Pomiar wysokiej rozdzielczości zachowania wywołanego zapachem u larw Drosophila

Podsumowanie

W tym artykule wideo opisujemy nową metodę pozwalającą na konstruowanie gradientów zapachowych o stabilnych i kontrolowanych geometriach. Pokrótce ilustrujemy, w jaki sposób te gradienty można wykorzystać do badań przesiewowych pod kątem wad węchowych (pełna i częściowa anosmia) oraz do badania bardziej subtelnych cech zachowania chemotaksji.

Streszczenie

Reakcje węchowe larw Drosophila były tradycyjnie badane na szalkach Petriego zawierających pojedyncze obwodowe źródło zapachu. W tym paradygmacie behawioralnym eksperymentator zwykle zakłada, że szybka dyfuzja cząsteczek odorantu ze źródła prowadzi do powstania stabilnego gradientu w naczyniu. Aby ustalić ilościową korelację między bodźcami sensorycznymi a reakcjami behawioralnymi, konieczne jest osiągnięcie dokładniejszej charakterystyki warunków bodźca zapachowego. W tym artykule wideo opisujemy nową metodę pozwalającą na konstruowanie gradientów zapachowych o stabilnych i kontrolowanych geometriach. Pokrótce ilustrujemy, w jaki sposób te gradienty można wykorzystać do badań przesiewowych pod kątem wad węchowych (pełna i częściowa anosmia) oraz do badania bardziej subtelnych cech zachowania chemotaksji.

Protokół

1. Sprzęt i odczynniki

Rozcieńczenia zapachu:

• Olej parafinowy (Sigma, numer CAS: 8012-95-1)
• Zapachy o najwyższej dostępnej czystości, które wywołują atrakcję u larw Drosophila¹. W tym artykule wideo zwierzęta zostały przetestowane z octanem izoamylu (Sigma, numer CAS: 123-92-2).
• Fiolki szklane 1,5 ml z teflonową nakrętką (Agilent Technologies)
• Cyfrowa waga pomiarowa do precyzyjnego rozcieńczania wagowo

Konfiguracja areny testowej:

• Agaroza (Promega)
• Pokrywki z 96-dołkowej mikropłytki (BD Falcon, numer katalogowy: 353071). Nasza arena behawioralna składa się z trzech ułożonych w stos pokryw.
• Jednokanałowy pipeter o pojemności 1–20 μl lub pipeter wielokanałowy do ładowania kropelek nawaniacza do górnej pokrywy stosu. Do skonfigurowania testu wieloźródłowego używamy wielokanałowego pipetera Pipet-Lite o pojemności 5–50 μl firmy Rainin.

Przygotowanie larw Drosophila do testów behawioralnych:

• 15% (m/m) roztwór sacharozy
• Zwykłe szalki Petriego (BD Falcon) do mycia i przechowywania larw
• Pędzel (długość włosia 4-5 mm) do manipulowania i przenoszenia larw

Rejestracja ruchu larw:

• Małe szpilki z płaską główką do przenoszenia larw na arenę
• Kleszcze lub pędzel do usuwania larw po nagraniu
• Podświetlana scena z jednorodnym, nienagrzewającym się źródłem światła, Light Pad "Slim Edge" wyprodukowanym przez Logan Electric
• Szafka otaczająca arenę behawioralną i kontrolująca warunki oświetleniowe
• System śledzenia wideo do rejestrowania ruchu zwierząt. Korzystamy z oprogramowania Ethovision (Noldus, Holandia).
• Kamera CCD i karta graficzna frame grabber (EureCard Piccolo Basic) zakupione z oprogramowaniem Ethovision
• Termometr i rejestrator wilgotności do monitorowania warunków atmosferycznych podczas testów behawioralnych (opcjonalnie)
• Matlab (The Mathworks) do niestandardowej analizy danych (opcjonalnie)

2. Arena behawioralna

Arena behawioralna składa się z trzech ułożonych w stos 96-dołkowych pokrywek na naczynia. Dolna pokrywa służy do odizolowania reszty systemu od podkładki świetlnej i zmniejszenia konwekcji na arenie. Druga pokrywka, pokryta 25 ml 3% żelu agarozowego, służy jako scena, po której larwy mogą chodzić. Górna pokrywa utrzymuje kropelki zapachu, które pozostają zawieszone przez napięcie powierzchniowe.

Kropelki zapachu są pipetowane bezpośrednio do studzienek pokrywy naczynia 96-dołkowego. Jedno lub wiele źródeł zapachów może być używanych do generowania gradientów o różnych, weryfikowalnych profilach². Aby przetestować wady anosmii i chemotaksji u larw, proponujemy użycie następujących dwóch testów.

2.1. Test pojedynczego źródła zapachu: pojedyncza kropla zapachu ułożona w #E7 studni (standardowy system odniesienia płytki 96-dołkowej).

• Bodziec: 10 μl zapachu rozcieńczonego w oleju parafinowym
• Warunki początkowe: pojedyncza larwa jest wprowadzana pod źródło zapachu (lub w jego bliskim sąsiedztwie).
• Podstawowe obserwacje: W przypadku atrakcyjnych bodźców (np. octanu izoamylu) larwy typu dzikiego gromadzą się pod źródłem. Zwierzęta anosmiczne lub zwierzęta narażone na wady węchu szybko oddalają się od kropli.
• Czas trwania próby: 3 min. Ruch danego zwierzęcia jest rejestrowany do momentu upływu czasu próby lub gdy tylko zwierzę zetknie się ze ścianką płytki.
• Możliwe wskaźniki kwantyfikacji behawioralnej: procent czasu spędzonego przez zwierzę w małej okrągłej strefie wyśrodkowanej na źródle zapachu, średnia odległość do źródła zapachu, przebieg czasu odległości do źródła zapachu itp.

Ten test skutecznie testuje podstawową anosmię u zmutowanych larw. Może być również używany do niezawodnego określania progu wykrywania dla poszczególnych zapachów².

2.2. Test wielu źródeł zapachów

Kilka kropel zapachu znajduje się w studzience górnej pokrywy. W tym artykule wideo ustawiamy gradienty wzdłuż środkowego rzędu E. W sumie sześć kropel wprowadzono do studzienek #E2, #E4, #E6, #E8, #E10 i #E12 (standardowy system odniesienia płytek 96-dołkowych). W przeciwieństwie do testów na szalce Petriego i pojedynczych źródłach zapachów, test z wieloma źródłami zapachów umożliwia jakościową kontrolę geometrii gradientu ustalonej wzdłuż i szerokości areny. Test ten wykorzystano do scharakteryzowania mechanizmów czuciowych umożliwiających larwom Drosophila chemotaksję².

• Bodziec: 10 μl kropelek zapachu układa się w naprzemiennych studzienkach wzdłuż rzędu. Taki układ prowadzi do utworzenia wybranego wiersza wyśrodkowanego na środku gradientu. Aby uzyskać jednorodny gradient wzdłuż szerokości areny, można załadować kilka rzędów z wieloma źródłami.
• Warunki początkowe: pojedyncza larwa jest wprowadzana pod źródło zapachu między studzienkami #E3 i #E4.
• Podstawowe fenotypy: larwy anosmiczne wędrują losowo od punktu początkowego. W celu uzyskania atrakcyjnych bodźców (np. octanu izoamylu) zwierzęta, które są w stanie wyczuć zapach, poruszają się w kierunku zwiększania stężenia zapachu. Precyzja, z jaką zwierzę wspina się po śladzie zapachowym, jest skorelowana z jego zdolnością do wyczuwania i przetwarzania bodźca zapachowego. Kręte ścieżki są często spowodowane wadami sensorycznymi. Gdy zwierzę osiągnie punkt najwyższego stężenia w badaniu, pozostaje w pobliżu tej pozycji.
• Czas trwania próby: maksymalnie 3 minuty (dłuższy czas śledzenia ma tendencję do wprowadzania szumu, gdy larwy tracą zainteresowanie i ostatecznie porzucają gradient). W przypadku gradientów zilustrowanych w tym artykule wideo, ruch pojedynczej larwy był rejestrowany do momentu, gdy zwierzę dotarło do sąsiedztwa źródła najwyższego stężenia (dobrze #E12). Nagrywanie było przerywane, gdy tylko zwierzę dotarło do obszaru docelowego lub zetknęło się z jakąkolwiek ścianą areny.
• Możliwe wskaźniki kwantyfikacji behawioralnej: procent czasu spędzonego przez zwierzę pod linią nawaniacza (niebieski prostokąt); średni kierunek w odniesieniu do lokalnego kierunku gradientu zapachu; połączony wynik chemotaksji mierzący globalną tendencję zwierzęcia do podążania za linią nawaniacza².

3. Weryfikacja profilu gradientu

Przed przetestowaniem larw w określonym gradiencie, ważne jest określenie jego stabilności w czasie. Na tej podstawie eksperymentator może określić odpowiedni czas trwania każdej próby i liczbę larw, które można śledzić sekwencyjnie na tym samym obszarze. Aby przetestować stabilność gradientu, opracowaliśmy metodę opartą na spektroskopii IR². Metoda ta wykracza poza zakres tego protokołu i nie będzie dalej rozwijana.

4. Protokół przygotowania eksperymentu

4.1. Przygotowanie płytki agarozowej i rozcieńczenia zapachu:

1. 1. Wlej 25 ml 3% agarozy na płaską wierzch 96-dołkowej pokrywki naczynia; pozwól agarozie ostygnąć i zestalać się (~ 30 min).
   
   Ważne: Upewnij się, że pokrywki 96-dołkowe znajdują się na płaskiej powierzchni przed wlaniem agarozy, ponieważ obecność nachylenia na zestalonym żelu agarozowym może wpływać na zachowanie larw. Podczas nalewania żelu usuń wszelkie pęcherzyki, które tworzą się na powierzchni.
   
   
2. 2. Rozcieńczyć zapachy do pożądanych stężeń w oleju parafinowym za pomocą wagi cyfrowej, aby dokładnie zmierzyć ilości oleju parafinowego i zapach w każdym rozcieńczeniu.

Uwagi: Gdy używane są niskie stężenia zapachu, lepiej jest przygotować zestaw stężeń źródłowych na podstawie seryjnych rozcieńczeń. Zacznij na przykład od roztworu 1,0 M i wykonaj rozcieńczenie 1:2, aby uzyskać roztwór 0,5 M. Postępując cyklicznie, otrzymuje się szereg rozcieńczeń zgodnie z postępem geometrycznym 1,0 M, 0,5 M, 0,25 M, 0,12 M, 0,06 M, 0,03 M, 0,015 M.

Ważne: Ponieważ wiele organicznych zapachów reaguje z plastikiem, rozcieńczenia zapachów muszą być przechowywane w szklanych fiolkach z teflonowymi nakrętkami. Idealnie, zapachy powinny być przygotowywane świeże przed każdym eksperymentem, aby zmniejszyć wahania rzeczywistego stężenia zapachu między eksperymentami. Jest to szczególnie ważne w przypadku stosowania wysoce lotnych chemikaliów.

4.2. Przygotowanie larw:

1. 1. Przygotuj 15% roztwór sacharozy w wodzie destylowanej.
   
   Uwagi: 15% roztwór sacharozy jest gęstszy niż larwy i spowoduje, że zostaną one wyrzucone na powierzchnię roztworu. Jednak nierozpuszczone kawałki pokarmu dla much mają większą gęstość niż roztwór i szybko opadają na dno. Tak więc stosowanie tego roztworu sacharozy zapewnia skuteczny sposób oddzielania larw od pokarmu. Roztwór sacharozy jest doskonałym podłożem dla zanieczyszczeń biologicznych, jeśli roztwór stanie się mętny, można go wysterylizować filtrem w celu usunięcia zanieczyszczenia.
   
   
2. Zaopatrzyć się w fiolkę z 6-dniowymi larwami lub larwami w pożądanym stadium rozwoju.
   
   Uwagi: Wszystkie nasze eksperymenty przeprowadzamy na larwach 6-dniowych (środek trzeciego stadium rozwojowego); Larwy na tym etapie rozwoju są wystarczająco duże, aby można je było łatwo wykryć za pomocą naszego oprogramowania śledzącego, ale są również bardzo aktywne.
   
   
3. Wlać sacharozę do fiolki z pokarmem zawierającej larwy.
4. Za pomocą szpatułki delikatnie rozbij i rozpuść pokarm na muchy, aby uwolnić larwy. Uwolnione larwy wypłyną na powierzchnię.
5. Odczekać kilka minut, aż kawałki pokarmu dla much opadną na dno fiolki, a następnie wlać sacharozę i larwy na szalkę Petriego. Jeśli konieczna jest wstępna selekcja larw, zwierzęta można zbierać, przelewając sacharozę przez filtr. Larwy można następnie przenieść do naczynia w celu selekcji za pomocą pędzla.
6. Pozostaw larwy na około 30 minut w roztworze sacharozy przed przystąpieniem do testów behawioralnych, aby umożliwić zwierzętom przyzwyczajenie się do roztworu sacharozy. Ponieważ larwy nie wydają się żywić sacharozą, zwierzęta doświadczą stanu głodu, który poprawia wydajność chemotaksji.
7. Pokrywka szalki Petriego może być wypełniona wodą (lub sacharozą) i używana jako pojemnik na wyrzucone zwierzęta po testach behawioralnych.

5. Protokół do wykonywania nagrań behawioralnych

5.1. Ustawienie areny:

1. 1. Nałóż kropelki zapachu na spód (dobrze zagłębioną stronę) świeżej 96-dołkowej pokrywki naczynia.
   
   Ważne: Aby uniknąć zanieczyszczenia różnymi zapachami i stężeniami zapachów, do każdej konfiguracji załadunku należy używać świeżej pokrywki. Żadna z pokrywek zawierających źródła zapachów nie jest poddawana recyklingowi po eksperymencie. W zależności od zastosowanego zakresu stężeń zapachów, stwierdzono, że gradienty nawaniania są stabilne tylko przez 10 do 20 minut w systemie zamkniętym. Dlatego ważne jest, aby zminimalizować czas między ustawieniem gradientu a faktycznym rozpoczęciem testu behawioralnego.
   
   
2. Odwróć pokrywkę i ułóż ją nad drugą pokrywką pokrytą 3% warstwą agarozy.
   
   Ważne: Ostrożnie odwróć pokrywkę, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się kropelek zapachu do sąsiednich studzienek.
   
   
3. Po odwróceniu górnej powieki na powierzchni agarozy, pozwól zapachowi dyfundować przez 30 sekund przed wprowadzeniem larwy.

5.2. Ładowanie larw:

1. Podnieś górną pokrywę zawierającą kropelki środka zapachowego na tyle, aby umożliwić załadowanie larwy.
2. Przenieś larwę z roztworu sacharozy do warstwy agarozy. Pozycja wyjściowa zwierzęcia zależy od zastosowanego testu:
   
   W przypadku testu z pojedynczym źródłem zapachu larwy są uwalniane pod kroplą nawaniacza.
   
   W przypadku testu z wieloma źródłami zapachu larwy są uwalniane między studzienkami #E3 i #E4,
   
   Ważne: Orientuj nowo wprowadzone zwierzęta w spójny sposób. Ustawiamy nasze zwierzęta w kierunku nachylenia, dbając o to, aby ciało i głowa zwierzęcia były skierowane w stronę najwyższego stężenia. Zwierzęta wprowadzone w orientacji przeciwnej do gradientu inicjują zachowanie poszukiwawcze. Naszym zdaniem ten początkowy okres poszukiwań stanowi niepotrzebne źródło szumu. Kontrolowanie orientacji głowy zmniejsza liczbę zwierząt, które stykają się ze ścianą areny podczas swoich zachowań eksploracyjnych. Praktyka ta nie ustala kierunku ruchu zwierzęcia ani nie zwiększa znacząco liczby zwierząt anosmicznych przypadkowo chemotaksujących wzdłuż linii zapachowej (tj. fałszywie dodatnich wyników w testach zapachowych).
   
   
3. Załóż górną pokrywę i natychmiast rozpocznij nagrywanie.
   
   Uwagi: Zdrowe larwy zaczynają pełzać natychmiast po wprowadzeniu na arenę i mogą pokonać odległość 1 cm w ciągu pierwszych 10 sekund. Jeśli eksperymentator jest powolny w inicjowaniu nagrywania, początkowe punkty danych zostaną utracone. Z tego powodu zalecamy, aby eksperymentator dobrze zapoznał się z poleceniami oprogramowania, aby rozpocząć nagrywanie przed próbą uruchomienia eksperymentu.
   
   
4. Pozwól larwie zachowywać się przez cały czas trwania nagrania (zwykle 3 minuty).
   
   Uwagi: Zapisy są przerywane przed końcem 3 minut, jeśli larwa uderzy w ścianę areny lub dotrze do obszaru docelowego (np. w teście gradientu).
   
5. Pod koniec nagrania niezwłocznie podnieś pokrywę i usuń larwę za pomocą kleszczy lub pędzla. Umieść śledzone zwierzęta w pokrywie szalki Petriego zawierającej wodę (lub sacharozę).
   
   Ważne: Zarejestrowane zwierzęta nie są ponownie wykorzystywane. Naczynie na wodę jest jedynie wygodnym pojemnikiem do oddzielania zarejestrowanych i niezarejestrowanych zwierząt podczas przeprowadzania eksperymentów.
   
6. Jeśli śledzisz wiele zwierząt pod areną, natychmiast załaduj następną larwę i rozpocznij nagrywanie, jak pokazano powyżej.
   
   Ważne: Liczba prób przeprowadzonych na tej samej arenie powinna być ustalana na podstawie stabilności gradientu, którą należy zweryfikować przed wykonaniem jakiegokolwiek eksperymentu behawioralnego².
   
7. Po wyśledzeniu i usunięciu z areny wszystkich larw, które mają być badane w uchwycie, należy wyrzucić górną pokrywę i warstwę agarozy. Pokrywka pośrednia (tj. pokrywka agarozowa) może zostać poddana recyklingowi.
   
   Uwaga: Zalecamy użytkownikom Ethovision wybór metody wykrywania "odejmowania tła".

6. Przykładowe eksperymenty pokazane w artykule wideo

6.1. Test pojedynczego źródła zapachu z 1,0 M octanu izoamylu.

Przetestowaliśmy na ślepo dziesięć mutantów Or83b-/- i dziesięć larw typu dzikiego (W1118), z których każda miała przypisany numer. Eksperymentator śledzący nie otrzymał żadnych informacji o genotypie każdego zwierzęcia. Po każdym nagraniu każdemu badanemu zwierzęciu przypisano fenotyp predykcyjny: wąchacze, jeśli zaobserwowano akumulację pod źródłem przez całe badanie; niewachnych, jeśli ścieżka szybko opuściła okolice źródła zapachu. Po zarejestrowaniu zachowania 20 zwierząt, ścieżki zostały pogrupowane według fenotypu. Wynik tego grupowania został następnie porównany z rzeczywistym genotypem larw: wszystkie dokonane przypisania okazały się prawidłowe.

6.2. Test wielu źródeł zapachu z wykładniczymi i liniowymi gradientami octanu izoamylu.

W tym eksperymencie porównaliśmy wydajność chemotaksacji larw dzikich typów wzdłuż gradientu liniowego i wykładniczego. Zachowania chemotaktyczne zarejestrowano dla dwóch gradientów ustawionych z tym samym najwyższym stężeniem 0,5 M. Jak wyjaśniono w artykule, źródła zapachu gradientu wykładniczego wahały się od 0,015 do 0,5 M. Źródła gradientu liniowego mieściły się w zakresie od 0,25 do 0,5 m (progresja arytmetyczna ze wspólną różnicą 0,05 m).

Gradient liniowy reprezentował bardziej wymagające środowisko chemotaksji, ponieważ lokalna różnica w stężeniu była stała i stosunkowo niewielka, a zakres stężeń wąski (0,25M). Natomiast zakres stężeń gradientu wykładniczego był większy wraz z rosnącymi lokalnymi różnicami w stężeniu wzdłuż szlaku.

Piętnaście larw zostało zarejestrowanych dla każdej z dwóch geometrii gradientów i ścieżek nałożonych na jeden wykres. Oględziny obu wykresów pokazują, że larwy typu dzikiego były w stanie niezawodnie wspinać się po gradiencie dla obu geometrii, ale ilość meandrów była większa w warunkach gradientu liniowego. Sugeruje to, że sygnał obecny na długości gradientu jest bardziej niezawodnie wykrywany dla kształtu wykładniczego niż dla liniowego.

6.3. Test wielu źródeł zapachu z gradientem octanu izoamylu w geometrii "dachu".

Tutaj sprawdzamy, czy larwy wprowadzone w gradieniu zapachu są wrażliwe na lokalne zmiany w stężeniu zapachu, a nie tylko na obecność lub brak zapachu. Gradient izoamylu ustalono poprzez zastosowanie kropelek zapachowych o stężeniach: 0,06, 0,12, 0,25, 0,5, 0,25, 0,12M. Wynikająca z tego geometria gradientu przypominała asymetryczny "dach" osiągający szczyt na wysokości 0,5 m.

Larwy zostały uwolnione między kropelkami zapachu 0,06 M i 0,12 M. Nasza hipoteza była taka, że gdyby larwy tylko obliczały obecność zapachu, podążałyby za całym gradientem bez szczególnego preferowania maksimum stężenia. W przeciwieństwie do tego, jeśli larwy są wrażliwe na lokalne zmiany stężenia, gromadzą się pod kroplą 0,5 M. Zarejestrowano piętnaście larw i stwierdzono, że po krótkim okresie eksploracyjnym wszystkie larwy zgromadziły się pod studnią o wyższym stężeniu. Sugeruje to, że obliczane są lokalne zmiany w stężeniu zapachu i informują o chemotaktycznym zachowaniu larw Drosophila.