Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej tkanki pępowinowej i ich różnicowanie w linię mięśni szkieletowych

6.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63725

⸱

31 sierpnia 2022

 , 
1Translational Health Science and Technology Institute (THSTI), NCR Biotech Science Cluster

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy protokół izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej tkanki pępowinowej i ich różnicowania w linię mięśni szkieletowych.

Streszczenie

Badanie potencjału terapeutycznego mezenchymalnych komórek macierzystych zależy od łatwości izolacji, zdolności do różnicowania oraz niezawodności i odporności źródła. Opisujemy tutaj krokowy protokół izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej tkanki pępowinowej (uMSC), ich immunofenotypowania oraz namnażania takich kultur przez kilka pasaży. W tej procedurze żywotność uMSC jest wysoka, ponieważ nie zachodzi trawienie enzymatyczne. Ponadto usunięcie naczyń krwionośnych, w tym tętnic pępowinowych i żyły, zapewnia, że nie dochodzi do zanieczyszczenia komórek pochodzenia śródbłonkowego. Stosując cytometrię przepływową, uMSC po izolacji są CD45−CD34−, co wskazuje na brak komórek z linii krwiotwórczej. Co ważne, wyrażają one kluczowe znaczniki powierzchni, CD105, CD90 i CD73. Po założeniu kultur w artykule opisano skuteczną metodę indukowania różnicowania tych uMSC w linię mięśni szkieletowych. Szczegółowa analiza progresji miogennej w zróżnicowanych uMSC ujawnia, że uMSC wyrażają Pax7, marker dla miogennych przodków w początkowych stadiach różnicowania, następnie ekspresję MyoD i Myf5, a na końcu końcowy marker różnicowania, łańcuch ciężki miozyny (MyHC).

Wprowadzenie

Ludzka pępowina została uznana za posiadającą solidny rezerwuar mezenchymalnych komórek macierzystych, które są obecnie badane pod kątem terapii regeneracyjnych ze względu na ich wysokie tempo proliferacji i różnicowania, właściwości immunomodulacyjne i zdolność do generowania komórek ze wszystkich trzech listków zarodkowych1. Tkanka pępowinowa składa się z wielu przedziałów, takich jak krew pępowinowa, podśródbłonek żyły pępowinowej i galaretka Whartona (WJ), która sama w sobie obejmuje trzy niewyraźne obszary - strefę okołonaczyniową, strefę międzynaczyniową i sub-owodnię lub wyściółkę pępowiny (CL)2. Chociaż uMSC mogą być izolowane ze wszystkich tych różnych regionów i szeroko wyrażać kluczowe markery MSC, nie ma jasności co do tego, czy te przedziały zawierają tę samą populację uMSC, czy też wykazują różnice w ich potencjach różnicowania3. W związku z tym protokoły izolacji uMSC wymagają większej precyzji w ich trybie i regionie izolacji, solidnej charakterystyki potencjałów różnicowania i wreszcie analizy porównawczej z różnych przedziałów pępowiny.

W tym kontekście, niewiele badań wykazało różnice w potencjale proliferacyjnym i różnicującym uMSC między różnymi częściami rdzenia. Spośród nich analizy porównawcze między uMSC wyizolowanymi z regionów CL i WJ wykazały większy potencjał proliferacyjny w uMSCs pochodzących z CL3,4. W innym badaniu uMSC pochodzące z WJ osiągały lepsze wyniki w testach proliferacji w porównaniu z komórkami okołonaczyniowymi (HUCPV) 5. Badając różnice między uMSC pochodzącymi z krwi pępowinowej a uMSC pochodzącymi z tkanki pępowinowej pozbawionymi zanieczyszczenia naczyniowego, stwierdzono różnicową ekspresję kluczowych markerów MSC między tymi dwoma przedziałami, a także zwiększone tempo proliferacji w uMSC pochodzących z tkanki pępowinowej6.

Spośród kilku badań badających potencjał różnicowania uMSC, głównie w tkankach linii mezodermy, takich jak linie osteogenne, adipogenne i chondrogenne, bardzo niewiele dostarczyło szczegółowych protokołów różnicowania miogennego i późniejszej charakterystyki, a także analiz porównawczych między różnymi przedziałami pępowiny. W tym kontekście opracowaliśmy solidny protokół różnicowania mięśni i zaobserwowaliśmy, że uMSC pochodzące z tkanki pępowinowej wykazują lepsze zdolności różnicowania miogennego w porównaniu z krwią pępowinową6. W tym miejscu szczegółowo opisano protokół krokowy izolacji uMSC z całej tkanki pępowinowej pozbawionej komórek związanych z naczyniem, ich charakterystyki i różnicowania się w linię miogenną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Użycie tkanki pępowinowej w tym badaniu zostało zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Badań nad Komórkami Macierzystymi (IC-SCR), Instytucjonalną Komisję Etyki, Instytut Nauki i Technologii Zdrowia Translacyjnego (IEC-THSTI), Instytucjonalną Komisję Etyki Szpitala Cywilnego, Gurugram, Haryana, oraz Instytucjonalną Komisję Bezpieczeństwa Biologicznego, THSTI. Próbki tkanki pępowinowej pobrano z porodów donoszonych w momencie porodu. Uzyskano świadomą pisemną zgodę od uczestników. Wszystkie metody zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami.

1. Izolacja MSCs z tkanki pępowinowej

  1. W momencie porodu odetnij co najmniej 5 cm pępowiny, najlepiej bliżej łożyska, i wysterylizuj pępowinę, przecierając zewnętrzną powierzchnię 70% etanolem. Przenieść kawałek tkanki pępowinowej sekwencyjnie z jednej probówki o pojemności 50 ml zawierającej sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do innej zawierającej to samo. Przetransportować probówkę z imieniem i nazwiskiem pacjenta na lodzie do laboratorium w ciągu 1 godziny
    UWAGA: W przypadku większego badania przydatne może być oznaczenie próbek kodem kreskowym, aby umożliwić ich śledzenie przez cały czas trwania badania. Co ważne, cały personel mający kontakt z tkankami ludzkimi powinien otrzymać pełny schemat szczepienia przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B.
  2. W laboratorium włącz UV na 25 minut w okapie BSL-2, aby wysterylizować autoklawowane narzędzia i pipety przed użyciem.
  3. Przenieś fragment tkanki pępowinowej z probówki zbiorczej do naczynia o długości 10cm2 poddanego kulturze tkankowej zawierającej PBS wzbogacony o 5 g / l glukozy, 50 μg / ml gentamycyny, 2,5 μg / ml amfoterycyny B, 100 U / ml penicyliny i 100 μg / ml streptomycyny (schemat w Rysunek 1).
  4. Za pomocą skalpela przetnij tkankę pępowinową pionowo wzdłuż jej osi podłużnej, aby uzyskać dwa półcylindryczne kawałki. Ze względu na skręt rdzenia i powierzchnię śluzowatą, przygwoźdź tkankę za pomocą kleszczy trzymanych w drugiej ręce.
  5. W tym momencie obserwuj tętnice pępowinowe i żyłę i usuń naczynia krwionośne za pomocą skalpela, aby zeskrobać je w jednym kierunku od powierzchni. Ponownie przepłucz tkankę pępowinową w PBS, aby usunąć całą pozostałość krwi związaną z tkanką. Upewnij się, że skrobanie jest delikatne, aby zachować integralność komórek w WJ otaczających naczynia.
  6. Zmiel każdą połówkę tkanki pępowinowej na 0,5 cm 3 kawałki i umieść je powierzchnią światła skierowaną w dół na naczyniu. Inkubować naczynie krótko przez 10 minut w komorze nawilżanej o temperaturze 37 °C zawierającej 5% CO2 .
  7. Po inkubacji zalać szalkę zawierającą fragmenty tkanki pępowinowej 20 ml pożywki zawierającej modyfikację MEM Alpha bez L-glutaminy, rybonukleozydów i dezoksyrybonukleozydów, 15% płodowej surowicy bydlęcej (nieinaktywowanej termicznie) i 50 μg/ml gentamycyny. Delikatnie dodaj pożywkę wzrostową wzdłuż boków, aby zapobiec wyparciu eksplantatów tkanek z ich orientacji. Dodać nadmiar pożywki, aby uwzględnić frakcję, która zostanie wchłonięta przez eksplantaty tkanek podczas inkubacji.
  8. Po 3 dniach inkubacji dodaj świeże podłoże do kultur. Upewnij się, że kultury są chronione przed wstrząsami i ruchem eksplantatów podczas obchodzenia się z naczyniami.
  9. Po 1 tygodniu usuń fragmenty tkanek pojedynczo za pomocą sterylnych kleszczy i wyrzuć za pomocą odpowiednich worków na zagrożenia biologiczne w celu usunięcia. Zachowaj istniejącą pożywkę i dodaj 10 ml świeżej pożywki. Pożywkę należy wymieniać co 4 dni, aż poszczególne kolonie osiągną zbieżność 70%.
    UWAGA: Jest prawdopodobne, że komórki nie będą równomiernie rozmieszczone w całej naczyniu, ponieważ będą istniały indywidualne kolonie proliferacyjne, które będą musiały być monitorowane pod kątem zbiegania się z czasem. Ogólnie rzecz biorąc, w ciągu miesiąca szalka o długości 10cm2 generuje wystarczającą ilość komórek, aby można je było podzielić na osobne naczynie.
  10. Zbierz przylegające komórki za pomocą roztworu trypsyny/EDTA (1x 0,25% trypsyny i 0,02% EDTA w zrównoważonym roztworze soli Hanksa [HBSS]). Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 470 × g przez 5 minut w temperaturze 25 °C i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce wzrostowej.

2. Immunofenotypowanie i rozmnażanie uMSCS

  1. Przejdź do immunofenotypowania, gdy przylegające komórki osiągną 50%-60% konfluencji i są dobrze rozprowadzone. Nie należy wykonywać analizy markerów MSC na w pełni zlewających się kulturach, ponieważ ma to tendencję do obniżania poziomu kluczowych markerów MSC.
  2. Po trypsynizacji rozprowadzić zawiesinę komórek 1 × 106 komórek/ml w probówkach FACS (1 × 105 komórek/probówkę) i wybarwić odpowiednimi przeciwciałami związanymi z fluoroforem (wszystkie rozcieńczenie 1:50) w połączeniu: niebarwiony; CD105 + CD90; CD105 + CD73; Płyta CD105; Płyta CD90; Płyta CD73; CD34 + CD45 (powszechny fluorofor); kontrole izotypu dla każdego fluoroforu. Zapisz łączną liczbę zdarzeń wynoszącą co najmniej 10 000 na cytometrze przepływowym w celu dalszej analizy.
    UWAGA: Ponieważ komórki są analizowane osobno dla każdego znacznika powierzchni, bramkowanie na podzbiorach komórek nie jest wymagane.
  3. Oprócz powyższych markerów należy potwierdzić obecność dodatnich i ujemnych markerów powierzchniowych w liniach uMSC utworzonych z pojedynczych próbek tkanki pępowinowej (tab. 1).
  4. Przeanalizuj znakowane komórki za pomocą cytometrii przepływowej i określ procent komórek CD105 + CD90 + i CD105 + CD73 +. Analizuj oddzielnie komórki CD105+ i CD34−CD45−.

3. Różnicowanie uMSC w mięśnie szkieletowe

  1. Pokryj płytki do hodowli tkankowych 0,01% kolagenu i 20 μg/ml lamininy w PBS. Talerze te należy pokrywać przez co najmniej 4 godziny w temperaturze pokojowej.
  2. Płytki uMSC o gęstości 10 000 komórek/cm2 w pożywce wzrostowej.
  3. Gdy komórki są w 70% zlewne, odessać pożywkę wzrostową i przepłukać kultury 2x PBS. Dodać miogenną pożywkę różnicującą (M1) składającą się z DMEM + 5% surowicy końskiej + 0,1 μM deksametazonu + 50 μM hydrokortyzonu do uMSC. W celu określenia kinetyki progresji miogennej należy dodawać pożywkę M1 co drugi dzień do kultur.
  4. Aby określić kinetykę progresji miogennej, przeanalizuj uMSC pod kątem ekspresji Pax7, MyoD, Myogenin i MyHC odpowiednio po 2 dniach, 4-5 dniach, 6-7 dniach i 10-14 dniach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Sukces izolacji uMSC z tkanki pępowinowej wynosi >95%, w przeciwieństwie do słabych wskaźników sukcesu z krwi pępowinowej. Po pomyślnym wyizolowaniu uMSC, analiza FACS ujawnia, że wszystkie komórki to CD34>−CD45−CD105+CD90+. Jednak w analizie porównawczej uMSC wyizolowane z krwi pępowinowej wykazują niejednorodne populacje, w których część komórek wykazuje CD34 + CD45 + CD105 + (~15%). Dodatkowo, podwójnie dodatnie CD105 + CD90 ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kroki krytyczne
Kluczowym krokiem w tym protokole jest pobieranie tkanek w warunkach aseptycznych, od momentu dostarczenia do utrzymania sterylnych kultur, przez cały czas rozmnażania. Podczas pobierania pępowiny ważne jest, aby pępowina nie dotykała żadnej niewysterylizowanej powierzchni i była zewnętrznie przecierana 70% etanolem przed pobraniem do probówek zawierających PBS uzupełniony antybiotykami. Ważne jest, aby ograniczyć czas między pobraniem pępowiny a przetworzeniem tkanki w celu izolacji...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Panu Ojas Tikoo za pomoc w filmowaniu i produkcji wideo. Dziękujemy również za pomoc otrzymaną od personelu GARBH-Ini (Interdyscyplinarna Grupa ds. Zaawansowanych Badań i Wyników Porodu - DBT India), pielęgniarek i starszych pracowników naukowych w Szpitalu Cywilnym Gurugram oraz dr Pallavi Kshetrapal za pomoc w logistyce. Prace te zostały wsparte grantami przyznanymi Suchitrze Gopinath z Wydziału Biotechnologii w Indiach (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)Thermo Fisher ScientificD1306
Amfoterycyna BSigma AldrichA2411
Roztwór antybiotyku 100x Płyn, testowany pod kątem endotoksyn (10 000 U penicylina i 10 mg Streptomycyna / ml w 0,9% normalnej soli fizjologicznej)HiMediaA001A-50mL
Przeciwciało anty-GAPDHSigma AldrichG8795
Przeciwciało anty-MyHC (My32)Novus BiologicalsNBP2-50401AF647
Przeciwciało anty-MyoD (5.8A)Novus BiologicalsNB100-56511
Przeciwciało anty-miogeninowe (klon F5D)Novus BiologicalsNBP2-34616AF594
Przeciwciało anty-Pax7DSHBDSHB-C1-576
APC Mysz anty-ludzka klon CD90 5E10BD Biosciences559869
Kolagen typu 1MerckC8919
D (+) GlukozaSigma AldrichG7021
DeksametazonSIGMAD4902
FACSCanto II lub FACSAria IIIBD Biosciences
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana BrazyliaGIBCO10270106być inaktywowana termicznie
Mysz FITC anty-ludzka Klon CD106 51-10C9BD Biosciences551146
FITC Mysz anty-ludzka klon CD14 M5E2BD Biosciences557153
FITC Mysz anty-ludzki klon CD31 WM59BD Biosciences557508
FITC Mysz anty-ludzka klon CD34 581BD Biosciences555821
FITC Mysz anty-ludzka klon CD45 HI30BD Biosciences555482
Mysz FITC anty-ludzki klon CD49D 9F10BD Biosciences560840
FITC Mysz anty-ludzka klon CD90 5E10BD Biosciences555595
FITC Mysz anty-ludzki klon HLA-A,B,C G46-2.6BD Biosciences557348
FITC Mysz anty-ludzka klon IgG G18-145BD Biosciences555786
oprogramowanie FlowJoBD Biosciences
GentamycynaSigma AldrichG1264
Surowica dla koniHiMediaRM1239
HydrokortyzonMerckH4001
LamininMerckL2020
MEM Alfa Modyfikacja bez L-glutaminy, rybonukleozydów i dezoksyrybonukleozydówHyclonSH30568. FSPodłoże podstawowe dla uMSCs
PE Mysz anty-ludzka klon CD105 266BD Biosciences560839
PE Mysz antyludzka klon CD44 515BD Biosciences550989
PE Mysz antyludzka klon CD49E llA1BD Biosciences555617
PE Mysz anty-ludzka klon IgG G18-145BD Biosciences555787
PE-Cy7 Mysz anty-ludzka CD73 CLONE AD2BD Biosciences561258
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH = 7,4HiMediaM1866
Roztwór trypsyny/EDTA (1x 0,25% trypsyny i 0,02% EDTA w zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS)HiMediaTCL049-100mL
nie

Bibliografia

  1. Kuroda, Y., et al. Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).
  2. Troyer, D. L., Weiss, M. L. Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).
  3. Karahuseyinoglu, S., et al. Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys. Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).
  4. Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane. Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).
  5. Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
  6. Mishra, S., et al. Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood. Scientific Reports. 10 (1), 18978(2020).
  7. Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
  8. Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord. Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).
  9. Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).
  10. Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly. BioMed Research International. 2013, 428726(2013).
  11. Ishige, I., et al. Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton's jelly explants of human umbilical cord. International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).
  12. Chal, J., et al. Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy. Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

R nicowanie mi ni szkieletowychr nicowanie miogenicznecytometria przep ywowamarkery powierzchniowe kom rekekspresja CD105 CD90CD73ci ki a cuch miozynyprogenitory miogeniczne

Powiązane artykuły