Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Elektroporacja plazmidowego DNA do mięśni szkieletowych myszy

4.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63916

⸱

6 kwietnia 2022

 , 
1Department of Cellular and Molecular Physiology, Penn State College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Elektroporacja plazmidowego DNA w mięśniach szkieletowych jest realną metodą modulowania ekspresji genów bez naruszania kurczliwości mięśni u myszy.

Streszczenie

Przejściowa modulacja ekspresji genów w mięśniach szkieletowych myszy za pomocą elektroporacji plazmidu jest użytecznym narzędziem do oceny normalnej i patologicznej fizjologii. Nadekspresja lub knockdown genów docelowych umożliwia badaczom manipulowanie poszczególnymi zdarzeniami molekularnymi, a tym samym lepsze zrozumienie mechanizmów wpływających na masę mięśniową, metabolizm mięśni i kurczliwość. Ponadto elektroporacja plazmidów DNA, które kodują znaczniki fluorescencyjne, pozwala badaczom mierzyć zmiany w subkomórkowej lokalizacji białek w mięśniach szkieletowych in vivo. Kluczowa ocena funkcjonalna mięśni szkieletowych obejmuje pomiar kurczliwości mięśni. W tym protokole wykazujemy, że badania kurczliwości całych mięśni są nadal możliwe po wstrzyknięciu plazmidowego DNA, elektroporacji i modulacji ekspresji genów. Celem tej procedury instruktażowej jest zademonstrowanie krok po kroku metody elektroporacji plazmidu DNA w mięśniach szkieletowych myszy w celu ułatwienia wychwytu i ekspresji we włóknach mięśniowych mięśni piszczelowych przednich i prostowników długich palców, a także wykazanie, że kurczliwość mięśni szkieletowych nie jest zagrożona przez wstrzyknięcie i elektroporację.

Wprowadzenie

Elektroporacja plazmidowego DNA do mięśni szkieletowych in vivo jest ważnym narzędziem do oceny zmian w fizjologii mięśni szkieletowych i sygnalizacji molekularnej poprzez modulację ekspresji genów w różnych stanach fizjologicznych i patofizjologicznych1,2,3,4,5,6,7,8,9. Eksperymentalny transfer genów do mięśni szkieletowych został zademonstrowany już w 1990 roku przez Wolffa i wsp., gdzie zarówno RNA, jak i DNA zostały pomyślnie przeniesione bez elektroporacji, a ekspresja lucyferazy utrzymywała się przez co najmniej 2 miesiące10. Stosunkowo niska skuteczność transfekcji tylko po wstrzyknięciu jest problematyczna, a Aihara i Miyazaki wykazali zwiększony transfer genów za pomocą elektroporacji w 1998 roku poprzez elektroporację konstruktu pCAGGS-IL-5 do mięśnia piszczelowego przedniego (TA) i pomiar ekspresji IL-5 w surowicy11. Od tego czasu w wielu badaniach analizowano skuteczność różnych stężeń, objętości i parametrów elektroporacji DNA, aby zapewnić maksymalną wydajność transferu genów. Mir i in. przetestowali różne parametry elektroporacji, w tym napięcie, liczbę impulsów, czas trwania i częstotliwość impulsów, a także stężenie DNA, i ustalili, że większe napięcie, liczba impulsów i stężenie DNA przyczyniły się do zwiększenia wydajności elektroporacji12. Głównym zastrzeżeniem wobec wysokiego napięcia elektroporacji jest to, że chociaż ułatwia ono zwiększony wychwyt DNA przez włókna mięśniowe, powoduje również uszkodzenie mięśni, co może zakłócić wyniki. Schertzer i wsp. wykazali, że elektroporacja przy napięciu 200 V spowodowała uszkodzenie w około 50% włókien mięśniowych 3 dni po elektroporacji, podczas gdy tylko 10% włókien mięśniowych zostało uszkodzonych przy napięciu 50 V13. Wzięliśmy pod uwagę zmienne wpływające na efektywny transfer DNA w porównaniu z uszkodzeniem mięśni i stwierdziliśmy, że napięcie 125 V na centymetr szerokości suwmiarki jest wystarczające do osiągnięcia skutecznego transferu genów.

Analiza pola przekroju poprzecznego włókien mięśniowych i kurczliwości całego mięśnia po elektroporacji są ważnymi aspektami metody pomiaru zmian w wielkości i funkcji mięśni spowodowanych modulacją genów. My i inni wykazaliśmy wcześniej, że elektroporacja samych wektorów kontrolnych nie powoduje zmniejszenia obszaru włókien mięśniowych. Konstrukt białka zielonej fluorescencji (EGFP) był użytecznym fluorescencyjnym wskaźnikiem transfekcji DNA w tych badaniach13,14. W wielu badaniach badano kurczliwość TA in situ po elektroporacji i uzyskano różne wyniki. Jedno z badań wykazało, że elektroporacja 75 V/cm spowodowała około 30% zmniejszenie siły tężcowej 3 dni po elektroporacji, a po 7 dniach od elektroporacji siła tężcowa wróciła do poziomu kontrolnego, podczas gdy elektroporacja 50 V/cm nie zagroziła sile13,15. Inne badanie wykazało, że nastąpiła 30% utrata siły tężcowej w ciągu 3 godzin po elektroporacji 180 V/cm, która powróciła do poziomu siły pozorowanej po 7 dniach16.

W poniższej szczegółowej procedurze demonstrujemy iniekcję i elektroporację plazmidu pcDNA3-EGFP w mięśniach TA i prostownika długiego palca (EDL) myszy. Wykazujemy również, że metoda ta nie wpływa na kurczliwość całych mięśni EDL. Celem jest wykazanie skutecznego wychwytu plazmidu przez włókna mięśniowe bez powodowania utraty funkcji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone w Penn State College of Medicine, zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Penn State i przeprowadzone zgodnie ze standardami etycznymi określonymi w Deklaracji Helsińskiej z 1964 roku i jej późniejszych poprawkach. Do tej procedury użyto 12-tygodniowych samic myszy C57BL/6. Wszystkie narzędzia chirurgiczne zostały autoklawizowane w celu uzyskania sterylności przed eksperymentami.

1. Przygotowanie do iniekcji/elektroporacji TA i EDL

UWAGA: Te kroki są identyczne dla przygotowania do iniekcji/elektroporacji TA i EDL.

  1. Oczyścić konstrukty plazmidu ekspresyjnego do stężenia 1 μg/μl rozcieńczonego w sterylnym PBS przed eksperymentem. Do tej procedury użyto dostępnego na rynku zestawu do oczyszczania bez endotoksyn w celu oczyszczenia pustego wektora pcDNA3-EGFP (GFP) lub pcDNA3 (kontrola).
  2. Obliczyć stężenie plazmidu, aby zapewnić odpowiednią objętość wstrzyknięcia (TA: 50 μg DNA w 50 μl sterylnego PBS; EDL 10 μg DNA w 10 μl sterylnego PBS) i podwielokrotne próbki.
  3. Zaprogramuj ustawienia elektroporatora za pomocą pokrętła wyboru i wciskając pokrętło, aby wybrać parametry w następujący sposób: Tryb - LV, Napięcie - 12,5 V/mm (do regulacji w momencie wtrysku), długość impulsu - 20 ms, liczba impulsów - 5, interwał - 200 ms, polaryzacja - jednobiegunowa.
  4. Znieczulij myszy za pomocą gazu izofluranowego. Umieść myszy w pudełku indukcyjnym z 5% izofluranem. Potwierdzić chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia poprzez brak odruchu szczypania palca u nogi za pomocą kleszczy i zmniejszyć izofluran do 2% dawki podtrzymującej. Przenieś myszy do odpowiedniego stożka nosowego spoczywającego na krążącej wodzie w temperaturze 37 °C do końca zabiegu.
  5. Usuń włosy z obu tylnych kończyn za pomocą małych maszynek do strzyżenia włosów. Wyszoruj kończyny dolne naprzemiennie 70% etanolem/betadyną, aby zdezynfekować miejsce wstrzyknięcia.

2. Wtrysk/elektroporacja TA

  1. Trzymając mysz w pozycji leżącej, zlokalizuj ścięgno TA widoczne przez skórę po bocznej stronie podudzia. Za pomocą mikrostrzykawki o pojemności 50 μl z odłączaną igłą 30 G, włóż igłę 1-2 mm powyżej połączenia mięśniowo-ścięgnistego pod płytkim kątem 5°, aż igła dotrze do górnego końca mięśnia.
    UWAGA: Celem jest wstrzyknięcie w środek mięśnia.
  2. Powoli wciskać tłok, jednocześnie powoli cofając igłę wzdłuż ścieżki wstrzykiwania, aby dostarczyć 50 μl roztworu plazmidu. Mięsień powinien spuchnąć.
  3. Ustaw minutnik na 1 minutę i zmierz grubość nogi w TA. W zależności od rozmiaru myszy może to być od 5 do 10 mm. Ustaw elektrody suwmiarki na zmierzoną grubość i ustaw napięcie elektroporatora na 12,5 V/mm.
  4. Po 1 minucie umieść elektrody zacisku wokół kończyny dolnej. Elektrody powinny być dobrze dopasowane, ale nie zbyt ciasne. Dostarcz 5 impulsów prostokątnych, o czasie trwania 20 ms i odstępach 200 ms (mięsień powinien drgać przy każdym impulsie).
  5. Powtórz z alternatywną kończyną, używając wektora kontrolnego.
  6. Wyjmij mysz ze znieczulenia i pozwól jej dojść do siebie na poduszce grzewczej ustawionej na 37 °C. Po odzyskaniu zdrowia włóż mysz z powrotem do klatki.

3. Wtrysk/elektroporacja EDL

  1. Gdy mysz znajduje się w pozycji leżącej, zlokalizuj grzebień kości piszczelowej przedniej wizualnie i poprzez delikatne badanie palpacyjne.
    1. Za pomocą skalpela wykonaj płytkie nacięcie przez skórę po bocznej stronie grzebienia piszczelowego przedniego 5 mm poniżej kolana do 2 mm powyżej połączenia mięśniowo-ścięgnistego TA.
    2. Za pomocą małych nożyczek tępo rozetnij powięź, odsłaniając mięsień TA.
    3. Ponownie, używając rozbioru nożyczkami, delikatnie oddziel mięsień TA od piszczelowej, pociągając mięsień na boki, odsłaniając EDL. Małe, zakrzywione kleszcze mogą być używane do utrzymywania TA z dala od EDL podczas zabiegu.
  2. Za pomocą mikrostrzykawki o pojemności 50 μl z odłączaną igłą o sile 30 G, wprowadzić igłę do EDL wzdłużnie, aż igła dotrze do górnego końca mięśnia.
  3. Powoli wciskać tłok, jednocześnie powoli cofając igłę wzdłuż ścieżki wstrzyknięcia, aby wstrzyknąć 10 μl roztworu plazmidu (mięsień powinien puchnąć).
  4. Ustaw minutnik na 1 minutę i zmierz grubość nogi w EDL. W zależności od rozmiaru myszy może to być od 5 do 10 mm. Ustaw elektrody suwmiarki na zmierzoną grubość i ustaw napięcie elektroporatora na 12,5 V/mm.
  5. Po 1 minucie umieść elektrody zacisku wokół kończyny dolnej. Elektrody powinny być dobrze dopasowane, ale nie zbyt ciasne. Dostarcz 5 impulsów prostokątnych, o czasie trwania 20 ms i odstępach 200 ms (mięśnie powinny drgać przy każdym impulsie).
  6. Zamknij nacięcie za pomocą jednorazowych niewchłanialnych szwów nylonowych 4/0.
  7. Powtórz z alternatywną kończyną lub pozostaw kończynę nietkniętą jako absolutną kontrolę.
  8. Wyjmij mysz ze znieczulenia i pozwól jej dojść do siebie na poduszce grzewczej ustawionej na 37 °C. Natychmiast po zabiegu i 12-24 godziny po zabiegu należy podać odpowiedni podskórny środek przeciwbólowy. Po odzyskaniu zdrowia umieść mysz z powrotem w klatce.
    UWAGA: Poprzednie badania wykazały deficyt kurczliwości mięśni w TA bezpośrednio po elektroporacji i że powrót do kurczliwości następuje w ciągu 3 dni13,15. Z tego powodu analizę zarówno mięśni TA, jak i EDL pod kątem histologii, ekspresji białek lub kurczliwości mięśni przeprowadza się 3-10 dni po elektroporacji. Przedłużoną ekspresję EGFP obserwowano do 3 tygodni po zabiegu13.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Elektroporacja w celu ułatwienia transferu genów w mięśniach szkieletowych jest użyteczną techniką stosowaną do oceny zmian w fizjologii mięśni. Przedstawiliśmy szczegółową procedurę krok po kroku, pozwalającą na efektywny transfer genów zarówno w mięśń piszczelowy przedni (TA), jak i w mięsień długi prostownik palców (EDL). Różnice w wydajności transfekcji wynikają z szeregu zmiennych. Do tych zmiennych należą parametry elektroporacji (liczba impulsów, napięcie, czas trwania impulsu itp.), rozmiar konstruktu genu oraz s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Transfer genów in vivo w mięśniach szkieletowych wzmocniony przez elektroporację jest użytecznym i stosunkowo prostym narzędziem do modulowania ekspresji białek w mięśniach. Pokazaliśmy kroki wymagane do osiągnięcia skutecznego transferu genów w mięśniach EDL i TA oraz wykazaliśmy, że pomiar kurczliwości EDL jest opłacalny po zabiegu. Technika ta nie wymaga bardziej skomplikowanych wektorów wirusowych i pozwala na porównanie obszaru przekroju poprzecznego transfekowanych i nietransfekowanych włókien mięśniowych ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

B.A.H. i D.L.W nie twierdzą, że nie występują w konflikcie interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4-0 Szew nylonowy (niewchłanialny)Ethicon662GSzew do zamknięcia nacięcia skóry
50&mikro; l Strzykawka Hamilton80501mikrostrzykawka
C57BLl/6NHsd myszyEnvigo04412-tygodniowe samice myszy używane do eksperymentów
Elektroda suwmiarkowaBTX45-01021,0 cm x 1,0 cm ze stali nierdzewnej
Akwizycja/analiza danych dynamicznej kontroli mięśniAuroraScientific 605AOprogramowanie służące do pomiaru i analizy kurczliwości mięśni
System elektroporacji ECM 830ElektroporatorBTX45-0662
EndoFree Plasmid Maxi KitQiagen12362Zestaw do oczyszczania plazmidu
Bardzo wąskie nożyczkiFine Science Tools14088-10Nożyczki do sekcji
Przetwornik siłyAurora Scientific407ADo pomiaru siły z EDL
Micro-Masquito HemastatsNarzędzia Fine Science13010-12Hemastaty do surturingu
wektora ekspresji ssaków pcDNA3.1Wektor kontrolnyFisher ScientificV79020
Plazmid ekspresji pcDNA3-EGFPAddgene13031Plazmid do ekspresji GFP
Kleszcze zakrzywione SemkenNarzędzia do nauki o naczyniu11009-13Kleszcze do chirurgii
Ostrza chirurgiczne ze stali nierdzewnej nr 10Becton Dickinson37 1210Ostrza skalpela
Tissue-Tek O.C.T. MediaVWR25608-930Zamrażarki do histologii
Agglutynina z kiełków pszenicy - Texas RedThermo-Fisher ScientificW21405Barwienie membrany o przekroju mięśniowym

Bibliografia

  1. Dodd, S., Hain, B., Judge, A. Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats. Biogerontology. 10, 605-611 (2009).
  2. Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse. Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).
  3. Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. Hsp27 inhibits IKKβ-induced NF-κB activity and skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).
  4. Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication. American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).
  5. Houston, F. E., et al. Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).
  6. Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy. The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).
  7. Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).
  8. Blaveri, K., et al. Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers. Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).
  9. Fewell, J. G., et al. Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation. Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).
  10. Wolff, J. A., et al. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).
  11. Aihara, H., Miyazaki, J. Gene transfer into muscle by electroporation in vivo. Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).
  12. Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).
  13. Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function. Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).
  14. Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).
  15. Schertzer, J. D., Lynch, G. S. Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation. Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).
  16. Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).
  17. Hain, B. A., et al. Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).
  18. Hain, B. A., et al. REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice. Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).
  19. Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).
  20. Waning, D. L., et al. Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice. Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).
  21. Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. Assessment of muscle mass and strength in mice. Bonekey Reports. 4, 732(2015).
  22. Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70. American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).
  23. Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo. Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).
  24. Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle. Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).
  25. Molnar, M. J., et al. Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles. Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Elektroporacja plazmidowatransfer genówmięsień myszykurczliwość mięśniiniekcja DNAmodulacja ekspresji genówmięsień piszczelowy przednimięsień prostownik długi palcówlokalizacja białek
Elektroporacja plazmidowego DNA do mięśni szkieletowych myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.