Kompleksowe zrozumienie zmian chodu wywołanych bezczynnością u gryzoni

Brak aktywności fizycznej lub nieużywanie prowadzi do pogorszenia efektorów lokomotorycznych, takich jak zanik mięśni i utrata masy kostnej¹ i dekondycjonowanie całego ciała². Co więcej, ostatnio zauważono, że brak aktywności wpływa nie tylko na aspekty strukturalne elementów układu mięśniowo-szkieletowego, ale także na jakościowe aspekty ruchu. Na przykład, pozycje kończyn szczurów wystawionych na symulowane środowisko mikrograwitacji różniły się od tych u nienaruszonych zwierząt nawet 1 miesiąc po zakończeniu interwencji^3,4. Niemniej jednak niewiele zgłoszono na temat deficytów ruchu spowodowanych brakiem aktywności. Nie ustalono również w pełni kompleksowej charakterystyki ruchowej pogorszeń.

Obecny protokół demonstruje i omawia zastosowanie oceny kinematycznej do wizualizacji zmian ruchu, odnosząc się do deficytów ruchu chodu wywołanych nieużywaniem u szczurów poddanych odciążeniu kończyn tylnych.

Wykazano, że nadmierne wydłużenie kończyn podczas chodzenia po symulowanym środowisku mikrograwitacji obserwuje się zarówno u ludzi⁵ jak i zwierząt^4,6,7,8. Dlatego, aby zapewnić uniwersalność, skupiliśmy się w tym badaniu na ogólnych parametrach: kątach stawu kolanowego i skokowego oraz odległości pionowej między stawem śródstopno-paliczkowym a biodrem (w przybliżeniu odpowiadającej wysokości biodra) w środkowym punkcie fazy podporu (śródpostawy). W dalszej części dyskusji zasugerowano potencjalne zastosowania oceny kinematyki wideo.

Seria analiz kinematycznych może być skuteczną miarą oceny funkcjonalnych aspektów kontroli neuronalnej. Jednakże, mimo że analizy ruchu zostały opracowane na podstawie obserwacji śladów lub prostych pomiarów na przechwyconym wideo^9,10 do wielu systemów kamer^11,12, uniwersalne metody i parametry nie zostały jeszcze ustalone. Metoda przedstawiona w niniejszym badaniu ma na celu dostarczenie tej wspólnej analizie ruchu kompleksowych parametrów.

W poprzednim worku¹³, próbowaliśmy zilustrować zmiany chodu u szczurów z uszkodzeniami nerwowymi za pomocą kompleksowej analizy wideo. Jednak ogólnie rzecz biorąc, potencjalne wyniki analiz ruchu są często ograniczone do z góry określonych zmiennych dostarczonych w ramach analizy. Z tego powodu w niniejszym badaniu szczegółowo opisano, w jaki sposób uwzględnić parametry zdefiniowane przez użytkownika, które mają szerokie zastosowanie. Oceny kinematyczne z wykorzystaniem analiz wideo mogą być jeszcze bardziej przydatne, jeśli zostaną wdrożone odpowiednie parametry.

Obecne badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Doświadczalny Uniwersytetu w Kioto (Med Kyo 14033) i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Narodowego Instytutu Zdrowia (Przewodnik dla Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych, 8. wydanie). Do niniejszego badania wykorzystano 7-tygodniowe samce szczurów rasy Wistar. Schemat przedstawiający sekwencję procedur znajduje się w pliku uzupełniającym 1.

1. Zapoznanie szczurów z chodzeniem na bieżni

UWAGA: Proszę zapoznać się z poprzednio opublikowanym raportem¹³, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat procedury.

1. Umieść szczura na bieżni przeznaczonej dla gryzoni (patrz tabela materiałów). Podczas pierwszej sesji pozwól zwierzęciu zbadać bieżnię, aby przyzwyczaić się do otoczenia.
   UWAGA: Ten proces trwa około 5 minut.
2. Stopniowo zwiększaj prędkość pasa do pożądanego poziomu (20 cm/s) i wyprowadzaj szczura na spacer. W razie potrzeby użyj porażenia prądem na końcu bieżni¹⁴.
   UWAGA: Jedna sesja marszu trwa około 10-20 minut.
3. Powtarzaj ten proces co drugi dzień przez 1 tydzień lub częściej, jeśli zajdzie taka potrzeba^15,16,17.
   UWAGA: Rozpocznij okres zaznajamiania się 1 tydzień przed krokiem 2.
4. Trzymaj szczury w grupach w klatkach (2-3 szczury w każdej klatce) w 12-godzinnym cyklu jasno-ciemnym. Zapewnij jedzenie i wodę ad libitum.

2. Zastosowanie odciążania tylnych kończyn u szczurów i ustawianie znaczników stawów

UWAGA: Podnieś tylne kończyny szczura za pomocą nici i taśmy klejącej przymocowanej do ogona, jak opisano w poprzednich raportach^18,19,20. Upewnij się, że nić i taśma są przymocowane u podstawy ogona, aby zapobiec ślizganiu się skóry ogona. Dokładnie monitoruj zwierzęta i w razie potrzeby dostosuj wysokość rozładunku lub szczelność taśmy.

1. Pod 2-5% inhalacją izofluranu z maską znieczulającą, owiń pierwszą połowę 30-centymetrowego paska taśmy klejącej wokół bliższej części ogona szczura.
2. Złóż bawełnianą nić o długości 1 m (bawełniany sznurek kuchenny o średnicy około 1 mm) na pół. Zrób pętlę, zawiązując węzeł w złożonym punkcie środkowym 50 cm. Węzeł musi znajdować się około 5 cm od końcówki, aby pozostawić pętlę o obwodzie 10 cm.
3. Pozwól, aby pozostałe 15 cm taśmy samoprzylepnej przeszło raz przez pętlę nici, aby zabezpieczyć taśmę. Owiń pozostałą taśmę wokół dystalnej części ogona.
4. Zamocuj drugą końcówkę nici na górnej platformie klatki. Trzymaj zwierzęta w klatce, która jest wystarczająco wysoka, aby unieść ich tylne kończyny za ogony. Oprócz rozładunku należy zapewnić takie samo środowisko, jak w przypadku grupy Ctrl, takie jak żywność, woda i ściółka podłogowa.
5. Skonfiguruj oznaczniki połączeń i oprogramowanie (patrz tabela materiałów), wykonując poniższe czynności.
   UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat tego kroku, zobacz Wang et al.¹³.
   1. Pod wpływem 2-5% inhalacji izofluranu przymocuj do ogolonej skóry kolorowe półkuliste markery (o średnicy 3 mm) odpowiadające kostnym punktom orientacyjnym. Utrzymuj poziom izofluranu na jak najniższym poziomie, aby zapobiec bardzo głębokiemu znieczuleniu.
   2. Upewnij się, że punktami orientacyjnymi są przedni górny kręgosłup biodrowy (ASIS), krętarz większy (staw biodrowy), staw kolanowy (kolano), kostka boczna (kostka) i piąty staw śródstopno-paliczkowy (MTP)²¹.
      UWAGA: Pomaluj czubek palca, jeśli potrzebny jest kąt palca. Użyj markera olejnego na bazie oleju (patrz Tabela materiałów). Płynny klej jest preferowany jako klej, ponieważ płynna forma wysycha szybciej.

3. Śledzenie znaczników za pomocą przechwyconych filmów

1. Otwórz aplikację MotionRecorder (patrz Tabela materiałów) i włącz bieżnię. Umieść szczura na pasie bieżni.
   UWAGA: Cztery kamery do przechwytywania wideo (patrz Tabela materiałów) są rozmieszczone wzdłuż długich krawędzi bieżni: dwie kamery na każdej krawędzi, w odległości około 50 cm x 50 cm od siebie, skierowane w stronę środka obszaru pasa bieżni.
2. Zwiększ prędkość taśmy do 20 cm/s. Gdy szczur zacznie chodzić normalnie z żądaną prędkością, kliknij ikonę nagrywania, aby rozpocząć przechwytywanie wideo. Po uzyskaniu wystarczającej liczby kroków (5 kolejnych kroków, najlepiej 10 kroków) zatrzymaj przechwytywanie, klikając ponownie ikonę nagrywania.
   UWAGA: Zbierz dane o wielu zwierzętach w jednym eksperymencie. Spróbuj do pięciu razy dla każdego szczura. Jeśli szczur nie chodzi, złap innego i spróbuj pierwszego później. Szybkość przechwytywania kamery wynosiła 120 klatek/s.
3. Otwórz aplikację 3DCalculator (patrz Spis materiałów) i plik wideo, który chcesz przeanalizować.
4. Przytnij wideo, dostosowując poziomy suwak u góry, aby zawierał wystarczającą liczbę kolejnych kroków. Przechwycony obraz zmienia się, przeciągając ikony końcówek żółtego suwaka.
5. Aby przechwycić znaczniki, wybierz legendy znaczników, klikając legendy znaczników na modelu obrazu patyczka, przeciągając je do odpowiedniego znacznika na przechwyconym filmie i zwalniając przycisk. Ten proces przypisuje kolor znacznika do legendy znacznika na obrazku na rysunku na patyczku. Powtórz ten proces dla każdego znacznika, który ma być śledzony.
6. Kliknij ikonę Automatyczne śledzenie. Jeśli system nie śledzi dokładnie znaczników lub proces śledzenia zatrzymuje się z powodu utraty znacznika, przełącz się na tryb ręczny.
   UWAGA: Ten automatyczny proces nie zatrzymuje się, chyba że znaczniki zostaną pominięte. Jeśli zatrzymania zdarzają się częściej niż co kilka klatek, rozważ zmianę położenia utraconych znaczników.
7. Jeśli potrzebny jest tryb ręczny, kliknij ikonę Ręczny, aby przełączyć. Kliknij brakującą legendę znacznika na obrazie drążka i odpowiadający mu znacznik na filmie. Wideo jest kontynuowane z jedną klatką dla każdego kliknięcia w trybie ręcznym.
   UWAGA: Korzystaj z ogólnodostępnych aplikacji, które umożliwiają automatyczne klikanie, aby zapobiec zmęczeniu osób śledzących (digitalizujących) znaczniki (patrz Tabela materiałów).

4. Obliczanie pożądanych parametrów

1. Otwórz aplikację KineAnalyzer (patrz Spis materiałów) i załaduj plik.
2. Przejdź do menu Widok > Edytuj wzorzec znacznika. Otworzy się okno "Edycja główna znacznika".
   UWAGA: Przechwycone znaczniki mają proste numery, dopóki nie zostaną oznaczone.
3. Kliknij żądaną etykietę (punkt orientacyjny) na karcie znacznika, a następnie kliknij żądany kolor. Ten proces przypisuje każdy znacznik do określonego punktu orientacyjnego.
4. Przejdź do zakładki link. Utwórz linie, klikając kolejno dwa znaczniki. Proces ten tworzy linie, które odpowiadają każdej kończynie za pomocą oznaczonych znaczników.
5. Przypisz kolory do utworzonych linii, wybierając żądany kolor z kolumny Kolor.
6. Definiuj kąty, przypisując linie odniesienia/ruchome i kierunki kątów. Przejdź do zakładki kąt. Po nazwaniu kąta przypisz Wektor A (linia odniesienia) i Wektor B (linia ruchoma), klikając znaczniki odpowiadające każdemu punktowi orientacyjnemu. Następnie zdefiniuj kierunek kąta za pomocą wartości w sekcji operacji w tej samej zakładce.
   UWAGA: W niniejszym badaniu skupiono się głównie na parametrach w środkowej fazie podporu (w środkowej postawie): KSt (kąt kolana), ASt (kąt kostki), MHD (odległość biodra śródstopia: odpowiednik wysokości biodra, patrz następna sekcja). Kąt kolana i kąt stawu skokowego zdefiniowano jako kąt między kością udową i piszczelową oraz odpowiednio kością piszczelową i piątą kością śródstopia. Kąt 0° oznacza, że przegub był w pełni wygięty.
7. Na karcie Odległość zdefiniuj parametr odległości (MHD). Wybierz dwa odpowiednie znaczniki w sekcji Ustawienie odległości. Dostępne będą również trajektorie stawów w funkcji znormalizowanego cyklu krokowego.
   UWAGA: Definiowanie kątów/parametrów należy wykonać tylko raz. Ustawienia parametrów będą dostępne do późniejszych ocen po zakończeniu procesu definiowania.

12 zwierząt zostało losowo przydzielonych do jednej z dwóch grup: grupy rozładunkowej (UL, n = 6) lub grupy kontrolnej (Ctrl, n = 6). W grupie UL tylne kończyny zwierząt były rozładowywane za ogon przez 2 tygodnie (okres UL), podczas gdy zwierzęta z grupy Ctrl pozostawiono wolne. 2 tygodnie po rozładunku grupa UL wykazała wyraźny wzorzec chodu w porównaniu z grupą Ctrl. Rysunek 1 pokazuje znormalizowane trajektorie stawów reprezentatywnych podmiotów. Podczas fazy podporu grupa UL wykazywała dalsze wyprosty w kolanie i kostce (tj. zgięcie podeszwowe kostki) niż grupa Ctrl, zwana "chodzeniem na palcach"3,16. Celem tego badania było określenie kompleksowej charakterystyki tych pogorszeń ruchomości. Aby wyjaśnić miary ilościowe z tych ogólnych wyników, wdrożono trzy parametry, jak wspomniano powyżej: KSt, kąt kolana w środkowej pozycji; ASt, kąt kostki; MHD, odległość śródstopia biodra (odległość pionowa między piątym stawem śródstopno-paliczkowym a stawem biodrowym), która jest praktycznie równa wysokości stawu biodrowego w połowie stawu.

Po 2 tygodniach (2 tygodnie po rozładowaniu), zarówno KSt, jak i ASt grupy UL były znacznie większe niż te z grupy Ctrl (Rysunek 2A,B, niesparowany test t: p < 0,01). Ponadto MHD było znacznie wyższe w grupie UL (Rysunek 3, niesparowany test t: p < 0,01). Pozycja łapy w pozycji środkowej jest pokazana na rysunku uzupełniającym 1.

Mniejsza aktywność spowodowana rozładowaniem może spowodować zmiany neuronalne22,23,24,25. Zmiany te mogą prowadzić do pogorszenia cech funkcjonalnych układu ruchu3,4 oraz cech układu mięśniowo-szkieletowego. Znaczące zmiany w parametrach opisanych powyżej można przypisać tym zmianom neuronalnym.

Rysunek 1: Znormalizowane trajektorie stawów reprezentatywnych podmiotów. Rzędna jest dostosowywana w taki sposób, aby trajektorie na diagramie pojawiały się w przybliżeniu w środku. (A) Stawy kolanowe i (B) skokowe w grupie odciążającej wykazywały dalsze wyprostowanie (zgięcie podeszwowe kostki) niż grupa kontrolna w fazie podporu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Kąty stawów kolanowych i skokowych w środkowej pozycji. Grupa rozładowująca wykazała istotnie większe kąty zarówno w (A) KSt (kolano), jak i (B) Ast (kostka) niż grupa kontrolna (niesparowany test t: p < 0,01). Słupek błędu reprezentuje 95% przedział ufności. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Wysokość stawu biodrowego w środkowej pozycji. Odległość śródstopia w stawie biodrowym w grupie odciążającej była istotnie wyższa niż w grupie kontrolnej (niesparowany test t: p < 0,01). Słupek błędu reprezentuje 95% przedział ufności. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Schemat przedstawiający sekwencję procedur. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 1: Pozycja łapy szczura w stanie śródziemnym. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowe wideo 1: Śledzenie kroków od dołu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dodatkowy film 2: Ocena ruchów dosięgnięcia. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów.