Spektroskopia sił zespołowych za pomocą sił ścinających

Summary

Zespołowa spektroskopia sił (EFS) to solidna technika mechanicznego rozkładania i wykrywania w czasie rzeczywistym zestawu struktur biomolekularnych w polach biofizycznych i biosensorycznych.

Abstract

Techniki jednocząsteczkowe oparte na zasadach fluorescencji i mechanochemii zapewniają najwyższą czułość w wykrywaniu biologicznym. Jednak ze względu na brak możliwości wysokiej przepustowości zastosowanie tych technik jest ograniczone w biofizyce. Spektroskopia sił zespołowych (EFS) wykazała wysoką przepustowość w badaniu ogromnego zestawu struktur molekularnych poprzez przekształcenie badań mechanochemicznych pojedynczych cząsteczek w badania zespołów molekularnych. W tym protokole drugorzędowe struktury DNA (i-motify) zostały rozwinięte w przepływie ścinającym między wirnikiem a stojanem końcówki homogenizatora z szybkością ścinania do 77796/s. Wykazano wpływ natężenia przepływu i wielkości cząsteczek na siły ścinające doświadczane przez i-motif. Technika EFS ujawniła również powinowactwo wiązania między i-motifami DNA a ligandami. Ponadto zademonstrowaliśmy reakcję chemiczną kliknięcia, która może być wywołana przez siłę ścinającą (tj. chemia mechano-klik). Wyniki te określają skuteczność wykorzystania siły ścinającej do kontrolowania konformacji struktur molekularnych.

Introduction

W spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek¹ (SMFS), właściwości mechaniczne poszczególnych struktur molekularnych zostały zbadane za pomocą zaawansowanych instrumentów, takich jak mikroskop sił atomowych, pęseta optyczna i pęseta magnetyczna^2,3,4. Ograniczony przez ten sam wymóg kierunkowości cząsteczek w układach generujących/wykrywających siłę lub małe pole widzenia w pęsetach magnetycznych i miniaturowym mikroskopie siły wirówki (MCF)^5,6,7,8, tylko ograniczona liczba cząsteczek może być badana jednocześnie za pomocą SMFS. Niska przepustowość SMFS uniemożliwia jego szerokie zastosowanie w dziedzinie rozpoznawania molekularnego, co wymaga zaangażowania dużego zestawu cząsteczek.

Przepływ ścinający stanowi potencjalne rozwiązanie do przyłożenia sił do ogromnego zestawu molekuł⁹. W przypadku przepływu cieczy wewnątrz kanału, im bliżej powierzchni kanału, tym wolniejsze natężenie przepływu¹⁰. Taki gradient prędkości przepływu powoduje naprężenie ścinające, które jest równoległe do powierzchni granicznej. Gdy cząsteczka jest umieszczana w tym przepływie ścinającym, cząsteczka zmienia orientację tak, że jej długa oś wyrównuje się z kierunkiem przepływu, ponieważ siła tnąca jest przykładana do długiej osi¹¹. W wyniku tej reorientacji oczekuje się, że wszystkie cząsteczki tego samego typu (rozmiar i długość uchwytów) ustawią się w tym samym kierunku, doświadczając tej samej siły ścinającej.

Ta praca opisuje protokół użycia takiego przepływu ścinającego do wywierania siły ścinającej na masywny zestaw struktur molekularnych, czego przykładem jest motyw DNA i. W tym protokole generowany jest przepływ ścinający między wirnikiem a stojanem w końcówce homogenizatora. Niniejsze badanie wykazało, że pofałdowana struktura i-motif DNA może być rozwijana przez szybkość ścinania 9724-97245 s⁻¹. Poza tym stwierdzono stałą dysocjacji wynoszącą 36 μM między ligandem L2H2-4OTD a i-motif. Wartość ta jest zgodna z wartością 31 μM zmierzoną za pomocą testu przesunięcia żelu¹². Co więcej, obecna technika jest wykorzystywana do rozwijania motywu dwuteowego, który może wystawić chelatowaną miedź (I) w celu katalizowania reakcji kliknięcia. Protokół ten pozwala zatem na rozwinięcie dużego zestawu struktur i-motif za pomocą tanich instrumentów w rozsądnym czasie (krótszym niż 30 minut). Biorąc pod uwagę, że technika siły ścinającej drastycznie zwiększa przepustowość spektroskopii sił, nazywamy tę technikę zespołową spektroskopią sił (EFS). Protokół ten ma na celu dostarczenie wytycznych eksperymentalnych ułatwiających zastosowanie tego EFS opartego na sile ścinającej.

Protocol

UWAGA: Wszystkie i odczynniki chemiczne użyte w tym protokole są wymienione w Materiałach Tabeli.

1. Przygotowanie mikroskopu siły ścinającej

UWAGA: Mikroskop siły ścinającej składa się z dwóch części, jednostki reakcji (homogenizatora) i jednostki detekcyjnej (mikroskopu fluorescencyjnego). Powiększenie okularu wynosi 10x, a powiększenie soczewki obiektywu (powietrza) 4x.

1. Zamontuj homogenizator i mikroskop na stole montażowym. Załóż gogle i włącz mikroskop fluorescencyjny, a następnie wyreguluj homogenizator tak, aby upewnić się, że wiązka światła wzbudzającego o odpowiedniej długości fali (tutaj zastosowano 488 nm) przechodzi przez środek końcówki dyspergującej homogenizatora.
2. Przygotować płaskodenną komorę reakcyjną o wysokości 5 cm i przekroju 1,5 cm,² x 1,5^cm2. Aby zredukować tło, upewnij się, że wybrany materiał komory nie fluoryzuje, np. okulary (niektóre tworzywa sztuczne mają fluorescencję).
3. Wybierz odpowiednią końcówkę dyspergującą homogenizatora, która może zapewnić pożądaną siłę ścinającą.
   UWAGA: Szybkość ścinania zależy od odległości między wirnikiem a stojanem przy stałej prędkości obrotowej¹¹ zgodnie z następującym równaniem:
   
   gdzie μ oznacza lepkość dynamiczną wody w temperaturze 20 °C; D jest średnicą wewnętrzną stojana; d to średnica zewnętrzna wirnika, a V to prędkość ścinania (obr./min/s).
4. Zacisnąć komorę reakcyjną na stoliku próbki mikroskopu fluorescencyjnego, a następnie wyregulować komorę tak, aby utrzymywała końcówkę dyspergującą homogenizatora (Rysunek 1). Upewnij się, że końcówka dyspergująca znajduje się nieco powyżej (~1 mm) dolnej powierzchni komory reakcyjnej.
5. Wyreguluj pionowe położenie homogenizatora i komory razem, aby upewnić się, że ostrość mikroskopu znajduje się na powierzchni końcówki dyspergującej. Następnie wyreguluj poziome położenie końcówki dyspergującej, aby upewnić się, że obszar wykrywania (pole view) jest ustawiony między wirnikiem a stojanem ( Rysunek 1).
6. Włącz kanały fluorescencyjne zgodnie z barwnikiem fluorescencyjnym użytym w eksperymencie.
7. Przed eksperymentem ze ścinaniem z dużą prędkością należy użyć wody dejonizowanej (DI) do przetestowania ścinania przy niskiej prędkości ścinania (np. 2,000 obr./min), aby upewnić się, że końcówka dyspergująca może działać prawidłowo bez dotykania komory reakcyjnej.

2. Rozwijanie i-motywów z ligandami i bez ligandów

1. Przygotuj ludzki telomerowy DNA z motywem dwuteowym (Tabela materiałów) znakowany barwnikiem i wygaszaczem na jego dwóch końcach, odpowiednio, w wodzie DI, zgodnie z opisem w Hu et al.¹¹.
   UWAGA: I-Motif zawierający sekwencję: 5'-TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA.
2. Rozcieńczyć DNA do 5 μM w buforze MES o pojemności 30 mM o pH 5,5 lub pH 7,4. Do roztworu DNA dodać ligand L2H2-4OTD, który został zsyntetyzowany zgodnie z Abraham Punnoose et al.¹³, w zakresie stężeń 0-60 μM. Delikatnie mieszaj roztwór przez 10 minut, aby złożyć struktury i-motif bez światła.
3. Sprawdź i zminimalizuj intensywność fluorescencji tła komory reakcyjnej, która jest wypełniona dejonizowaną wodą DI za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego bez ścinania. Łatwym sposobem na zminimalizowanie fluorescencji tła jest umycie komory reakcyjnej wodą DI. Wartość fluorescencji tła należy później odjąć w analizach danych.
   UWAGA: Począwszy od tego etapu, należy unikać światła rozproszonego.
4. Ustaw parametry kamery CCD za pomocą oprogramowania. Zalecane parametry to: czas naświetlania = 0,5 s, czułość CCD = 1600 i czas nagrywania = 20 min.
5. Za pomocą długiej pipety dodaj roztwór DNA do pustej i czystej komory reakcyjnej. Przykryj komorę reakcyjną czarną skrzynką. Następnie uruchom homogenizator, aby wykonać ścinanie z wybraną szybkością ścinania w zakresie od 9 724 s⁻¹ do 97 245 s⁻¹ (wybrane za pomocą oprogramowania powiązanego z homogenizatorem) przez 20 minut przy włączonej kamerze CCD w celu zarejestrowania danych.
6. Po eksperymencie wyjmij komorę i umyj ją wodą DI.

3. Reakcja na kliknięcie wywołana siłą ścinającą

1. Przygotuj i-motif DNA w wodzie DI. Inkubować 10 μM DNA z i-motif w 300 μL 30 mM buforu Tris (pH 7,4) uzupełnionego 150 μM CuCl i 300 μM kwasem askorbinowym przez 10 minut w celu złożenia struktur i-motif (wszystkie stężenia są stężeniami końcowymi w roztworze).
   UWAGA: CuCl jest katalizatorem reakcji kliknięcia. Kwas askorbinowy zapobiegnie utlenianiu miedzi (I).
2. Ultrafiltrować roztwór za pomocą urządzenia do ultrafiltracji przy sile odśrodkowej 14 300 x g. Uzupełnić roztwór do ~500 μL 30 mM buforem Tris (pH 7,4) uzupełnionym 300 μM kwasem askorbinowym po każdej filtracji.
3. Powtórz filtrację 3 razy.
4. Zebrać pozostały roztwór i uzyskać końcową objętość 300 μl, dodając 30 mM Tris (pH 7,4) uzupełnionego 300 μM kwasu askorbinowego wraz z 20 μM azydkiem Calfluoru 488, 20 μM HPG i 10 μM TBTA. Po dodaniu odczynników przenieś roztwór do ciemni.
   UWAGA: Po tym kroku należy unikać światła.
5. Przed eksperymentami ścinającymi należy sprawdzić i zminimalizować intensywność fluorescencji tła komory reakcyjnej wypełnionej wodą demineralizowaną. Łatwym sposobem na zminimalizowanie fluorescencji tła jest umycie komory reakcyjnej wodą DI.
6. Dodaj roztwór DNA do pustej komory reakcyjnej za pomocą długiej pipety, a następnie rozpocznij ścinanie homogenizatora z szybkością ścinania 63,209 s⁻¹ przez 20 minut przy włączonej kamerze CCD.
7. Po eksperymencie wyjmij komorę i umyj ją wodą DI.

Results

Rysunek 1 przedstawia mechaniczne rozwijanie i wykrywanie w czasie rzeczywistym cząsteczek zespołowych w EFS. W klasie Rysunek 1B, zaobserwowano, że intensywność fluorescencji DNA z motywem i-motif wzrasta wraz z szybkością ścinania w zakresie od 9,724 s⁻¹ do 97,245 s⁻¹ w buforze MES o pH 5,5. Jako kontrola, intensywność fluorescencji nie została zwiększona, gdy ten sam DNA motywu dwubiegunowego został ścięty z szybkością 63 209 ^s-...

Discussion

Protokół opisany w tym manuskrypcie pozwala na badanie w czasie rzeczywistym rozwijania się zestawu struktur biomolekularnych za pomocą siły ścinającej. Przedstawione wyniki podkreślają, że struktury i-motif DNA mogą być rozwijane za pomocą siły ścinającej. Rozwinięcie i-motifu związanego z ligandem i reakcje kliknięcia wywołane siłą ścinającą były dowodami koncepcji dla tej metody spektroskopii sił zespołowych.

Rysunek 1 przedstawia konfigurację instrumentu. Końc...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3K MWCO	Amicon Millipore Sigma	ufc900324
Kwas askorbinowy	VWR	VWRC0143-100G
Calfluor 488 azydek	Kliknij Narzędzia chemiczne	1369-1
CuCl	Thermo
Końcówka dyspersyjna	Szwajcaria	PT-DA07/2EC-B101
Oligonukleotydy DNA
Barwnik	IDT	/5Cy5
Mikroskop fluorescencyjny	Janpan	Nikon TE2000-U
Homogenizator	Szwajcaria	PT 3100D
HPG	Santa Cruz Biotechnology	CS-295271
KCl	VWR	VWRC26760.295
MES	VWR	VWRCE169-500G
Quencher	IDT	/3IAbRQSp/
TBTA	Tokyo Chemical Industry	T2993
Tris	VWR	VWRCE133-100G