Wysokorozdzielczy pomiar zachowań sterowanych węchem u larw Drosophila

Podsumowanie

W niniejszym artykule wideo opisujemy nową metodę umożliwiającą tworzenie gradientów substancji zapachowych o stabilnych i kontrolowalnych geometriach. Krótko ilustrujemy, w jaki sposób gradienty te mogą być wykorzystane do wykrywania wad węchu (całkowitej i częściowej anosmii) oraz do badania bardziej subtelnych cech zachowań chemotaktycznych.

Streszczenie

Reakcje węchowe u larw *Drosophila* były tradycyjnie badane w szalkach Petriego zawierających pojedyncze peryferyjne źródło zapachu. W tym paradygmacie behawioralnym badacz zazwyczaj zakłada, że szybka dyfuzja cząsteczek substancji zapachowej ze źródła prowadzi do powstania stabilnego gradientu w szalce. Aby ustanowić ilościową korelację między bodźcami sensorycznymi a odpowiedziami behawioralnymi, konieczna jest dokładniejsza charakterystyka warunków stymulacji zapachowej. W tym artykule wideo opisujemy nową metodę pozwalającą na tworzenie gradientów substancji zapachowych o stabilnej i kontrolowanej geometrii. Krótko ilustrujemy, w jaki sposób gradienty te mogą być wykorzystane do badania defektów węchowych (anosmii całkowitej i częściowej) oraz do analizy subtelniejszych cech zachowania chemotaktycznego.

Protokół

1. Sprzęt i odczynniki

Rozcieńczenia zapachów:

• Olej parafinowy (Sigma, numer CAS: 8012-95-1)
• Zapachy o najwyższej dostępnej czystości, które wywołują atrakcję u larw Drosophila¹. W niniejszym artykule wideo zwierzęta testowano z użyciem octanu izoamylu (Sigma, numer CAS: 123-92-2).
• Szklane fiolki o pojemności 1,5 ml z nakrętką teflonową (Agilent Technologies)
• Cyfrowa waga pomiarowa do precyzyjnego rozcieńczania wagowego

Przygotowanie areny testowej:

• Agaroza (Promega)
• Wieczka do mikropłytek 96-dołkowych (BD Falcon, numer katalogowy: 353071). Nasza arena behawioralna składa się z trzech ułożonych jeden na drugim wieczek.
• Jednokanałowa pipeta 1-20 μl lub pipeta wielokanałowa do nakładania kropli substancji zapachowej na górne wieczko stosu. Do przygotowania testu z wieloma źródłami używamy wielokanałowej pipety Pipet-Lite 5-50 μl firmy Rainin.

Przygotowanie larw Drosophila do testów behawioralnych:

• 15% (w/w) roztwór sacharozy
• Standardowe szalki Petriego (BD Falcon) do płukania i przechowywania larw
• Pędzel (długość włosia 4-5 mm) do manipulowania i przenoszenia larw

Rejestracja ruchu larw:

• Małe piny z płaską główką do przenoszenia larw do areny
• Pęseta lub pędzelek do usuwania larw po zakończeniu pomiaru
• Podświetlany stół z jednorodnym, niedogrzewającym źródłem światła, podświetlacz „Slim Edge” firmy Logan Electric
• Obudowa do otoczenia areny behawioralnej i kontroli warunków oświetlenia
• System śledzenia wideo do rejestracji ruchu zwierząt. Stosujemy oprogramowanie Ethovision (Noldus, Holandia).
• Kamera CCD i karta przechwytywania obrazu (EureCard Piccolo Basic) zakupiona wraz z oprogramowaniem Ethovision
• Termometr i rejestrator wilgotności do monitorowania warunków atmosferycznych podczas testów behawioralnych (opcjonalnie)
• Matlab (The Mathworks) do spersonalizowanej analizy danych (opcjonalnie)

2. Arena behawioralna

Arena behawioralna składa się z trzech ułożonych jedna na drugiej pokrywek od płytek 96-dołkowych. Dolna pokrywka służy do odizolowania reszty układu od podkładki świetlnej i ograniczenia konwekcji w arenie. Druga pokrywka, pokryta 25ml 3% żelu agarozowego, służy jako podłoże, po którym poruszają się larwy. Górna pokrywka utrzymuje krople zapachowe, które pozostają zawieszone dzięki napięciu powierzchniowemu.

Krople substancji zapachowych są pipetowane bezpośrednio do studzienek pokrywy płytki 96-dołkowej. Do generowania gradientów o wyraźnych, weryfikowalnych profilach można użyć pojedynczego lub wielu źródeł zapachu². Aby przetestować występowanie anosmii oraz defektów chemotaksji u larw, proponujemy zastosowanie następujących dwóch testów.

2.1. Test z pojedynczym źródłem zapachu: pojedyncza kropla zapachu umieszczona w dołku #E7 (standardowy system referencyjny dla płytek 96-dołkowych).

• Bodziec: 10µl zapachu rozcieńczonego w oleju parafinowym
• Warunki początkowe: pojedyncza larwa zostaje umieszczona pod źródłem zapachu (lub w jego bezpośrednim sąsiedztwie).
• Podstawowe obserwacje: W przypadku bodźców atrakcyjnych (np. octanu izopentylu), larwy typu dzikiego gromadzą się pod źródłem. Zwierzęta anosmiczne lub zwierzęta z defektami węchu szybko oddalają się od kropli.
• Czas trwania próby: 3 min. Ruch danego zwierzęcia jest rejestrowany do momentu upływu czasu próby lub do chwili, gdy zwierzę dotknie ścianki płytki.
• Możliwe wskaźniki do kwantyfikacji behawioralnej: procent czasu spędzonego przez zwierzę w małej strefie okrągłej z centrum w źródle zapachu; średnia odległość od źródła zapachu; przebieg czasowy odległości od źródła zapachu itp.

Ten test pozwala na efektywne badanie podstawowej anosmii u zmutowanych larw. Może być on również wykorzystany do wiarygodnego określenia progu detekcji dla konkretnych zapachów².

2.2. Analiza wielu źródeł zapachowych

W studzienkach górnej pokrywy umieszczono kilka kropel substancji zapachowych. W niniejszym artykule wideo tworzymy gradienty wzdłuż środkowego rzędu E. Łącznie sześć kropel wprowadzono do studzienek nr #E2, #E4, #E6, #E8, #E10 oraz #E12 (zgodnie ze standardowym systemem referencyjnym dla płytek 96-dołkowych). W przeciwieństwie do testów w szalkach Petriego i z pojedynczym źródłem zapachu, analiza z wieloma źródłami zapachowymi umożliwia jakościową kontrolę geometrii gradientu ustanowionego wzdłuż długości i szerokości areny. Analizę tę wykorzystano do scharakteryzowania mechanizmów sensorycznych umożliwiających chemotaksję² larw Drosophila.

• Bodziec: 10μl kropli zapachu naniesiono naprzemiennie w studzienkach wzdłuż rzędu. Taki układ prowadzi do powstania gradientu skoncentrowanego w wybranym rzędzie. Aby ustanowić jednorodny gradient w poprzek areny, można napełnić kilka rzędów wieloma źródłami.
• Warunki początkowe: pojedyncza larwa zostaje wprowadzona pod źródło zapachu pomiędzy studzienkami nr E3 i nr E4.
• Podstawowe fenotypy: larwy anosmiczne wędrują losowo z punktu startowego. W przypadku bodźców atrakcyjnych (np. octanu izoamylu) osobniki zdolne do węchania nawigują w kierunku rosnącego stężenia zapachu. Dokładność, z jaką zwierzę podąża śladem zapachowym, koreluje z jego zdolnością do wykrywania i przetwarzania bodźca zapachowego. Kręte ścieżki są często spowodowane defektami sensorycznymi. Po dotarciu zwierzęcia do punktu o najwyższym stężeniu w próbie, pozostaje ono w pobliżu tej pozycji.
• Czas trwania próby: maksymalnie 3 min (dłuższy czas śledzenia ma tendencję do wprowadzania szumu, ponieważ larwy tracą zainteresowanie i ostatecznie opuszczają gradient). Dla gradientów przedstawionych w tym artykule wideo ruch pojedynczej larwy rejestrowano do momentu, aż zwierzę dotarło do sąsiedztwa źródła o najwyższym stężeniu (studzienka nr E12). Rejestrację przerwano w momencie, gdy zwierzę dotarło do obszaru docelowego lub zetknęło się z jakąkolwiek ścianą areny.
• Możliwe wskaźniki do kwantyfikacji behawioralnej: procent czasu spędzonego przez zwierzę pod linią zapachową (niebieski prostokąt); średni kierunek względem lokalnego kierunku gradientu zapachowego; łączny wskaźnik chemotaksji mierzący globalną tendencję zwierzęcia do podążania wzdłuż linii zapachowej².

3. Weryfikacja profilu gradientu

Przed testowaniem larw w konkretnym gradiencie ważne jest określenie jego stabilności w czasie. Na tej podstawie badacz może ustalić odpowiedni czas trwania każdej próby oraz liczbę larw, które można śledzić sekwencyjnie w tej samej arenie. Aby przetestować stabilność gradientu, opracowaliśmy metodę opartą na spektroskopii IR². Metoda ta wykracza poza zakres niniejszego protokołu i nie będzie dalej omawiana.

4. Protokół przygotowania eksperymentu

4.1. Przygotowanie płyty agarowej i rozcieńczeń zapachu:

1. 1. Wlej 25 ml 3% agarozy na płaską górną powierzchnię pokrywki płytki 96-dołkowej; odstaw agarozę do ochłonięcia i zastygnięcia (~ 30 min).
   
   Ważne: Przed wylaniem agarozy upewnij się, że pokrywki płytki 96-dołkowej znajdują się na płaskiej powierzchni, ponieważ nachylenie zastygłego żelu agarozowego może wpłynąć na zachowanie larw. Podczas wylewania żelu usuń wszelkie pęcherzyki powietrza tworzące się na powierzchni.
   
   
2. 2. Rozcieńcz zapachy do pożądanych stężeń w oleju parafinowym, używając wagi cyfrowej do dokładnego odmierzenia ilości oleju parafinowego i zapachu w każdym rozcieńczeniu.

Uwagi: W przypadku stosowania niskich stężeń substancji zapachowych zaleca się przygotowanie serii stężeń roztworów macierzystych metodą rozcieńczeń seryjnych. Należy zacząć, na przykład, od roztworu 1,0M i wykonać rozcieńczenie 1:2, aby otrzymać roztwór 0,5M. Poprzez powtarzanie tej procedury otrzymuje się szereg rozcieńczeń zgodnie z progresją geometryczną: 1,0M, 0,5M, 0,25M, 0,12M, 0,06M, 0,03M, 0,015M.

Ważne: Ponieważ wiele zapachów organicznych wchodzi w reakcję z tworzywami sztucznymi, rozcieńczenia zapachów należy przechowywać w szklanych fiolkach z zakrętkami teflonowymi. Idealnie byłoby przygotowywać zapachy na świeżo przed każdym eksperymentem, aby zminimalizować wahania rzeczywistego stężenia zapachu pomiędzy poszczególnymi badaniami. Jest to szczególnie istotne w przypadku stosowania substancji o wysokiej prątności.

4.2. Przygotowanie larw:

1. 1. Przygotować 15% roztwór sacharozy w wodzie destylowanej.
   
   Uwagi: Roztwór sacharozy o stężeniu 15% jest gęstszy od larw, co powoduje ich wypływanie na powierzchnię roztworu. Jednak nierozpuszczone grudki pożywki dla muszek mają większą gęstość niż roztwór i szybko opadają na dno. Zatem zastosowanie tego roztworu sacharozy stanowi wydajny sposób oddzielenia larw od pożywki. Roztwór sacharozy jest doskonałym medium dla zanieczyszczeń biologicznych; jeśli roztwór stanie się mętny, można go wysterylizować poprzez filtrowanie w celu usunięcia zanieczyszczeń.
   
   
2. Pobrać fiolkę z 6-dniowymi larwami lub larwami na pożądanym etapie rozwoju.
   
   Uwagi: Wszystkie nasze eksperymenty są przeprowadzane na 6-dniowych larwach (środek trzeciego stadium larwalnego); larwy na tym etapie rozwoju są wystarczająco duże, aby łatwo wykrywać je za pomocą naszego oprogramowania do śledzenia, a jednocześnie są bardzo aktywne.
   
   
3. Wlać sacharozę do fiolki z pożywką zawierającą larwy.
4. Za pomocą szpatułki delikatnie rozbić i rozpuścić pożywkę dla muszek, aby uwolnić larwy. Uwolnione larwy wypłyną na powierzchnię.
5. Odczekać kilka minut, aż grudki pożywki opadną na dno fiolki; następnie przelać sacharozę z larwami do szalki Petriego. Jeśli konieczna jest wstępna selekcja larw, zwierzęta można zebrać, przelewając sacharozę przez filtr. Następnie larwy można przenieść do naczynia w celu selekcji za pomocą pędzla.
6. Pozostawić larwy przez około 30 minut w roztworze sacharozy przed przystąpieniem do testów behawioralnych, aby zwierzęta mogły przyzwyczaić się do roztworu sacharozy. Ponieważ larwy nie wydają się żywić sacharozą, zwierzęta znajdą się w stanie głodu, co poprawia wyniki chemotaksji.
7. Pokrywkę szalki Petriego można napełnić wodą (lub sacharozą) i wykorzystać jako pojemnik na zwierzęta odrzucone po testach behawioralnych.

5. Protokół przeprowadzania rejestracji behawioralnych

5.1. Przygotowanie areny:

1. 1. Nanieś krople substancji zapachowej na spodnią stronę (stronę z wgłębieniami) nowej pokrywki płytki 96-dołkowej.
   
   Ważne: Aby uniknąć kontaminacji różnymi zapachami i ich stężeniami, dla każdego zestawu do ładowania należy użyć nowej pokrywki. Żadna z pokrywek zawierających źródła zapachu nie jest ponownie wykorzystywana po zakończeniu eksperymentu. W zależności od zastosowanego zakresu stężeń zapachowych stwierdzono, że gradienty substancji zapachowych są stabilne w systemie zamkniętym jedynie przez 10 do 20 minut. Dlatego ważne jest zminimalizowanie czasu pomiędzy przygotowaniem gradientu a faktycznym rozpoczęciem testu behawioralnego.
   
   
2. Odwróć pokrywkę i ustaw ją nad drugą pokrywką pokrytą 3% warstwą agarozy.
   
   Ważne: Odwróć pokrywkę ostrożnie, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się kropli substancji zapachowej do sąsiednich dołków.
   
   
3. Po odwróceniu górnej pokrywki na powierzchni agarozy odczekaj 30 sekund, aby zapach mógł się rozprzestrzenić przed wprowadzeniem larwy.

5.2. Ładowanie larw:

1. Podnieś górną pokrywkę zawierającą krople substancji zapachowej na tyle, aby umożliwić wprowadzenie larwy.
2. Przenieś larwę z roztworu sacharozy na warstwę agarozy. Pozycja startowa zwierzęcia zależy od stosowanego testu:
   
   W przypadku testu z pojedynczym źródłem zapachu larwy są uwalniane pod kroplą substancji zapachowej.
   
   W przypadku testu z wieloma źródłami zapachu larwy są uwalniane pomiędzy studzienkami #E3 i #E4.
   
   Ważne: Orientuj nowo wprowadzone zwierzęta w jednolity sposób. My orientujemy zwierzęta w kierunku gradientu, dbając o to, aby ciało i głowa zwierzęcia były zwrócone w stronę najwyższego stężenia. Zwierzęta wprowadzone w orientacji przeciwnej do gradientu wykazują zachowanie poszukiwawcze. Naszym zdaniem ten początkowy okres poszukiwań stanowi niepotrzebne źródło szumu. Kontrola orientacji głowy zmniejsza liczbę zwierząt, które podczas zachowań eksploracyjnych kontaktują się ze ścianą areny. Praktyka ta nie narzuca kierunku ruchu zwierzęcia ani nie zwiększa znacząco liczby zwierząt anosmicznych, które przypadkowo wykonują chemotaksję wzdłuż linii zapachu (tzn. wyniki fałszywie dodatnie w testach węchowych).
   
   
3. Załóż górną pokrywkę i bezzwłocznie rozpocznij nagrywanie.
   
   Uwagi: Zdrowe larwy zaczynają pełznąć natychmiast po wprowadzeniu do areny i mogą pokonać dystans 1cm w ciągu pierwszych 10 sekund. Jeśli eksperymentator będzie zwlekał z rozpoczęciem nagrywania, początkowe punkty danych zostaną utracone. Z tego powodu zalecamy, aby eksperymentator dobrze zapoznał się z poleceniami oprogramowania do uruchamiania nagrywania przed przystąpieniem do eksperymentu.
   
   
4. Pozostaw larwę w stanie swobodnego zachowania przez czas trwania nagrania (zazwyczaj 3 minuty).
   
   Uwagi: Nagrania są przerywane przed upływem 3 min, jeśli larwa uderzy w ścianę areny lub dotrze do obszaru docelowego (np. w teście gradientowym).
   
5. Po zakończeniu nagrywania bezzwłocznie podnieś pokrywkę i usuń larwę za pomocą pęsety lub pędzla. Umieść śledzone zwierzęta w pokrywce szalki Petri zawierającej wodę (lub sacharozę).
   
   Ważne: Nagrane zwierzęta nie są wykorzystywane ponownie. Naczynie z wodą służy jedynie jako wygodny pojemnik do oddzielenia zwierząt nagranych od nienagranych podczas przeprowadzania eksperymentów.
   
6. W przypadku śledzenia wielu zwierząt w jednej konfiguracji areny, bezzwłocznie wprowadź kolejną larwę i rozpocznij nagrywanie w opisany powyżej sposób.
   
   Ważne: Liczba prób przeprowadzonych w tej samej konfiguracji areny powinna być ustalona na podstawie stabilności gradientu, którą należy zweryfikować przed wykonaniem jakiegokolwiek eksperymentu behawioralnego².
   
7. Gdy wszystkie larwy przeznaczone do testów w danej konfiguracji areny zostaną śledzone i usunięte z areny, wyrzuć górną pokrywkę oraz warstwę agarozy. Pokrywka pośrednia (tzn. pokrywka na agarozę) może zostać wykorzystana ponownie.
   
   Uwaga: Zalecamy użytkownikom programu Ethovision wybór metody detekcji „background subtraction” (odejmowanie tła).

6. Przykładowe eksperymenty zaprezentowane w artykule wideo

6.1. Analiza pojedynczego źródła zapachu z użyciem 1,0M octanu izoamylu.

Przeprowadziliśmy ślepą próbę z udziałem dziesięciu mutantów Or83b-/- oraz dziesięciu larw typu dzikiego (W1118), z których każda otrzymała przypisany numer. Osoba odpowiedzialna za śledzenie nie otrzymała żadnych informacji o genotypie poszczególnych zwierząt. Po każdym nagraniu każdemu badanemu zwierzęciu przypisano przewidywany fenotyp: „wyczuwające”, jeśli przez cały czas trwania próby obserwowano gromadzenie się pod źródłem zapachu; „niewyczuwające”, jeśli ścieżka szybko oddalała się od obszaru źródła zapachu. Po zarejestrowaniu zachowania 20 zwierząt ścieżki pogrupowano zgodnie z fenotypem. Wynik tego grupowania porównano następnie z rzeczywistym genotypem larw: stwierdzono, że wszystkie przypisania były poprawne.

6.2. Test z wieloma źródłami zapachu z wykorzystaniem gradientów wykładniczych i liniowych octanu izoamylu.

W tym doświadczeniu porównano sprawność chemotaksji larw typu dzikiego wzdłuż gradientu liniowego i wykładniczego. Zachowania chemotaktyczne rejestrowano dla dwóch gradientów o tej samej najwyższej koncentracji wynoszącej 0,5M. Jak wyjaśniono w artykule, źródła zapachu w gradiencie wykładniczym miały stężenia od 0,015 do 0,5M. Źródła gradientu liniowego miały stężenia od 0,25 do 0,5M (progresja arytmetyczna z różnicą 0,05M).

Gradient liniowy stanowił bardziej wymagające środowisko chemotaktyczne, ponieważ lokalna różnica w stężeniu była stała i stosunkowo niewielka, a zakres stężeń był wąski (0.25M). W przeciwieństwie do niego, zakres stężeń w gradiencie wykładniczym był większy, z rosnącymi lokalnymi różnicami stężeń wzdłuż ścieżki.

Zarejestrowano piętnaście larw dla każdego z dwóch wariantów geometrii gradientu, a ich ścieżki naniesiono na jeden wykres. Wizualna analiza obu wykresów wykazuje, że larwy typu dzikiego były w stanie niezawodnie przemieszczać się w górę gradientu w obu geometriach, jednak stopień meandrowania był większy w przypadku gradientu liniowego. Sugeruje to, że sygnał obecny wzdłuż gradientu jest wykrywany bardziej niezawodnie dla kształtu wykładniczego niż liniowego.

6.3. Analiza wielu źródeł zapachowych z gradientem octanu izoamylu w geometrii typu „dach”.

W niniejszym doświadczeniu weryfikujemy, czy larwy wprowadzone w gradient zapachowy wykazują wrażliwość na lokalne zmiany stężenia zapachu, a nie tylko na samą obecność lub brak zapachu. Gradient izoamylu utworzono poprzez aplikację kropli zapachowych o następujących stężeniach: 0.06, 0.12, 0.25, 0.5, 0.25, 0.12M. Powstała geometria gradientu przypominała asymetryczny „dach” z szczytem przy 0.5M.

Larwy wypuszczono pomiędzy kroplami zapachu o stężeniach 0,06M i 0,12M. Nasza hipoteza zakładała, że jeśli larwy jedynie obliczałyby obecność zapachu, podążałyby wzdłuż całego gradientu bez szczególnych preferencji dla maksymalnego stężenia. W przeciwieństwie do tego, gdyby larwy były wrażliwe na lokalne zmiany stężenia, gromadziłyby się pod kroplą 0,5M. Zapisano zachowanie piętnastu larw i stwierdzono, że po krótkim okresie eksploracyjnym wszystkie larwy zgromadziły się pod dołkiem o wyższym stężeniu. Sugeruje to, że lokalne zmiany stężenia zapachu są obliczane i wpływają na zachowanie chemotaktyczne larw Drosophila.