Obecny protokół opisuje nieopartą na emulsji metodę wytwarzania mikrożeli chitozanowo-genipinowych. Wielkość tych mikrożeli może być precyzyjnie kontrolowana i mogą one wykazywać pęcznienie zależne od pH, ulegać degradacji in vivo i być naładowane cząsteczkami terapeutycznymi, które uwalniają się z czasem w sposób ciągły, co czyni je bardzo istotnymi dla zastosowań inżynierii tkankowej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wytwarzanie mikrożeli chitozanowo-genipinowych o kontrolowanej wielkości i wolnych od emulsji do zastosowań w inżynierii tkankowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mikrożele chitozanowe cieszą się dużym zainteresowaniem w inżynierii tkankowej ze względu na ich szeroki zakres zastosowań, niski koszt i immunogenność. Jednak mikrożele chitozanowe są powszechnie wytwarzane przy użyciu metod emulsyjnych, które wymagają płukania rozpuszczalnikami organicznymi, które są toksyczne i szkodliwe dla środowiska. Niniejszy protokół przedstawia szybką, niecytotoksyczną, nieopartą na emulsji metodę wytwarzania mikrożeli chitozanowo-genipinowych bez konieczności płukania rozpuszczalnikiem organicznym. Opisane tutaj mikrożele mogą być wytwarzane z precyzyjną kontrolą rozmiaru. Wykazują one przedłużone uwalnianie biomolekuł, co czyni je bardzo istotnymi dla inżynierii tkankowej, biomateriałów i medycyny regeneracyjnej. Chitozan jest sieciowany z genipiną w celu utworzenia sieci hydrożelowej, a następnie przepuszczany przez filtr strzykawkowy w celu wytworzenia mikrożeli. Mikrożele mogą być filtrowane w celu uzyskania różnych rozmiarów, a ponadto wykazują pęcznienie zależne od pH i z czasem ulegają enzymatycznej degradacji. Te mikrożele zostały wykorzystane w modelu uszkodzenia płytki wzrostu szczura i wykazano, że sprzyjają one zwiększonej naprawie tkanki chrzęstnej i wykazują całkowitą degradację po 28 dniach in vivo. Ze względu na niski koszt, wysoką wygodę i łatwość wytwarzania z materiałów cytokompatybilnych, te mikrożele chitozanowe stanowią ekscytującą i unikalną technologię w inżynierii tkankowej.
Wprowadzenie
Płytka wzrostu, znana również jako physis, to struktura chrząstki znajdująca się na końcu kości długich, która pośredniczy we wzroście u dzieci. Jeśli płytka wzrostowa zostanie uszkodzona, może powstać tkanka naprawcza znana jako "pręt kostny", która przerywa normalny wzrost i może powodować wady wzrostu lub deformacje kątowe. Dane epidemiologiczne wykazały, że 15%-30% wszystkich urazów szkieletu u dzieci jest związanych z płytką wzrostową. Powstawanie prętów kostnych występuje do 30% tych urazów, co sprawia, że urazy płytki wzrostowej i związane z nimi leczenie stanowią istotny problem kliniczny1,2,
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Kolorado w Denver. Do niniejszego badania wykorzystano 6-tygodniowe samce szczurów rasy Sprague-Dawley. Model uszkodzeń płytki wzrostu szczurów został stworzony na podstawie wcześniej opublikowanego raportu30.
1. Przygotowanie polimeru chitozanu
- Otrzymać oczyszczony i liofilizowany chitozan o niskiej masie cząsteczkowej (LMW) z dostępnych na rynku źródeł (patrz tabela materiałów).
- Do zlewki o pojemności 1 l dodać 495 ml podwójnie destylowanej wody....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Pomyślna synteza mikrożeli chitozanowych opiera się na reakcji sieciowania genipiny z chitozanem, w której biorą udział w szczególności grupy aminowe w łańcuchach polimerowych chitozanu. W przeciwieństwie do innych technik wytwarzania mikrożeli, metoda ta nie wymaga stosowania emulsji ani płukania rozpuszczalnikami i może być szybko i łatwo przeprowadzona przy użyciu niedrogiej aparatury. Charakterystycznym wskaźnikiem pomyślnej syntezy mikrożeli jest wyraźna zmiana barwy z białej na ciemnoniebieską po zmieszaniu chitoza.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Mikrożele były szeroko badane w ostatnich latach ze względu na ich wysoki poziom zastosowania do różnych celów, takich jak dostarczanie leków lub enkapsulacja komórek9. Łatwość wytwarzania konstruktów biomateriałowych w mikroskali ma istotne znaczenie w inżynierii tkankowej, ponieważ umożliwia naukowcom opracowywanie strategii opartych na hydrożelu w określonej skali i skali czasowej. Jednak większość metod wytwarzania mikrożeli chitozanowych wymaga drogiego sprzętu i odczynników, emulsji lub cyto.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institute of Health pod numerami nagród R03AR068087 i R21AR071585 oraz przez Fundację Boettchera (#11219) dla MDK. CBE było wspierane przez NIH/NCATS Colorado CTSA Grant Number TL1 TR001081.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kwas octowy | SigmaAldrich | AX0073 | |
| BD Strzykawka Luer-Lock | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
| Bü chner Funnel | Fisher Scientific | FB966F | średnicy 100 mm |
| Chitozan (niska masa cząsteczkowa) | SigmaAldrich | 448869 | 75-80% deacetylacja |
| Rurki membranowe do dializy | Fisher Scientific | 08-670-5C | 3500 MWCO |
| Etanol | SigmaAldrich | 493538 | |
| Genipin | SigmaAldrich | G4796 | |
| Heracell Inkubator 150i | ThermoFisher | 50116047 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Rekombinowany ludzki SDF-1a | Peprotech | 300-28A | |
| Rekombinowany ludzki TGF-b3 | Peprotech | 100-36E | |
| Bibuła filtracyjna Whatman klasy 540 | SigmaAldrich | Z241547 | 8 mm Rozmiar porów |
| Whatman Klasa 541 | SigmaAldrich | WHA1541055 | 22 mm rozmiar porów |
| Whatman Bibuła filtracyjna klasa 542 | SigmaAldrich | WHA1542185 | 2,7 mm rozmiar porów |
| Sito siatkowe | McMaster-Carr | 9317T86 | Nr 100 Siatka |
Bibliografia
- Mizuta, T., Benson, W. M., Foster, B. K., Morris, L. L. Statistical analysis of the incidence of physeal injuries. Journal of Pediatric Orthopaedics. 7 (5), 518-523 (1987).
- Mann, D. C., Rajmaira, S. Distribution....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
