Artykuł metodologiczny

Generowanie sfer 3D i kultur 2D granicy faz powietrze-ciecz indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek nabłonka pęcherzyków płucnych typu 2 pochodzących z ludzkich komórek macierzystych

DOI:

10.3791/63875

⸱

15 kwietnia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Regenerative Medicine, Boston University and Boston Medical Center, 2The Pulmonary Center and Department of Medicine, Boston University School of Medicine, 3QIMR Berghofer Medical Research Institute

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki nabłonkowe typu 2 z pęcherzyków płucnych typu 2 (iAT2). Komórki te mogą być hodowane jako samoodnawiające się kulki w hodowli 3D lub przystosowane do hodowli na granicy faz powietrze-ciecz (ALI).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W płucach nabłonek pęcherzyków płucnych stanowi fizyczną barierę przed bodźcami środowiskowymi i odgrywa istotną rolę w homeostazie i chorobie. Komórki nabłonka pęcherzyków płucnych typu 2 (AT2) są fakultatywnymi przodkami dystalnego nabłonka płuc. Dysfunkcja i uszkodzenie AT2 mogą wynikać z różnych chorób płuc i przyczyniać się do nich. Lepsze zrozumienie biologii AT2 ma zatem kluczowe znaczenie dla zrozumienia biologii i chorób płuc; jednak pierwotne ludzkie AT2 są na ogół trudne do wyizolowania i mają ograniczoną podaż. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, za pomocą protokołu ukierunkowanego różnicowania, który podsumowuje rozwój płuc płuc typu 2 pochodzącego z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), można wygenerować za pomocą protokołu ukierunkowanego różnicowania, który podsumowuje rozwój płuc in vivo. iAT2 rosną w warunkach wolnych od karmienia, dzielą program transkryptomiczny z dorosłymi pierwotnymi AT2 i wykonują kluczowe funkcje AT2, takie jak produkcja, pakowanie i wydzielanie środka powierzchniowo czynnego. Protokół ten szczegółowo opisuje metody utrzymywania samoodnawiających się iAT2 poprzez szeregowe pasażowanie w kulturze trójwymiarowej (3D) lub adaptację iAT2 do hodowli na granicy faz powietrze-ciecz (ALI). Jednokomórkowa zawiesina iAT2 jest generowana przed posiewem w 3D rozpuszczonej matrycy błony podstawnej (zwanej dalej "matrycą"), gdzie samoorganizują się w jednowarstwowe kule nabłonkowe. iAT2 w hodowli 3D mogą być seryjnie dysocjowane na zawiesiny jednokomórkowe, które mają być pasażowane lub posiane w hodowli 2D ALI. W hodowli ALI iAT2 tworzą spolaryzowaną monowarstwę z powierzchnią wierzchołkową wystawioną na działanie powietrza, dzięki czemu platforma ta jest łatwo podatna na ekspozycje środowiskowe. W związku z tym protokół ten generuje niewyczerpany zapas iAT2, wytwarzając ponad 1 x 1030 komórek na komórkę wejściową w ciągu 15 przejść, zachowując program AT2 wskazywany przez wyrażenieSFTPC tdTomato. Uzyskane w ten sposób komórki stanowią powtarzalną i istotną platformę, którą można zastosować do badania mutacji genetycznych, modelowania ekspozycji środowiskowych lub badań przesiewowych leków.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W płucach, drogi oddechowe i komórki nabłonka pęcherzyków płucnych są pierwszymi, które napotykają wdychane ekspozycje środowiskowe, w tym patogeny przenoszone przez wdychane aerozole i szkodliwe bodźce, takie jak dym papierosowy. Komórki nabłonka pęcherzyków płucnych typu 2 (AT2) są niezbędne do utrzymania homeostazy płuc, ponieważ są fakultatywnymi przodkami dystalnego nabłonka płuc, wytwarzają środki powierzchniowo czynne w celu zmniejszenia napięcia powierzchniowego pęcherzyków płucnych i wywołują wrodzoną odpowiedź immunologiczną na narażenie wziewne1,2. Jednak dysfunkcja AT2 może wynikać z uszkodzeń płuc lub mutacji w genach, które są selektywnie wyrażane w AT2, takich jak SFTPC, SFTPB i ABCA33,4,5. Poprzednie podejścia do badania tych mutacji genetycznych opierały się na modelach mysich6 lub zmodyfikowanych, zawierających mutacje wektorach wprowadzonych do unieśmiertelnionych linii komórkowych7. W związku z tym potrzebne są platformy, które mogą modelować wpływ zaburzeń genetycznych i środowiskowych na AT2 w fizjologicznie odpowiednich typach komórek oraz w produktywnym systemie in vitro, aby lepiej zrozumieć rolę, jaką AT2 odgrywają w zdrowiu i chorobie.

Jeśli chodzi o modelowanie ekspozycji w powietrzu, hodowle komórek nabłonka pierwotnego nabłonka dróg oddechowych na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) zostały z powodzeniem wykorzystane do ujawnienia kluczowych reakcji molekularnych na dym papierosowy8 oraz do modelowania infekcji dróg oddechowych9,10. Porównywalny system hodowli ALI dla nabłonka pęcherzyków płucnych, kluczowego miejsca infekcji lub urazu w chorobie, jest znacznie mniej rozwinięty w porównaniu z modelowym systemem nabłonka dróg oddechowych. Unieśmiertelnione linie komórkowe zostały wyhodowane w ALI jako proxy dla nabłonka pęcherzyków płucnych11,12, ale te linie komórkowe są transkryptomicznie różne od pierwotnych komórek nabłonka pęcherzyków płucnych13 i brakuje im kluczowej maszynerii komórkowej, takiej jak zdolność do wydzielania środków powierzchniowo czynnych lub tworzenia ścisłych połączeń w ALI12. Pierwotne ludzkie AT2 mogą być hodowane w sferach 3D w obecności fibroblastów1,14, ale podlegają ograniczeniom, w tym ograniczonemu dostępowi do płuc eksplantatów i ich tendencji do starzenia się lub utraty fenotypu komórkowego w większości dotychczasowych kultur. Cechy te stanowią barierę dla powszechnego przyjęcia pierwotnych badań in vitro AT2, chociaż ostatnio poczyniono postępy w optymalizacji kultur 3D bez karmienia w celu ekspansji pierwotnych AT2s15,16,17,18.

Protokoły ukierunkowanego różnicowania zostały opracowane w celu podsumowania in vivo kamieni milowych rozwoju w celu wygenerowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) pochodzących z komórek nabłonka pęcherzyków płucnych typu 2 (iAT2s)19. IAT2 rosną jako samoodnawiające się kulki w hodowli 3D bez surowicy w zdefiniowanym pożywce zawierającej CHIR99021, KGF, deksametazon, cAMP i 3-izobutylo-1-metyloksantynę (IBMX), określaną jako "CK + DCI"19, w przypadku braku karmników fibroblastów i może być hodowany przez >20 pasaży20,21. Co więcej, iAT2 dzielą program transkryptomiczny z pierwotnymi AT2 dorosłego człowieka, tworzą ciała blaszkowate oraz produkują i pakują surfaktant19,21,22. Protokół ten szczegółowo opisuje szeregowe przechodzenie iAT2 poprzez dysocjację komórek do zawiesiny pojedynczej komórki. W tym momencie iAT2 mogą być ponownie powlekane i dalej rozwijane w kulturze 3D lub powlekane w kulturze 2D ALI 23. Metody te mogą być wykorzystane do badania wewnętrznej biologii AT2 w homeostazie i chorobie20,22 oraz do badania wpływu związków lub bodźców na skalowalnej, fizjologicznie istotnej platformie23,24, jak to zostało wcześniej pokazane.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty polegające na różnicowaniu ludzkich linii iPSC zostały przeprowadzone zgodnie z Institutional Review Board of Boston University (protokół H33122). Fibroblasty skórne, pozyskane w celu przeprogramowania na iPSC, zostały pozyskane od dawcy za pisemną świadomą zgodą, za zgodą Biura Ochrony Badań Naukowych nad Ludźmi Washington University School of Medicine, St. Louis, MO. Przeprogramowane iPSC zostały wygenerowane w Centrum Medycyny Regeneracyjnej na Uniwersytecie Bostońskim i Boston Medical Center w Bostonie.

1. Dysocjacja pęcherzyków płucnych

  1. Przygotować kompletne pożywki różnicujące bez surowicy (cSFDM) zgodnie ze składem podanym w Tabeli 1.
  2. Przygotuj nośniki CK + DCI w przygotowanej bazie cSFDM zgodnie z tabelą 2.
  3. Rozmrozić matrycę 2D (zakwalifikowaną do przeszczepu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych) i/lub 3D (o obniżonym współczynniku wzrostu) na lodzie, zgodnie z wymaganiami dla potrzeb doświadczalnych.
  4. Odessać całe podłoże CK + DCI za pomocą pipety lub pipety aspirującej z próżnią z kropelek matrycy 3D zawierających pęcherzyki pęcherzykowe, pochodzących z ukierunkowanego różnicowania19, w płytce 12-dołkowej.
  5. Dodać 1 ml dypazy (2 mg/ml) na kroplę. Delikatnie odpipetować kroplę do kropli za pomocą pipety P1000. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, pipetując raz w górę i w dół po 30 minutach.
  6. Przenieść zdysocjowane organoidy (z kroku 1.5) z jednej kropli matrycy w dypazie do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Do umycia dodaj 10 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco firmy Iscove (IMDM, patrz tabela materiałów).
  7. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant za pomocą pipety lub pipety aspiracyjnej z podciśnieniem, pozostawiając jak najmniej supernatantu.
    UWAGA: Ważne jest, aby usunąć całą dyspazę, ponieważ pozostała dypaza może rozpuścić matrycę, do której następnie zostaną zasiane komórki. Jeśli nad osadem widoczne jest wyraźne zamglenie, oznacza to, że dypaza nie rozpuściła całkowicie matrycy i można dodać więcej dypazy do osadu przez kolejne 20-30 minut w temperaturze 37 °C.
  8. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml 0,05% trypsyny na kroplę i przenieść z powrotem na płytkę 12-dołkową. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 12-15 min. Obserwuj dysocjację pod mikroskopem. Na tym etapie należy unikać nadmiernego pipetowania komórek.
    UWAGA: Pod koniec inkubacji komórki muszą uzyskać zawiesinę jednokomórkową po 3-5 krotnym pipetowaniu pipetą P1000. W przypadku pasażowania iAT2 do ALI (krok 3) czas trypsynizacji musi być zminimalizowany (maksymalnie 12 minut), tak aby komórki były w skupiskach 2-3-komórkowych, a nie w zawiesinie pojedynczej komórki, gdy są gotowe do posiewu na wkładce do hodowli komórkowej.
  9. Zatrzymaj działanie trypsyny za pomocą równej objętości pożywki zawierającej FBS (10% FBS kwalifikowany przez ES w DMEM). Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  10. Umyj komórki 10 ml IMDM. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  11. Ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości do zliczenia, a następnie policzyć komórki za pomocą hemocytometru (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Z jednej zlewającej się kropli matrycy o objętości 50 μl wysianej w 400 komórkach/μl, oczekiwana wydajność wynosi od 500 000 do 1,5 x 106 komórek na kroplę.
  12. Zawiesinę jednokomórkową komórek iAT2 należy wykorzystać do wytworzenia pęcherzyków płucnych poprzez posiew w matrycy 3D (krok 2) i/lub posiew na wkładkach do hodowli komórkowych w celu hodowli ALI (krok 3).

2. 3D poszycie iAT2s

  1. Po zliczeniu (Krok 1.11) określ liczbę pożądanych komórek do ponownego platerowania w matrycy 3D (400 komórek/μl matrycy z 50-100 μl kropelek matrycy 3D na dołek 12-dołkowej płytki). Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć jak najwięcej supernatantu za pomocą pipety.
  2. Ponownie zawieś komórki w macierzy 3D. Zawiesić szybko i na lodzie, jeśli to konieczne, aby zapobiec polimeryzacji matrycy (która następuje, gdy jest ciepła).
  3. Użyj pipety P200, aby dozować jedną kroplę matrycy 3D na dołek do wstępnie podgrzanej 12-dołkowej płytki. Ostrożnie pipetować, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków w kropli matrycy. Nie dopuścić do osadzenia się zawiesiny komórek podczas dozowania wielu kropel.
  4. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 20-30 minut, aby umożliwić polimeryzację kropelek matrycy.
  5. Dodać 1 ml CK + DCI + 10 μM pożywki Y-27632 (patrz tabela materiałów) do studzienki, aby przykryć kroplę matrycy.
  6. Po 72 godzinach zmień medium na CK + DCI bez 10 μM Y-27632.
  7. Wymieniaj pożywkę na nową CK + DCI co 48-72 godz.
    UWAGA: IAT2 zazwyczaj będą musiały być pasażowane mniej więcej co 10-14 dni, w zależności od linii komórkowej i gęstości posiewu.

3. Przejście iAT2s do ALI

  1. Przygotować świeżo powleczone wkładki do hodowli komórkowych o średnicy 6,5 mm na 1 godzinę przed użyciem, rozcieńczając matrycę 2D w zmodyfikowanej pożywce Eagle F-12 (DMEM/F12) firmy Dulbecco do roztworu roboczego zgodnie z instrukcjami producenta dla matrycy 2D (patrz tabela materiałów). Następnie dodać 100 μl rozcieńczonej matrycy na 6,5 mm wkładkę do hodowli komórkowej. Pozostawić matrycę do polimeryzacji w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 30 minut lub w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  2. Odessać nadmiar matrycy z wkładek do hodowli komórkowych za pomocą pipety lub pipety aspiracyjnej z próżnią i przepłukać raz DMEM/F12. Odessać to płukanie bezpośrednio przed dodaniem komórek.
  3. Po zliczeniu określ liczbę komórek wymaganych do zasiania żądanej liczby komórek we wkładkach hodowlanych (520 000 żywych komórek/cm2, co odpowiada 172 000 żywych komórek na wkładkę do hodowli komórkowej o średnicy 6,5 mm). Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć jak najwięcej supernatantu.
  4. Ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości do wysiewu 100 μL CK + DCI + 10 μM Y-27632 na wkładkę do hodowli komórkowej (zawiesina komórek powinna wynosić 1,720 komórek/μL). Dodać 100 μl do komory wierzchołkowej wkładki do hodowli komórkowej. Delikatnie poruszyć płytkę w układzie krzyżowym, aby zapewnić równomierne rozłożenie komórek w poprzek wkładki do hodowli komórkowej i potwierdź to, sprawdzając pod mikroskopem przy 4x obiektywie.
    UWAGA: Gęstość wysiewu ma kluczowe znaczenie i może wymagać optymalizacji, w zakresie od 160 000 do 300 000 komórek na wkładkę do hodowli komórkowej 6,5 mm. Barwnik przepuszczalny dla komórek w kolorze kalceinowym (patrz Tabela materiałów) może być dodany do komórek i oglądany pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym w celu wizualizacji komórek po wysianiu.
  5. Dodać 500 μL CK + DCI + 10 μM Y-27632 do podstawno-bocznego przedziału każdej wkładki do hodowli komórkowej.
  6. Odessać wierzchołkowy CK + DCI + 10 μM pożywki Y-27632 48 godzin po wysiewie za pomocą pipety zainicjować ALI (znany jako "air-lift").
    UWAGA: W tym momencie komórki powinny być w 100% zlewne. Jeśli komórki nie są w 100% zlewne, kroki 3.7-3.8 należy nadal wykonywać we wskazanych punktach czasowych; Tworzenie się zlewających się monowarstw komórek może trwać dłużej.
  7. Zmień podstawno-boczne CK + DCI + 10 μM podłoża Y-27632 po 72 godzinach na CK + DCI bez 10 μM Y-27632.
    UWAGA: Powinien być minimalny, jeśli w ogóle, "wyciek" medium na stronę wierzchołkową. Jeśli jednak zdarzy się to w ciągu pierwszych kilku dni, kontynuuj codzienne zasysanie strony wierzchołkowej, aż nie będzie dalszego wycieku.
  8. Wymieniaj podłoże podstawno-boczne na świeże CK + DCI co 48-72 godz.
    UWAGA: iAT2 stosowane w kulturach ALI dojrzewają maksymalnie po 5-14 dniach od posiewu.
  9. Utrzymuj komórki pod ścisłym nadzorem do 28 dni po posiewie, jeśli to konieczne, w celu bardziej długotrwałych eksperymentów.
    UWAGA: Widoczne oznaki niepowodzenia ALI, takie jak odklejanie się komórek od krawędzi wkładki lub tworzenie się w monowarstwie, można zaobserwować po zbyt długim czasie w hodowli, w którym to momencie ALI nie nadaje się już do eksperymentów.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

iAT2 zostały przeniesione do zawiesiny jednokomórkowej, a następnie ponownie posiane w matrycy 3D lub w 2D na wkładkach do hodowli komórkowych do hodowli ALI (Rysunek 1). Po dysocjacji pojedynczych komórek iAT2 analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Krótko mówiąc, komórki zawieszone w 1% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS) z barwnikiem żywotności błękitu kalceinowego (1:1000) analizowano na cytometrze przepływowym, bramkując pod kątem niefragmentów, singletów i tdTomato. Tutaj, jako przykład, jest linia SPC2 (SPC2-ST-B2 clone20), która ma reporter tdTomato ukierunkowany na endogenne locus SFTPC w celu ułatwienia wizualizacji i śledzenia programu AT2 w czasie w kulturze (Rysunek 2A). Wyrażenie iAT2 SFTPC-tdTomato zostało zachowane po ponownym pokryciu w matrycy 3D jako kule (Rysunek 2B) i po posianiu na wkładkach do hodowli komórkowych (Rysunek 2C). Trans-epitelialna rezystancja elektryczna (TEER) może być mierzona w celu określenia integralności kultury ALI (Rysunek 2D). Do pomiaru TEER użyto woltoomomierza (patrz tabela materiałów), w którym do komory wierzchołkowej dodano 100 μl pożywki CK + DCI. Wkładki do hodowli komórkowych pokryte Matrigelem w przypadku braku komórek wysiewanych traktowano jako ślepe próby. Odczyty zostały wykonane w trzech miejscach w każdej studni.

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie przepływu pracy protokołu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Reprezentatywne wyniki protokołu. (A) Reprezentatywne wyniki cytometrii przepływowej dla SFTPC-tdPomidor w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych pochodzących z pęcherzyków płucnych typu 2 (iAT2s) hodowanych w 3D. Pokazaną kontrolą ujemną jest endoderma niepłucna (CD47lo). (B) Reprezentatywne obrazowanie żywych komórek iAT2 hodowanych w 3D w różnych dniach po pasażowaniu (dpp) (SFTPC-tdTomato, podziałka = 50 μm). (C) Reprezentatywne obrazowanie żywych komórek iAT2 posianych na granicy faz powietrze-ciecz (SFTPC-tdTomato, podziałka = 500 nm). (D) Reprezentatywna transnabłonkowa rezystancja elektryczna iAT2 platerowanych na granicy faz powietrze-ciecz. n = 3, słupki błędów wskazują odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

. .
OdczynnikiObjętość na 500 mlKońcowe stężenie
Zmodyfikowany Środek Dulbecco firmy Iscove (IMDM)375 ml75%
Mieszanka składników odżywczych F-12 szynki (F12)125 ml25 proc
B-27 (z suplementem RA)5 ml1 proc
Suplement N-22,5 ml0,50%
BSA (7,5% zapasów)3,3 ml0,05%
Primocin (zapas 50 mg/ml)1 ml100 μg/ml
Glutamax (100x w magazynie)5 ml1x
Kwas askorbinowy (50 mg/ml zapasu)500 μL50 μg/ml
1-tioglicerol (MTG) (od 26 μl w 2 ml IMDM)1,5 ml4,5 x 10-4 m

Tabela 1: Skład kompletnego podłoża różnicującego bez surowicy (cSFDM).

OdczynnikKońcowe stężenie
CHIR990213 μM
rhKGF (Kanał Nauk Rolniczych10 ng/ml
deksametazon50 nM
Sól sodowa 8-bromoadenozyno-30,50-cyklicznego monofosforanu (cAMP)0,1 mM
3-izobutylo-1-metyloksantyna (IBMX)0,1 mM

Tabela 2: Kompozycje nośników CK + DCI.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AT2 utrzymują homeostazę płuc, a dysfunkcja tych kluczowych komórek pęcherzyków płucnych może zarówno powodować, jak i wynikać z różnych chorób płuc. Ze względu na trudności w dostępie i izolowaniu pierwotnych ludzkich AT2, generowane są iAT2. Stosując metody ukierunkowanego różnicowania opisane w innym miejscu25 oraz opisaną tutaj ekspansję i zasiewanie komórek, iPSC wygenerowane od dowolnej osoby mogą zostać zróżnicowane w silnie samoodnawiające się iAT2, dostarczając w ten sposób specyficzne dla pacjenta komórki do badań biomedycznych, w tym podstawowych badań biomedycznych, badań rozwojowych, modelowania chorób, terapii komórkowych lub badań przesiewowych leków. Niniejszy protokół szczegółowo opisuje metodę dysocjacji iAT2 do zawiesiny pojedynczej komórki, którą można następnie ponownie pokryć w 3D Matrigel w celu wygenerowania pęcherzyków do ekspansji komórek lub ponownie platerować w hodowli 2D ALI w celu dalszych eksperymentów.

Protokół składa się z kilku krytycznych etapów, aby zapewnić pomyślne pasażowanie i ponowne powlekanie zarówno w kulturach 3D, jak i ALI. Mechaniczne rozpryskiwanie musi być zminimalizowane, ponieważ nadmierne pipetowanie może zmniejszyć żywotność komórek. Ponadto gęstość wysiewu iAT2 zarówno w kulturach 3D, jak i 2D ALI ma kluczowe znaczenie; w przypadku hodowli 3D, ogólnie rzecz biorąc, 400 komórek/μl 3D Matrigel jest optymalne dla większości linii iPSC. Jednak zakres gęstości od 100 do 500 komórek/μl czasami kończył się sukcesem, a optymalizacja gęstości może być wymagana dla różnych linii komórkowych. W przypadku hodowli ALI optymalizacja gęstości wysiewu iAT2 na wkładkach do hodowli komórkowych jest również niezbędna do uzyskania zlewającej się monowarstwy komórek 48 godzin po wysiewie (tj. w dniu transportu powietrznego). Niektóre linie iAT2 wymagają więcej komórek na wkładkę; Dlatego, jeśli wymagane jest rozwiązywanie problemów, zalecany jest zakres od 160 000 do 300 000 komórek/wkładkę dla 24-dołkowych wkładek do hodowli komórkowych. Kultury 3D można również skalować do płytek 24- i 48-dołkowych, utrzymując gęstość wysiewu na poziomie 400 komórek/μl matrycy 3D i zmniejszając wielkość kropel matrycy odpowiednio do 25 μl i 20 μl. Hodowle ALI można skalować do 96-dołkowych wkładek do hodowli komórkowych poprzez pokrycie każdej wkładki 30 μl matrycy, posiew 80 000 komórek w 30 μl na wkładkę i podawanie 150 μl podłoża podstawno-bocznego na studzienkę. Gęstość wysiewu oraz objętości matrycy i podłoża muszą być odpowiednio skalowane i optymalizowane dla innych formatów płytek.

Ograniczeniem tego protokołu jest to, że komórki używane do posiewu ALI muszą być wystarczająco oczyszczone, aby były NKX2-1+ i SFTPC+19,20,21,23 w celu utworzenia iAT2 ALIs, a tworzenie kultur ALI może się różnić w zależności od linii. Ponadto protokół ten umożliwia ekspansję i generowanie kultur tylko AT2, zapewniając redukcjonistyczny system modelowy oparty na pojedynczym kluczowym typie komórek pęcherzykowych. Co ważne, na tych platformach brakowało innych istotnych typów komórek pęcherzyków płucnych, takich jak komórki pęcherzyków płucnych typu 1. Inne grupy odniosły sukces w hodowli pierwotnych ludzkich AT2 jako sferoidów lub kultur organotypowych z fibroblastamilub bez 1,14,15,16,17; jednak pierwotne ludzkie AT2 mają tendencję do utraty ekspresji kluczowych środków powierzchniowo czynnych, gdy są hodowane w normalnej hodowli 2D bez warunków ALI26. Co więcej, ostatnie prace wykazały, że iAT2 wyrażają wyższe markery proliferacyjne i niższe markery dojrzewania AT2 niż świeże, niehodowane ludzkie pierwotne AT227. Pomimo tych różnic między iAT2 a świeżymi pierwotnymi ludzkimi AT2, stwierdziliśmy, że nawet hodowane pierwotne AT2 wykazywały różnice transkryptomiczne w stosunku do świeżych, niehodowlanych pierwotnych AT227, a zatem wnioskujemy, że te modele in vitro mają różne mocne strony i ograniczenia w modelowaniu biologii płuc in vivo.

Platforma iAT2 może być stosowana do badania mutacji genetycznych z iPSC pochodzących od pacjentów19,20. System można również znacznie rozbudować, aby dostosować go do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków. Ponadto iAT2 ALI nadają się do narażenia środowiskowego, takiego jak infekcja wirusowa lub bakteryjna lub narażenie na dym papierosowy, opary e-papierosów lub inne aerozole23. Podsumowując, ten protokół do generowania zarówno 3D, jak i 2D kultur ALI iAT2 pozwala na długoterminową hodowlę typu komórek istotnego z punktu widzenia choroby i zapewnia fizjologiczną, skalowalną platformę, która umożliwia wykorzystanie tych komórek w wielu zastosowaniach.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serdecznie dziękujemy członkom laboratoriów Wilson, Kotton i Hawkins za ich pomocne dyskusje. Jesteśmy również bardzo wdzięczni Gregowi Millerowi (CReM Laboratory Manager) i Marianne James (iPSC Core Manager) za ich nieocenione wsparcie. Dziękujemy Brianowi Tiltonowi i BUMC Flow Cytometry Core za ich pomoc techniczną w sortowaniu komórek (wspieraną przez grant NIH #1S10OD021587-01A1). Praca ta była wspierana przez stypendium CJ Martin Early Career Fellowship z Australijskiej Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych przyznane RBW; Dotacja NIH F30HL147426 dla KMA; Nagroda I.M. Rosenzweig dla Młodszego Badacza przyznana przez The Pulmonary Fibrosis Foundation oraz Nagroda Integrated Pilot Grant Award przyznana przez Boston University Clinical & Translational Science Institute (1UL1TR001430) dla KDA; Szwajcarska Narodowa Fundacja Nauki (P2ELP3_191217) do ABA; NIH przyznaje DNK U01HL148692, U01HL134745, U01HL134766 i R01HL095993; oraz granty NIH U01TR001810, R01DK101510 i R01DK117940 przyznane AAW; Utrzymanie, bankowość i udostępnianie iPSC są wspierane przez grant NIH NO1 75N92020C00005. Rysunek 1 został utworzony przy użyciu Biorender.com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3-izobutylo-1-metyloksantyna (IBMX)SigmaI5879Do
12-dołkowej płytki do hodowli komórekPłytki Corning3513do hodowli
1-tioglicerolu (MTG)M6145Sigmado CKDCI
2D Matrigel (matryca) - Matrigel Matryca z kwalifikacją hESCCorning8774552Do powlekania ALI Transwells
3D Matrigel (matryca) - Wzrost Czynnik o obniżonym współczynniku MatrigelCorning356230Do uprawy kulek iAT2 w
soli sodowej 8-bromoadenozyny 30,50-cyklicznego monofosforanu (cAMP)SigmaB7880Dla CKDCI
Kwas askorbinowyA4544SigmaDla CKDCI
B27 bez kwasu retinowegoLife Technologies12587-010Dla
albuminy surowicy bydlęcej CKDCI (BSA) (7,5%)Thermo Fisher15260037Dla CKDCI
Calcein blueLife TechnologiesC1429Do rozróżniania żywych/martwych w cytometrii przepływowej
Calcein greenLife TechnologiesC1430Opcjonalna wizualizacja komórek na wkładce do hodowli
komórkowej Wkładki do hodowli komórkowych - Costar 6,5 mm Clear Transwells z 0,4 i mikro; m wielkość porówTranswells Millipore-SigmaCLS3470-48EAALI
CHIR99021Tocris4423Dla CKDCI
DeksametazonSigmaD4902Do CKDCI
Dispaza (2 mg / ml)Thermo Fisher354235Do rozpuszczenia matrigelu
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher11995Aby dokonać inaktywacji trypsyny podłoża (10% FBS w DMEM)
Zmodyfikowana mieszanka Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)Thermo FisherA4192002Do płukania
soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco (PBS)Thermo Fisher14190Do analiz cytometrycznych
płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (charakteryzowana hyklonem)GE Healthcare Life SciencesSH30071.03Do wytwarzania pożywki do inaktywacji trypsyny (10% FBS w DMEM)
GlutamaxLife Technologies35050-061szynki CKDCI
(F12)Cellgro10-080-CV
hemocytometruFisher02-671-6Do liczenia komórek
Invivogen  Primocin 1 G (50 mg / ml)Fisher ScientificNC9392943Do CKDCI
Zmodyfikowany Ilbecco's Medium (IMDM) firmy IscoveThermo Fisher12440053Do CKDCI
Milicell ERS-2 WoltomierzMiliporeMERS00002Do pomiaru przeznabłonkowego oporu elektrycznego
Suplement N2Life Technologies17502-048Dla CKDCI
Rekombinowany ludzki KGFR& D Systems251-KG-010Dla CKDCI
Kwas retinowySigmaR2625Dla CKDCI
Trypan niebieskiThermo Fisher15250061Do zliczania komórek podczas pasażu
Trypsyna-EDTA (0,05%)Gibco25-300-062Aby dysocjować sfery iAT2
Dichlorowodorek Y-27632Tocris1254Dodaj do komórek po pasażowaniu
CKDCI Do mieszanki składników odżywczych F-12 Do CKDCI

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
  2. Mason, R. J., Williams, M. C. Type II alveolar cell. Defender of the alveolus. American Review of Respiratory Disease. 115 (6), Pt 2 81-91 (1977).
  3. Nogee, L. M., et al. A mutation in the surfactant protein C gene associated with familial interstitial lung disease. New England Journal of Medicine. 344 (8), 573-579 (2001).
  4. Nogee, L. M., et al. A mutation in the surfactant protein B gene responsible for fatal neonatal respiratory disease in multiple kindreds. Journal of Clinical Investigation. 93 (4), 1860-1863 (1994).
  5. Shulenin, S., et al. ABCA3 gene mutations in newborns with fatal surfactant deficiency. New England Journal of Medicine. 350 (13), 1296-1303 (2004).
  6. Nureki, S. I., et al. Expression of mutant Sftpc in murine alveolar epithelia drives spontaneous lung fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 128 (9), 4008-4024 (2018).
  7. Katzen, J., et al. An SFTPC BRICHOS mutant links epithelial ER stress and spontaneous lung fibrosis. Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (6), 126125(2019).
  8. Mathis, C., et al. Human bronchial epithelial cells exposed in vitro to cigarette smoke at the air-liquid interface resemble bronchial epithelium from human smokers. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (7), 489-503 (2013).
  9. Purkayastha, A., et al. Direct exposure to SARS-CoV-2 and cigarette Smoke increases infection severity and alters the stem cell-derived airway repair response. Cell Stem Cell. 27 (6), 869-875 (2020).
  10. Matrosovich, M. N., Matrosovich, T. Y., Gray, T., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Human and avian influenza viruses target different cell types in cultures of human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (13), 4620-4624 (2004).
  11. Tollstadius, B. F., Silva, A. C. G. d, Pedralli, B. C. O., Valadares, M. C. Carbendazim induces death in alveolar epithelial cells: A comparison between submerged and at the air-liquid interface cell culture. Toxicology in Vitro. 58, 78-85 (2019).
  12. Winton, H. L., et al. Cell lines of pulmonary and non-pulmonary origin as tools to study the effects of house dust mite proteinases on the regulation of epithelial permeability. Clinical and Experimental Allergy. 28 (10), 1273-1285 (1998).
  13. Kanagaki, S., et al. Hydroxypropyl cyclodextrin improves amiodarone-induced aberrant lipid homeostasis of alveolar cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 64 (4), 504-514 (2021).
  14. Sucre, J. M. S., et al. Successful establishment of primary type 2 alveolar epithelium with 3D organotypic co-culture. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 158-166 (2018).
  15. Kobayashi, Y., et al. Persistence of a regeneration-associated, transitional alveolar epithelial cell state in pulmonary fibrosis. Nature Cell Biology. 22, 934-946 (2020).
  16. Choi, J., et al. Inflammatory signals induce AT2 cell-derived damage-associated transient progenitors that mediate alveolar regeneration. Cell Stem Cell. 27 (3), 366-382 (2020).
  17. Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
  18. Katsura, H., et al. Human lung stem cell-based alveolospheres provide insights into SARS-CoV-2-mediated interferon responses and pneumocyte dysfunction. Cell Stem Cell. 27 (6), 890-904 (2020).
  19. Jacob, A., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into functional lung alveolar epithelial cells. Cell Stem Cell. 21 (4), 472-488 (2017).
  20. Alysandratos, K. -D., et al. Patient-specific iPSCs carrying an SFTPC mutation reveal the intrinsic alveolar epithelial dysfunction at the inception of interstitial lung disease. Cell Reports. 36 (9), 109636(2021).
  21. Hurley, K., et al. Reconstructed single-cell fate trajectories define lineage plasticity windows during differentiation of human PSC-derived distal lung progenitors. Cell Stem Cell. 26 (4), 593-608 (2020).
  22. Sun, Y. L., et al. Heterogeneity in human iPSC-derived alveolar epithelial type II cells revealed with ABCA3/SFTPC reporters. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 65 (4), 442-460 (2021).
  23. Abo, K. M., et al. Human pluripotent stem cell-derived alveolar type 2 cells mature and respond to environmental exposures in air-liquid interface culture. Journal of Clinical Investigation Insight. 7 (6), (2022).
  24. Huang, J., et al. SARS-CoV-2 infection of pluripotent stem cell-derived human lung alveolar type 2 cells elicits a rapid epithelial-intrinsic inflammatory response. Cell Stem Cell. 27 (6), 962-973 (2020).
  25. Jacob, A., et al. Derivation of self-renewing lung alveolar epithelial type II cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 14 (12), 3303-3332 (2019).
  26. Beers, M. F., Moodley, Y. When is an alveolar type 2 cell an alveolar type 2 cell? A conundrum for lung stem cell biology and regenerative medicine. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 18-27 (2017).
  27. Alysandratos, K. D., et al. Impact of cell culture on the transcriptomic programs of primary and iPSC-derived human alveolar type 2 cells. bioRxiv. , (2022).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Indukowane pluripotencjalne kom rki macierzystehodowla sfer 3Dkierowana r nicowaniebia ko surfingowe Czawiesina pojedynczych kom rektransepitelny op r elektrycznytest immunofluorescencyjnymodelowanie chor b p uc

Powiązane artykuły