Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie kultur komórek nabłonka dróg oddechowych na granicy faz powietrze-ciecz z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

5.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63882

⸱

14 czerwca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Pulmonary Center, Boston University School of Medicine, 2Center for Regenerative Medicine, Boston University and Boston Medical Center, 3Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, Brown Foundation Institute of Molecular Medicine, University of Texas Health Science Center

W tym artykule

Podsumowanie

Ostatnie postępy w protokołach różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych pozwalają na stopniowe wyprowadzanie typów komórek specyficznych dla narządów. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe kroki dotyczące utrzymania i ekspansji komórek podstawnych dróg oddechowych pochodzących z iPSC oraz ich różnicowania w nabłonek śluzowo-rzęskowy w kulturach na granicy faz powietrze-ciecz.

Streszczenie

Choroby dróg oddechowych, takie jak astma, mukowiscydoza (CF), pierwotne dyskinezy rzęsek (PCD) i wirusowe infekcje dróg oddechowych są głównymi przyczynami zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. Platformy in vitro wykorzystujące ludzkie komórki nabłonka oskrzeli (HBEC) odegrały zasadniczą rolę w naszym zrozumieniu nabłonka dróg oddechowych w zdrowiu i chorobie. Dostęp do HBEC od osób z rzadkimi chorobami genetycznymi lub rzadkimi mutacjami jest wąskim gardłem w badaniach nad płucami.

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) są łatwo generowane przez "przeprogramowanie" komórek somatycznych i zachowują unikalne tło genetyczne indywidualnego dawcy. Najnowsze osiągnięcia pozwalają na ukierunkowane różnicowanie iPSC do komórek progenitorowych nabłonka płuc, komórek pęcherzyków płucnych typu 2, a także komórek nabłonka przewodów oddechowych za pośrednictwem komórek podstawnych, głównych komórek macierzystych dróg oddechowych.

Tutaj przedstawiamy protokół utrzymania i rozbudowy komórek podstawnych dróg oddechowych pochodzących z iPSC (zwanych dalej iBC), jak również ich trójliniowego różnicowania w kulturach na granicy faz powietrze-ciecz (ALI). iBC są utrzymywane i rozwijane jako sfery nabłonkowe zawieszone w kropelkach macierzy zewnątrzkomórkowej hodowanej w pierwotnym pożywce dla komórek podstawnych, uzupełnionej inhibitorami szlaków sygnałowych TGF-ß i BMP. iBC w tych sferach nabłonkowych wyrażają kluczowe markery podstawowe TP63 i NGFR, mogą być oczyszczane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS), a po posianiu na porowatych błonach w standardowych warunkach hodowli ALI różnicować się w funkcjonalny nabłonek dróg oddechowych. Kultury ALI pochodzące od zdrowych dawców składają się z komórek podstawnych, wydzielniczych i wielorzęskowych i wykazują integralność bariery nabłonkowej, ruchliwe rzęski i wydzielanie śluzu. Kultury pochodzące od osób z mukowiscydozą lub PCD podsumowują dysfunkcyjny transport chlorków za pośrednictwem CFTR lub nieruchome rzęski, odpowiednie chorobowe wady nabłonka.

Tutaj prezentujemy protokół generowania komórek ludzkich, który może być zastosowany do modelowania i zrozumienia chorób dróg oddechowych.

Wprowadzenie

Przewlekłe choroby płuc stanowią dużą część zachorowalności i śmiertelności na całym świecie1. Stany, które wpływają na przewodzące drogi oddechowe, takie jak astma, mukowiscydoza (CF), pierwotna dyskineza rzęsek (PCD) i infekcje wirusowe, stanowią zarówno powszechne, jak i rzadsze choroby, nabyte i genetyczne, które przyczyniają się do tego ogólnoświatowego obciążenia. Główne funkcje przewodzących dróg oddechowych to: 1) działanie jako kanał dla laminarnego przepływu powietrza oraz 2) zapewnienie śluzowo-rzęskowego usuwania patogenów i zanieczyszczeń. Komórki wydzielnicze, wielorzęskowe i podstawne reprezentują główne typy komórek nabłonkowych przewodzących dróg oddechowych. Rzadsze typy komórek nabłonkowych obejmują jonacyty, komórki kępek i komórki neuroendokrynne i zostały omówione gdzie indziej2.

Ogólnie rzecz biorąc, główną przeszkodą w zrozumieniu mechanizmów choroby i rozwoju podejść terapeutycznych był ciągły brak ludzkiej pierwotnej tkanki do wykorzystania w modelach przedklinicznych. HBEC są powszechnie uważane za złoty standard w biologii nabłonka dróg oddechowych człowieka i odgrywają kluczową rolę w badaniach nad mukowiscydozą, w szczególności3. Jednak zazwyczaj są one izolowane albo z biopsji bronchoskopowych, albo z tkanki płucnej po operacji, albo z płuc odrzuconych do przeszczepu. Dostęp do HBEC od osób z chorobami genetycznymi, w tym priorytety badawcze dotyczące mukowiscydozy i PCD, jest rzadki i nieprzewidywalny. Konieczne jest pokonanie tego wąskiego gardła w komórkach nabłonka dróg oddechowych pochodzących od pacjenta. iPSC są łatwo generowane od każdego osobnika, zachowują unikalne tło genetyczne dawcy i mają niezwykłą zdolność do namnażania się i przetrwania przez długi czas w warunkach hodowli komórkowej4,5,6. Poprzez rekapitulację kluczowych etapów embriologicznych, iPSC przechodzą "ukierunkowane różnicowanie" do typów komórek specyficznych dla narządów. Wraz z innymi opracowaliśmy protokoły generowania komórek progenitorowych płuc pochodzących z iPSC, komórek pęcherzyków płucnych typu 27,8 oraz komórek przewodzących dróg oddechowych, w tym komórek podstawnych dróg oddechowych9,10,11,12.

Komórka podstawna dróg oddechowych jest komórką macierzystą przewodzącej drogi oddechowej13. We wcześniej opublikowanych pracach nasza grupa wygenerowała komórki nabłonka dróg oddechowych pochodzące z iPSC, w tym podzbiór (iBC), który wyraża kanoniczne markery komórek podstawnych, w tym TP63, KRT5 i NGFR. Podążając za wskazówkami z biologii podstawowej komórki dorosłej, hamowanie podwójnych szlaków SMAD (TGF-β i BMP) prowadzi do regulacji w górę NGFR+ iBCs11,14. iBC NGFR+ są ponownie zawieszane w postaci pojedynczych komórek w kropelkach macierzy zewnątrzkomórkowej i hodowane w pożywce dla komórek podstawnych. Odnawiają się samoodnawiają, aby utrzymać populację iBC i tworzą sferoidy nabłonkowe; jednak część różnicuje się również w komórki wydzielnicze w tym formacie (określanym jako hodowla 3D). W poniższym protokole szczegółowo opisujemy kroki mające na celu utrzymanie i ekspansję tych iBC w hodowli 3D, a także kroki wymagane do wygenerowania funkcjonalnej 2-D śluzowo-rzęskowej hodowli ALI.

Początkowe kroki tego protokołu różnicowania zostały wcześniej opublikowane i nie będą tutaj omawiane11,12. Niniejszy manuskrypt skupi się na ekspansji i oczyszczaniu iBC, a następnie ich różnicowaniu w funkcjonalne komórki wydzielnicze i wielorzęskowe w hodowli ALI.

Protokół

Każdy z poniższych kroków powinien być wykonany przy użyciu sterylnej techniki w okapie z przepływem laminarnym poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2. Wszystkie podłoża powinny być podgrzane do temperatury pokojowej (22 °C) przed dodaniem do komórek, chyba że wyraźnie zaznaczono inaczej. Każdy etap wirowania powinien być przeprowadzany w temperaturze pokojowej (około 22 °C). Rysunek 1 przedstawia schematy protokołu.

1. Przygotowanie wymaganych mediów

UWAGA: Zobacz Plik uzupełniający 1, aby uzyskać szczegółowe informacje.

  1. Podłoże dla komórek podstawnych
    1. Przygotuj podłoże bazowe zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Do każdych 50 ml pożywki bazowej dodać 5 μl A83-01 (10 mM), 5 μl DMH1 (10 mM), 50 μl Y-27632 (10 mM) i 100 μl Primociny (50 mg/ml). W dalszej części pożywki pożywka nazywana jest pożywką dla komórek podstawnych.
    3. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.
  2. Podłoże różnicujące ALI
    1. Przygotuj podłoże zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Do każdych 50 ml pożywki różnicującej ALI dodać 100 μl Primocin (50 mg/ml).
    3. Przechowywać w bezpiecznym miejscu w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
  3. Bufor sortowania
    1. Na każde 50 ml buforu sortującego połącz 47,5 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa, 1 ml FBS, 200 μl EDTA (500 mM), 1,25 ml buforu HEPES (1 M), 50 μl Y-27632 (10 mM) i 100 μl Primocin (50 mg / ml).
    2. Filtr sterylizować przy użyciu porów o wielkości 0,4 μm.
    3. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.
  4. Pożywka do kriokonserwacji
    1. Na każde 50 ml pożywki do kriokonserwacji należy dodać 45 ml pożywki z komórek podstawowych i 5 ml dimetylosulfotlenku (DMSO).
    2. Filtr sterylizować przy użyciu porów o wielkości 0,4 μm.
    3. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.

2. Rozmrażanie kriokonserwowanych iBC

  1. Rozmrozić (na lodzie) wystarczającą ilość macierzy zewnątrzkomórkowej zredukowanej przez czynnik wzrostu 3D (zwanej dalej matrycą 3D). Przechowywać na lodzie do momentu, gdy będzie gotowy do użycia.
    UWAGA: Podczas rozmrażania jednej fiolki (zawierającej 250 000 komórek) rozmrozić 100-200 μl matrycy 3D.
  2. Rozmrozić fiolkę z wcześniej kriokonserwowanymi jednokomórkowymi zawiesinami iBC przez inkubację w kąpieli wodnej lub perełkowej o temperaturze 37 °C, aż do momentu, gdy nie będzie widocznej zamrożonej pożywki (1-2 min).
  3. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml dodać zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  4. Dodaj kroplami 6-10 ml DMEM/F12 do zawiesiny komórek, delikatnie wymieszaj i odwiruj przy 300 x g przez 5 minut, aby osadzać komórki.
  5. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki z komórek podstawowych za pomocą mikropipety P1000. Usunąć podwielokrotność 10 μl i przeprowadzić liczenie komórek.
  6. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki o gęstości 4 000 komórek/μl w uprzednio rozmrożonej matrycy 3D za pomocą mikropipety P1000.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby unikać dodawania bąbelków do matrycy 3D. Powoli i ostrożnie pipetować matrycę.
  7. Za pomocą mikropipety P200 dodać jedną kroplę (25 lub 50 μl) do podstawy każdego dołka 12-dołkowej płytki poddanej działaniu kultur tkankowych. Jeśli zaczynasz od 250 000 zamrożonych komórek, oczekiwana liczba kropel na tym etapie wynosi od 3 do 4 (kropel 25 μl), w zależności od żywotności komórek.
  8. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez około 15 minut, a następnie dodać tyle podłoża z komórek podstawowych do każdego dołka, aby całkowicie zanurzyć kroplę (1,5 ml na 50 μl; 1 ml na 25 μl), używając pipety serologicznej o pojemności 5 ml. Umieścić płytkę z powrotem w nawilżonym inkubatorze.
  9. Karmić komórki co 2 dni za pomocą świeżej pożywki z komórek podstawowych. Dodać świeżą pożywkę z boku studzienki za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml, uważając, aby nie naruszyć kropelek komórek.
    UWAGA: Gęstość komórek posianych na tym etapie jest 10-krotnie wyższa niż rutynowe pasażowanie iBC w sekcji 3.

3. Dysocjacja sferoid i ekspansja iBC w kulturze 3-D

  1. Rozmrozić (na lodzie) wystarczającą objętość matrycy 3D. Przechowywać na lodzie do momentu, gdy będzie gotowy do użycia.
    UWAGA: Wymagana objętość matrycy 3-W będzie się różnić w zależności od liczby komórek wymaganych przez użytkownika.
  2. Około 5-7 dni później odessać pożywkę z każdej studzienki i za pomocą mikropipety P1000 dodać 1 ml Dispazy II (1 U/ml) bezpośrednio na sferoidy, aby oddzielić się od kropli matrycy.
    1. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 10-15 minut.
  3. Za pomocą mikropipety P1000 odpipetuj Dispase w górę i w dół 1-2 razy, rozbijając duże grudki matrycy 3D. Przywrócić temperaturę płytki do 37 °C na dodatkowe 30-40 minut, pozwalając matrycy całkowicie się rozpuścić.
    1. Gdy kropla matrycy 3D nie jest już widoczna pod mikroskopem świetlnym, dodaj swobodnie unoszące się sferoidy do stożka o pojemności 15 ml za pomocą końcówki do pipety serologicznej o pojemności 5 ml. Dodać DMEM/F12 do końcowej objętości 10 ml na stożek i odwirować przy 200 x g przez 3 minuty w celu osadzenia sferoid.
  4. Odessać supernatant i dodać 1 ml 0,05% trypsyny (37 °C) na każdą początkową kroplę zdysocjowaną (np. jeśli zaczyna się od czterech kropel, dodać 4 ml trypsyny do kolby stożkowej).
    1. Inkubować w temperaturze 37 °C, często rozcierając (co 2-3 minuty).
    2. Oceniaj za pomocą mikroskopu świetlnego co kilka minut. Gdy większość (>90%) sferoidów zostanie zdysocjowana na pojedyncze komórki, dodaj 10% płodowej surowicy bydlęcej (w DMEM / F12) w stosunku objętościowym 1:1 do trypsyny.
  5. Przefiltrować komórki przez sitko o wielkości 40 μm i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.
  6. Wykonaj zliczanie komórek i równomiernie ponownie zawieś komórki o gęstości 400 komórek/μl rozmrożonej matrycy 3D. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza. Zawieś ponownie tyle kropel, ile jest potrzebne do dalszej aplikacji. Powtórz krok 2.6-2.9 dla każdej studzienki.

4. Ocena i oczyszczanie iBC NGFR+

  1. Po 10-14 dniach od ostatniego pasażu rozdzielić sferoidy na zawiesinę pojedynczej komórki, jak w krokach 3.2-3.5 i przeprowadzić liczenie komórek.
    UWAGA: Różne linie iPSC zachowują się inaczej; w związku z tym zakres 10-14 dni może się różnić dla różnych iBC. Proszę zapoznać się z Rysunek 2, aby zapoznać się z typowym wyglądem 3-D iBC po 1, 4, 8 i 14 dniach, kiedy są one odpowiednie do sortowania komórek NGFR+. Sortowanie wcześniej niż zalecane (np. dzień 8, jak w Rysunek 2C), skutkuje ogólnie niższą liczbą komórek przy rzadszym wyrażaniu NGFR. Sortowanie później niż zalecane (np. dłużej niż 14 dni po ostatnim pasażu) prowadzi do słabej przeżywalności komórek po sortowaniu.
  2. Ponownie zawiesić komórki o gęstości 1 x 106 komórek/100 μl w buforze sortującym (populacja główna). Przenieść małą porcję (25-50 μl) do oddzielnej probówki (mniejsza populacja).
    1. Dodać sprzężone przeciwciało anty-NGFR (rozcieńczenie 1:100) do głównej populacji komórek.
    2. Dodać przeciwciało kontrolne izotypu (rozcieńczenie 1:200) do populacji komórek o mniejszym znaczeniu.
    3. Chroń komórki przed światłem i trzymaj na lodzie przez 30 minut, z przerwami (co 5-10 minut) rozcierając komórki, aby zapobiec granulowaniu.
  3. Po 30 minutach dodaj bufor sortujący w stosunku 1:1 do każdej probówki komórek. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 min.
  4. Odessać supernatant, ponownie zawiesić granulowane komórki w buforze sortowania o gęstości 10 x 106 komórek/ml i dodać żywe lub martwe komórki.
  5. Stosując odpowiednią strategię bramkowania NGFR+ (opartą na kontroli izotypu, patrz Rysunek 3), posortuj wystarczającą ilość żywych komórek NGFR+ do niezbędnych dalszych zastosowań.
    UWAGA: W przypadku korzystania z iBC z reporterami fluorescencyjnymi (tj. NKX2-1GFP TP63tdTomato) zaleca się sortowanie pod kątem komórek "potrójnie dodatnich" (tj. NKX2-1GFP+, TP63tdTomato+, NGFR+), z odpowiednim wyborem bramki i kompensacją (Rysunek 3). Podczas tej ekspansji iBC część komórek różnicuje się w komórki wydzielnicze i można również wykryć bardzo mały odsetek komórek wielorzęskowych. Obie te populacje należą do NGFR-.

5. Generacja śluzowo-rzęskowych kultur ALI

  1. Przygotować porowate wkładki membranowe o średnicy 6,5 mm, dodając matrycę o pojemności 200 μl do komory wierzchołkowej (matryca kwalifikowana przez ludzkie embrionalne komórki macierzyste lub rekombinowana ludzka laminina-521) zgodnie z instrukcją producenta.
    1. Umieścić w temperaturze 37 °C na co najmniej 2 godziny przed rozpoczęciem pracy.
  2. Odessać matrycę powłoki z komory wierzchołkowej wkładu. Dodać 500 μl pożywki z komórek podstawowych do komory podstawno-bocznej.
  3. Ponownie zawiesić co najmniej 30 000 posortowanych komórek NGFR+ (od kroku 4.5) w 100-200 μl pożywki z komórek podstawowych i przenieść do komory wierzchołkowej za pomocą mikropipety P200. Powtórz dla tylu dołków, ile jest pożądane (i dostępnych komórek). Umieścić płytkę w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C.
  4. W ciągu 2-3 dni odessać komory wierzchołkowe i podstawno-boczne i karmić świeżą pożywką z komórek bazalnych (500 μl do wierzchołkowych, 100 μl do podstawno-bocznych).
  5. Codziennie monitoruj komorę wierzchołkową za pomocą mikroskopu świetlnego. Gdy komórki zlewają się w >80% (zwykle 3-7 dni), zastąp pożywkę z komórek podstawnych pożywką różnicującą ALI (nie podgrzaną) zarówno w komorze wierzchołkowej, jak i podstawno-bocznej. Podczas pracy z ALI Differentiation Medium należy chronić przed światłem, trzymając pojemniki na media owinięte w folię i wyłączając górne światła, jeśli jest to możliwe.
  6. Następnego dnia należy odessać pożywkę z komory wierzchołkowej, wystawiając w ten sposób powierzchnię wierzchołkową na działanie powietrza.
  7. Pożywkę ALI Differentiation Medium należy wymieniać w komorze podstawno-bocznej co 2-3 dni.
    1. Monitoruj wygląd kultury co 1-2 dni. Ostrożnie odessać nagromadzony płyn z komory wierzchołkowej, nie naruszając warstwy komórek.
    2. Oceń przeznabłonkową rezystancję elektryczną (TEER) pod kątem integralności nabłonka.
      UWAGA: TEER można ocenić w ciągu kilku dni po ekspozycji na powietrze, aby uzyskać odczyt integralności warstwy nabłonkowej. Idealny czas na pomiar TEER nie został ustalony, chociaż wartości zgodne z wysokiej jakości różnicowaniem śluzowo-rzęskowym wynoszą zwykle >500 xcm2.
    3. Jeśli konieczne jest usunięcie zanieczyszczeń lub śluzu, delikatnie dodaj 100 μL PBS (bez Ca2+ lub Mg2+) do komory wierzchołkowej. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut, a następnie ostrożnie odsysać PBS.
    4. Po 7-10 dniach ekspozycji na powietrze zwykle pojawiają się ruchliwe rzęski, które można zobaczyć za pomocą mikroskopii świetlnej. W zależności od planowanego eksperymentu i odczytu, komórki mogą być analizowane po 14-28 dniach ekspozycji na powietrze.
      UWAGA: Jeśli użyto fluorescencyjnych komórek reporterowych i jeśli dostępny jest mikroskop fluorescencyjny z żywymi komórkami, komórki można śledzić za pomocą mikroskopii świetlnej, a także fluorescencji reporterowej.

6. Opcjonalna (ale zalecana) kriokonserwacja iBC

  1. Po 10-14 dniach od ostatniego pasażu hodowli 3D, należy dysocjować sferoidy do zawiesiny jednokomórkowej, jak w krokach 3.2-3.5. Wykonaj zliczanie komórek.
  2. Zawiesić w podłożu do kriokonserwacji o gęstości 250 000 komórek/500 μl w kriowalu.
  3. Umieścić kriowial (kriowialisty) w pojemniku, aby zapewnić stały spadek temperatury (1 °C/min) i przenieść do -80 °C na 24-48 godzin, a następnie przenieść do -150 °C w celu długotrwałego przechowywania.
    UWAGA: Przeprowadzono powtórną kriokonserwację, a także kriokonserwację wcześniej posortowanych komórek NGFR+, ale nie zostały one odpowiednio ocenione pod kątem żywotności komórek i zdolności do tworzenia funkcjonalnych kultur ALI. Szczególnie w przypadku wydłużonego pasażu komórkowego zaleca się ocenę kariotypu, ponieważ zauważono, że różni się on w komórkach iPSC i pochodzących z iPSC.

Wyniki

Zgodnie z tym protokołem, 200 000 kriokonserwowanych iBC (wcześniej potwierdzono, że posiadają prawidłowy kariotyp 46XY)11 odmrożono i namnożono w hodowli 3D. Pięć dni później powstałe sferoidy rozdzielono, policzono i ponownie pasażowano w celu dalszej ekspansji. Uzyskano około 480 000 komórek, które zawieszono ponownie w matrycy 3D (12 kropli po 50 µL, gęstość 400 komórek/µL). Co 2-3 dni stosowano świeże Basal Cell Medium. Po dziesięciu dniach komórki ponownie rozdzielono i policzono. Zebrano łącznie 19,7 x 106 komórek i przygotowano je do analizy FACS. 106 komórek barwiono kontrolą izotypową IgG1κ sprzężoną z APC, a pozostałe 18,7 x 106 komórek barwiono przeciwciałem anty-NGFR sprzężonym z APC przez 30 min w ciemności (Rysunek 3).

Bramkowanie komórek NGFR+ wykonano po porównaniu z komórkami kontrolnymi izotypowymi i zostało ono celowo ustawione tak, aby wyizolować komórki NGFR+ o najwyższej ekspresji (Rysunek 3). Przy zastosowaniu tej techniki bramkowania, 28% żywych, pojedynczych komórek było NGFR+. Mimo dostępności większej liczby komórek, do dalszej hodowli zebrano 750 000 komórek. Posortowane komórki zawieszono ponownie w Basal Cell Medium w stężeniu 50 000 komórek/100 µL. Następnie 50 000 komórek wysiano na każdy porowaty insert membranowy o średnicy 6,5 mm, który został pokryty ludzką rekombinowaną lamininą-521 (2 µg/200 µL) zgodnie z wytycznymi producenta. Do komory basolateralnej każdego insertu dodano 500 µL Basal Cell Medium, a płytkę umieszczono w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C. Po trzech dniach odessano medium z komory apikalnej; w badaniu pod mikroskopem świetlnym stwierdzono, że komórki osiągnęły około 90% konfluencji (Rysunek 4B). Odessano medium z komory basolateralnej, a następnie do komory apikalnej (100 µL) i basolateralnej (500 µL) dodano ALI Differentiation Medium. Następnego dnia odessano medium z komory apikalnej.

Przez kolejne 21 dni komórki poddawano okresowej ocenie za pomocą mikroskopii świetlnej i co 2-3 dni dostarczano im świeże Medium do Różnicowania ALI (wyłącznie do komory bazolateralnej). Początkowo poszczególne komórki były łatwo identyfikowalne (Rycina 4A), miały wydłużony, wrzecionowaty kształt i tworzyły luźno upakowaną warstwę jednowarstwową (Rycina 4B). W kolejnych dniach i tygodniach komórki utworzyły gęsto upakowaną, wysoce komórkową warstwę nabłonkową, a po 7-10 dniach zaobserwowano wyraźne pojawienie się bijących rzęsek oraz produkcję śluzu. Obliczono wartości TEER próbek, które były zbliżone do kontrolnych komórek pierwotnych (zakres od 700-1600 Ω x cm2)11. Następnie przeprowadzono fiksację (dni 21-28) za pomocą paraformaldehydu oraz immunoznakowanie m.in. kanonicznych markerów komórek nabłonka dróg oddechowych, takich jak MUC5AC i acetylowana α-tubulina (Rycina 4C). Biorąc pod uwagę obserwację ruchomych rzęsek, produkcję śluzu, a także potwierdzające barwienie immunocytochemiczne komórek wielorzęskowych i wydzielniczych, podobne do wyników dla pierwotnych HBECs, wyciągnęliśmy wniosek, że pomyślnie wygenerowano komórki nabłonka dróg oddechowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

figure-results-1
Rycina 1: Ogólny schemat protokołu. Kriokonserwowane iBC są rozmrażane, namnażane i oczyszczane metodą FACS przed wysianiem na wkładki z porowatej membrany, gdzie różnicują się w funkcjonalne nabłonki rzęskowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rycina 2: Reprezentatywne obrazy w kontraście fazowym. Reprezentatywne obrazy w kontraście fazowym pokazujące typowy wygląd iBC w hodowli 3D po (A) 1 dniu, (B) 4 dniach, (C) 8 dniach i (D) 14 dniach (bezpośrednio przed sortowaniem według NGFR). Paski skali reprezentują 500 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rycina 3: Reprezentatywne wykresy FACS. Reprezentatywne wykresy FACS dla iBC bez reportera oraz z reporterem fluorescencyjnym. Przedstawiono przykłady kontroli izotypowych, które posłużyły do selekcji komórek NGFR+ o najwyższej ekspresji. Linie iPSC zawierające reporter fluorescencyjny są poddawane „potrójnej sortowaniu” w celu wyizolowania komórek NKX2-1GFP+ TP63tdTomato+ NGFR+. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-4
Rycina 4: Reprezentatywne obrazy kultur iBC na membranach porowatych. Przedstawiono obrazy w kontraście fazowym (A) 1 dzień oraz (B) 3 dni po wysiewaniu. Reprezentatywne znakowanie immunocytochemiczne kultur śluzowo-rzęskowych pokazano w (C); acetylowana alfa-tubulina (zielony) i MUC5AC (czerwony). Paski skali odpowiadają 25 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Plik uzupełniający 1: Tabela składników pożywek. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

HBEC są złotym standardem typu komórek do badania chorób nabłonka dróg oddechowych. Ze względu na ich ograniczenia (w tym dostępność i trudność w manipulacji genetycznej) opracowaliśmy protokół do wyprowadzania kultur iBC i ALI. Komórki te mogą pochodzić od dowolnego dawcy i zachowują swoje unikalne tło genetyczne, co pozwala na podstawowe badania rozwojowe, modelowanie chorób i opracowywanie nowych terapii.

Chociaż każdy pojedynczy krok opisanego protokołu jest konieczny, jest kilka, które zasługują na dodatkową wzmiankę. Po pierwsze, na każdym etapie, który wymaga dysocjacji sferoid na pojedyncze komórki, bardzo ważne jest, aby unikać nadmiernego pipetowania; Trawienie enzymatyczne (z dipazą lub trypsyną) sprzyja lepszemu przeżyciu komórek, podczas gdy nadmierne pipetowanie prowadzi do znacznej śmierci komórki. Po drugie, podczas oczyszczania iBC NGFR+ kluczowe znaczenie ma wykorzystanie kontroli izotypu i zalecamy wybór komórek NGFR+ o najwyższej ekspresji z FACS (Rysunek 3). Efektem takiego podejścia są optymalne hodowle ALI z odpowiednim różnicowaniem śluzowo-rzęskowym. Wreszcie, precyzyjnie udokumentowane w protokole przygotowanie i wysiew porowatych błon ma fundamentalne znaczenie dla przetrwania kultur ALI. Podczas gdy zwykle wysiewamy 30 000-60 000 komórek na wkładkę, odnieśliśmy sukces z zaledwie 20 000 komórek. Podczas gdy udane hodowle można wygenerować przy użyciu powłoki matrycowej kwalifikowanej do zarodków ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, ostatnio zastosowaliśmy ludzką rekombinowaną lamininę-521 o znacznie wyższej trwałości kultur ALI.

Bardzo rzadko zróżnicowanie iPSC może nie być w stanie zwiększyć odpowiedniego odsetka iBC NGFR+. W tym przypadku szeregowe pasażowanie iBC (w hodowli 3D) może z czasem skutkować zwiększoną częstotliwością NGFR. Ograniczenia tego protokołu obejmują czas, koszt i wiedzę specjalistyczną potrzebną do wygenerowania tych komórek. Ponadto zdajemy sobie sprawę, że wielu badaczy jest zainteresowanych mniej powszechnymi typami komórek nabłonka dróg oddechowych (np. jonocyty, komórki neuroendokrynne). Chociaż wykryliśmy niektóre z tych rzadszych typów komórek, jak w pierwotnych hodowlach HBEC, nie są one odtwarzalnie identyfikowane, prawdopodobnie z powodu niepełnej wiedzy na temat sygnałów rozwojowych wymaganych do wytworzenia tych komórek.

Jak jest napisane, powyższy protokół rozpoczyna się od rozmrożenia już kriokonserwowanych iBC. Szczegóły poprzedzające tę kriokonserwację są już wcześniej opisane i wykraczają poza zakres tego manuskryptu11,12.

Nasza metoda hodowli ALI nabłonka dróg oddechowych pozwala na wytworzenie funkcjonalnych komórek nabłonka dróg oddechowych od prawie każdego dawcy. To znacznie zwiększa dostęp do cennych, genetycznie kontrolowanych komórek nabłonka dróg oddechowych, które mogą być wykorzystane do modelowania chorób, badań przesiewowych leków, przyszłych terapii komórkowych, a także do lepszego zrozumienia wzorców rozwojowych w nabłonku dróg oddechowych.

Oświadczenia

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Podziękowania

Dziękujemy członkom laboratoriów Hawkins, Kotton i Davis za ich pomocny wkład na przestrzeni lat w ten i inne projekty. Jesteśmy również wdzięczni Brianowi Tiltonowi (dyrektorowi ds. sortowania komórek BU) za jego poświęcenie i wiedzę techniczną, a także jesteśmy wdzięczni Gregowi Millerowi i Marianne James z Centrum Medycyny Regeneracyjnej Uniwersytetu Bostońskiego (CReM) za ich wsparcie i wiedzę techniczną w zakresie konserwacji i charakterystyki iPSC specyficznych dla pacjenta, wspieranych przez granty NIH NO1 75N92020C00005 i U01TR001810. Praca ta była wspierana przez granty NIH U01HL148692, U01HL134745, U01HL134766 i R01HL095993 dla D.N.K, R01HL139876 dla B.R.D, R01 HL139799 dla F.H. oraz granty Fundacji Mukowiscydozy (CFF) CFF 00987G220 i CFF WANG20GO dla D.N.K, CFF DAVIS15XX1, DAVIS17XX0, DAVIS19XX0 dla B.R.D, CFF SUZUKI19XX0 dla SS, CFF BERICA2010 dla AB, i CFF HAWKIN20XX2 do F.H.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
12-dołkowa płytka poddana hodowli tkankowejCorning3515płaskie dno
3-D czynnik wzrostu zredukowany MatrigelCorning356230
A83-01ThermoFisher Scientific293910
Wkładki do hodowli komórkowych (Transwell)Corning3470średnica 6,5 mm; 0,4 i mu; m wielkość porów
Dimetylosulfotlenek (DMSO)SigmaD8418
Dispase II, proszekThermoFisher Scientific17105-041
DMH1ThermoFisher Scientific412610
Dulbecco's Modified Eagle Podłoże / mieszanka składników odżywczych (DMEM):F-12ThermoFisher Scientific11330-032
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco ( PBS) (1X)Gibco14190-144
Roztwór soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)SigmaE7889
Surowica bydlęca płodu (FBS)FisherSH3007003E
Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS)ThermoFisher Scientific14175-079
HEPESSigmaH3375
z certyfikatem hESC MatrigelCorning354277
Mysia kontrola izotypu IgG1kappa, sprzężony z APCBiolegend400122
Mysi monoklonalny anty-ludzki CD271/NGFR, Biolegend 345108 sprzężony z APC
StemCell Technologies05040
PrimocinInvivoGenant-pm-2
rhLaminin-521ThermoFisher ScientificA29248Stężenie końcowe: 10ug/ml
roztworu trypsyny-EDTA, 0,05%InvitrogenT3924
Y-27632Tocris1254
PneumaCult-ALI Medium (ALI Differentiation Medium)StemCell Technologies 05001 PneumaCult-Ex Plus Medium (podłoże bazalnokomórkowe)

Bibliografia

  1. GBD Chronic Respiratory Disease Collaborators. Prevalence and attributable health burden of chronic respiratory diseases, 1990-2017: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. The Lancet. Respiratory Medicine. 8 (6), 585-596 (2020).
  2. Alysandratos, K. -D., Herriges, M. J., Kotton, D. N. Epithelial stem and progenitor cells in lung repair and regeneration. Annual Review of Physiology. 83, 529-550 (2021).
  3. Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).
  4. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 10, 74(2019).
  7. Jacob, A., et al. Derivation of self-renewing lung alveolar epithelial type II cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 14 (12), 3303-3332 (2019).
  8. Gotoh, S., et al. Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).
  9. Huang, S. X. L., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2013).
  10. Mou, H., et al. Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs. Cell Stem Cell. 10 (4), 385-397 (2012).
  11. Hawkins, F. J., et al. Derivation of airway basal stem cells from human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 28 (1), 79-95 (2021).
  12. Suzuki, S., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into functional airway basal stem cells. STAR Protocols. 2 (3), 100683(2021).
  13. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  14. Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

kom rki nab onka dr g oddechowychpo ywka do kom rek podstawowychsfery nab onkowekom rki NGFR dodatniesortowanie kom rek aktywowane fluorescencjkom rki wielorz skowepomiar TEERwydzielanie luzu

Powiązane artykuły