Artykuł metodologiczny

Przygotowanie proteomiki jednokomórkowej do analizy spektrometrii mas z wykorzystaniem lizy cieplno-zamrażalniczej i nośnika izobarycznego

DOI:

10.3791/63802

⸱

9 grudnia 2022

 ,  , 
1Department of Bioengineering, Northeastern University, 2Barnett Institute, Northeastern University, 3Department of Biology, Northeastern University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole opisujemy, jak przygotować komórki ssaków do analizy proteomicznej pojedynczej komórki za pomocą spektrometrii mas przy użyciu dostępnych na rynku odczynników i sprzętu, z opcjami zarówno ręcznego, jak i automatycznego pipetowania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza proteomiczna pojedynczej komórki wymaga czułych, ilościowo dokładnych, szeroko dostępnych i solidnych metod. Aby sprostać tym wymaganiom, opracowano protokół Single-Cell ProtEomics (SCoPE2) jako metodę drugiej generacji do ilościowego oznaczania setek do tysięcy białek z ograniczonych próbek, aż do poziomu pojedynczej komórki. Eksperymenty z wykorzystaniem tej metody pozwoliły na ilościowe określenie ponad 3000 białek w 1500 pojedynczych komórkach ssaków (500-1000 białek na komórkę) w ciągu 10 dni od czasu użycia spektrometru masowego. SCoPE2 wykorzystuje cykl zamrażania i ogrzewania do lizy komórek, eliminując potrzebę czyszczenia pojedynczych komórek, a w konsekwencji zmniejszając straty próbki, jednocześnie przyspieszając przygotowanie próbki i upraszczając jej automatyzację. Dodatkowo w metodzie wykorzystuje się nośnik izobaryczny, który wspomaga identyfikację białek i zmniejsza straty próbki.

Ten protokół wideo zawiera szczegółowe wskazówki, które umożliwiają przyjęcie zautomatyzowanej analizy białek jednokomórkowych przy użyciu tylko sprzętu i odczynników, które są powszechnie dostępne. Pokazujemy krytyczne etapy procedury przygotowania pojedynczych komórek do analizy proteomicznej, od pobrania przez wstrzyknięcie do analizy metodą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas w tandemie (LC-MS/MS). Dodatkowo widzowie są prowadzeni przez zasady projektowania eksperymentalnego z nośnikiem izobarycznym, kontrolę jakości zarówno dla nośnika izobarycznego, jak i preparatów jednokomórkowych oraz reprezentatywne wyniki wraz z omówieniem ograniczeń tego podejścia.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza pojedynczych komórek jest powszechnie stosowana do badania poziomu heterogeniczności w systemach biologicznych, które w innym przypadku byłyby niedostrzegalne przy pomiarach masowych1,2,3. Taka różnorodność komórkowa może mieć funkcjonalne konsekwencje, które mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia integralnych procesów biologicznych, od oporności terapeutycznej komórek nowotworowych4,5,6 do heterogeniczności międzykomórkowej w cukrzycy7,8,9,10. Wiele badań koncentrowało się na pomiarze kwasów nukleinowych w pojedynczych komórkach, poprzez pomiar poziomów genetycznych lub transkryptomicznych i umożliwiło klasyfikację typów i stanów komórek. Taki postęp w przestrzeni kwasów nukleinowych nie może jednak wypełnić luki w wiedzy na temat regulacji potranskrypcyjnej11, co powoduje potrzebę podobnie wysokoprzepustowych pomiarów białek w pojedynczych komórkach12,13,14,15.

Opracowaliśmy SCoPE216,17, aby sprostać zapotrzebowaniu na rygorystyczną i solidną proteomikę jednokomórkową systemów ssaków. Jest to metoda multipleksowana, pozwalająca na zwiększenie przepustowości poprzez równoległe etykietowanie i analizowanie wielu komórek18, w przeciwieństwie do mthodów bez etykiet, które analizują jedną komórkę naraz19,20. Metodologia przygotowania próbki, podejście oparte na spektrometrii mas i kolejne etapy analizy danych pozwalają na dokładne określenie ilościowe setek do tysięcy białek na pojedynczą komórkę. Metoda ta umożliwia analizę spektrometrii mas pojedynczych komórek za pomocą nośnika izobarycznego21, małej próbki zbiorczej komórek (zwykle 25-200), która jest biologicznie podobna do populacji pojedynczej komórki będącej przedmiotem zainteresowania. Ten materiał nośny jest multipleksowany w zestawie z kanałem referencyjnym z tego samego materiału i pojedynczymi komórkami za pomocą tandemowych znaczników masy (etykiety TMT). Kanał nośny zmniejsza utratę próbki na powierzchni i zapewnia fragmenty szkieletu jonowego w celu pomyślnej identyfikacji peptydów. Kanał referencyjny, który jest przygotowywany luzem, a następnie rozcieńczany do 5-10 odpowiedników komórek dla każdego zestawu pojedynczych komórek, pomaga kontrolować zmienność techniczną analizy. W szczególności odniesienie pozwala na normalizację zmienności spowodowanej efektami związanymi z LC-MS/MS, takimi jak pobieranie próbek jonów i wydajność jonizacji. Zwykle kanały odniesienia i nośne są wykonane z tej samej populacji komórek.

Ten protokół przygotowania próbki jest metodą drugiej generacji, opartą na SCoPE-MS22 poprzez wiele synergicznych ulepszeń. Ulepszenia obejmują metodę lizy komórek, która pozwala uniknąć oczyszczania próbki, co jest częstym etapem preparatów proteomicznych SM. Wykorzystuje mPOP (minimal ProteOmic sample Preparation)23, która jest metodą lizy zamrażalniczo-cieplnej. Metoda ta umożliwiła lizę pojedynczych komórek w mniejszych objętościach i na płytkach wielodołkowych, a nie w fiolkach, co umożliwiło większą przepustowość i automatyzację za pomocą termocyklerów. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta obniżyła koszt pojedynczej komórki i zwiększyła dokładność ilościową w porównaniu z SCoPE-MS16,24.

Ten protokół opisuje, jak przygotować pojedyncze komórki do analizy proteomicznej, w tym jak przygotować nośnik i kanały referencyjne za pomocą etykiet izobarycznych TMTpro 18-plex. Komórki ssaków, które są w zawiesinie pojedynczej komórki i które można wyizolować na 384-dołkowych płytkach, prawdopodobnie podlegają temu protokołowi. Dołączono również reprezentatywne wyniki udanych zestawów pojedynczych komórek, wyświetlające kilka wykresów kontroli jakości wygenerowanych przez aplikację R Shiny, DO-MS25. Inne opublikowane narzędzia programowe26,27 oraz eksperymentalne wytyczne17,21 poprawiły przyjęcie tego protokołu. Mamy nadzieję, że ten wizualny przewodnik pomoże naukowcom w przeprowadzaniu eksperymentów proteomicznych na pojedynczych komórkach.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: W tym protokole temperatura pokojowa (RT) wynosi 18-22 °C.

1. Generowanie nośników i materiałów odniesienia

  1. Izolacja komórek
    1. Zbierz interesujące komórki do zawiesin komórkowych w lodowatym chłodzie 1x PBS.
      UWAGA: Jeśli to możliwe, nośnik i materiał referencyjny powinny być przygotowane z populacji komórek wybranej do badania na poziomie pojedynczej komórki. Podobna liczba komórek z różnych warunków eksperymentalnych (takich jak stymulowane i niestymulowane komórki odpornościowe) powinna stanowić nośnik i odniesienie. W sytuacjach, w których nie można pobrać wystarczająco dużej liczby tych komórek, należy wybrać odpowiednią populację komórek na podstawie podobieństwa biologicznego.
    2. Za pomocą hemocytometru lub innego sposobu zliczania komórek (takiego jak FACS) należy policzyć liczbę komórek w zawiesinie.
    3. Odwiruj i ponownie zawieś 22 000 komórek każdego typu komórek w 11 μl wody klasy HPLC, oddzielnie w probówkach PCR (standardowe probówki PCR 250 μl).
      UWAGA: Zalecana tutaj liczba komórek jest wystarczająca dla nośników i odniesień do liczby zestawów, które można przygotować z 384-dołkowej płytki pełnej pojedynczych komórek. Wejście do ogniwa w tym kroku i ilości odczynników w kolejnych krokach mogą być skalowane proporcjonalnie w celu uzyskania większej liczby zestawów. Szybkość wirowania w dół zależy od praktyk hodowli komórkowych w laboratorium. Typowe odkręcanie: 300 × g przez 5 min.
    4. Przenieść próbki do zamrażarki o temperaturze -80 °C na co najmniej 30 minut
      PUNKT PAUZY: Próbki mogą pozostawać zamrożone przez kilka miesięcy bez konsekwencji dla danych z pojedynczych komórek.
  2. Liza komórek
    1. Podgrzej probówkę PCR z komórkami do 90 °C przez 10 minut (z pokrywą termocyklera ustawioną na 105 °C), a następnie pozwól probówkom ostygnąć do 12 °C zaraz po cyklu ogrzewania.
    2. Krótko odwiruj probówkę, a następnie odwiruj w dół w stołowej przędzarce probówki do PCR w temperaturze pokojowej, aby zebrać cały płyn na dnie probówki.
    3. W sonikatorze w łaźni wodnej sonikuj probówki przez 5 minut, a następnie umieść je na lodzie w temperaturze pokojowej.
  3. Trawienie trypsyny
    1. Dodać 2,2 μl mieszanki wzorcowej (zob. tabela 1 dla składników) do każdej probówki z próbką na lodzie.
      UWAGA: Trypsyna może powodować podrażnienie skóry, dróg oddechowych i oczu. Pamiętaj, aby nosić środki ochrony osobistej. Uchwyt pod wyciągiem chemicznym.
    2. Krótko zawiruj probówki, aby wymieszać i odwirować w stołowej przędzarce probówki do PCR w temperaturze pokojowej, aby zebrać cały płyn na dnie każdej probówki.
    3. Podgrzewać próbki w temperaturze 37 °C przez 3 godziny (z pokrywą termocyklera ustawioną na 52 °C).
  4. Reakcja na etykietowanie TMT
    1. Odwiruj próbki po roztrawieniu w laboratoryjnym wirowniku probówkowym do PCR w temperaturze pokojowej.
    2. Podziel każdą próbkę na dwie równe objętości po 6,6 μl każda, tak aby każda probówka zawierała 11 000 komórek.
    3. Do probówek przeznaczonych na nośnik dodać 3,3 μl etykiety TMT 126, która została ponownie zawieszona w stężeniu 85 mM.
    4. Do probówek przeznaczonych do celów referencyjnych dodać 3,3 μl etykiety TMT 127N, która została ponownie zawieszona w stężeniu 85 mM.
    5. Krótko zwiruj probówki i odwiruj w dół w stołowej wirówce do PCR w temperaturze pokojowej, aby zebrać płyn na dnie.
    6. Pozostaw probówki w temperaturze RT na 1 godzinę.
  5. Wygaszanie reakcji znakowania TMT
    1. Dodać 1,65 μl 0,5% hydroksyloaminy do każdej probówki.
      UWAGA: Hydroksyloamina może powodować podrażnienie skóry. Pamiętaj, aby nosić środki ochrony osobistej.
    2. Krótko zwiruj probówki i odwiruj w dół w stołowej wirówce do PCR w temperaturze pokojowej, aby zebrać płyn na dnie.
    3. Pozostaw probówki w pozycji RT na 30 minut.
  6. Kombinacja nośnika i odniesienia
    1. Jeżeli próbki, które będą stanowić nośnik, zostały oddzielnie oznakowane, należy je wymieszać w równych proporcjach.
    2. Jeżeli próbki, które będą stanowić odniesienie, zostały oddzielnie oznakowane, należy je wymieszać w równych proporcjach.
    3. Wymieszaj nośnik i odniesienie tak, aby końcowe stężenie nośnika wynosiło 100-200 komórek/μl, a stężenie referencyjne wynosiło 5-10 komórek/μl.
    4. Oceń jakość nośnika i materiałów odniesienia przed połączeniem ich z zestawami jednokomórkowymi.
      UWAGA: Kontrolę jakości nośnika i materiału referencyjnego można przeprowadzić różnymi metodami, ale zaleca się korzystanie z oprogramowania DO-MS, dostępnego pod adresem do-ms.slavovlab.net17. Krytyczne pomiary jakości obejmują wskaźnik błędnego rozszczepienia (<25%, wskaźnik obliczany jako liczba pewnie zidentyfikowanych peptydów z pominiętym rozszczepieniem podzielona przez liczbę peptydów zidentyfikowanych peptydów w sumie ) i skuteczność etykietowania (>99%, wskaźnik obliczany jako liczba miejsc znakowania, a mianowicie N-koniec peptydu i lizyna, z etykietą podzieloną przez całkowitą liczbę miejsc etykietowania).
      PUNKT PAUZY: Nośnik i materiały odniesienia mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą potrzebne.
składnikStężenie mieszankiKońcowe stężenie na probówkę
Trypsyna Złoto50 ng/μl8,33 ng/μl
TEAB, pH = 8,5500 mM83,33 mln
Nukleaza benzonazy1.2 Jednostki0,2 jednostki

Tabela 1: Ilość odczynnika w mieszance wzorcowej. Podane są końcowe stężenia odczynników potrzebnych do trawienia trypsyny.

2. Przygotowanie próbki SCoPE2

  1. Izolacja komórek
    1. Uzupełnij wodę klasy HPLC o 25 fmol na peptyd na μl syntetycznego roztworu peptydów.
      UWAGA: Roztwór peptydowy Waters MassPrep jest przykładem tego, co można zastosować. Składa się z siedmiu peptydów, które nie jonizują zbyt dobrze. Jest to kluczowy aspekt tego rozwiązania: peptydy te nie zakłócają dokładnej kwantymetrii spektrometrii mas pojedynczych komórek. Każda wysoce oczyszczona mieszanina kilku peptydów, których obecność w próbkach będących przedmiotem zainteresowania prawdopodobnie nie znajdzie się w próbkach, będzie odpowiednia.
    2. Dodaj 1 μl tej mieszanki do każdego dołka płytki 384-dołkowej za pomocą robota dozującego płyn lub pipety ręcznej.
    3. Uszczelnij płytkę i odkręć ją w stołowej wirówce talerzowej w temperaturze RT, aby zebrać płyn na dole.
      PUNKT PAUZY: Płytki z tym roztworem można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą potrzebne.
    4. Uzyskiwanie zawieszenia nieustalonych komórek, które są zdezagregowane.
      UWAGA: Sposób dokładnego uzyskania zawiesiny komórek zależy od typu ogniwa, które jest przedmiotem zainteresowania. Oto szerokie przykłady:
      1. Komórki zawiesinowe: odwiruj komórki w osad i usuń pożywkę do hodowli komórek.
      2. Komórki przylegające: usunąć komórki z naczynia lub kolby poprzez trypsynizację lub skrobanie. Następnie odwiruj je, aby usunąć pożywkę do hodowli komórkowych.
    5. Dwukrotnie przemyć zawiesinę komórkową 1x lodowato zimnym PBS. Pozostaw komórki zawieszone w 1x PBS po drugim praniu.
    6. Jeśli płytka 384-dołkowa została zamrożona, rozmrozić ją w temperaturze pokojowej. Zakręć ją, aby upewnić się, że cały płyn znajduje się na dnie studzienek.
    7. Użyj sortera komórek lub innych dostępnych środków, takich jak ręczne pobieranie, aby rozprowadzić pojedyncze komórki do odpowiednich studzienek.
      UWAGA: Dodaj pojedyncze komórki do studzienek, pozostawiając niektóre studzienki puste dla kontroli negatywnych i pozytywnych (patrz dyskusja). W przypadku korzystania z cytometrii przepływowej należy używać najniższego możliwego natężenia przepływu dla cytometru przepływowego. Uważa się, że niższe natężenie przepływu jest łagodniejsze dla obsługi komórek. Dodatkowo rozmiar dyszy powinien być odpowiedni do użytku z interesującymi komórkami. Zaleca się współpracę z zakładem cytometrii przepływowej.
    8. Dodać kontrole pozytywne 2-5 komórek równoważnego lizatu do wybranych studzienek pipetowanych ręcznie lub za pomocą robotów do obsługi cieczy.
    9. Uszczelnij i odwiruj płytkę z posortowanymi komórkami w stołowym wirniku talerzowym w punkcie RT, aby zebrać płyn na dole. Zamrozić płytkę w temperaturze -80 °C tak szybko, jak to możliwe.
      PUNKT PAUZY: Płytki z posortowanymi pojedynczymi komórkami można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą potrzebne.
  2. Liza komórek
    1. Weź 384-dołkową płytkę z posortowanymi pojedynczymi komórkami i włóż ją do termocyklera tak szybko, jak to możliwe.
    2. Podgrzej płytkę do 90 °C przez 10 minut (przy temperaturze pokrywki ustawionej na 105 °C), a następnie pozwól talerzowi ostygnąć do 12 °C.
    3. Krótko zakręć płytką w stołowym kołpaku talerzowym w punkcie RT.
    4. W sonikatorze w kąpieli wodnej sonikuj płytkę przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie umieść ją na lodzie.
  3. Trawienie trypsyny
    1. Przygotować 100 μl mieszanki wzorcowej (zob. tabela 1 dla składników) na płytkę 384-dołkową.
    2. Do każdego dołka płytki 384-dołkowej dodać 0,2 μl mieszanki wzorcowej przygotowanej w kroku 2.3.1 przy użyciu urządzenia do obchodzenia się z cieczą.
      UWAGA: Jeśli stosowane jest pipetowanie ręczne, należy używać większych objętości, upewniając się, że końcowe stężenia odczynników są nadal takie same w każdym dołku.
    3. Uszczelnij płytkę, wiruj przez 5 s i wiruj w dół w stołowej obracarce do płyt w temperaturze RT.
    4. Podgrzewać płytkę 384-dołkową w temperaturze 37 °C (przy temperaturze pokrywki ustawionej na 52 °C) przez 3 godziny.
  4. Reakcja na etykietowanie TMT
    1. Wyjmij 85 mM zapasów etykiet TMT (od 128N do 135N) z zamrażarki w temperaturze -80 °C. Podgrzej rurki do temperatury pokojowej przed ich otwarciem.
    2. Rozcieńczyć etykiety do 22 mM w bezwodnym acetonitrylu.
      UWAGA: Acetonitryl jest cieczą łatwopalną. Może podrażniać skórę, oczy, drogi oddechowe i ośrodkowy układ nerwowy. Pamiętaj, aby nosić środki ochrony osobistej. Uchwyt pod wyciągiem chemicznym.
    3. Korzystając z tej strategii etykietowania, dodaj 0,5 μl rozcieńczonych etykiet TMT do każdego dołka płytki 384-dołkowej. Użyj robota dozującego ciecze (jeśli używasz urządzenia do obsługi cieczy, upewnij się, że używasz odpowiedniego sprzętu odpowiedniego dla rozpuszczalników organicznych) lub pipety ręcznej.
      UWAGA: Patrz Tabela 2, aby zapoznać się ze strategią etykietowania. Tabela 3 zawiera przykładowy układ płyt.
    4. Uszczelnij płytkę, wiruj przez 5 s i wiruj w dół w stołowej obracarce do płyt w temperaturze RT.
    5. Pozwól reakcji etykietowania postępować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  5. Wygaszanie reakcji znakowania TMT
    1. Do każdej studzienki płytki 384-dołkowej dodać 0,2 μl 0,5% hydroksyloaminy (rozcieńczonej w wodzie klasy HPLC) za pomocą płynnego środka do obchodzenia się z płynem.
      UWAGA: Jeśli stosowane jest pipetowanie ręczne, należy używać większych objętości, upewniając się, że końcowe stężenia odczynników są nadal takie same w każdym dołku.
    2. Uszczelnij płytkę, wiruj przez 5 s i wiruj w dół w stołowej obracarce do płyt w temperaturze RT.
    3. Trzymaj talerz w pozycji RT przez 30 minut.
  6. Przygotowanie do analizy LC-MS/MS: połączenie pojedynczych komórek i studzienek kontrolnych z nośnikiem/materiałem odniesienia
    1. Wyjąć połączony nośnik/materiał odniesienia z zamrażarki w temperaturze -80 °C.
    2. Dla każdego zestawu należy odpipetować 1 μl nośnika i materiału odniesienia do pierwszego dołka, który będzie częścią pojedynczego zestawu. Odpipetować całą objętość pierwszego dołka do następnego dołka. Kontynuuj pipetowanie całej objętości z jednej komórki do drugiej, aż wszystkie studzienki, które mają być włączone do jednego zestawu, zostaną połączone w ostatnim dołku.
      UWAGA: Nośnik i materiał referencyjny powinny mieć stężenie odpowiednio 200- i 5-komórkowych odpowiedników, ale jak omówiono wcześniej21, ilości te mogą się różnić. Każdy zestaw, zgodnie ze strategią etykietowania (patrz Tabela 2), powinien zawierać nośnik, odniesienie oraz do 12 lub 14 próbek jednokomórkowych lub kontrolnych w przypadku stosowania TMTpro-16plex lub TMTpro-18plex (patrz krok 2.4.3).
    3. Do każdego zestawu dodać 5 μl 50% acetonitrylu (rozcieńczonego w wodzie klasy HPLC) do pierwszego studzienki jednokomórkowej, która ma być włączona do każdego zestawu. Odpipetować całą objętość od pierwszego dołka do następnego dołka. Kontynuuj pipetowanie całej objętości z jednej komórki do drugiej, aż wszystkie studzienki, które mają być włączone do jednego zestawu, zostaną połączone w ostatnim dołku.
      UWAGA: Ten etap mycia może pomóc w odzyskaniu próbki ze studni.
    4. Przenieś każdy zestaw do indywidualnych szklanych wkładów do podajnika próbek do autosamplera.
      UWAGA: Zestawy te można również łączyć w pojedyncze dołki z płytką 384-dołkową i bezpośrednio umieszczać w automatycznym podajniku próbek do wstrzykiwań28.
    5. Po połączeniu wszystkich zestawów i umieszczeniu ich w szklanych wkładkach wysuszyć próbki.
      PUNKT PAUZY: Wysuszone zestawy można przechowywać w temperaturze -80 °C przez co najmniej 1 tydzień przed uruchomieniem na spektrometrze masowym.
    6. Przed analizą LC-MS/MS dodaj 1,2 μl 0,1% kwasu mrówkowego (rozcieńczonego w wodzie klasy HPLC) do każdego zestawu, aby ponownie zawiesić znakowane peptydy.
      UWAGA: Kwas mrówkowy jest cieczą łatwopalną. Może spowodować poważne uszkodzenie oczu lub oparzenia skóry. Pamiętaj, aby nosić środki ochrony osobistej. Trzymaj w dobrze wentylowanym miejscu.
    7. Umieścić wkładki automatycznego podajnika próbek w szklanych fiolkach z automatycznym podajnikiem próbek i zamknąć każdą próbkę nakrętką.
    8. Wirować każdą fiolkę przez 5 sekund, aby upewnić się, że ponowne zawieszenie zostało zakończone, a następnie odwirować w wirówce do fiolki w temperaturze obrotowej.
    9. Upewnij się, że każda próbka znajduje się na dnie wkładki, a nie jest rozpryskiwana po bokach.
    10. Umieścić fiolki w tacce automatycznego podajnika próbników.
    11. Do każdego zestawu wstrzyknąć 1 μl do analizy LC-MS/MS.
Etykieta126127N127C128N128C129N129C130N130C....135N
Typ próbkiPrzewoźnikOdniesieniePustyPustySC/KontrolaSC/KontrolaSC/KontrolaSC/KontrolaSC/Kontrola....SC/Kontrola

Tabela 2: Przykładowy schemat etykietowania SCoPE2 TMTpro-18plex. Przewoźnik i numer referencyjny są zwykle oznaczone na pierwszych dwóch etykietach TMT. Następnie kolejne dwie etykiety są pomijane ze względu na potencjalne zanieczyszczenie izotopowe, które sprawiłoby, że oznaczanie ilościowe byłoby mniej dokładne. Pozostałe pozostawione etykiety są przeznaczone dla pojedynczych komórek lub kontrolek.

128C129N129C130N130C131N131C132N132C133N133C134N128C129N129C130N130C131N131C132N132C133N133C134N
123456789101112131415161718192021222324
ASCSC-SCSCSCSCSC+SCSCSCSCSCSCSCSCSC-SC+SCSCSC
BSC+SCSCSCSCSCSCSCSC+SCSCSCSCSCSCSCSCSC-SCSC+
CSC-SC-SCSCSC+SC-SCSCSCSC+SC-SCSCSCSCSCSC-
DSCSCSCSCSCSC-SCSCSCSC+SC-SCSCSCSCSCSCSCSCSCSC
ESCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSC+SCSCSCSCSC-SCSC
FSCSCSCSCSCSCSCSC-SCSCSCSC+SCSCSC+SCSCSC+SCSC
GSCSCSC+SCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSC-SCSCSCSC
HSCSCSCSCSC+SCSCSCSCSCSCSCSCSCSC+SCSCSCSCSCSCSC
ISCSCSCSCSCSCSCSCSC+SCSC-SCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSC
J-SC+SCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSC-SCSCSCSCSCSC
KSCSCSCSC-SCSCSCSC-SCSC+SC--SCSCSCSCSCSCSCSC
LSCSCSCSCSC-SCSCSCSCSC-SCSCSCSCSCSCSCSCSCSC+SC
MSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSC+SCSCSCSC
N+SCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSC
OSCSCSCSC+SCSCSCSCSC-SCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSC
PSCSC-SCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSC+SCSCSC-SC

Tabela 3: Przykładowy układ tablicy do etykietowania za pomocą TMTpro-16plex. Używając formatu płytki 384-dołkowej (lub dowolnego innego formatu płytki), ważne jest, aby losowo wybrać dołki, do których sortowane są komórki. Inny układ płyt zostanie użyty dla TMTpro-18plex.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pozytywne wyniki protokołu pociągają za sobą sprawdzenie, czy wiele krytycznych kroków w protokole zostało pomyślnie wykonanych; obejmują one przygotowanie nośnika, izolację pojedynczej komórki, lizę, trawienie, etykietowanie kodami kreskowymi i optymalizację parametrów MS. Wykresy DO-MS umożliwiają łatwą ocenę zakończenia każdego krytycznego kroku w protokole. Pomyślnie przygotowany nośnik, który zwykle odpowiada ilości 25 i 200 komórek (w zestawie), jest dobrze trawiony i dobrze oznakowany. Wykresy z DO-MS pozwalają na ilościowe określenie intensywności próbki (w celu oszacowania ilości), wydajności trawienia (najlepiej <25% rozszczepienia) oraz skuteczności etykietowania (musi wynosić >99%). Co najważniejsze, próbki nośników, które nie są całkowicie oznakowane, mogą pozwolić na reakcję krzyżową z kodami kreskowymi przeznaczonymi dla pojedynczych komórek i dodać fałszywy sygnał do kwantyfikacji peptydów jednokomórkowych.

Studnie kontroli negatywnej zawierają wszystkie eksperymentalne odczynniki, ale nie mają komórki. Pozwala to nie tylko na ocenę szumu tła, ale także na określenie skuteczności izolacji komórek poprzez dostarczenie reprezentatywnego sygnału z pustej studni. Raport DO-MS oferuje wykresy do oceny zmierzonego sygnału ze studzienki kontrolnej wraz ze studzienkami jednokomórkowymi w celu określenia powodzenia izolacji komórek i szumu tła. Dodatkowo, jakość kwantyfikacji można ocenić za pomocą potoku SCoPE2 (dostępnego na GitHub: github.com/SlavovLab/SCoPE2) lub pakietu SCP Bioconductor29.

Efektywność trawienia i etykietowania pojedynczych komórek nie może być bezpośrednio badana, jak w przypadku nośnika, ale DO-MS ponownie dostarcza wykresy, które pozwalają oszacować efektywność trawienia i etykietowania. Włączając kontrolę 100-200 komórek wraz z przygotowaniem pojedynczych komórek (tj. otrzymując wszystkie te same dodatki odczynników), można ocenić wydajność trawienia i znakowania dla tej kontroli i założyć, że jest ona wspólna dla pojedynczych komórek przygotowanych obok. Na słabe trawienie wskazuje wysoki stosunek intensywności rozszczepionych peptydów do ich całkowicie rozszczepionych odpowiedników (Rysunek 1).

Innym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę w zestawach, jest ułamek brakujących danych i mediana intensywności jonów reporterowych w każdym kanale TMT (Rysunek 2). Gdy z powodzeniem przygotuje się pojedyncze komórki, ilość brakujących danych na komórkę i kontrolę pozytywną jest znacznie mniejsza niż w próbkach kontroli ujemnej. Podobnie, mediana intensywności prekursorów jest znacznie wyższa w pojedynczych komórkach i kontrolach pozytywnych niż w kontrolach ujemnych. Optymalizacja parametrów MS została obszernie omówiona gdzie indziej21, a optymalne parametry można określić za pomocą takich narzędzi jak DO-MS lub SCP Companion25,27.

figure-results-1
Rysunek 1: Kontrola jakości przygotowania nośnika. Wykresy DO-MS przedstawiające (A) skuteczność znakowania prawidłowo przygotowanego nośnika w miejscach znakowania TMT: pierwszorzędową aminę w łańcuchu bocznym lizyny i N-koniec peptydu, oraz (B) wydajność trawienia przy resztach aminokwasowych rozszczepienia tryptycznego. Skrót: TMT = tandem mass tag. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Kontrola jakości preparatu jednokomórkowego. Wykresy DO-MS przedstawiające (A) ułamek brakujących danych w pojedynczych komórkach (C5-10), kontrolach (C13,16), nośniku (C1) i odniesieniu (C2) oraz (B) intensywność pojedynczych komórek i kontroli. Tagi 127C, 128N, 131C, 132N, 133N i 133C, które odpowiadają C3, C4, C11, C12 i C15, są nieużywane w tym konkretnym zestawie. Kontrola pozytywna składa się z materiału komórkowego przetworzonego na peptydy luzem, a następnie rozcieńczonego do poziomu 2-5 komórek/μl przed znakowaniem. Kontrola ujemna polega na poddaniu studni wszystkim etapom przygotowawczym stosowanym w przypadku pojedynczych komórek, tylko bez dodawania pojedynczej komórki. Skrót: TMT = tandem mass tag. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z kluczy do skutecznego przygotowania i analizy pojedynczych komórek za pomocą SCoPE2 jest przygotowanie nośnika i kanałów referencyjnych. Sugerowany rozmiar nośnika to od 100 do 200 komórek; Jednak liczba komórek potrzebnych do konkretnego eksperymentu z pojedynczą komórką może być określona na podstawie zasad omówionych w innym miejscu21. Dla sugerowanego rozmiaru potrzeba co najmniej ~11 275 komórek na płytkę 384-dołkową, co pozwala na 200-komórkowy nośnik i 5-komórkowe odniesienie w każdym zestawie. Korzystne może być wyizolowanie większej liczby komórek, jeśli pożądane populacje komórek nie są czynnikiem ograniczającym, po prostu posiadanie dodatkowego materiału w przypadku błędów (jak to zrobiono w tym protokole, izolując 22 000 komórek zamiast 11 275 komórek). Ilość nośnika i odniesienie potrzebne do określenia liczby pożądanych płytek powinna być przygotowana w jednej partii, aby zminimalizować wszelkie różnice między partiami, które mogą powodować różnice w identyfikacji peptydów lub oznaczaniu ilościowym między partiami.

Przed wyizolowaniem pojedynczych komórek do studzienek na płytce 384-dołkowej ważne jest, aby wziąć pod uwagę projekt układu płytki. W każdej płytce 384-dołkowej zaleca się przeprowadzenie zarówno kontroli pozytywnej, jak i negatywnej. Kontrole ujemne to studzienki, do których nie dodaje się żadnych komórek, ale są one poddawane tym samym odczynnikom i procedurom, co studzienki jednokomórkowe. Kontrole pozytywne to studzienki, do których dodaje się lizat komórkowy rozcieńczony do 2-5 komórek/μl zamiast pojedynczych komórek. Jest to szczególnie ważne do wdrożenia, gdy metody izolacji pojedynczych komórek nie są dobrze zwalidowane. Każda płytka 384-dołkowa powinna mieć idealnie losowy rozkład pojedynczych komórek i kontroli (np. nie mieć kontroli ujemnych lub pozytywnych tylko w jednym rzędzie). Każda płytka powinna mieć równy rozkład wszystkich interesujących populacji komórek, zamiast izolować jeden typ komórek na jednej płytce i drugi typ komórek na drugiej płytce. Pozwoli to uniknąć wiązania efektów wsadowych z typami komórek będących przedmiotem zainteresowania. Ponadto, jeśli do analizy potrzebna jest więcej niż jedna płytka 384-dołkowa, zaleca się wyizolowanie komórek podczas jednej sesji, zamiast rozkładania etapu izolacji na kilka dni, jeśli to możliwe.

Liza zarówno pojedynczych komórek, jak i nośnika/odniesienia odbywa się w wodzie w cyklu zamrażania-ogrzewania23. Przewiduje się, że większość proteaz została zdenaturowana na tym etapie. Trypsyna jest następnie dodawana natychmiast po etapie denaturacji w wysokim stężeniu, o wiele rzędów wielkości większym niż nawet najliczniejsze proteazy komórkowe. W wyniku masowego działania większość produktów aktywności proteazy będzie spowodowana trypsyną.

Redukcja/alkilowanie reszt cysteiny nie jest wykonywane w tym protokole przed trawieniem trypsyny. Peptydy zawierające cysteinę stanowią około 10% peptydów tryptycznych z ludzkiego proteomu. Obserwujemy mniej peptydów zawierających cysteinę przy użyciu podejścia bez redukcji/alkilowania. Na tych etapach stosuje się odczynniki, które są niezgodne z etykietowaniem przez TMT (NHS-ester chemistry) bezpośrednio po trawieniu.

W tej strategii etykietowania TMT nośnik i referencje są oznaczone odpowiednio 126 i 127N, podczas gdy studzienki jednokomórkowe i kontrolne są oznaczone 128C do 135N. Dwie etykiety po numerze referencyjnym, 127C i 128N, nie są używane ze względu na izotopowe zanieczyszczenie krzyżowe wynikające z kanału nośnego i referencyjnego, które są wyraźnie znacznie obfitsze w materiał peptydowy niż pojedyncze komórki. W sumie w zestawie znajduje się 12 kanałów TMT, które można wykorzystać do etykietowania pojedynczych komórek lub studzienek kontrolnych za pomocą TMTpro-16plex lub 14 kanałów TMT na zestaw za pomocą TMTpro-18plex.

Krytyczne kroki w protokole do wykonywania pomiarów proteomiki pojedynczej komórki przy użyciu tego protokołu obejmują przygotowanie nośnika, izolację pojedynczej komórki, lizę, trawienie, etykietowanie kodami kreskowymi i odpowiednie parametry spektrometrii mas. Kroki te zostały opisane w niniejszym dokumencie i zostały szczegółowo opisane w innych miejscach 17,21,25. Każdy krok ma odpowiadający mu wykres lub zestaw wykresów w DO-MS, które umożliwiają łatwą kontrolę jakości. Na przykład, w przypadku udanego stworzenia nośnika, wykresy przedstawiające liczbę zidentyfikowanych peptydów, skuteczność znakowania i procentowy wskaźnik nieczystości pozwalają zweryfikować jego pomyślne przygotowanie. Reprezentatywne raporty DO-MS są zawarte w niniejszej publikacji i można je zobaczyć pod adresem http://scope2.slavovlab.net/ dla oryginalnych danych16. Te raporty DO-MS pozwalają ocenić optymalizację metody w kierunkach, które nie zostały jeszcze zbadane przez autorów, takich jak dłuższe gradienty LC, różne enzymy trawienne lub alternatywne chemiczne kody kreskowe.

Obecnie szeregowa analiza peptydów za pomocą algorytmów akwizycji zależnej od danych ogranicza liczbę peptydów, które można analizować w serii LC o rozsądnej długości. Wynika to częściowo z dłuższych czasów napełniania wymaganych do pomyślnego pozyskania wystarczającej ilości jonów do wiarygodnej kwantyfikacji pojedynczej komórki21. Nieodłącznym ograniczeniem w stosowaniu nośnika jest brak bezpośredniej oceny efektywności trawienia i znakowania pojedynczych komórek. Obecnie jednym z rozwiązań tego ograniczenia jest przeprowadzanie kontroli jakości na większej próbce przetwarzanej wraz z pojedynczymi komórkami.

Zaproponowaliśmy szereg możliwości ulepszenia proteomiki jednokomórkowej, takich jak budowa spektrometrów masowych z wieloma analizatorami. Obecna metoda pozwala na ilościowe oznaczanie tysięcy białek z pojedynczych komórek ssaków z prędkością około 100 komórek dziennie za pomocą dostępnych na rynku odczynników i sprzętu. SCoPE2, druga generacja podejścia SCoPE-MS, znacznie poprawiła swoją poprzedniczkę pod względem liczby komórek możliwych do przeanalizowania w jednostce czasu, liczby białek możliwych do przeanalizowania w jednostce czasu, czasu potrzebnego na przygotowanie próbki, dostępności odczynników i sprzętu oraz całkowitego kosztu przygotowania i analizy na pojedynczą komórkę. Białka związane z błoną są dostępne za pomocą lizy zamrażalniczo-cieplnej i trawienia proteazy, jak pokazano w porównaniu z lizą mocznika23. Metoda identyfikuje wiele białek z górnej jednej trzeciej proteomu w odniesieniu do liczebności16. Jeśli zmodyfikowany proteoform znajduje się w górnej jednej trzeciej proteomu, a zmodyfikowany peptyd jest podatny na analizę spektrometrii mas (dobrze jonizuje, ma różnicę masy w stosunku do niezmodyfikowanego peptydu), będzie bardziej podatny na ten protokół. Metoda ta może być z powodzeniem stosowana w systemach biologicznych, w których występuje znacząca heterogeniczność między komórkami, na przykład w różnicowaniu, starzeniu się lub odpowiedziach immunologicznych (tj. Fagocytoza).

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować nagrodzie Fall 2021 NSF I-Corps Program (strona Northeastern University), która sfinansowała tę publikację.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytka 384-dołkowa, standardowa płytka PCRThermo Fisher ScientificAB1384 W przypadku zastąpienia, przed przygotowaniem SCoPE2 należy ocenić poziom potencjalnego zanieczyszczenia polimerem z innych płytek.
Acetonitryl (do przygotowania), Optima LC-MS/MS klasaFisher ScientificA955-1Ten acetonitryl jest używany do wszelkich, a mianowicie 50% acetonitrylu, który jest używany do przechodzenia przez studzienki po przejściu przez nośnik i odniesienie podczas łączenia zestawów SCoPE2.
Uwaga: Acetonitryl jest cieczą łatwopalną. Może podrażniać skórę, oczy, drogi oddechowe i ośrodkowy układ nerwowy. Pamiętaj, aby nosić środki ochrony osobistej. Uchwyt pod wyciągiem chemicznym.
Acetonitryl (do przygotowania TMT), bezwodny, 99,8%Sigma Aldrich271004-100MLTen acetonitryl służy do ponownego zawieszania etykiet TMT w stężeniu producenta.
Uwaga: Acetonitryl jest cieczą łatwopalną. Może podrażniać skórę, oczy, drogi oddechowe i ośrodkowy układ nerwowy. Pamiętaj, aby nosić środki ochrony osobistej. Uchwyt pod wyciągiem chemicznym.
Samoprzylepne folie do płytek PCRThermo Fisher ScientificAB0626
Autosampler nakrętki gwintowane do fiolekThermo Fisher ScientificC5000-51B
Wirówka do fiolek z autosamplerem (tj. myFuge 5)MTC BioC2595Ten model nie posiada żadnej regulacji prędkości. Jest po prostu używany do zbierania płynu na dnie fiolek z automatycznym samplerem.
Nukleaza benzonazowaSigma AldrichE1014-25KU
Fiolki z gwintem z przezroczystego szkła, 9 mmThermo Fisher Scientific60180-509
Kwas mrówkowy, przebijający, klasa LC-MS/MS ThermoFisher Scientific85178Uwaga: Kwas mrówkowy jest cieczą łatwopalną. Może spowodować poważne uszkodzenie oczu lub oparzenia skóry. Pamiętaj, aby nosić środki ochrony osobistej. Trzymaj w dobrze wentylowanym miejscu.
Szklane wkłady do automatycznego podajnika próbek, 9 mmThermo Fisher ScientificC4010-630
Hydroksyloamina (HA), 50% wag./objSigma Aldrich467804-50MLUwaga: Hydroksyloamina może powodować podrażnienie skóry. Pamiętaj, aby nosić środki ochrony osobistej.
Chipy mikroprzepływowe Mantis, chipy 3PFE o małej objętościFormulatrixMCLVPR2Te chipy są przeznaczone do użytku z manipulatorem cieczy Mantis microfluidics do dozowania roztworów organicznych. Mogą one być używane do dozowania etykiet TMT.
Chipy mikroprzepływowe Mantis, chipy silikonowe o małej objętościFormulatrixMCLVS12Te chipy są przeznaczone do użytku z manipulatorem cieczy Mantis microfluidics do dozowania roztworów wodnych. Nie można ich używać do dozowania etykiet TMT.
Maniska mikroprzepływowa obsługa cieczyFormulatrixLiquid handler może być zastąpiony przez Mantis. Ważne jest jednak, aby sprawdzić, czy system jest kompatybilny ze 100% acetonitrylem (jak w przypadku etykiet TMT) oraz czy system nie wprowadza do próbek zanieczyszczeń polimerowych lub innego rodzaju zanieczyszczeń.
Adapter płytki Mantis PCR z szerokimi stożkowymi kołkami do automatycznej obsługi płytekFormulatrix232400
Mieszanina peptydówMassPREP Wody186002337Mieszanina dziewięciu peptydów nietryptycznych
Wirówka do probówek PCR (tj. 16-miejscowa mikrowirówka do probówek 0,2 ml)USA Scientific2621-0016Ten model nie posiada żadnej kontroli prędkości. Służy po prostu do zbierania płynu na dnie rurek.
Probówki do PCR: TempAssure 0,2 ml PCR 8-probówkowe paskiUSA Scientific1402-3900W przypadku podstawienia, przed przygotowaniem SCoPE2 należy ocenić poziom potencjalnego zanieczyszczenia polimerem z innych płytek.
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 10x, pH 7,4, bez RNazThermo Fisher ScientificAM9625
Wirówka płytkowa (tj. mikrowirówka PlateFuge)Benchmark ScientificModel C2000Ten model nie posiada żadnej regulacji prędkości. Służy po prostu do zbierania cieczy na dnie studni.
Termocykler (tj. C1000 Touch z modułem 384-dołkowym)Biorad1851138
TMTpro 16plex Label, 1 x 5 mgThermo Fisher ScientificA44520
Wodorowęglan trietyloamonu (TEAB), 1 M, pH 8,5Sigma AldrichT7408100ML
Spektrometria mas ze złotem trypsynowymklasy PromegaV5280Jest to trypsyna o bardzo wysokiej czystości. Inne odczynniki trypsyny mogą różnić się poziomem czystości. Poziom czystości jest ważny dla osiągnięcia pozytywnych wyników SCoPE2.

Uwaga: Trypsyna może powodować podrażnienie skóry, dróg oddechowych i oczu. Pamiętaj, aby nosić środki ochrony osobistej. Uchwyt pod wyciągiem chemicznym.
Vortex (Analogowy mieszalnik wirowy)VWRModel 58816-121
Sonikator do kąpieli wodnej (tj. myjka ultradźwiękowa 2,8 l z cyfrowym timerem)VWR97043964
Woda, Optima LC-MS/MS klasaFisher ScientificW6-1Wszystkie roztwory, które muszą być rozcieńczone lub przygotowane, zaleca się sporządzanie z wodą o spektrometrii mas. Wszelkie rozcieńczenia i/lub mieszanki wzorcowe powinny być świeże. Zanieczyszczenie wynikające z wody o niższej jakości może negatywnie wpływać na wykrywanie peptydów i jakość danych z pojedynczych komórek.
W razie potrzeby należy użyć płytki polipropylenowej .. Zestaw odczynników

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Symmons, O., Raj, A. What's luck got to do with it: single cells, multiple fates, and biological nondeterminism. Molecular Cell. 62 (5), 788-802 (2016).
  2. Paul, I., White, C., Turcinovic, I., Emili, A. Imaging the future: the emerging era of single-cell spatial proteomics. The FEBS Journal. 288 (24), 6990-7001 (2020).
  3. Levy, E., Slavov, N. Single cell protein analysis for systems biology. Essays in Biochemistry. 62 (4), 595-605 (2018).
  4. Nagasawa, S., Kashima, Y., Suzuki, A., Suzuki, Y. Single-cell and spatial analyses of cancer cells: toward elucidating the molecular mechanisms of clonal evolution and drug resistance acquisition. Inflammation and Regeneration. 41 (1), 22(2021).
  5. Shaffer, S. M., et al. Rare cell variability and drug-induced reprogramming as a mode of cancer drug resistance. Nature. 555 (7695), 274(2018).
  6. Pan, D., Jia, D. Application of single-cell multi-omics in dissecting cancer cell plasticity and tumor heterogeneity. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 757024(2021).
  7. Segerstolpe, Å, et al. Single-cell transcriptome profiling of human pancreatic islets in health and type 2 diabetes. Cell Metabolism. 24 (4), 593-607 (2016).
  8. Tritschler, S., Theis, F. J., Lickert, H., Böttcher, A. Systematic single-cell analysis provides new insights into heterogeneity and plasticity of the pancreas. Molecular Metabolism. 6 (9), 974-990 (2017).
  9. Hanna, S. J., Tatovic, D., Thayer, T. C., Dayan, C. M. Insights from single cell rna sequencing into the immunology of type 1 diabetes- cell phenotypes and antigen specificity. Frontiers in Immunology. 12, 751701(2021).
  10. Baron, M., et al. A single-cell transcriptomic map of the human and mouse pancreas reveals inter- and intra-cell population structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
  11. Franks, A., Airoldi, E., Slavov, N. Post-transcriptional regulation across human tissues. PLoS Computational Biology. 13 (5), 1005535(2017).
  12. Slavov, N. Unpicking the proteome in single cells. Science. 367 (6477), 512-513 (2020).
  13. Specht, H., Slavov, N. Transformative opportunities for single-cell proteomics. Journal of Proteome Research. 17 (8), 2565-2571 (2018).
  14. Slavov, N. Learning from natural variation across the proteomes of single cells. PLoS Biology. , (2021).
  15. Slavov, N. Driving single cell proteomics forward with innovation. Journal of Proteome Research. 20 (11), 4915-4918 (2021).
  16. Specht, H., et al. Single-cell proteomic and transcriptomic analysis of macrophage heterogeneity using SCoPE2. Genome Biology. 22 (1), 50(2021).
  17. Petelski, A. A., et al. Multiplexed single-cell proteomics using SCoPE2. Nature Protocols. 16 (12), 5398-5425 (2021).
  18. Slavov, N. Scaling up single-cell proteomics. Molecular and Cellular Proteomics: MCP. 21 (1), 100179(2022).
  19. Cong, Y., et al. Ultrasensitive single-cell proteomics workflow identifies> 1000 protein groups per mammalian cell. Chemical Science. 12 (3), 1001-1006 (2021).
  20. Lombard-Banek, C., et al. In vivo subcellular mass spectrometry enables proteo-metabolomic single-cell systems biology in a chordate embryo developing to a normally behaving tadpole (X. laevis). Angewandte Chemie. 60 (23), 12852-12858 (2021).
  21. Specht, H., Slavov, N. Optimizing accuracy and depth of protein quantification in experiments using isobaric carriers. Journal of Proteome Research. 20 (1), 880-887 (2020).
  22. Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation. Genome Biology. 19 (1), 161(2018).
  23. Specht, H., Harmange, G., Perlman, D. H., Emmott, E. Automated sample preparation for high-throughput single-cell proteomics. BioRxiv. , at https://www.biorxiv.org/content/10.1101/399774v1.abstract (2018).
  24. Singh, A. Towards resolving proteomes in single cells. Nature Methods. 18 (8), 856(2021).
  25. Huffman, R. G., Chen, A., Specht, H., Slavov, N. DO-MS: Data-driven optimization of mass spectrometry methods. Journal of Proteome Research. 18 (6), 2493-2500 (2019).
  26. Chen, A. T., Franks, A., Slavov, N. DART-ID increases single-cell proteome coverage. PLoS Computational Biology. 15 (7), 1007082(2019).
  27. Cheung, T. K., et al. Defining the carrier proteome limit for single-cell proteomics. Nature Methods. 18 (1), 76-83 (2021).
  28. Leduc, A., Huffman, R. G., Slavov, N. Droplet sample preparation for single-cell proteomics applied to the cell cycle. bioRxiv. , https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.04.24.441211v1.abstract (2021).
  29. Vanderaa, C., Gatto, L. Utilizing Scp for the analysis and replication of single-cell proteomics data. bioRxiv. , (2021).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Protok SCoPE2znakowanie tandemowymi znacznikami masyilo ciowe oznaczanie bia ekchromatografia cieczowatrawienie trypsynzautomatyzowane przygotowanie pr bek

Powiązane artykuły