Spektroskopia sił zespołowych za pomocą sił ścinających

Podsumowanie

Zespołowa spektroskopia sił (EFS) to solidna technika mechanicznego rozkładania i wykrywania w czasie rzeczywistym zestawu struktur biomolekularnych w polach biofizycznych i biosensorycznych.

Streszczenie

Techniki jednocząsteczkowe oparte na zasadach fluorescencji i mechanochemii zapewniają najwyższą czułość w wykrywaniu biologicznym. Jednak ze względu na brak możliwości wysokiej przepustowości zastosowanie tych technik jest ograniczone w biofizyce. Spektroskopia sił zespołowych (EFS) wykazała wysoką przepustowość w badaniu ogromnego zestawu struktur molekularnych poprzez przekształcenie badań mechanochemicznych pojedynczych cząsteczek w badania zespołów molekularnych. W tym protokole drugorzędowe struktury DNA (i-motify) zostały rozwinięte w przepływie ścinającym między wirnikiem a stojanem końcówki homogenizatora z szybkością ścinania do 77796/s. Wykazano wpływ natężenia przepływu i wielkości cząsteczek na siły ścinające doświadczane przez i-motif. Technika EFS ujawniła również powinowactwo wiązania między i-motifami DNA a ligandami. Ponadto zademonstrowaliśmy reakcję chemiczną kliknięcia, która może być wywołana przez siłę ścinającą (tj. chemia mechano-klik). Wyniki te określają skuteczność wykorzystania siły ścinającej do kontrolowania konformacji struktur molekularnych.

Wprowadzenie

W spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek¹ (SMFS), właściwości mechaniczne poszczególnych struktur molekularnych zostały zbadane za pomocą zaawansowanych instrumentów, takich jak mikroskop sił atomowych, pęseta optyczna i pęseta magnetyczna^2,3,4. Ograniczony przez ten sam wymóg kierunkowości cząsteczek w układach generujących/wykrywających siłę lub małe pole widzenia w pęsetach magnetycznych i miniaturowym mikroskopie siły wirówki (MCF)^5,6,7,8, tylko ograniczona liczba cząsteczek może być badana jednocześnie za pomocą SMFS. Niska przepustowość SMFS uniemożliwia jego szerokie zastosowanie w dziedzinie rozpoznawania molekularnego, co wymaga zaangażowania dużego zestawu cząsteczek.

Przepływ ścinający stanowi potencjalne rozwiązanie do przyłożenia sił do ogromnego zestawu molekuł⁹. W przypadku przepływu cieczy wewnątrz kanału, im bliżej powierzchni kanału, tym wolniejsze natężenie przepływu¹⁰. Taki gradient prędkości przepływu powoduje naprężenie ścinające, które jest równoległe do powierzchni granicznej. Gdy cząsteczka jest umieszczana w tym przepływie ścinającym, cząsteczka zmienia orientację tak, że jej długa oś wyrównuje się z kierunkiem przepływu, ponieważ siła tnąca jest przykładana do długiej osi¹¹. W wyniku tej reorientacji oczekuje się, że wszystkie cząsteczki tego samego typu (rozmiar i długość uchwytów) ustawią się w tym samym kierunku, doświadczając tej samej siły ścinającej.

Ta praca opisuje protokół użycia takiego przepływu ścinającego do wywierania siły ścinającej na masywny zestaw struktur molekularnych, czego przykładem jest motyw DNA i. W tym protokole generowany jest przepływ ścinający między wirnikiem a stojanem w końcówce homogenizatora. Niniejsze badanie wykazało, że pofałdowana struktura i-motif DNA może być rozwijana przez szybkość ścinania 9724-97245 s⁻¹. Poza tym stwierdzono stałą dysocjacji wynoszącą 36 μM między ligandem L2H2-4OTD a i-motif. Wartość ta jest zgodna z wartością 31 μM zmierzoną za pomocą testu przesunięcia żelu¹². Co więcej, obecna technika jest wykorzystywana do rozwijania motywu dwuteowego, który może wystawić chelatowaną miedź (I) w celu katalizowania reakcji kliknięcia. Protokół ten pozwala zatem na rozwinięcie dużego zestawu struktur i-motif za pomocą tanich instrumentów w rozsądnym czasie (krótszym niż 30 minut). Biorąc pod uwagę, że technika siły ścinającej drastycznie zwiększa przepustowość spektroskopii sił, nazywamy tę technikę zespołową spektroskopią sił (EFS). Protokół ten ma na celu dostarczenie wytycznych eksperymentalnych ułatwiających zastosowanie tego EFS opartego na sile ścinającej.

Protokół

UWAGA: Wszystkie bufory i odczynniki chemiczne użyte w tym protokole są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie mikroskopu sił ścinania

UWAGA: Mikroskop siły ścinania składa się z dwóch części: jednostki reakcyjnej (homogenizatora) oraz jednostki detekcyjnej (mikroskopu fluorescencyjnego). Powiększenie okularu wynosi 10x, a powiększenie obiektywu (powietrznego) wynosi 4x.

1. Zmontuj homogenizator i mikroskop na stole montażowym. Załóż okulary ochronne i włącz mikroskop fluorescencyjny, a następnie wyreguluj homogenizator, aby upewnić się, że wiązka światła wzbudzenia o odpowiedniej długości fali (w tym przypadku użyto 488 nm) przechodzi przez środek końcówki rozdrabniającej homogenizatora.
2. Przygotuj płaskodenną komorę reakcyjną o wysokości 5 cm i przekroju 1,5 cm² x 1,5 cm². Aby zminimalizować tło, upewnij się, że wybrany materiał komory nie wykazuje fluorescencji, np. szkło (niektóre tworzywa sztuczne fluorescują).
3. Wybierz odpowiednią końcówkę rozdrabniającą homogenizatora, która zapewni pożądaną siłę ścinania.
   UWAGA: Szybkość ścinania zależy od odległości między rotorem a statorem przy stałej prędkości obrotowej¹¹ zgodnie z poniższym równaniem:
   
   gdzie µ to lepkość dynamiczna wody w 20 °C; D to średnica wewnętrzna statora; d to średnica zewnętrzna rotora, a V to prędkość ścinania (rpm/s).
4. Zaciśnij komorę reakcyjną na stoliku przedmiotowym mikroskopu fluorescencyjnego, a następnie ustaw komorę tak, aby pomieściła końcówkę rozdrabniającą homogenizatora (Rycina 1). Upewnij się, że końcówka rozdrabniająca znajduje się nieco powyżej (~1 mm) dna komory reakcyjnej.
5. Wyreguluj wspólnie pionową pozycję homogenizatora i komory, aby upewnić się, że ostrość mikroskopu jest ustawiona na powierzchni końcówki rozdrabniającej. Następnie dostosuj poziomą pozycję końcówki rozdrabniającej tak, aby obszar detekcji (pole widzenia) znajdował się pomiędzy rotorem a statorem (Rycina 1).
6. Włącz kanały fluorescencji zgodnie z barwnikiem fluorescencyjnym użytym w eksperymencie.
7. Przed rozpoczęciem eksperymentu z szybkim ścinaniem, użyj wody zdejonizowanej (DI), aby przetestować proces przy niskiej prędkości ścinania (np. 2 000 rpm), w celu upewnienia się, że końcówka rozdrabniająca pracuje prawidłowo i nie dotyka komory reakcyjnej.

2. Rozwijanie i-motywów z ligandami i bez ligandów

1. Przygotować ludzkie telomerowe DNA i-motif (Tabela materiałów) w wodzie dejonizowanej (DI), odpowiednio znakowane barwnikiem i gasicielem na dwóch końcach, zgodnie z opisem w Hu et al.¹¹.
   UWAGA: sekwencja zawierająca i-motif: 5'-TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA.
2. Rozcieńczyć DNA do stężenia 5 µM w buforze MES 30 mM o pH 5.5 lub pH 7.4. Do roztworu DNA dodać ligand L2H2-4OTD, zsyntetyzowany według Abraham Punnoose et al.¹³, w zakresie stężeń 0-60 µM. Delikatnie mieszać roztwór przez 10 min w ciemności, aby umożliwić sfałdowanie struktur i-motif.
3. Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego sprawdzić i zminimalizować intensywność fluorescencji tła w komorze reakcyjnej wypełnionej dejonizowaną wodą DI, bez nakładania ścinania. Prostym sposobem na zminimalizowanie fluorescencji tła jest przemycie komory reakcyjnej wodą DI. Wartość fluorescencji tła musi zostać odjęta podczas późniejszej analizy danych.
   UWAGA: Od tego momentu należy unikać światła rozproszonego.
4. Ustawić parametry kamery CCD za pomocą oprogramowania. Zalecane parametry są następujące: czas ekspozycji = 0.5 s, czułość CCD = 1600 oraz czas rejestracji = 20 min.
5. Za pomocą długiej pipety wprowadzić roztwór DNA do pustej i czystej komory reakcyjnej. Przykryć komorę reakcyjną czarnym pudełkiem. Następnie uruchomić homogenizator, aby przeprowadzić ścinanie z wybraną szybkością ścinania w zakresie od 9 724 s⁻¹ do 97 245 s⁻¹ (wybranej za pomocą oprogramowania homogenizatora) przez 20 min, przy włączonej kamerze CCD w celu rejestracji danych.
6. Po zakończeniu eksperymentu wyjąć komorę i przemyć ją wodą DI.

3. Reakcja klik wyzwalana siłą ścinania

1. Przygotować i-motif DNA w wodziey destylowanej (DI). Inkubować 10 µM i-motif DNA w 300 µL buforu Tris 30 mM (pH 7,4) uzupełnionego o 150 µM CuCl oraz 300 µM kwasu askorbinowego przez 10 min w celu sfałdowania struktur i-motif (wszystkie stężenia są stężeniami końcowymi w roztworze).
   UWAGA: CuCl jest katalizatorem reakcji click. Kwas askorbinowy zapobiega utlenianiu miedzi (I).
2. Przefiltrować roztwór za pomocą urządzenia do ultrafiltracji przy sile odśrodkowej 14 300 x g. Po każdej filtracji uzupełnić objętość roztworu do ok. 500 µL za pomocą buforu Tris 30 mM (pH 7,4) uzupełnionego o 300 µM kwasu askorbinowego.
3. Powtórzyć filtrację 3 razy.
4. Zebrać pozostały roztwór i doprowadzić do końcowej objętości 300 µL, dodając Tris 30 mM (pH 7,4) uzupełniony o 300 µM kwasu askorbinowego wraz z 20 µM Calfluor 488 azide, 20 µM HPG oraz 10 µM TBTA. Po dodaniu odczynników przenieść roztwór do ciemni.
   UWAGA: Po tym kroku należy unikać ekspozycji na światło.
5. Przed eksperymentami z przeciąganiem sprawdzić i zminimalizować intensywność fluorescencji tła w komorze reakcyjnej wypełnionej wodą DI za pomocą mikroskopu. Prostym sposobem na zminimalizowanie fluorescencji tła jest przemycie komory reakcyjnej wodą DI.
6. Wprowadzić roztwór DNA do pustej komory reakcyjnej za pomocą długiej pipety, a następnie rozpocząć przeciąganie homogenizatorem przy szybkości ścinania 63 209 s⁻¹ przez 20 min przy włączonej kamerze CCD.
7. Po zakończeniu eksperymentu wyjąć komorę i przemyć ją wodą DI.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia mechaniczne rozwijanie i detekcję w czasie rzeczywistym zespołów cząsteczek w EFS. Na Rysunku 1B zaobserwowano, że intensywność fluorescencji DNA i-motywu wzrastała wraz z prędkością ścinania w zakresie od 9 724 s⁻¹ do 97 245 s⁻¹ w buforze MES o pH 5,5. Jako kontrolę przeprowadzono badanie, w którym intensywność fluorescencji nie wzrosła podczas ścinania tego samego DNA i-motywu z prędkością 63 209 s<...

Dyskusja

Protokół opisany w tym manuskrypcie pozwala na badanie w czasie rzeczywistym rozwijania się zestawu struktur biomolekularnych za pomocą siły ścinającej. Przedstawione wyniki podkreślają, że struktury i-motif DNA mogą być rozwijane za pomocą siły ścinającej. Rozwinięcie i-motifu związanego z ligandem i reakcje kliknięcia wywołane siłą ścinającą były dowodami koncepcji dla tej metody spektroskopii sił zespołowych.

Rysunek 1 przedstawia konfigurację instrumentu. Końc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
3K MWCO	Amicon Millipore Sigma	ufc900324
Kwas askorbinowy	VWR	VWRC0143-100G
Calfluor 488 azydek	Kliknij Narzędzia chemiczne	1369-1
CuCl	Thermo
Końcówka dyspersyjna	Szwajcaria	PT-DA07/2EC-B101
Oligonukleotydy DNA
Barwnik	IDT	/5Cy5
Mikroskop fluorescencyjny	Janpan	Nikon TE2000-U
Homogenizator	Szwajcaria	PT 3100D
HPG	Santa Cruz Biotechnology	CS-295271
KCl	VWR	VWRC26760.295
MES	VWR	VWRCE169-500G
Quencher	IDT	/3IAbRQSp/
TBTA	Tokyo Chemical Industry	T2993
Tris	VWR	VWRCE133-100G

ACRO270525000 IDT /