Artykuł metodologiczny

Wielokrotne dożylne dawkowanie bolusa i inwazyjna ocena hemodynamiczna w modelu nadciśnienia tętniczego płucnej myszy wywołanego niedotlenieniem

DOI:

10.3791/63839

⸱

11 listopada 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Yale University School of Medicine, 2Department of Vascular Surgery, The First Hospital of China Medical University, Key Laboratory of Pathogenesis, Prevention, and Therapeutics of Aortic Aneurysm, 3VasoRx Inc., 4Yale Cardiovascular Research Center, Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine, 5Department of Cell Biology, Yale University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół krok po kroku przeprowadza wielokrotne dożylne podawanie dawki bolusa i inwazyjne monitorowanie hemodynamiczne u myszy. Badacze mogą wykorzystać ten protokół do przyszłych badań przesiewowych związków terapeutycznych w kierunku nadciśnienia tętniczego płucnego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tętnicze nadciśnienie płucne (PAH) jest postępującą chorobą zagrażającą życiu, dotykającą głównie małych tętniczek płucnych. Obecnie nie ma lekarstwa na TNP. Ważne jest, aby odkryć nowe związki, które mogą być stosowane w leczeniu WWA. Model PAH indukowany hipoksją myszy jest szeroko stosowanym modelem do badań nad WWA. Model ten podsumowuje kliniczne objawy choroby WWA grupy 3 u ludzi i jest ważnym narzędziem badawczym do oceny skuteczności nowych eksperymentalnych terapii PAH. Badania z wykorzystaniem tego modelu często wymagają podawania związków u myszy. W przypadku związku, który musi być podawany bezpośrednio do krwiobiegu, optymalizacja podawania dożylnego (IV) jest kluczową częścią procedur eksperymentalnych. Idealnie byłoby, gdyby system iniekcji dożylnych umożliwiał wielokrotne wstrzyknięcia w określonym czasie. Chociaż model PAH wywołany hipoksją myszy jest bardzo popularny w wielu laboratoriach, wykonanie wielokrotnego dożylnego dożylnego dawkowania i inwazyjnej oceny hemodynamicznej w tym modelu jest technicznie trudne. W tym protokole przedstawiamy instrukcje krok po kroku, jak przeprowadzić wielokrotne dawkowanie bolusa dożylnego przez żyłę szyjną myszy oraz wykonać cewnikowanie tętnic i prawej komory w celu oceny hemodynamicznej w mysim modelu PAH wywołanym niedotlenieniem.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nadciśnienie tętnicze płucne (PAH) definiuje się jako średnie ciśnienie skurczowe w tętnicy płucnej większe niż 20 mmHg w spoczynku1,2. Jest to postępująca i śmiertelna choroba charakteryzująca się utrzymującym się wzrostem ciśnienia w tętnicy płucnej, prowadzącym do przeciążenia prawej komory i ostatecznie śmierci z powodu niewydolności prawej komory1. Obecnie nie ma lekarstwa na TNP.

Wykorzystanie zwierzęcych modeli nadciśnienia płucnego jest ważne dla testowania skuteczności eksperymentalnych terapii PAH. Wśród tych modeli, model PAH wywołany hipoksją myszy dostarczył kluczowych informacji na temat rozwoju choroby WWA u ludzi grupy 33,4. Badania z wykorzystaniem tego modelu często wymagają podawania związków myszom w celu oceny skuteczności i bezpieczeństwa nowego związku. Dlatego badacze potrzebują szczegółowej procedury eksperymentalnej do dawkowania związków i pomiarów hemodynamicznych, aby zapewnić spójność iniekcji i odtwarzalność pomiaru ciśnienia krwi od początku do końca.

Metody dożylnego wstrzykiwania (IV) i pomiaru ciśnienia krwi zostały opisane w literaturze5,6. W metodologii brakuje jednak ilustracji wizualnej i szczegółowego opisu. Poniżej przedstawiamy kluczowe kroki do udanego wstrzyknięcia bolusa dożylnego oraz dokładnego pomiaru i rejestracji ciśnienia krwi ogólnoustrojowego i prawej komory. Przedstawione tutaj procedury są ważnym źródłem informacji dla badaczy zainteresowanych platformą do podawania związków dożylnie w celu opracowania metody leczenia TNP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitety ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Yale.

1. Przygotowanie zwierząt, narzędzi, sprzętu do pomiaru ciśnienia krwi i komory do hipoksji

  1. Aklimatyzacja zwierząt.
    UWAGA: Zwierzętami doświadczalnymi wykorzystanymi do tego badania były samce, 8-tygodniowe myszy C57BL/6 o wadze 25-27 g. Przy szacowaniu liczby zwierząt potrzebnych do eksperymentu należy wziąć pod uwagę kilka czynników, w tym śmiertelność związaną z operacją, nieoczekiwane powikłania chirurgiczne i nagłą nieoczekiwaną śmierć. Użyj co najmniej 10 myszy na grupę, aby osiągnąć moc statystyczną i uniknąć badań o zbyt małej mocy.
    1. Po otrzymaniu zwierzęcia należy umieścić w wentylowanych klatkach dla gryzoni (grupy po pięć zwierząt w klatce) wyposażonych w odpowiednią ściółkę, karmę dla gryzoni i wodę. Pozwól zwierzętom zaaklimatyzować się w nowym środowisku (12-godzinny cykl jasno-ciemny w temperaturze 18-20 °C) przez co najmniej 3 dni.
    2. Losowo przypisz je do następujących grup: Normoxia (Grupa 1), hipoksja (Grupa 2) i hipoksja + miRNA 7C1/let-7 (Grupa 3).
  2. Przygotowanie narzędzi chirurgicznych i sprzętu do pomiaru ciśnienia krwi.
    1. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne przez autoklawowanie (Rysunek 1A).
    2. Przygotuj prowizoryczną platformę do wstrzykiwań z domowym stożkiem do znieczulenia nosa (Ryc. 1B), pakietami szwów (Rycina 1C) i sprzętem do zabiegu PAH (Ryc. 1D-F).
  3. Warunki eksperymentalne do indukcji nadciśnienia tętniczego płucnego (PAH).
    1. Ustaw zbiornik N2, czujnik tlenu i półszczelną komorę hipoksji (Rysunek 2A).
    2. Ustal nastawę 10%O2 w czujniku tlenu i pozwól systemowi osiągnąć stan ustalony (Rysunek 2B, C).
    3. Utrzymuj zwierzęta z hipoksją (grupa 2) i hipoksją + 7C1/let-7 miRNA (grupa 3) w niedotlenieniu (10%O2) przez 3 tygodnie. Po 3 tygodniach niedotlenienia umieść zwierzęta w warunkach normoksyjnych na 1 tydzień (Rysunek 2D). Grupa normoksyczna (Grupa 1) przebywa w normoksyi przez 4 tygodnie.
      UWAGA: (1) 3 tygodnie niedotlenienia, a następnie 1 tydzień normoksji to sprawdzona metoda rozwoju TNP i niewydolności prawej komory serca7. Czujnik tlenu wykrywa stężenieO2 wewnątrz półzamykanej komory hipoksji i koryguje je, wtłaczając gazN2 przez rurkę infuzyjną gazu.
    4. Zwierzęta należy badać codziennie przez cały czas trwania eksperymentu (3 tygodnie). Skonsultuj się z weterynarzem, jeśli zwierzęta wykazują oznaki niepokoju, takie jak dramatyczna utrata masy ciała i trudności w oddychaniu. Jeśli eutanazja jest konieczna w przypadku zwierząt znajdujących się w ciężkim stanie, należy wykluczyć zwierzę z badania.
      UWAGA: Narażenie na niedotlenienie powoduje utratę masy ciała myszy. Utrata masy ciała o 10% jest zwykle stosowana jako wiarygodny wskaźnik rozwoju PAH.
    5. Unikać szerokiego otwierania komory niedotlenienia. W celu czyszczenia klatki, uzupełniania jedzenia, zmiany butelek z wodą i podawania związku, otwieraj komory na nie więcej niż 1 godzinę tygodniowo.

2. Dożylne wstrzyknięcie bolusa przez żyłę szyjną

  1. Przygotowanie i znieczulenie myszy.
    1. Wyjmij klatki myszy z hipoksją (grupa 2) i hipoksja + 7C1/let-7 miRNA (grupa 3) z komory hipoksji i delikatnie wyjmij zwierzę z klatki.
      UWAGA: Schemat dawkowania miRNA 7C1/let-7 (1,5 mg/kg dożylnie/dawkę) to dwa razy w tygodniu przez 4 tygodnie leczenia. Zaleca się, aby badacze wyjęli z komory hipoksji klatki do leczenia hipoksji i hipoksji + związku podczas wstrzyknięcia dożylnego, aby upewnić się, że wszystkie zwierzęta otrzymują taką samą wielkość ekspozycji na hipoksję w przedziale czasu.
    2. Zważ mysz za pomocą precyzyjnej wagi i zapisz jej wagę (Rysunek 3A).
    3. Umieść mysz w komorze indukcyjnej znieczulenia podłączonej do parownika anestezjologicznego i zamknij ją (Rysunek 3B). Zapewnij wsparcie termiczne i nałóż smar do oczu na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Wystaw mysz na działanie 3% izofluranu aż do utraty przytomności (Rysunek 3C-D).
    4. Wyjmij mysz z komory i ogol sierść od szczęki do środka mostka doogonowo. Na boki ogolić futro od kątów żuchwy, przez boki szyi i w kierunku ramion (Rysunek 3E).
    5. Umieść mysz znieczuloną izofluranem w pozycji leżącej (brzuchem do góry) na platformie iniekcyjnej pod mikroskopem preparacyjnym. Utrzymuj znieczulenie przez stożek nosowy z 1,5% izofluranem i delikatnie przytrzymuj cztery nogi taśmą samoprzylepną, aby unieruchomić ciało (Rysunek 3F).
    6. Zastosuj szkodliwy bodziec (np. uszczypnięcie palca u nogi) za pomocą prostych kleszczy, aby zapewnić odpowiedni poziom znieczulenia. Znieczulona mysz nie powinna reagować na stymulację przed i w trakcie zabiegu chirurgicznego.
  2. Przygotowanie środka do wstrzykiwań.
    1. Przygotować pojedynczą dawkę środka do wstrzykiwań w dawce 1,5 mg/kg mc. w sterylnych warunkach.
      UWAGA: Podgrzej środek do wstrzykiwań do temperatury pokojowej (RT), ponieważ wstrzykiwanie zimnych substancji może powodować dyskomfort i spadek temperatury ciała myszy (jeśli nie spowoduje to uszkodzenia związku). Optymalna dawka i czas trwania miRNA związku 7C1/let-7 użyte w tym badaniu są oparte na wcześniejszych publikacjach8,9.
    2. Do sterylnej strzykawki jednorazowego należy naładować objętość do wstrzyknięcia. Trzymać strzykawkę w pozycji pionowej i przesunąć tłok, aby usunąć powietrze ze strzykawki. Nie używać ponownie strzykawki.
    3. Należy ograniczyć objętość wstrzyknięcia do 200 μl u myszy o masie 25 g, aby zmniejszyć częstość występowania hemodilucji i nieprawidłowego wpływu na pracę serca u zwierząt. Jeśli wymagana jest większa objętość, należy podzielić związek do wstrzykiwań na dwie wstrzyknięcia w odstępie 10 minut.
  3. Przygotuj mysz do wstrzyknięcia dożylnego.
    1. Delikatnie wyszoruj obszar operacyjny trzy razy trzema naprzemiennymi rundami roztworu jodu powidonu i 70% etanolu. Buprenorfinę (0,05 mg/kg, SQ) należy podać 30 minut przed zabiegiem chirurgicznym.
    2. Wykonaj 0,5 cm podłużne cięcie lekko na prawo od linii środkowej szyi za pomocą ostrza skalpela (Rysunek 3G).
    3. Użyj kleszczy, aby oddzielić tkankę mięśniową i tłuszczową, aby zlokalizować prawą żyłę szyjną zewnętrzną (Rysunek 3H).
      UWAGA: Miejsca wstrzyknięć należy zmieniać za każdym razem, aby uniknąć powstawania blizn.
    4. Użyj soczewki obiektywowej o dużej mocy, aby umożliwić łatwą wizualizację obszaru wtrysku (Rysunek 3I).
  4. Iniekcja dożylna
    1. Włóż sterylną igłę 28 G do żyły szyjnej ze skosem igły skierowanym do góry (Rysunek 3J, K).
      UWAGA: Iniekcja do żyły ogonowej jest alternatywą dla iniekcji do żyły szyjnej. Jednak ta technika jest trudna do przeprowadzenia wielokrotnego dawkowania ze względu na zmienność głębokości żył, koloru ogona myszy i twardości skóry.
    2. Powoli nacisnąć tłok strzykawki, aby wstrzyknąć związek do żyły. Pozwól, aby igła pozostała w żyle przez dodatkowe 10 sekund, aby zapobiec cofaniu się wstrzykiwacza (Rysunek 3L).
      UWAGA: Niebieskawy barwnik pozwala na łatwą wizualizację iniekcji. Nie należy dołączać barwnika do wstrzykiwania materiałów testowych. Niedokładne wstrzyknięcie spowoduje nagromadzenie niebieskawego barwnika wokół miejsca wstrzyknięcia dożylnego.
    3. Wyjmij igłę i użyj bawełnianego wacika, aby przyłożyć ucisk do miejsca wstrzyknięcia, aby zapobiec krwawieniu (Rysunek 3M).
    4. Zszyj skórę szwem 5-0 (Ryc. 3N). Po operacji przenieś zwierzę do ciepłego, czystego, suchego miejsca i podaj Meloksykam (1 mg/kg, SQ, q24h). Umieść zwierzę w czystej klatce regeneracyjnej bez ściółki, ale spód przykryty ręcznikiem papierowym.
      UWAGA: Mysz powinna zostać obudzona ze znieczulenia i odzyskać przytomność w ciągu 5 minut po powrocie do klatki rekonwalescencji. Monitoruj mysz pod kątem oznak niepokoju.
    5. Umieść zwierzęta z powrotem w ich domowej klatce i umieść klatkę myszy z powrotem w komorze niedotlenienia.
      UWAGA: Cała procedura, od znieczulenia myszy do zakończenia iniekcji do żyły szyjnej, trwa około 10-15 minut przez jednego eksperymentatora. Aby skrócić ekspozycję na normoksję u myszy, zaleca się, aby co najmniej dwóch badaczy współpracowało w celu przeprowadzenia procedury wstrzyknięcia żyły szyjnej.

3. Pomiar ciśnienia krwi

  1. Przygotuj przyrządy do pomiaru ciśnienia krwi.
    1. Namocz końcówkę cewnika 1,0 F w podgrzanym PBS o temperaturze 37 °C co najmniej 30 minut przed pomiarem hemodynamicznym (Rysunek 4A).
    2. Zmierz odległość od miejsca wprowadzenia cewnika do żądanego miejsca końcówki cewnika. Na przykład odległość między aortą wstępującą myszy a środkiem szyi wynosi około 1-1,2 cm. Odległość między prawą komorą serca a środkiem szyi wynosi około 2,3-2,8 cm.
    3. Zaznacz dwa oznaczenia odległości cewnika, aby zapewnić wizualne wskazanie głębokości wprowadzenia (Rysunek 4B).
    4. Podłącz cewnik do przetwornika ciśnienia, podłącz przetwornik ciśnienia do kanału wejściowego 1 w urządzeniu do akwizycji danych, włącz jednostkę sterującą ciśnieniem i objętością i zainicjuj oprogramowanie do analizy ciśnienia krwi do akwizycji danych. Utwórz nowy dokument analizy ciśnienia krwi i ustaw kanał 1 dla ciśnienia.
    5. Wykonaj kalibrację ciśnienia zgodnie z protokołem producenta. Pozwól, aby cała konfiguracja ustabilizowała się przez co najmniej 5 minut (Rysunek 4C).
    6. W oprogramowaniu do analizy ciśnienia krwi wybierz Konwersja jednostek z menu rozwijanego Kanał 1 (Rysunek 4D, czerwona strzałka).
    7. Ustaw domyślne wartości konwersji jednostek (Rysunek 4E).
      UWAGA: Ciśnienie krwi jest reprezentowane w milimetrach słupa rtęci (mmHg). Znormalizowane ciśnienie wyjściowe z jednostki sterującej ciśnieniem wynosi 1 V na 100 mmHg. 25 mmHg odpowiada wyjściu 0,25 V, a 100 mm Hg odpowiada wyjściu 1 V.
  2. Przygotuj mysz do zabiegu pomiaru ciśnienia krwi.
    1. Znieczulić mysz 3% inhalacją izofluranu przez stożek nosowy.
    2. Nałóż maść weterynaryjną bezpośrednio na powierzchnię oczu myszy, aby zapobiec wysuszeniu, ponieważ mysz nie może zamknąć oczu w znieczuleniu. Ogol sierść z szyi myszy pod narkozą.
    3. Wyszoruj ogolony obszar trzema naprzemiennymi rundami roztworu jodu powidonu i 70% wacikiem etanolowym. Umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej na platformie iniekcyjnej pod mikroskopem preparacyjnym. Umieść nos myszy w stożku nosowym, aby utrzymać znieczulenie (1,5% izofluranu) przez cały zabieg chirurgiczny.
    4. Przetestuj reakcję motoryczną znieczulonej myszy na szkodliwy bodziec. Znieczulona mysz nie powinna reagować na szkodliwy bodziec przed i w trakcie operacji.
      UWAGA: Wziewne (izofluran) i iniekcyjne (ketamina/ksylazyna) środki znieczulające mogą obniżać ciśnienie krwi. Ogólnie rzecz biorąc, znieczulenie wziewne izofluranem ma niewielki wpływ na obniżenie ciśnienia krwi niż ketamina/ksylazyna. Dlatego izofluran jest preferowanym środkiem znieczulającym wziewnym w stosunku do ketaminy/ksylazyny. Osiągnięcie odpowiedniej głębokości znieczulenia ma kluczowe znaczenie dla dokładnych i powtarzalnych pomiarów hemodynamicznych. Badacz musi utrzymywać stałą głębokość znieczulenia dla każdej myszy.
  3. Cewnikowanie aorty wstępującej
    1. Zastosuj szkodliwy bodziec (np. szczypanie palca u nogi) za pomocą prostych kleszczy, aby zapewnić odpowiedni poziom znieczulenia. Wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry od żuchwy do mostka (Ryc. 5A).
    2. Oddziel gruczoły ślinowe i odsłoń tchawicę (Ryc. 5B).
    3. Użyj kleszczy, aby oczyścić tkankę miękką wzdłuż naczyń, aby odsłonić prawą tętnicę szyjną i prawą żyłę szyjną zewnętrzną (Ryc. 5C).
    4. Umieść 0,5 ml PBS w jamie, aby spowolnić rozwój skurczu naczyń podczas manipulowania tętnicą szyjną.
    5. Ostrożnie odizoluj 5 mm odcinek prawej tętnicy szyjnej. Umieść kawałek sterylnego białego papieru pod naczyniem jako tło, aby tętnica była bardziej widoczna (Rysunek 5D).
      UWAGA: Ostrożnie oddziel nerw błędny (biały) od tętnicy i upewnij się, że nie przeciąć ani nie uszkodzić nerwu lub tętnicy.
    6. Korzystanie z 8-0 Zszyj zawiąż stały węzeł , aby zamknąć czaszkowy koniec naczynia (Rysunek 5E).
    7. Zawiąż pierwszy luźny węzeł (#2), aby tymczasowo zablokować przepływ krwi z aorty. Następnie zawiąż drugi luźny węzeł między pierwszymi dwoma szwami (Rysunek 5F). Drugi luźny węzeł (#3) zostanie użyty do szybkiego zabezpieczenia cewnika po umieszczeniu.
    8. Za pomocą igły 25 G wykonaj mały otwór, wystarczająco duży, aby przejść przez cewnik, w linii z naczyniem między ligaturami #3 i #1 (Rysunek 5G).
      UWAGA: Tętnice szyjne przenoszą natlenioną krew z serca i mają bardzo wysokie ciśnienie. Jeśli tętnica szyjna zostanie przecięta, ciśnienie to spowoduje wytrysk krwi (Rysunek 5H).
    9. Przytrzymaj cewnik w odległości 1.5 cala od końcówki i delikatnie włóż końcówkę cewnika przez otwór tętnicy (znak X). Zaciśnij środkowy węzeł szwu wokół cewnika i naczynia, które nadal umożliwia przejście cewnika (Rysunek 5I-J).
      UWAGA: Ten krok wymaga praktyki. Potencjalne powikłania związane z tym krokiem obejmują krwawienie w miejscu wprowadzenia cewnika i skurcz naczyń krwionośnych. Kiedy dochodzi do krwawienia, utrata krwi z tętnicy krwawiącej zmniejsza objętość krwi, co prowadzi do poważnego spadku ogólnoustrojowego ciśnienia krwi. Ze względu na ciężkość zwierzę osiągnęło humanitarny punkt końcowy i musi zostać poddane eutanazji. W przypadku mechanicznie wywołanego skurczu naczyń krwionośnych występuje zwykle podczas wprowadzania cewnika spowodowanego uporczywym skurczem naczyń krwionośnych. Powoduje to, że otwór naczynia krwionośnego jest mniejszy i zapobiega przesuwaniu się cewnika do tętnicy szyjnej. Nie należy używać nadmiernej siły przeciwstawiającej opór w celu przesunięcia cewnika. W przypadku wystąpienia umiarkowanego lub ciężkiego oporu związanego ze skurczem naczyń krwionośnych spróbuj ponownie za chwilę lub użyj mniejszego cewnika (np. 1,0 F). Doświadczeni mikrochirurdzy mogą osiągnąć 100% skuteczność cewnikowania aorty wstępującej.
    10. Po tym, jak cewnik przejdzie przez pierwszy luźny węzeł za pomocą końcówki czujnika, zapnij drugi luźny węzeł mocniej, aby zabezpieczyć cewnik i delikatnie zwolnij pierwszy luźny węzeł (Rysunek 5K, L).
    11. Kontynuuj wprowadzanie cewnika w kierunku aorty wstępującej zgodnie ze znakiem na cewniku (Rysunek 4B), aż analiza ciśnienia pokaże profil ciśnienia tętniczego krwi (Rysunek 5M). Rejestruj dane dotyczące ogólnoustrojowego ciśnienia krwi (SBP) za pomocą systemu akwizycji danych i oprogramowania.
    12. Poluzuj środkowy węzeł szwu , aby umożliwić wyciągnięcie cewnika (Rysunek 5N).
    13. Zawiąż środkowy węzeł szwu wokół naczynia przed wyciągnięciem cewnika z tętnicy szyjnej (Rysunek 5O-P).
    14. Umieść cewnik w PBS.
  4. Cewnikowanie prawego serca.
    1. Ostrożnie odizoluj prawą zewnętrzną żyłę szyjną od otaczającej tkanki łącznej i podwiąż wszystkie małe gałęzie za pomocą 8-0 szew (niebieskie groty strzałek) (Rysunek 6A).
      UWAGA: W przypadku cewnikowania prawego serca dostęp do serca jest powszechnie uzyskiwany przez prawą żyłę szyjną.
    2. Korzystanie z 8-0 zszyć, zawiązać stały węzeł , aby zamknąć czaszkowy koniec naczynia (Ryc. 6B). Następnie zawiąż luźny węzeł na ogonowym końcu naczynia (Rysunek 6C).
    3. Użyj igły 25 G, aby zrobić mały otwór proksymalnie do stałego węzła (Rysunek 6D).
      UWAGA: Żyły szyjne przenoszą odtlenioną krew do serca i mają niskie ciśnienie. Jeśli żyła szyjna zostanie przecięta, krew nie wytryśnie (Ryc. 6D, E).
    4. Przytrzymaj cewnik i włóż cewnik do nacięcia żyły (znak X) (Rysunek 6E) i zaciśnij węzeł ogonowy wokół cewnika i naczynia (Rysunek 6F).
    5. Powoli i delikatnie wepchnij cewnik do prawego serca. Monitoruj głębokość końcówki cewnika na podstawie znaku cewnika (Rysunek 4B).
      UWAGA: Ocena ciśnienia skurczowego prawej komory (RVSP) u myszy z zamkniętą klatką piersiową jest wyzwaniem ze względu na złożoną anatomię i strukturę RV. Ten krok wymaga wysokiego poziomu wiedzy specjalistycznej i dużej praktyki. W rękach doświadczonego mikrochirurga wskaźnik powodzenia cewnikowania prawej komory może zbliżyć się do 90%.
    6. Oceń położenie końcówki cewnika zgodnie ze śledzeniem fal ciśnienia w oprogramowaniu. Gdy końcówka cewnika znajdzie się w prawej komorze, monitor pokaże typowy ślad RVSP (Rysunek 6G, H).
      UWAGA: Gdy kształt krzywych ciśnienia w płucach wygląda nietypowo (np. kolczaste krzywizny), oznacza to nieprawidłowe umiejscowienie cewnika. Dostosuj pozycję cewnika, delikatnie odciągając cewnik nieco do tyłu, a następnie powoli przesuwając cewnik do bardziej centralnej pozycji w prawej komorze. Aby uniknąć generowania artefaktów w danych badawczych, badacz powinien unikać długotrwałych (nie więcej niż 1 minut) lub powtarzających się prób (nie więcej niż dwie próby) cewnikowania prawej komory.
    7. Utrzymuj cewnik nieruchomo i zbieraj dane przez 5 minut.
    8. Po zakończeniu nagrywania ostrożnie wyciągnij cewnik i zawiąż węzeł ogonowy wokół naczynia (Rysunek 6I). Umieść cewnik z powrotem w roztworze PBS.
      UWAGA: Po zakończeniu eksperymentu oczyść cewnik 1% roztworem enzymów trawiennych zgodnie z instrukcjami producenta. Oprócz oceny stanu hemodynamicznego, badacze mogą pobrać serca i płuca do badania histopatologicznego PAH. Aby zapewnić skuteczność wielokrotnego dożylnego dawkowania w bolusie, badacze mogą wyizolować komórki śródbłonka płuc i zmierzyć poziomy miRNA let-7.

4. Analiza danych dotyczących ciśnienia krwi

  1. Sprawdź zapis ciśnienia krwi.
    1. Otwórz plik z danymi oprogramowania do analizy ciśnienia krwi (PAH JOVE.adicht).
    2. W kanale 1 wybierz obszar reprezentujący sygnał ciśnienia i umieść kursor kształtu fali na szczycie (znak X), aby zmierzyć amplitudę ciśnienia (Rysunek 7A).
    3. Określ maksymalną amplitudę fali ciśnienia. Reprezentuje to ciśnienie skurczowe (Rysunek 7A, czerwona strzałka).
    4. Wyodrębnij obszar zainteresowania (Rysunek 7B szary obszar) z obrazu, naciskając Shift + Command + 3 (dla komputerów Mac) lub Windows + Shift + S (dla komputerów z systemem Windows) i wklej go do pliku graficznego.
  2. Analiza statystyczna danych dotyczących ciśnienia krwi.
    1. Wprowadź dane dotyczące ciśnienia krwi poszczególnych myszy w oprogramowaniu do analizy statystycznej.
    2. Wykonaj niesparowany test t-Studenta do analizy statystycznej dwóch badanych grup (normoksja vs. hipoksja; niedotlenienie vs. hipoksja + 7C1/let-7 miRNA). Rozważ różnice w średnich wartościach tak znaczące jak p < 0,05.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Znieczulenie często obniża ciśnienie krwi. W związku z tym zastosowano minimalną dawkę znieczulenia, aby znieść ruchy w odpowiedzi na szkodliwy bodziec. Udany dostęp do prawej komory komory można zobrazować jako zmiany fali hemodynamicznej w różnych obszarach układów żylnych (Rysunek 8).

W tym badaniu, myszy zostały losowo przydzielone do grupy normoksycznej (21% O2) (n = 10), grupy niedotlenienia (10% O2) (n = 10) lub grupy leczenia hipoksją +...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stworzono kilka zwierzęcych modeli nadciśnienia płucnego w celu naśladowania zdarzeń zwiększonego oporu naczyniowego płuc u ludzi. Wśród nich model PAH wywołany hipoksją myszy jest szeroko stosowany do oceny skuteczności nowych eksperymentalnych terapii PAH. Badania z wykorzystaniem tego modelu często wymagają podawania związków myszom. W porównaniu z innymi opublikowanymi protokołami iniekcji dożylnej (IV) i inwazyjnej oceny hemodynamicznej, metoda ta zapewnia zarówno ilustrację wizualną, jak i szczegółowy opis.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

K Zsebo, M Simons i P-Y Chen są naukowymi założycielami i udziałowcami VasoRx, Inc. M Simons jest członkiem Naukowej Rady Doradczej VasoRx, Inc. HJ Duckers jest pracownikiem i udziałowcem VasoRx. Pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez Mikrogrant Joint Biology Consortium udzielony w ramach grantu NIH P30AR070253 (PYC), Cardiovascular Medical Research Education Fund (PYC), VasoRx, Inc. Fund (MS) oraz grantów NIH HL135582 (MS), HL152197 (MS).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw szwów prolenowych 5-0Ethicon8698Gdo zamykania nacięć
Zestaw szwów nylonowych 8-0AROSurgical InstrumentsT06A08N14-13do podwiązania
Komora indukcyjna anestezjologiiVETEQUIP#941444Trzyma zwierzę podczas ekspozycji na znieczulenie
interfejsu cewnika PEC-4DMillardo podłączenia cewnika Millar Mikro-Tip do PCU-2000
Filtry kanistrowewęglowe VETEQUIP#931401  aby pomóc usunąć  odpady znieczulające  gazy
Waciki bawełnianeMcKesson24-106do uciskania miejsca wstrzyknięcia w celu zapobieżenia krwawieniu
Cienkie nożyczkiFine Science Tools14059-11Narzędzia chirurgiczne
Strzykawka insulinowa 28 GEXEL26027do iniekcji dożylnej żyły szyjnej
IsofluraneCOVETRUS#029405do znieczulenia myszy
Oprogramowanie LabChart 8Narzędziado analizy danych
Cewnik ciśnieniowy Mikro-Tip SPR-1000 (1.0 F)Millardo inwazyjnego pomiaru ciśnienia krwi
Igła-25 GBD305124do wykonania małego otworu w naczyniu
Kontroler tlenu Czujnik tlenu ProOxBioSpherixE702do monitorowania stężenia tlenu
Jednostka kontroli ciśnienia PCU-2000 Millardo podłączenia cewnika Millar Mikro-Tip do PowerLab 4/35
PowerLab 4/35ADInstrumentsfor Data Acquisition.
Badacz musi podłączyć PowerLab 4/35 do osobistego laptopa zawierającego oprogramowanie LabChart 8 w celu działania.
Prism 8GraphPaddo statystyk i wykresów naukowych
Półzamykalna komora do hipoksjiBioSpherix: sztuczne środowisko, które symuluje warunki panujące na dużych wysokościach dla zwierząt
Nożyczki sprężynoweNarzędzia do nauki15021-15Narzędzia chirurgiczne
Pęseta Styl 4Mikroskopia elektronowa Nauki0302-4-PONarzędzia
chirurgiczneZwiązek VasoRx 7C1 / let-7 miRNAVasoRx, Inc.Lot# B2-L-16AprIV związek do wstrzykiwań
VIP 3000 Waporyzator weterynaryjnyCOLONIAL MEDICAL SUPPLY CO., INC.do dokładnego podawania znieczulenia

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McLaughlin, V. V., McGoon, M. D. Pulmonary arterial hypertension. Circulation. 114 (1), 1417-1431 (2006).
  2. Hoeper, M. M., Humbert, M. The new haemodynamic definition of pulmonary hypertension: evidence prevails, finally. European Respiratory Journal. 53 (3), 1900038(2019).
  3. Chen, Y., et al. A novel rat model of pulmonary hypertension induced by mono treatment with SU5416. Hypertension Research. 43 (8), 754-764 (2020).
  4. Xiong, M., et al. Mouse model of experimental pulmonary hypertension: Lung angiogram and right heart catheterization. Pulmonary Circulation. 11 (4), 20458940211041512(2021).
  5. Kmiotek, E. K., Baimel, C., Gill, K. J. Methods for intravenous self administration in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (70), e3739(2012).
  6. Potus, F., Martin, A. Y., Snetsinger, B., Archer, S. L. Biventricular assessment of cardiac function and pressure-volume loops by closed-chest catheterization in mice. Journal of Visualized Experiments. (160), e61088(2020).
  7. Bueno-Beti, C., Hadri, L., Hajjar, R. J., Sassi, Y. The Sugen 5416/hypoxia mouse model of pulmonary arterial hypertension. Experimental Models of Cardiovascular Diseases. 1816, 243-252 (2018).
  8. Chen, P. Y., et al. FGF regulates TGF-beta signaling and endothelial-to-mesenchymal transition via control of let-7 miRNA expression. Cell Reports. 2 (6), 1684-1696 (2012).
  9. Chen, P. Y., et al. Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis. Nature Metabolism. 1 (9), 912-926 (2019).
  10. Daugherty, A., Rateri, D., Hong, L., Balakrishnan, A. Measuring blood pressure in mice using volume pressure recording, a tail-cuff method. Journal of Visualized Experiments. (27), e1291(2009).
  11. Alam, M. A., Parks, C., Mancarella, S. Long-term blood pressure measurement in freely moving mice using telemetry. Journal of Visualized Experiments. (111), e53991(2016).
  12. Luo, F., et al. Invasive hemodynamic assessment for the right ventricular system and hypoxia-induced pulmonary arterial hypertension in mice. Journal of Visualized Experiments. (152), e60090(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Nadci nienie t tnicze p ucmysi model hipoksjiiniekcja do y y szyjnejkateteryzacja prawej komorykateteryzacja t tnicypomiar ci nienia t tniczegoprzesiew w rozwoju lek wwprowadzanie katetra

Powiązane artykuły