Artykuł metodologiczny

Biochemiczne oczyszczanie i charakterystyka proteomiczna rdzeni fibryli amyloidowych z mózgu

3.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63816

⸱

28 kwietnia 2022

 ,  , 
1Department of Neurology, Northwestern University Feinberg School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ta metoda biochemicznego oczyszczania z analizą proteomiczną opartą na spektrometrii mas ułatwia solidną charakterystykę rdzeni włókienkowych amyloidu, co może przyspieszyć identyfikację celów zapobiegania chorobie Alzheimera.

Streszczenie

Inkluzje fibrylarne białkowe są kluczowymi patologicznymi cechami charakterystycznymi wielu chorób neurodegeneracyjnych. We wczesnych stadiach choroby Alzheimera (AD) peptydy beta-amyloidu tworzą protofibryle w przestrzeni zewnątrzkomórkowej, które działają jak nasiona, które stopniowo rosną i dojrzewają w duże blaszki amyloidowe. Pomimo tej podstawowej wiedzy, obecna wiedza na temat struktury, składu i wzorców odkładania włókien amyloidowych w mózgu jest ograniczona. Jedną z głównych barier była niemożność wyizolowania wysoce oczyszczonych włókien amyloidowych z ekstraktów mózgowych. Metody oparte na mikrodysekcji oparte na oczyszczaniu powinowactwa i wychwytywaniu laserowym były wcześniej stosowane do izolowania amyloidów, ale są ograniczone przez niewielką ilość materiału, który można odzyskać. Ten nowatorski, solidny protokół opisuje biochemiczne oczyszczanie rdzeni blaszek amyloidowych za pomocą solubilizacji dodecylosiarczanu sodu (SDS) z ultrawirowaniem i ultradźwiękami w gradiencie gęstości sacharozy i daje wysoce czyste włókienka od pacjentów z AD i tkanki mózgowe modelowe AD. Oparta na spektrometrii mas (MS) oddolna analiza proteomiczna oczyszczonego materiału stanowi solidną strategię identyfikacji prawie wszystkich głównych składników białkowych włókienek amyloidowych. Wcześniejsze badania proteomiczne białek w koronie amyloidowej ujawniły nieoczekiwanie duży i funkcjonalnie zróżnicowany zbiór białek. Warto zauważyć, że po udoskonaleniu strategii oczyszczania liczba białek współoczyszczających została zmniejszona ponad 10-krotnie, co wskazuje na wysoką czystość wyizolowanego materiału nierozpuszczalnego w SDS. Barwienie ujemne oraz mikroskopia elektronowa immuno-złota pozwoliły potwierdzić czystość tych preparatów. Konieczne są dalsze badania, aby zrozumieć atrybuty przestrzenne i biologiczne, które przyczyniają się do osadzania się tych białek w inkluzjach amyloidu. Podsumowując, ta strategia analityczna jest dobrze przygotowana do pogłębienia wiedzy na temat biologii amyloidu.

Wprowadzenie

Amyloid to niezwykle stabilny układ supramolekularny, który występuje w różnorodnym panelu białek, z których niektóre prowadzą do patologicznych zmian1. Nagromadzenie wewnątrz- lub zewnątrzkomórkowych agregatów amyloidu obserwuje się w kilku chorobach neurodegeneracyjnych2. Agregaty amyloidowe są niejednorodne i wzbogacone o dużą liczbę białek i lipidów3. W ostatnich latach zainteresowanie proteomem amyloidu wzbudziło znaczne zainteresowanie wśród neurobiologów zajmujących się badaniami podstawowymi i translacyjnymi. Opracowano kilka metod ekstrakcji i oczyszczania agregatów amyloidu z mysich i pośmiertnych tkanek ludzkiego mózgu. Mikrodysekcja laserowa, immunoprecypitacja, decelularyzacja i biochemiczna izolacja agregatów amyloidu są szeroko stosowanymi metodami ekstrakcji i oczyszczania blaszek, włókienek i oligomerów amyloidu4,5,6,7. Wiele z tych badań koncentrowało się na określeniu składu białkowego tych ciasno upakowanych złogów fibrylarnych przy użyciu półilościowego stwardnienia rozsianego. Jednak dostępne wyniki są niespójne, a zaskakująco duża liczba wcześniej zgłoszonych białek współoczyszczających jest trudna do interpretacji.

Podstawowym ograniczeniem istniejącej literatury opisującej proteom rdzenia amyloidu w mózgach myszy AD i AD jest to, że oczyszczony materiał zawiera niemożliwą do opanowania liczbę białek współoczyszczających. Ogólnym celem tej metody jest przezwyciężenie tego ograniczenia i opracowanie solidnego biochemicznego oczyszczania do izolowania rdzeni włókien amyloidowych. Strategia ta wykorzystuje wcześniej opisaną metodę biochemiczną opartą na ultrawirowaniu w gradiencie gęstości sacharozy do izolacji nierozpuszczalnych, wzbogaconych frakcji amyloidowych SDS z pośmiertnych tkanek mózgu ludzkiego i mysiego AD8,9. Metoda ta opiera się na istniejącej literaturze, ale idzie dalej z ultradźwiękami i płukaniem SDS w celu usunięcia większości luźno związanych białek związanych z amyloidem, co prowadzi do izolacji wysoce oczyszczonych włókienek amyloidowych (Rysunek 1). Włókienka oczyszczone za pomocą tego protokołu przezwyciężają kilka istniejących wyzwań, często napotykanych w badaniach strukturalnych włókienek amyloidowych wyizolowanych z ekstraktów mózgowych. Wizualizacja tych włókien za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) potwierdza integralność i czystość oczyszczonego materiału (Rysunek 2). W tym badaniu izolowane fibryle są rozpuszczone i trawione do peptydów z trypsyną, a bezznacznikowa analiza stwardnienia rozsianego może łatwo ujawnić tożsamość białek tworzących rdzeń fibryli. Warto zauważyć, że niektóre z tych białek mają wrodzoną tendencję do tworzenia zespołów supramolekularnych w organellach niezwiązanych z błoną. Ponadto wiele białek zidentyfikowanych w analizie włókienek beta-amyloidu (Aβ) jest również związanych z innymi chorobami neurodegeneracyjnymi, co sugeruje, że białka te mogą odgrywać kluczową rolę w wielu proteinopatiach.

Ta metoda SDS/ultradźwięków raczej nie zmieni ani nie zakłóci struktury rdzeni fibrylowych. Oczyszczony materiał nadaje się również do szerokiej gamy podejść do analizy proteomicznej od góry do dołu i od dołu do góry oraz dodatkowych strategii analizy strukturalnej opartych na MS, takich jak sieciowanie chemiczne lub wymiana wodorowo-deuterowa. Całkowity odzysk przy użyciu tej metody jest stosunkowo wysoki, a zatem nadaje się do szczegółowych badań strukturalnych, które wymagają mikrogramów lub miligramów oczyszczonego materiału. Oczyszczony materiał nadaje się również do badań strukturalnych z wykorzystaniem krioEM i mikroskopii sił atomowych. Protokół ten, w połączeniu ze stabilnym znakowaniem izotopowym ssaków, może ułatwić badania struktury amyloidu metodą magnetycznego rezonansu jądrowego w stanie stałym (NMR)10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten protokół obejmuje użycie tkanek mózgowych ludzi lub kręgowców. Wszystkie badania zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi instytucjonalnymi Northwestern University. Bieżący przepływ pracy jest ustandaryzowany przy użyciu APP-knock in (AppNL-G-F/NL-G-F) ekstraktów z obszaru mózgu mózgu myszy i hipokampa11. Protokół ten został zoptymalizowany pod kątem ekstraktów mózgowych od myszy w wieku 6-9 miesięcy i może skutecznie oczyszczać amyloidy zarówno z samców, jak i samic.

UWAGA: Aby lepiej zrozumieć ogólną procedurę eksperymentalną, zobacz Rysunek 1 dla schematu przepływu pracy.

1. Pobieranie tkanek i oczyszczanie z amyloidu

UWAGA: Idealnie, fibryle amyloidowe powinny być izolowane ze świeżo wypreparowanych obszarów mózgu. Jednak ta metoda działa również dobrze w przypadku tkanek mózgowych zamrożonych lub zamrożonych błyskawicznie. Poniżej znajduje się krótki zarys zamrażania tkanek mózgowych w celu przechowywania do wykorzystania w późniejszym czasie.

  1. Pobieranie i przechowywanie tkanki mózgowej: Wypreparuj mózgi myszy i szybko zbierz obszary obciążone amyloidem (tj. korę i hipokamp), a następnie zamroź w ciekłym azocie lub kąpieli alkoholowej w suchym lodzie.
    UWAGA: Szybkie zamrażanie pomaga zachować cechy strukturalne składników tkanki. Myszy są poddawane eutanazji przez izofluran i zwichnięcie szyjki macicy12,13. Zaleca się unikanie stosowania CO2 , ponieważ może to zagrozić integralności proteomu mózgu.
  2. Po rozwarstwieniu należy pociąć i przechowywać świeże tkanki w małych blokach (np. 5 mm x 5 mm), ponieważ ułatwia to bardziej wydajną homogenizację przed ekstrakcją amyloidu. Przenieś tkankę do sterylnej fiolki kriogenicznej, dokręć jej nakrętkę i szybko zanurz
    3. .
  3. Tkanki należy przechowywać zamrożone w bardzo niskich temperaturach (tj. -80 °C lub ciekły azot). Jeśli ekstrakcja ma być przeprowadzona kilka dni później, należy przechowywać tkanki w temperaturze -20 °C i unikać cykli zamrażania i rozmrażania. Rozmrozić zamrożone tkanki na mokrym lodzie, gdy są gotowe do ekstrakcji i oczyszczenia.
    UWAGA: Bezpośredni kontakt tkanek z ciekłym azotem może spowodować uszkodzenie tkanek i białek. Należy pamiętać, że kąpiel alkoholowa może usunąć trwałe markery z etykiet tubek.

2. Wzbogacanie materiału nierozpuszczalnego SDS

UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki na lodzie i odwiruj w temperaturze 4 °C, chyba że zaznaczono inaczej. Szczegółowe informacje na temat wszystkich i rozwiązań stosowanych w tym protokole znajdują się w pliku uzupełniającym 1. Producenci i numery katalogowe chemikaliów i przyrządów znajdują się w Tabeli Materiałów.

  1. Zacznij od świeżo wypreparowanych lub zamrożonych obszarów tkanki mózgowej (rozmrożonych na lodzie) umieszczonych w probówce o pojemności 2 ml zawierającej 6-8 kulek ceramicznych i świeżo przygotowanym lodowatym buforze homogenizacyjnym (1 ml na 0,25-1 g masy mokrej tkanki).
  2. Przenieść probówki do homogenizatora młynka perełkowego i zmielić zawartość tkanki z prędkością 4000 obr./min, w dwóch cyklach po 30 s każdy i w odstępie 30 s pomiędzy nimi.
    UWAGA: Alternatywnie, do mielenia i homogenizacji tkanek można użyć zmotoryzowanych mieszadeł lub homogenizatorów.
  3. Dodać 9 ml lodowatego buforu homogenizacyjnego do 1 ml homogenatu całych tkanek mózgu w probówkach o pojemności 15 ml, uszczelnić paskami folii woskowej laboratorium i obracać od końca do końca przez noc w temperaturze 4 °C, aby zapewnić solidną rozpuszczalność.
    UWAGA: Aby usunąć niechciane duże zanieczyszczenia komórkowe i lipidy, następnego ranka wirować probówki w temperaturze 800 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut i zebrać supernatant w świeżej probówce. Zawiesić pozostały osad w 2 ml lodowatego buforu homogenizacyjnego, dobrze wymieszać, ponownie wirować przez 10 minut w temperaturze 4 °C i połączyć oba supernatanty.
  4. Powoli dodawać stałą sacharozę do zawiesiny ekstraktu tkankowego do końcowego stężenia 1,2 M, dobrze wymieszać i odwirować przy 250 000 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant za pomocą pipety. Zawiesić osad w 2 ml buforu homogenizacyjnego zawierającego 1,9 M sacharozy przez triturację, a następnie odwirować przy 125 000 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Objętość bufora można dostosować w zależności od ilości materiału odzyskanego z poprzedniego kroku. Ogólnie rzecz biorąc, 10 objętości buforu homogenizacyjnego (V/V) jest idealne do tego etapu.
  6. Zebrać górną białą warstwę stałą za pomocą pipety, przenieść ją do świeżej probówki i rozpuścić w 1 ml lodowatego buforu do mycia, pipetując kilkakrotnie w górę i w dół, bez wprowadzania pęcherzyków powietrza.
  7. Oprócz wierzchniej warstwy, granulka jest również wzbogacona w włókienka amyloidowe. Aby uzyskać wyższą wydajność, połącz dwie frakcje i kontynuuj. Ostrożnie usuń środkową warstwę wodną za pomocą pipety i wyrzuć.
  8. Odwirować połączone frakcje przy 8000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
  9. Dodać 1 ml lodowatego buforu do wytrawiania do przemytego osadu, ponownie zawiesić i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 3 godziny.
  10. Wirować przy 8000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant za pomocą pipety.
  11. Ponownie zawiesić i przemyć (tak samo jak w kroku 2.8) strawione osady dwa razy w 1 ml lodowatego buforu Tris.
  12. Zawiesić przemyty osad w 1 ml buforu do rozpuszczania zawierającego 1% SDS i 1,3 M sacharozy, pipetując w górę iw dół. Szybko wirować przy 200 000 x g przez 60 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Chociaż fibryle amyloidowe są wysoce odporne na detergenty i denaturanty, bardzo długa ekspozycja na detergent (1% SDS) może wpłynąć na integralność włókienek lub usunąć ściśle związane białka, co zagrozi późniejszym analizom. Dlatego natychmiast po ponownym zawieszeniu granulek przystąp do wirowania.
  13. Zachować osad i zwiększyć objętość pozostałego supernatantu przez dodanie 50 mM buforu Tris (w stosunku 1:0,3) w celu zmniejszenia stężenia sacharozy z 1,3 do 1 M i ponownie odwirować przy 200 000 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C.
  14. Rozpuść dwa granulki w 100 μl buforu Tris zawierającego 0,5% SDS i połącz je w celu oczyszczenia z amyloidu. Widoczne granulki są małe i powinny wydawać się nieprzezroczyste i białawe (patrz Rysunek 2A).

3. Oczyszczanie amyloidu

UWAGA: Połącz dwie granulki, rozpuść przez pipetowanie aż do uzyskania jednolitego roztworu i przejdź do następujących etapów oczyszczania amyloidu.

  1. W celu całkowitego rozpuszczenia materiału bogatego w amyloid obecnego w granulkach, należy poddać rurkę mechanicznemu ścinaniu wytwarzanemu przez fale ultradźwiękowe w urządzeniu do sonikacji w kąpieli działającym przez 30 s ON i 30 s OFF ze średnią częstotliwością przez 20 cykli.
  2. Natychmiast odwirować materiał przy 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić osad w 500 μl 0,5% buforu SDS Tris.
  3. Powtórz kroki 3.1. i 3.2. cztery razy, co daje w sumie pięć prań. Liczbę prań można zwiększyć, aby poprawić czystość.
    UWAGA: Etapy sonikacji i mycia są zoptymalizowane przy 0,5% SDS, ponieważ wyższe stężenia mogą wpływać na strukturę, integralność lub skład białkowy włókienek. Nie zaleca się zwiększania stężenia SDS na tym etapie.
  4. Po ostatnim etapie wirowania umyj osad w 200 μl ultraczystej wody i odwiruj przy 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C, aby usunąć resztki detergentu. Przemyty granulat zawierający oczyszczone włókienka amyloidu wydaje się półprzezroczysty i czasami jest trudny do zauważenia.
  5. Końcową osadkę zawierającą oczyszczone włókienka amyloidowe rozpuścić w 100 μl ultraczystej wody. Natychmiast należy przejść do następnego etapu w celu dalszego przetwarzania lub zachować zawiesinę włókienkową w temperaturze -20 °C do dalszej analizy. W przypadku zamrożenia rozmrozić na lodzie przed rozpoczęciem wytrącania.

4. Wytrącanie chloroformu metanolu

UWAGA: Jeśli ostatecznym celem jest przeprowadzenie analizy białka, zaleca się odsolenie i usunięcie dodatkowych zanieczyszczeń niebiałkowych.

  1. Dodać 400 μl metanolu do oczyszczonych 100 μl włókienek amyloidowych w probówce o pojemności 1,5 ml i dobrze przetrząsnąć.
  2. Dodać 100 μl chloroformu do probówki i dobrze odwirować.
  3. Dodaj 300 μl ultraczystej wody i dokładnie wymieszaj. Powoduje to, że mieszanina staje się mętna z powodu wytrącania się białek.
  4. Wirować przy 12 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
  5. Ostrożnie usunąć warstwę wodną (tj. górę), nie naruszając warstwy granicznej zawierającej płatek białkowy.
  6. Ponownie dodać tę samą objętość metanolu i odwirować przy 12 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
  7. Odrzucić supernatant za pomocą pipety i wysuszyć granulkę na powietrzu w temperaturze pokojowej. Unikać nadmiernego wysuszenia; frakcja amyloidowa jest trudna do ponownego rozpuszczenia, jeśli jest nadmiernie wysuszona.

5. Trawienie trypsyny

  1. Rozpuścić osad w 50 μl buforu chlorowodorku guanidyny (GuHCl). Sonikować w lodowatej kąpieli wodnej i podgrzewać w temperaturze 95 °C przez 5 minut, jeśli jest to wymagane.
  2. Dokładnie wirować w temperaturze pokojowej przez 45 minut do 1 godziny, aby całkowicie się rozpuścił. Osad nie będzie widoczny po tym kroku, a roztwór wygląda na przejrzysty.
  3. Dodać taką samą objętość 0,2% roztworu środka powierzchniowo czynnego. Rozpuszczanie w temperaturze pokojowej z wirowaniem przez 60 min. Ten krok zwiększa aktywność enzymatyczną trypsyny.
  4. Dodać 1 μl tris-2-karboksyetylofosfiny (TCEP) z 500 mM roztworu podstawowego. Inkubować przez 60 minut.
  5. Dodać 2 μl 500 mM jodoacetamidu (IAA) i inkubować w ciemności przez 20 minut.
  6. Ugasić IAA 5 μl roztworu TCEP przez 15 minut.
  7. Dodać wymaganą objętość 50 mM roztworu wodorowęglanu amonu do probówki, aby zmniejszyć stężenie guanidyny do 1,5 M.
  8. Do probówki dodać 1% roztwór środka powierzchniowo czynnego (1 μl/50 μg białka).
  9. Dodać trypsynę (1 μg/100 μg białka) i pozostawić probówkę do mieszania w temperaturze 37 °C na noc.

6. Oczyszczanie peptydów

  1. Następnego ranka zakwasz strawiony roztwór peptydu, obniżając pH do 2,0 poprzez dodanie kwasu mrówkowego.
  2. Aktywować kolumnę wirową C18 (n-oktadecyl) w probówce odbiorczej o pojemności 2 ml, dodając 200 μl 50% roztworu metanolu i wirować przy 1500 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Powtórz krok aktywacji.
  3. Zrównoważyć złoża żywicy kolumny C18, dodając 200 μl buforu równoważącego i wirując przez 2 minuty w tych samych warunkach. Powtórz ten krok.
  4. Zakwaszony roztwór peptydowy załadować do kolumny C18 i odwirować przy 1500 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Zebrać przepływ i ponownie go załadować. Odrzuć drugi przepływ.
  5. Przemyć peptydy związane z żywicą C18 buforem do płukania 2x, jak to zrobiono w kroku 6.3. Użyj tego samego bufora równowagi do mycia kolumny.
  6. Eluować peptydy, dodając 40 μl buforu elucyjnego, a następnie odwirować przy 1500 x g, przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Powtórzyć etap elucji trzy razy, aby zwiększyć wydajność odzyskanych peptydów.
  7. Wysuszyć peptydy w szybkim koncentratorze próżniowym poprzez odparowanie roztworu wodnego. Suche granulki można przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni przed analizą MS.

7. Konfiguracja spektrometru masowego do analizy peptydów

UWAGA: Dla parametrów MS, zobacz Plik uzupełniający 1 (zaadaptowany z poprzedniej publikacji z laboratorium)14.

  1. Przed załadowaniem próbek peptydów do analizy MS należy rozpuścić suche granulki peptydów w 20 μl buforu do ładowania próbki i wykonać mikro BCA w celu ilościowego określenia stężenia odzyskanych peptydów.
  2. Przenieść rozpuszczone peptydy do szklanej fiolki i załadować 3 μg (oznaczone ilościowo z mikro BCA) peptydów do automatycznego podajnika próbek systemu UPLC.
  3. Załadować próbki do wentylowanej kolumny pułapki (kolumna C18 HPLC, 0,075 mm x 20 mm) o natężeniu przepływu 250 nL/min.
  4. Ustawić kolumnę pułapki w jednej linii z kolumną analityczną (0,075 μm x 500 mm) i przymocować końcówkę emitera do źródła jonizacji elektrorozpylania (ESI) poddanego natryskowi voltage 2000 V.
    UWAGA: W tym badaniu przeprowadza się ESI, w którym faza ruchoma jest poddawana jonizacji wysokonapięciowej do fazy gazowej. Wytworzony w ten sposób spray jest kierowany do komory próżniowej MS przez podgrzaną kapilarę. W próżni desolwatacja kropel i wyrzucanie jonów zachodzi w obecności ciepła i napięcia. Następnie jony są przyspieszane w kierunku analizatora masy w obecności środowiska o wysokim napięciu.
  5. Analizuj próbki w 2-godzinnych seriach akwizycji. Badanie to jest przeprowadzane przy użyciu akwizycji zależnej od danych z najbardziej intensywnym paradygmatem selekcji 20 najlepszych jonów prekursorowych.
    UWAGA: W akwizycji zależnej od danych w skanowaniu MS1 wykrywana jest ograniczona liczba peptydów prekursorowych i poddawana fragmentacji w celu analizy MS2. Jednak dynamiczne wykluczenie jest tutaj problematyczne, ponieważ bardzo obfite peptydy Aβ zostaną pominięte ze względu na fragmentację i spowodują niedoszacowanie ich ilości.
  6. W celu bezwzględnego oznaczania ilościowego peptydów Aβ należy ponownie przeprowadzić te same próbki przy użyciu docelowej metody MS/MS. Na potrzeby tego badania przygotowano wyczerpującą listę wszystkich współczynników m/z dla różnych możliwych tryptycznych peptydów Aβ dla modeli myszy knock-in APP (patrz tabela uzupełniająca 1). Inne grupy powinny przygotować podobną listę zgodnie z dostępnym modelem mysim i możliwymi peptydami wygenerowanymi z białka będącego przedmiotem zainteresowania (np. Aβ dla AD).
    UWAGA: Aby rozwiązać problem wykluczenia peptydów o dużej obfitości, należy zastosować podejście ukierunkowane, dostarczając listę wybranych wartości m/z odpowiadających peptydom tryptycznym Aβ. Podejście to rozwiązuje problem zależnego od danych wykluczenia peptydów Aβ i może określić ilościowo bezwzględne ilości różnych monomerów (peptydów Aβ38, 40 i 42) z wysoką rozdzielczością.
  7. Spektrometr mas generuje widma MS próbek peptydów i zapisuje pliki surowych danych w katalogu docelowym. Użyj tego pliku do przeprowadzenia dopasowania spektralnego przy użyciu dobrze znanych narzędzi statystycznych i bioinformatycznych. Dostępnych jest wiele narzędzi do przeszukiwania i analizy baz danych w trybie online i offline.

8. Analiza danych MS

  1. Wyodrębnij pliki MS1 i MS2 za pomocą narzędzia Rawconverter w trybie offline (http://www.fields.scripps.edu/rawconv/).
  2. Przeprowadzaj identyfikację, kwantyfikację i szczegółowe analizy danych w internetowej wyszukiwarce danych MS. W tym badaniu wykorzystano Integrated Proteomics Pipeline - IP2 (Bruker: http://www.integratedproteomics.com/).
    UWAGA: Dostępnych jest kilka innych narzędzi do analizy danych MS online i offline, z których można również korzystać, takich jak MaxQuant (https://www.maxquant.org/).
  3. Po przesłaniu plików MS1 i MS2 wybierz zaktualizowaną bazę danych proteomu myszy. W tym przypadku wybrano zaktualizowaną bazę danych myszy zawierającą dodatkowe mutacje specyficzne dla aplikacji do identyfikacji peptydów przy użyciu algorytmów ProLuCId i SEQUEST11.
  4. W systemie analizy IP2 należy wybrać parametry domyślne i zmodyfikować je zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi. W tym badaniu zastosowano tolerancję masową peptydu wynoszącą 50 ppm dla prekursora i 600 ppm dla fragmentów (patrz plik uzupełniający 1 dla innych parametrów stosowanych w IP2).
    UWAGA: Badacze mogą modyfikować parametry wyszukiwania zgodnie z celami eksperymentu. Na przykład, aby zidentyfikować modyfikacje potranslacyjne, dodaj wartości modyfikacji różnicowej dla różnych PTM (np. ubikwitynacja, SUMOylacja, fosforylacja).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym opracowaniu przedstawiono szczegółową metodę izolacji i oczyszczania włókien amyloidowych z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody ultracentryfugacji w gradiencie gęstości sacharozy (patrz Rycina 1). Innowacja w tej metodzie polega na wprowadzeniu etapów płukania za pomocą sonikacji w kąpieli ultradźwiękowej, a następnie solubilizacji w SDS, co pozwala na usunięcie wielu słabo związanych białek z włókien amyloidowych, które współoczyszczają się z gęstymi i czystymi włóknami. Etap ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Osiągnięcie jasnego zrozumienia struktury i składu amyloidu jest wyzwaniem dla biologów strukturalnych i biochemików ze względu na złożoność biologiczną i ograniczenia eksperymentalne w ekstrakcji oczyszczonych włókienek z tkanek mózgowych AD 16,17. Fibryle amyloidowe są polimorficzne na poziomie molekularnym, wykazując niejednorodną populację o różnej długości i złożoności18,19. Aby lepiej zrozumieć ich ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez R01AG061865 grantowe NIH dla R.J.V. i J.N.S. Autorzy dziękują członkom grupy badawczej Vassar i Savas z Northwestern University za ich wnikliwe dyskusje. Serdecznie dziękujemy również doktorom. Ansgar Seimer i Ralf Langen z Uniwersytetu Południowej Kalifornii za ich kluczowy wkład. Dziękujemy dr Faridzie Korabovej za przygotowanie próbki i obrazowanie mikroskopią elektronową z barwieniem ujemnym w Northwestern University Center for Advanced Microscopy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Acclaim PepMap 100 C18 Kolumna HPLC 0,075 mm x 20  mmThermo Scientific164535Można stosować alternatywne instrumenty, chemikalia i przeciwciała innych producentów
Wodorowęglan amonuSigma-Aldrich9830
anty-amyloid beta (1-16) 6E10Biolegend803001
anty-amyloid beta (17-24) Przeciwciało 4G8Biolegend800701
anty-amyloid beta (N koniec 82E1) przeciwciałoIBL America10323
anty-amyloidowe fibrylowe LOC  EMD MilliporeAB2287
Zestaw BCAThermo Fisher Scientific23225
Bioruptor Pico PlusDiagenodeB01020001
Chlorek WapniaSigma-Aldrich  C1016
KolagenazaSigma-AldrichC0130
Kompletny  Koktajl inhibitorów proteazySigma-Aldrich11697498001
Dnaza IThermo Fisher ScientificEN0521
EDTASigma-AldrichEDS
Chlorowodorek guanidynySigma-AldrichG4505
HyperSep C18 WkładyThermo Fisher Scientific60108-302
Zintegrowany rurociąg proteomiczny - Stopień ochrony IP2 http://www.integratedproteomics.com/
Jodoacetamid (IAA)Sigma-AldrichI1149
K54 System homogenizacji tkanek MotorCole ParmerGlas-Col 099C
MaxQuanthttps://www.maxquant.org/
Micro BCAkit Thermo Fisher Scientific23235
Nanoviper 75 μ m x 50  cmThermo Scientific164942
Optima L-90K UltrawirówkaBeckman CoulterBR-8101P-E
Orbitrap Fusion TribridMass SpectrometerThermo ScientificIQLAAEGAAPFADBMBCX
Kolumny obrotowe Pierce C18Thermo Fisher Scientific89870
Homogenizator tkankowy Precellys 24Bertin InstrumentsP000062-PEVO0-A
ProteaseMAX(TM) Surfaktant Wzmacniacz trypsynyPromegaV2072
RawConverterhttp://www.fields.scripps.edu/rawconv/
Azydek soduVWR97064-646
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Sigma-Aldrich74255
Mikrowirówka Sorvall Legend Micro 21RThermo Fisher Scientific
75002446-biegowy koncentrator próżniowyLabconco7315021
Tris-2-karboksyetylofosfiny (TCEP)Sigma-AldrichC4706-2G
Tris-HClThermo Fisher Scientific15568025
Trypsin Gold-Mass spec gradePromegaV5280
UltiMate 3000 RSLCnano SystemThermo Scientific
przeciwciało ULTIM3000RSLCNANO

Bibliografia

  1. Willbold, D., Strodel, B., Schröder, G. F., Hoyer, W., Heise, H. Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids. Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).
  2. Rambaran, R. N., Serpell, L. C. Amyloid fibrils: abnormal protein assembly. Prion. 2 (3), 112-117 (2008).
  3. Upadhyay, A., et al. Complex inclusion bodies and defective proteome hubs in neurodegenerative disease: New clues, new challenges. The Neuroscientist. , (2021).
  4. Greiner, E. R., Kelly, J. W., Palhano, F. L. Immunoprecipitation of amyloid fibrils by the use of an antibody that recognizes a generic epitope common to amyloid fibrils. PLOS ONE. 9 (8), 105433(2014).
  5. Kourelis, T. V., et al. A proteomic atlas of cardiac amyloid plaques. JACC: CardioOncology. 2 (4), 632-643 (2020).
  6. Mangione, P. P., et al. Increasing the accuracy of proteomic typing by decellularisation of amyloid tissue biopsies. Journal of Proteomics. 165, 113-118 (2017).
  7. Rostagno, A., Neubert, T. A., Ghiso, J. Unveiling brain Aβ heterogeneity through targeted proteomic analysis. Methods in Molecular Biology. 1779, 23-43 (2018).
  8. Roher, A. E., et al. Morphology and toxicity of Aβ-(1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer's disease. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20631-20635 (1996).
  9. Lu, J. -X., et al. Molecular structure of β-amyloid fibrils in Alzheimer's disease brain tissue. Cell. 154 (6), 1257-1268 (2013).
  10. Tycko, R. Solid-state NMR studies of amyloid fibril structure. Annual Review of Physical Chemistry. 62, 279-299 (2011).
  11. Saito, T., et al. Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease. Nature Neuroscience. 17 (5), 661-663 (2014).
  12. Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941(2021).
  13. Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics. Neuromethods. Li, K. 57, Humana Press. Totowa, NJ. (2011).
  14. Hark, T. J., et al. Pulse-chase proteomics of the App knockin mouse models of Alzheimer's disease reveals that synaptic dysfunction originates in presynaptic terminals. Cell Systems. 12 (2), 141-158 (2021).
  15. Liu, S., et al. Highly efficient intercellular spreading of protein misfolding mediated by viral ligand-receptor interactions. Nature Communications. 12 (1), 5739(2021).
  16. Toyama, B. H., Weissman, J. S. Amyloid structure: conformational diversity and consequences. Annual Review of Biochemistry. 80, 557-585 (2011).
  17. Sundaria, N., et al. Neurodegeneration & imperfect ageing: Technological limitations and challenges. Mechanisms of Ageing and Development. 200, 111574(2021).
  18. Cendrowska, U., et al. Unraveling the complexity of amyloid polymorphism using gold nanoparticles and cryo-EM. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (12), 6866-6874 (2020).
  19. Seuring, C., et al. Amyloid fibril polymorphism: almost identical on the atomic level, mesoscopically very different. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (8), 1783-1792 (2017).
  20. Close, W., et al. Physical basis of amyloid fibril polymorphism. Nature Communications. 9 (1), 699(2018).
  21. Tycko, R. Amyloid polymorphism: Structural basis and neurobiological relevance. Neuron. 86 (3), 632-645 (2015).
  22. Konstantoulea, K., et al. Heterotypic Amyloid β interactions facilitate amyloid assembly and modify amyloid structure. The EMBO Journal. 41, 108591(2022).
  23. Hondius, D. C., et al. Proteomics analysis identifies new markers associated with capillary cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 1-19 (2018).
  24. Luo, J., Wärmländer, S. K., Gräslund, A., Abrahams, J. P. Cross-interactions between the Alzheimer disease amyloid-β peptide and other amyloid proteins: a further aspect of the amyloid cascade hypothesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16485-16493 (2016).
  25. Hosp, F., et al. Spatiotemporal proteomic profiling of Huntington's disease inclusions reveals widespread loss of protein function. Cell Reports. 21 (8), 2291-2303 (2017).
  26. Wallace, E. W. J., et al. Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress. Cell. 162 (6), 1286-1298 (2015).
  27. Darling, A. L., Liu, Y., Oldfield, C. J., Uversky, V. N. Intrinsically disordered proteome of human membrane-less organelles. Proteomics. 18 (5-6), 1700193(2018).
  28. Kepchia, D., et al. Diverse proteins aggregate in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease brain. Alzheimer's Research & Therapy. 12 (1), 1-20 (2020).
  29. Espay, A. J., et al. Revisiting protein aggregation as pathogenic in sporadic Parkinson and Alzheimer diseases. Neurology. 92 (7), 329-337 (2019).
  30. Fändrich, M., Schmidt, M., Grigorieff, N. Recent progress in understanding Alzheimer's β-amyloid structures. Trends in Biochemical Sciences. 36 (6), 338-345 (2011).
  31. Bonnin, E. A., Fornasiero, E. F., Lange, F., Turck, C. W., Rizzoli, S. O. NanoSIMS observations of mouse retinal cells reveal strict metabolic controls on nitrogen turnover. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 1-10 (2021).
  32. Michno, W., et al. Following spatial Aβ aggregation dynamics in evolving Alzheimer's disease pathology by imaging stable isotope labeling kinetics. Science Advances. 7 (25), (2021).
  33. Toyama, B. H., et al. Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures. Cell. 154 (5), 971-982 (2013).
  34. Bomba-Warczak, E., Edassery, S. L., Hark, T. J., Savas, J. N. Long-lived mitochondrial cristae proteins in mouse heart and brain. Journal of Cell Biology. 220 (9), 202005193(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oczyszczanie w kien amyloidowychrdzenie blaszek amyloidowychgradient g sto ci sacharozyultrawirowaniespektrometria masekstrakcja z tkanki m zgowejsolubilizacja w SDSimmunoz ota mikroskopia elektronowapeptydy beta amyloidu

Powiązane artykuły