostatycznych, sterylnych gaz i bibułek do ważenia.

2. Nadciśnienie wywołane angiotensyną II

  1. Podaj meloksykam (0,5 mg/kg, SC) myszom C57BL/6 na krótko przed indukcją znieczulenia. Następnie znieczul myszy za pomocą wstrzyknięcia pentobarbitalu sodu, jak opisano wcześniej20,21. W razie potrzeby można również zastosować izofluran. Potwierdź głębokość znieczulenia za pomocą ujemnego odruchu szczypania palca u nogi.
  2. Usuń włosy z tyłu za pomocą golarki. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
  3. Umieść zwierzę na stole operacyjnym w pozycji grzbietowej. Przetrzyj i przetrzyj ogolony obszar jodonem powidonu, a następnie trzema chusteczkami z 70% etanolem.
  4. Wykonaj 1 cm nacięcie za pomocą sterylnego ostrza skalpela, prostopadle do ogona, za uchem nad łopatką przedniej nogi.
  5. Użyj sterylnego hemostatu, aby wykonać podskórny tunel pod skórą i utwórz kieszeń na pompę22. Delikatnie włożyć pompę osmotyczną wypełnioną angiotensyną II (1 000 ng/kg/min) do kieszeni. Upewnij się, że jest wystarczająco dużo wolnego miejsca, aby zszyć ranę bez rozciągania skóry.
  6. Zszyj mięsień przerwanymi szwami 6-0 Vicryl i zamknij skórę przerwanymi szwami nylonowymi 4-0. Pobrać wymaz i przetrzeć miejsce rany jodonem powidonu. Wykonaj tę samą operację z równą objętością soli fizjologicznej dla grupy kontrolnej.
  7. Umieść wszystkie narzędzia chirurgiczne w sterylizatorze na 10 sekund i wymieniaj sterylne rękawiczki między operacjami. Monitoruj wszystkie myszy, aż do całkowitego wyzdrowienia.
  8. Ściśle monitoruj i obserwuj gojenie się ran u myszy co najmniej dwa razy dziennie w pierwszym tygodniu, a następnie raz dziennie, w tym zaczerwienienie, obrzęk i infekcję. Natychmiast wykonaj sekcję, jeśli myszy umrą podczas infuzji Ang II.
  9. Mierz ciśnienie krwi na początku badania i co tydzień po infuzji Ang II za pomocą metody pletyzmografii mankietu ogonowego23 u świadomych myszy. Upewnij się, że eksperymenty z pomiarem ciśnienia krwi są przeprowadzane w cichym miejscu, w temperaturze 22 ± 2 °C, gdzie myszy są aklimatyzowane przez 1 godzinę przed rozpoczęciem eksperymentu. Przyzwyczajaj myszy przez co najmniej 5 kolejnych dni przed wyjściowymi pomiarami ciśnienia krwi23,24.

3. Obustronne odnerwienie nerek

  1. Wybierz myszy z podwyższonym ciśnieniem krwi (BP) ≥140/90 mmHg lub 25% wzrostem skurczowego ciśnienia tętniczego/rozkurczowego ciśnienia krwi, 1 tydzień po infuzji Ang II.
  2. Zapisz masę ciała zwierzęcia przed operacją i wybierz zwierzęta o minimalnej wadze 24 g do operacji odnerwienia nerek.
  3. Znieczulij myszy za pomocą pentobarbitalu sodu. Potwierdź głębokość znieczulenia za pomocą ujemnego odruchu szczypania palca u nogi.
  4. Usuń włosy na brzuchu za pomocą golarki. Wykonaj tę procedurę ostrożnie i dokładnie, aby uniknąć zanieczyszczenia chirurgicznego.
  5. Umieść myszy na stole operacyjnym, trzymając brzuch w górze i przymocuj jego kończyny taśmą. Zdezynfekuj skórę brzucha jodonem powidonu, a następnie użyj trzech chusteczek z 70% etanolem.
  6. Wykonaj 2 cm brzuszne nacięcie brzucha w linii środkowej za pomocą ostrza skalpela. Odciągnąć jelito gazą nasączoną solą fizjologiczną o temperaturze 37 °C, aby odsłonić lewą tętnicę nerkową. Ostrożnie, ale tępo wypreparuj tłuszcz z tętnicy nerkowej za pomocą zakrzywionej pęsety. (Rysunek 1A-C).
  7. Pokrój papier wagowy na prostokąt o tym samym rozmiarze co tętnica nerkowa sterylnymi ostrymi nożyczkami. Dla porównania, przytnij papier do ważenia w tym samym rozmiarze, jak pokazano na przerywanej linii w Rysunek 1C.
    UWAGA: Jest to krytyczna część operacji, spróbuj wyciąć kilka kawałków papieru do ważenia na raz, aby zachować ten sam kształt.
  8. Zanurz papier wagowy w 10% roztworze fenolu/etanolu na co najmniej 30 sekund. Przykryj powierzchnię lewej tętnicy nerkowej i owiń naczynie papierem do ważenia, trzymaj przez 2 minuty (Rysunek 1D). Użyj gazy, aby chronić otaczające tkanki, aby papier wagowy nie dotykał otaczających nerek i jelit.
    UWAGA: Roztwór fenolu jest stabilny w plastikowych probówkach, ale nie w szklanych fiolkach. Dlatego roztwór musi być świeżo przygotowany dla każdego eksperymentu18.
  9. Wykonaj tę samą procedurę dla prawej tętnicy nerkowej. Wykonaj pozorowaną operację za pomocą papieru wagowego zanurzonego w soli fizjologicznej.
  10. Ustaw mięśnie w ich początkowej pozycji i zamknij otrzewną szwami 6-0 Vicryl w przerywanym szwie. Następnie zamknij skórę przerwanymi nylonowymi szwami 4-0. Monitoruj wszystkie myszy, aż do całkowitego wyzdrowienia.

4. Opieka pooperacyjna

  1. Nałóż jod powidonu na nacięcie i umieść zwierzę w ciepłym kocu elektrycznym w celu rekonwalescencji i monitorowania pooperacyjnego.
  2. Monitoruj myszy dwa razy dziennie, aby ocenić zaczerwienienie, obrzęk i ból lub infekcję jamy brzusznej. Meloksykam (0,5 mg/kg mc., SC) należy podać wszystkim myszom około 1 godziny przed i 24 godziny po zabiegu RDN.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Statystyka
Wszystkie dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe. W eksperymentach obejmujących trzy lub więcej warunków zastosowano jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA), a następnie testy post-hoc Bonferroniego do porównań między poszczególnymi grupami. Wartość p równa lub mniejsza niż 0,05 uznana została za istotną. Do wykonania wszystkich analiz statystycznych wykorzystano komercyjne oprogramowanie.

Wzrost ciśnienia tętniczego wywołany przez An...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

To, czy RDN może obniżać ciśnienie krwi, stało się kontrowersyjne od czasu publikacji negatywnego wyniku badania symplicity HTN-3 7,25. Jednak kilka badań klinicznych i eksperymentów na zwierzętach wykazało pozytywne i skuteczne wyniki RDN u ludzi i zwierząt z nadciśnieniemtętniczym 9,10,11,12,13,14,15,16,17.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie ma żadnych konfliktów interesów, finansowych lub innych, jak deklarują autorzy.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81770420), Komisję Nauki i Technologii Gminy Szanghaj (20140900600), Szanghajskie Kluczowe Laboratorium Klinicznej Medycyny Geriatrycznej (13dz2260700), Szanghajską Miejską Kluczową Specjalizację Kliniczną (shslczdzk02801) oraz Centrum geriatrycznej choroby wieńcowej, Szpital Huadong Stowarzyszony z Uniwersytetem Fudan.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Angiotensyna IISangon BiotechCAS: 4474-91-3Aby wykonać model animolu z nadciśnieniem
Przeciwciało przeciw hydroksylazie tyrozynyAbcamab137869Aby ocenić ekspresję TH nerwów nerkowych
Analiza ciśnienia krwiVisitech SystemsBP-2000Zmierz ciśnienie krwi myszy
Mini-pompa osmotycznaDURECT CorporationCA 95014Aby napełnić Angiotensyną II
Norepinefryna Zestaw ELISAAbcamab287789do pomiaru poziomu noradrenaliny w nerkach
PhenolSangon BiotechCAS: 108-95-2Uszkodzić nerek współczulnych
Papier wagowySangon BiotechF512112Aby zniszczyć nerw nerkowy za pomocą papieru wagowego zanurzonego w fenolu; https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F512112. 
tętniczym

Bibliografia

  1. Messerli, F. H., Rimoldi, S. F., Bangalore, S. The transition from hypertension to heart failure: Contemporary update. JACC Heart Failure. 5 (8), 543-551 (2017).
  2. Lackland, D. T., et al. Implications of recent clinical trials and hypertension guidelines on stroke and future cerebrovascular research. Stroke. 49 (3), 772-779 (2018).
  3. Rossignol, P., et al. The double challenge of resistant hypertension and chronic kidney disease. The Lancet. 386 (10003), 1588-1598 (2015).
  4. Du, X., Patel, A., Anderson, C. S., Dong, J., Ma, C. Epidemiology of cardiovascular disease in China and opportunities for improvement. JACC International. Journal of the American College of Cardiology. 73 (24), 3135-3147 (2019).
  5. Valenzuela, P. L., et al. Lifestyle interventions for the prevention and treatment of hypertension. Nature Review Cardiology. 18 (4), 251-275 (2021).
  6. Krum, H., et al. Catheter-based renal sympathetic denervation for resistant hypertension: a multicentre safety and proof-of-principle cohort study. The Lancet. 373 (9671), 1275-1281 (2009).
  7. Bhatt, D. L., et al. A controlled trial of renal denervation for resistant hypertension. The New England Journal of Medicine. 370 (15), 1393-1401 (2014).
  8. Kjeldsen, S. E., Narkiewicz, K., Burnier, M., Oparil, S. Renal denervation achieved by endovascular delivery of ultrasound in RADIANCE-HTN SOLO or by radiofrequency energy in SPYRAL HTN-OFF and SPYRAL-ON lowers blood pressure. Blood Press. 27 (4), 185-187 (2018).
  9. Böhm, M., et al. Efficacy of catheter-based renal denervation in the absence of antihypertensive medications (SPYRAL HTN-OFF MED Pivotal): a multicentre, randomised, sham-controlled trial. The Lancet. 395 (10234), 1444-1451 (2020).
  10. Azizi, M., et al. Endovascular ultrasound renal denervation to treat hypertension (RADIANCE-HTN SOLO): a multicentre, international, single-blind, randomised, sham-controlled trial. The Lancet. 391 (10137), 2335-2345 (2018).
  11. Kandzari, D. E., et al. Effect of renal denervation on blood pressure in the presence of antihypertensive drugs: 6-month efficacy and safety results from the SPYRAL HTN-ON MED proof-of-concept randomised trial. The Lancet. 391 (10137), 2346-2355 (2018).
  12. Townsend, R. R., et al. Catheter-based renal denervation in patients with uncontrolled hypertension in the absence of antihypertensive medications (SPYRAL HTN-OFF MED): a randomised, sham-controlled, proof-of-concept trial. The Lancet. 390 (10108), 2160-2170 (2017).
  13. Sun, X., et al. Renal denervation restrains the inflammatory response in myocardial ischemia-reperfusion injury. Basic Research in Cardiology. 115 (2), 15(2020).
  14. Sharp, T. E., et al. Renal denervation prevents heart failure progression via inhibition of the renin-angiotensin system. Journal of the American College of Cardiology. 72 (21), 2609-2621 (2018).
  15. Wang, H., et al. Renal denervation attenuates progression of atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice independent of blood pressure lowering. Hypertension. 65 (4), 758-765 (2015).
  16. Chen, H., et al. Renal denervation mitigates atherosclerosis in ApoE-/- mice via the suppression of inflammation. American Journal of Translational Research. 12 (9), 5362-5380 (2020).
  17. Wang, Y., et al. Renal denervation promotes atherosclerosis in hypertensive apolipoprotein E-deficient mice infused with Angiotensin II. Frontiers in Physiology. 8, 215(2017).
  18. Eriguchi, M., Tsuruya, K. Renal sympathetic denervation in rats. Methods in Molecular Biology. 1397, 45-52 (2016).
  19. Thukkani, A. K., Bhatt, D. L. Renal denervation therapy for hypertension. Circulation. 128 (20), 2251-2254 (2013).
  20. Zhang, Y. J., et al. NAD(+) administration decreases microvascular damage following cardiac ischemia/reperfusion by restoring autophagic flux. Basic Research in Cardiology. 115 (5), 57(2020).
  21. Wang, M., et al. Long-term renal sympathetic denervation ameliorates renal fibrosis and delays the onset of hypertension in spontaneously hypertensive rats. American Journal of Translational Research. 10 (12), 4042-4053 (2018).
  22. Lu, H., et al. Subcutaneous Angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e53191(2015).
  23. Wilde, E., et al. Tail-cuff technique and its influence on central blood pressure in the mouse. Journal of the American Heart Association. 6 (6), 005204(2017).
  24. Daugherty, A., Rateri, D., Hong, L., Balakrishnan, A. Measuring blood pressure in mice using volume pressure recording, a tail-cuff method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1291(2009).
  25. Esler, M. Illusions of truths in the Symplicity HTN-3 trial: generic design strengths but neuroscience failings. Journal of the American Society of Hypertension. 8 (8), 593-598 (2014).
  26. Han, W., et al. Low-dose sustained-release deoxycorticosterone acetate-induced hypertension in Bama miniature pigs for renal sympathetic nerve denervation. Journal of the American Society of Hypertension. 11 (5), 314-320 (2017).
  27. Han, W., et al. The safety of renal denervation as assessed by optical coherence tomography: pre- and post-procedure comparison with multi-electrode ablation catheter in animal experiment. Hellenic Journal of Cardiology. 61 (3), 190-196 (2020).
  28. Cai, X., et al. Noninvasive stereotactic radiotherapy for renal denervation in a swine model. Journal of the American College of Cardiology. 74 (13), 1697-1709 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model nadci nienia t tniczegoPomiar ci nienia t tniczegoPrzerost sercaAblacja nerw w wsp czulnychOsmotyczna minipompaAplikacja fenoluBadanie histologiczneTyrozynowa hydroksylaza
Poprawa unerwienia nerek łagodziła nadciśnienie indukowane przez infuzję angiotensyny II
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.