Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie zaprojektowanych płatów naczyniowych przy użyciu technologii druku 3D

DOI:

10.3791/63920

⸱

19 maja 2022

 ,  , 
1Faculty of Biomedical Engineering, Technion-Israel Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaprojektowane klapy wymagają wbudowanej funkcjonalnej sieci naczyniowej. W tym protokole przedstawiamy metodę wytwarzania wydrukowanego w 3D płata tkankowego zawierającego hierarchiczną sieć naczyniową i jej bezpośrednie zespolenia mikrochirurgiczne z tętnicą udową szczura.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inżynieria wszczepialnych, funkcjonalnych, grubych tkanek wymaga zaprojektowania hierarchicznej network. 3D naczyniowej bioprinting to technologia używana do tworzenia tkanek poprzez dodawanie warstwa po warstwie drukowalnych biomateriałów, zwanych biotuszami, oraz komórek w uporządkowany i automatyczny sposób, co pozwala na tworzenie bardzo skomplikowanych struktur, których tradycyjne techniki inżynierii tkankowej nie są w stanie osiągnąć. Tak więc biodruk 3D jest atrakcyjnym podejściem in vitro, które naśladuje natywną strukturę kompleksu naczyniowego, od naczyń milimetrowych po sieci mikronaczyniowe.

Postępy w biodruku 3D w granulowanych hydrożelach umożliwiły wytłaczanie w wysokiej rozdzielczości biotuszów na bazie matrycy zewnątrzkomórkowej o niskiej lepkości. Ta praca przedstawia połączone biodrukowanie 3D i podejście do drukowania 3D opartego na formach ofiarnych do wytwarzania zaprojektowanych unaczynionych płatów tkankowych. Biodrukowanie 3D komórek śródbłonka i komórek podporowych przy użyciu rekombinowanego biotuszu kolagenowo-metakrylanowego w kąpieli żelatynowej jest wykorzystywane do wytwarzania samoorganizującej się sieci kapilarnej. Ta wydrukowana mikrokrążność jest złożona wokół mezoskalowego, przypominającego naczynie porowatego rusztowania, wytwarzanego przy użyciu ofiarnej formy wydrukowanej w 3D i jest obsadzana komórkami śródbłonka.

Ten zespół indukuje śródbłonek naczynia mezoskalowego do zespolenia z otaczającą siecią naczyń włosowatych, tworząc hierarchiczną sieć naczyniową w obrębie zmodyfikowanego płata tkankowego. Zmodyfikowany płat jest następnie bezpośrednio wszczepiany przez zespolenie chirurgiczne do tętnicy udowej szczura przy użyciu techniki mankietowej. Opisane metody mogą być rozszerzone o wytwarzanie różnych unaczynionych płatów tkankowych do stosowania w chirurgii rekonstrukcyjnej i badaniach unaczynienia.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poważne wady tkanek są spowodowane urazami, wadami wrodzonymi lub chorobami, a obecnym złotym standardem leczenia tych wad jest stosowanie autologicznych przeszczepów, unaczynionych płatów tkankowych i mikronaczyniowych wolnych płatów jako substytutów tkanek. Jednak te opcje mają wady w postaci ograniczonej tkanki miejsca dawczego i zachorowalności na miejsce dawcze1. W związku z tym rośnie zapotrzebowanie na alternatywne substytuty tkanek, które można zastosować do korygowania tych wad2. Grubość inżynieryjnych konstruktów tkankowych jest ograniczona przez dyfuzję składników odżywczych i gazów w kierunku komórek, a zatem odpowiednia sieć naczyniowa jest niezbędna do generowania dużych, grubych i odpowiednio odżywionych rusztowań.

Zastosowano kilka podejść do promowania unaczynienia implantów inżynieryjnych3, w tym rekrutacja in vivo wsparcia naczyniowego od gospodarza, dostarczanie czynników wzrostu i cytokin w obrębie rusztowań, prewaskularyzacja implantów, generowanie przepuszczalnego, rozgałęziającego się łoża mikronaczyń za pomocą technik mikrowzorcowania4, wykorzystanie materiałów protektorowych do tworzenia kanałów naczyniowych/sieci5, a także tworzenie kanałów w 3D bioprinted constructs5,6. Unaczynienie grubych tkanek wymaga włączenia hierarchicznej sieci naczyniowej składającej się z naczyń w skali makro i mikrokapilarnej. Naczynia w skali makro skutecznie rozprowadzają krew w całym konstrukcie i pozwalają na mikrochirurgiczne zespolenia z naczyniami krwionośnymi gospodarza, podczas gdy naczynia w skali mikrokapilarnej umożliwiają dyfuzję składników odżywczych.

Bioprinting zyskał dużą uwagę w ostatnich latach ze względu na przewagę, jaką oferuje w porównaniu z konwencjonalnymi metodami inżynierii tkankowej. Tkanki i narządy to złożone i skomplikowane obiekty 3D o określonej architekturze. Biodruk 3D, dzięki zdolności do osadzania warstw biomateriałów w wysokiej rozdzielczości, umożliwia tworzenie złożonych substytutów tkanek i narządów (np. nerki, płuca, wątroba)7. Kilka technologii druku zostało dostosowanych do biodruku, w tym oparte na wytłaczaniu, inkjet8, deposition wspomagane laserowo9,10 i stereolitografia11,12 bioprinting. Technologie oparte na wytłaczaniu polegają na wytłaczaniu materiału przez dyszę poprzez wywieranie nacisku na powierzchnię masową materiału po przeciwnej stronie dyszy.

Free-form, odwracalne zatapianie zawieszonych hydrożeli (FRESH) to technika biodruku13,14, która wykorzystuje granulowany materiał podporowy, w którym wytłaczany materiał jest osadzany i mocowany na miejscu przez kąpiel podporową. Kąpiel podporowa zapewnia mechaniczne podparcie dla wytłaczanego, wstępnie usieciowanego biotuszu aż do jego usieciowania. Główną zaletą tej techniki jest to, że kąpiel podporowa pozwala na wytłaczanie materiałów o niskiej lepkości, które nie mogą zachować swojego kształtu po wytłaczeniu i przed usieciowaniem15. Rozszerza to pulę dostępnych materiałów, które można wykorzystać jako biotusze.

Ten artykuł przedstawia protokół generowania płata unaczynionego, który łączy w sobie mikroskalowe i mezoskalowe naczynia. Aby to osiągnąć, w rekombinowanym hydrożelu z metakrylanu ludzkiego kolagenu (rhCollMA) generowane są biodrukowane, samoorganizujące się sieci mikronaczyniowe, które następnie łączą się z wnętrzem większego, wszczepialnego, naczyniowego rusztowania, w wyniku czego powstaje w pełni zmodyfikowana tkanka flap16. Aby zapewnić szybką i bezpośrednią perfuzję tkanek inżynieryjnych, wymagane jest bezpośrednie zespolenie mikrochirurgiczne z naczyniami gospodarza. Rusztowanie naczyniowe nie ma wystarczającej wytrzymałości na utrzymanie szwów, aby można je było zespoleć przy użyciu tradycyjnego mikrochirurgicznego szycia ścian naczyń. Dlatego opisujemy metodę "mankiet"17,18,19 w celu uzyskania zespolenia ze wspólną tętnicą udową szczura. W tej metodzie końce naczyń zabezpiecza się szwami obwodowymi, bez konieczności perforacji ściany naczynia.

Chociaż proponowany protokół został przygotowany do badania hierarchicznego unaczynienia w środowisku rhCollMA, to podejście może być rozszerzone i zastosowane do wielu nowych zastosowań. Protokół można zastosować do biodrukowania różnych komórek specyficznych dla tkanek w różnych biotuszach. Co więcej, geometrię i rozmiar konstruktów można łatwo modyfikować w celu dopasowania do określonych wymagań, takich jak rekonstrukcja dużych tkanek lub badania biologiczne.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone i przeprowadzone pod nadzorem Technion Pre-Clinical Research Authority (PCRA Technion, zatwierdzenie etyczne nr 058-05-20). Do badań wykorzystano samce szczurów rasy Sprague-Dawley (275-350 g). Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów, sprzętu i oprogramowania używanego w tym protokole.

1. Produkcja rusztowań naczyniowych

  1. Utwórz komputerowy model 3D pożądanego kształtu rusztowania naczyniowego za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD) lub pobierz plik 3D żądanej struktury naczyniowej z repozytoriów internetowych.
    1. Utwórz walec o średnicy wewnętrznej 0,9 mm, średnicy zewnętrznej 2 mm i wysokości 18 mm. Dodaj promieniste okienka o średnicy 0,22 mm wzdłuż ścianki cylindra.
  2. Utwórz formę do rusztowania za pomocą oprogramowania do projektowania 3D i wyeksportuj ją jako plik . Plik STL. Następnie dodaj lejek do projektu, aby ułatwić późniejsze napełnianie formy.
  3. Zaimportuj plik . STL do oprogramowania do krojenia dla drukarki 3D do modelowania osadzania topionego (FDM). Pokrój model z warstwą o wysokości 0,1 mm i wyeksportuj go jako .gcode lub wyślij bezpośrednio do drukarki 3D.
  4. Wydrukuj formę 3D na drukarce 3D FDM wyposażonej w dyszę 0,25 mm, przy użyciu rozpuszczalnego w wodzie włókna z kopolimeru butenowo-diolowo-alkoholowego (BVOH). Przechowuj wydrukowane formy w komorze próżniowej do czasu użycia.
    UWAGA: Unikaj dotykania filamentu BVOH gołymi rękami, ponieważ jest on wrażliwy na wilgoć. Ponadto zaleca się przechowywanie filamentu w komorze próżniowej, aby uniknąć narażenia na wilgoć.
  5. Przygotować roztwór polimeru mieszaniny 1:1 kwasu poli-L-mlekowego (PLLA) i kwasu polimlekowo-koglikolowego (PLGA) w 1,4-dioksanie.
    1. Odważyć 350 mg PLLA i 350 mg PLGA i przenieść do szklanej fiolki o pojemności 20 ml.
    2. Odmierzyć 10 ml 1,4-dioksanu i przenieść do szklanej fiolki za pomocą szklanej pipety. Dodaj małe mieszadło magnetyczne do szklanej fiolki.
      UWAGA: 1,4-dioksan jest niebezpiecznym rozpuszczalnikiem organicznym. Używaj odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej i pracuj wewnątrz dygestorium.
    3. Umieścić szklaną fiolkę w gorącej łaźni wodnej podgrzanej do temperatury 70 °C i mieszać zawartość przez noc, aż wszystkie polimery całkowicie się rozpuszczą. Przechowuj roztwór w hermetycznym szklanym pojemniku do czasu użycia.
  6. Napełnij formy BVOH roztworem PLLA:PLGA.
    1. Za pomocą pipety wyporowej odmierz 30 μl roztworu polimeru i napełnij formę.
      UWAGA: Objętość potrzebna do napełnienia formy będzie się zmieniać w zależności od objętości zaprojektowanego naczynia. Kontynuuj dodawanie roztworu polimeru, aż lejek formy zostanie całkowicie wypełniony.
    2. Odwirować formę przy 100 × g przez 2 minuty. Uzupełnić formę kolejnymi 20 μl roztworu polimeru, aby zapewnić całkowite napełnienie.
  7. Zamrozić napełnione formy w temperaturze -80 °C przez co najmniej 30 minut, aby upewnić się, że cały roztwór polimerowy zamarza. Usuń rozpuszczalnik z form, liofilizując je przez noc.
    UWAGA: Kolor polimeru w formie powinien zmienić kolor z przezroczystego na biały po procesie liofilizacji.
  8. Aby usunąć protektorowy materiał formy, przenieś formy po procesie liofilizacji do 5 l dejonizowanej łaźni wodnej pod delikatnym mieszaniem. Wymień wodę w wannie, gdy zrobi się mętna. Gdy cały BVOH się rozpuści, wysusz rusztowania na powietrzu i przechowuj je w komorze próżniowej do czasu użycia.

2. Powlekanie rusztowania naczyniowego fibronektyną

  1. Zdezynfekować rusztowania naczyniowe PLLA:PLGA zanurzając je w 70% etanolu na 30 min.
  2. Mycie rusztowań 3x 5 min za pomocą PBS.
  3. Przygotować rozcieńczenie 50 μg/ml ludzkiej fibronektyny w PBS i pokryć rusztowania.
    1. Zmieszaj 500 μl podstawowego roztworu fibronektyny (1 mg/ml) z 9,5 ml PBS.
    2. Zanurzyć zdezynfekowane rusztowania naczyniowe w roztworze fibronektyny i inkubować je w temperaturze 37 °C przez 60 minut, aby umożliwić adsorpcję białek.
  4. Po inkubacji przepłukać rusztowania PBS w celu usunięcia niezwiązanej fibronektyny. Rusztowania powlekane należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.

3. Przygotowanie biotuszu rhCollMA

  1. Przygotować bufor fosforanowy do neutralizacji kwaśnego materiału wyjściowego z biotuszu rhCollMA.
    1. Przygotuj 10-krotny zapas buforu fosforanowego, rozpuszczając 5,495 g Na2HPO4, 1,55 g NaH2PO4 i 30 mg NaCl w 50 ml wody dejonizowanej.
    2. Przygotować 10-krotne rozcieńczenie 10-krotnego buforu fosforanowego, łącząc 1 część 10-krotnego buforu fosforanowego z 9 częściami wody dejonizowanej.
  2. Połączyć 900 μl podstawowego roztworu rhCollMA ze 100 μl 10x buforu fosforanowego, aby zneutralizować kwaśny roztwór rhCollMA.
  3. Rozcieńczyć zobojętniony roztwór rhCollMA do pożądanego stężenia 10 mg/ml, mieszając go z wymaganą ilością 1x buforu fosforanowego.
    UWAGA: Koncentracja zapasów rhCollMA różni się w zależności od partii. W związku z tym objętość 1x buforu fosforanowego potrzebna do osiągnięcia pożądanego stężenia będzie się różnić.
  4. Przygotować roztwór porogen-fotoinicjator (PEO-LAP) do połączenia z rozcieńczonym neutralnym rhCollMA.
    1. Przygotuj 1,6% (w/v) roztwór poli(tlenku etylenu) (PEO) w DMEM wolnym od czerwieni fenolowej, rozpuszczając 160 mg PEO w 10 ml DMEM.
    2. Dodać 20 mg fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinianu litu (LAP) do tego roztworu, aby otrzymać 0,2% (w/v) LAP w roztworze. Od tego momentu przykryj roztwór folią aluminiową lub przechowuj go w ciemnym miejscu, aby chronić go przed światłem.
    3. Wysterylizuj roztwór PEO-LAP, przepuszczając go przez filtr 0,22 μm. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.
  5. Przed biodrukowaniem należy zmieszać rozcieńczony neutralny roztwór rhCollMA z roztworem PEO-LAP w stosunku 1:1, aby uzyskać końcowy roztwór biotuszu. Używaj pipetowania, a nie wiru, aby wymieszać roztwory, unikając pęcherzyków powietrza.
  6. Jeśli do roztworu zostanie wprowadzonych dużo pęcherzyków, odwiruj go przy 2 000 × g przez 30 s. Po odwirowaniu ponownie wymieszaj roztwór biotuszu, aby zapewnić jednorodność.

4. Przygotowanie do kąpieli z granulowanym wsparciem

  1. Przygotuj żelatynowy granulowany materiał podporowy.
    1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego podzielić zawartość jednej probówki o wadze 2 g liofilizowanego materiału nośnego na dwie sterylne stożkowe probówki o pojemności 50 ml, z których każda zawiera około 1 g.
    2. Dodać 40 ml zimnego (4 °C) DMEM wolnego od czerwieni fenolowej do każdej probówki i energicznie mieszać, aż cały liofilizowany materiał podporowy się rozpuści.
    3. Pozostawić powstałą gnojowicę w temperaturze 4 °C, aby umożliwić ponowne nawodnienie materiału nośnego.
    4. Odgazuj materiał podporowy w komorze próżniowej przez 30 minut, aby zredukować pęcherzyki.
    5. Odwirować materiał podporowy o stężeniu 2 000 × g przez 5 minut. Upewnij się, że materiał znajduje się na dnie probówki, a supernatant jest czysty.
    6. Odessać supernatant, uważając, aby nie zassać materiału podporowego na dole.
      UWAGA: Materiał podporowy nie powinien płynąć podczas pochylania rurki po usunięciu supernatantu. Jeśli materiał przepływa, należy go ponownie odwirować przy użyciu tych samych ustawień, ale bez dodawania nowego supernatantu.
  2. Przenieść około 4 ml przygotowanego, zagęszczonego materiału podporowego do każdego dołka 12-dołkowej płytki za pomocą pipety wyporowej. Postukaj płytką studzienki o twardą powierzchnię, aby wymusić równomierne rozprowadzenie materiału podporowego w studzience.
    UWAGA: Minimalna zalecana objętość materiału podporowego to 3x objętość konstrukcji, która zostanie w nim wydrukowana.
  3. Umieścić płytkę studzienkową z materiałem podporowym na schłodzonym stoliku do biodrukarki lub w temperaturze 4 °C, aż do momentu, gdy zostanie użyta w celu zapobieżenia topnieniu się cząstek żelatyny.

5. Włączenie komórek śródbłonka i komórek podporowych za pomocą biotuszu

  1. Przygotuj pożywkę z komórek śródbłonka zgodnie z instrukcjami producenta, mieszając podłoże podstawowe z odpowiednim składnikiem zestawu pożywki, w tym roztworem antybiotyku, płodową surowicą bydlęcą i suplementami wzrostu komórek śródbłonka.
  2. Przygotuj pożywkę z komórek macierzystych miazgi zębowej, łącząc 500 ml DMEM o niskiej zawartości glukozy, 58 ml płodowej surowicy bydlęcej, 5,8 ml aminokwasów endogennych (NEAA), 5,8 ml substytutu glutaminy, 5,8 ml 1 M HEPS i 5,8 ml roztworu penicyliny, streptomycyny i nystatyny.
  3. Przygotować zawiesinę zawierającą 2 × 106 ludzkich komórek mikronaczyniowych tkanki tłuszczowej wykazujących ekspresję ZsGreen1 (HAMEC-ZsGreen1) i 6 × 106 komórek macierzystych miazgi zęba (DPSC) w 10 ml pożywki z komórek śródbłonka.
  4. Odwirować zawiesinę komórkową o masie 200 × g przez 4 minuty, aby uzyskać osad komórkowy. Odessać pożywkę sklarowaną nad osadem.
  5. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml przygotowanego wcześniej biotuszu rhCollMA (zawierającego PEO-LAP), aby uzyskać biotusz o całkowitym stężeniu komórek 8 × 106 komórek na 1 ml biotuszu.
    UWAGA: Po połączeniu biotuszu z komórkami przejdź natychmiast do następnego kroku. Jeśli komórki pozostaną w zawiesinie przez długi czas, opadną na dno probówki, a ich żywotność ulegnie pogorszeniu. W przypadku eksperymentów nieobejmujących komórek, pomiń kroki 5.1-5.5 lub włącz koraliki fluorescencyjne do biotuszu zamiast komórek, aby uzyskać lepszą mikroskopijną wizualizację wydrukowanych konstrukcji.
  6. Przenieś mieszaninę komórek i biotuszu do wkładów drukarskich.
    1. Dopasuj igłę o średnicy wewnętrznej 0,22 mm do bursztynowego wkładu drukarskiego o pojemności 3 ml i umieść wkład w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
    2. Przenieś 1 ml mieszaniny komórek i biotuszu do wkładu drukarskiego, napełniając go od góry, używając pipety wyporowej w celu zmniejszenia pęcherzyków.
  7. Zainstaluj kasetę drukującą w odpowiednim narzędziu przy biodrukarce.

6. Biodrukowanie sieci mikronaczyniowych za pomocą rhCollMA bioink

  1. Stwórz projekt CAD 3D dla biodrukowanej sieci mikronaczyniowej.
    1. Naszkicuj wzór 2D kwadratu o średnicy 4 mm z okrągłym kanałem o średnicy 2 mm w środku. Wyciągnij szkic o 4 mm, aby uzyskać sześcian o wymiarach 4 mm x 4 mm x 4 mm z kanałem centralnym. Wyeksportuj ten obiekt jako plik . Plik STL.
  2. Importuj płytkę 12-dołkową . szablon STL do zakładki modelowania brył w oprogramowaniu do krojenia biodrukarki i umieść go w wyznaczonym obszarze wirtualnego stołu roboczego.
  3. Zaimportuj plik . STL kształtu sześcianu do zakładki modelowania brył w oprogramowaniu do krojenia bioprinter. Kliknij pole wyboru Użyj fragmentatora zewnętrznego | Skonfiguruj fragmentator w sekcji Właściwości obiektu. W wyskakującym okienku wybierz prostoliniowy wzór dla wzoru wypełnienia i wpisz 30% w gęstości wypełnienia. Kliknij przycisk Akceptuj.
  4. Umieść kopię kształtu sześcianu w każdej żądanej wirtualnej studni, klikając sześcian i przesuwając go za pomocą myszy.
  5. Utwórz nowe ustawienia materiału dla biotuszu rhCollMA w zakładce materiały w oprogramowaniu do krojenia bioprinter, klikając przycisk dodaj materiał. Wybierz ustawienia materiału do drukowania. W przypadku ciśnienia wpisz 2 psi w odpowiednim polu. Aby uzyskać prędkość wpisać 20 mm/s w odpowiednim polu.
    UWAGA: Każdy materiał biotuszu ma swoje własne różne ustawienia drukowania, które można zapisać na liście materiałów w aplikacji.
  6. Przypisz wartości szerokości i wysokości linii do 0,24 mm, a wartość przyspieszenia do 400 mm/s2, wpisując te wartości w odpowiednich polach.
  7. Na karcie modelowania bryłowego kliknij obiekt sześcianu, a następnie kliknij materiał rhCollMA w sekcji materiałów, aby przypisać go do kształtu sześcianu. W zakładce biomontaż kliknij przycisk wyślij zadanie drukowania, aby wysłać zadanie drukowania do biodrukarki.
  8. Załaduj wkład drukujący załadowany biotuszem komórkowym do pneumatycznego narzędzia dozującego o pojemności 3 ml w temperaturze otoczenia biodrukarki opartej na wytłaczaniu 3D.
  9. Ustaw temperaturę stołu roboczego na 4 °C, klikając przycisk chłodzenia w zakładce Sterowanie-Ogrzewanie/Chłodzenie na ekranie interfejsu biodrukarki. Załaduj płytę z kąpielą podporową na stół drukarki.
    UWAGA: Ustawienia materiału dotyczące ciśnienia i prędkości drukowania mogą ulec zmianie ze względu na różnice w temperaturze otoczenia lub zmienność partii biotuszu. Na przykład w chłodniejsze dni do wytłaczania tej samej ilości materiału potrzebne jest wyższe ciśnienie lub mniejsza prędkość.
  10. Na karcie drukowania na ekranie interfejsu biodrukarki kliknij zadanie drukowania wysłane w kroku 6.7. i kliknij start | przejdź do rozpoczęcia zadania drukowania.
  11. Po wydrukowaniu należy wystawić płytkę studzienkową na działanie źródła światła o długości fali 405 nm i natężeniu 3 mW/cm2 przez 30 s, aby zainicjować sieciowanie biotuszu rhCollMA.
  12. Po usieciowaniu inkubować płytkę studzienkową w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 20 minut, aż cała kąpiel podporowa się rozpuści.
  13. Delikatnie zassać płynną kąpiel podporową i zastąpić ją podłożem z komórek śródbłonka. Inkubować konstrukty w temperaturze 37 °C i 5% CO2 aż do wykorzystania w dalszych etapach.
    UWAGA: Ze względu na kurczenie się konstrukcji po wydrukowaniu, zaleca się wykonanie Kroku 7 montażu w tym samym dniu co Krok 6.

7. Łączenie biodrukowanej sieci mikronaczyniowej z rusztowaniem naczyniowym w celu uzyskania zmodyfikowanej unaczynionej klapy

  1. Natychmiast po usunięciu materiału podporowego z biodrukowanej sieci mikronaczyniowej, umieść rusztowanie naczyniowe PLLA:PLGA pokryte fibronektyną w głównym kanale struktury biodrukowanej.
  2. Zmontowane konstrukty inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2 dni.
  3. Wyłóż światło rusztowania naczyniowego komórkami śródbłonka.
    1. Przygotować zawiesinę komórkową ludzkich komórek mikronaczyniowych tkanki tłuszczowej wykazujących ekspresję tdPomidor (HAMEC-tdTomato) w stężeniu 1 × 107 komórek/ml.
    2. Umieścić 20 μl kropli tej zawiesiny komórkowej na hydrofobowej powierzchni (tj. 10-centymetrowej naczyniu z kulturą nietkankową [nonTC]).
    3. Delikatnie umieść rusztowania naczyniowe na wierzchu kropli, tak aby światło rusztowania na jednym końcu stykało się z kropelką komórki.
    4. Zassać kroplę z przeciwległego końca rusztowania (tj. końca, który nie styka się z kroplą), wypełniając jej światło zawiesiną komórkową.
    5. Umieść rusztowanie z nasionami w probówce mikrowirówkowej i umieść je w rotatorze w środku w nawilżonym inkubatorze na 60 minut. Następnie przenieść rusztowanie na płytkę 12-dołkową i dodać 2 ml pożywki z komórek śródbłonka.
  4. Hoduj zmodyfikowane płaty przez 7 dni, zastępując pożywkę co 2 dni świeżą pożywką z komórek śródbłonka.

8. Mikroskopia konfokalna i barwienie immunofluorescencyjne zmodyfikowanych płatów

  1. Po 4 dniach i 7 dniach hodowli należy wykonać obrazowanie żywych komórek zmontowanych rusztowań za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego laserowego.
    1. Zdefiniuj kanały fluorescencyjne dla białek fluorescencyjnych ZsGreen1 i tdTomato w oprogramowaniu do akwizycji obrazów mikroskopowych.
    2. Wybierz soczewkę obiektywową 5x/0,16 z zoomem 0,5x (rozmiar piksela 5 μm) i zdefiniuj stos Z z 22 warstwami o grubości 41 μm każdy.
    3. Zdefiniuj skan kafelka 3 x 2, aby zobrazować i uchwycić całą konstrukcję.
  2. Dostosuj intensywność lasera i wartości wzmocnienia, aby uzyskać wyraźny sygnał fluorescencyjny bez nasycenia i minimalnego tła oraz uzyskać obrazy.
  3. Wykonaj projekcję o maksymalnej intensywności uzyskanego stosu Z, aby uzyskać pojedynczy obraz 2D za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazu mikroskopu lub podobnego oprogramowania do analizy obrazu.
  4. Wykonaj obrazowanie obszaru zainteresowania w większym powiększeniu.
    1. Przełącz się na obiektyw 10x/0,3 z zoomem 0,5 (rozmiar piksela 1,25 μm) i zdefiniuj stos Z z 9 warstwami o grubości 41 μm.
    2. Wykonaj kroki 8.2.-8.3.
  5. Po 7 dniach hodowli napraw zmodyfikowane klapy, zanurzając je w 4% paraformaldehydzie na 20 minut.
  6. Umyj konstrukcje 3x 5 min za pomocą PBS.
  7. Dodać 0,3% (v/v) Triton-X w PBS do konstruktów i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej w celu przepuszczalności komórek.
  8. Umyj konstrukcje 3x 5 min za pomocą PBS.
  9. Przygotować roztwór blokujący, rozpuszczając 5% (w/v) albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w PBS. Dodać roztwór blokujący do specjalnie zaprojektowanych klapek i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  10. Przygotować roztwór przeciwciała pierwotnego, rozcieńczając mysie przeciwciało przeciw aktynie mięśni gładkich (anty-SMA) w stosunku 1:50 w 5% roztworze BSA przygotowanym wcześniej w celu wybarwienia komórek podporowych wykazujących ekspresję SMA.
  11. Inkubować rusztowania w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego przez noc w temperaturze 4 °C.
  12. Myć 3x 5 min z PBS.
  13. Przygotować roztwór przeciwciała drugorzędowego, rozcieńczając kozie przeciwciało anty-mysie IgG 1:400 sprzężone z Cy3 i 4',6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI, 2,5 μg / ml) w PBS.
  14. Nanieść wtórny roztwór przeciwciała na rusztowania i inkubować przez 3 godziny w temperaturze pokojowej.
  15. Myć 3x 5 min z PBS.
  16. Konstrukcje należy przechowywać w temperaturze 4 °C w PBS przez okres do 1 miesiąca.
  17. Zobrazuj poplamione rusztowania za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego z laserem.
    1. Zdefiniuj trzy kanały fluorescencyjne (DAPI, ZsGreen i Cy3) w oprogramowaniu do akwizycji obrazów mikroskopowych.
    2. Zdefiniuj stos Z o grubości przekroju 2 μm i łącznej grubości 50 μm. Następnie zdefiniuj skanowanie kafelków, aby zobrazować większe obszary konstrukcji.
    3. Dostosuj parametry akwizycji, aby uzyskać wyraźny sygnał fluorescencyjny bez nasycenia i minimalnego tła.
    4. Rejestruj obrazy za pomocą obiektywu 20x/0,8 z zoomem 1,0x (rozmiar piksela 0,31 μm).
  18. Wykonaj projekcję o maksymalnej intensywności uzyskanego stosu Z, aby uzyskać pojedynczy obraz 2D za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazu mikroskopu lub podobnego oprogramowania do analizy obrazu.

9. Zespolenie zmodyfikowanego płata bezpośrednio z tętnicą udową szczura za pomocą techniki mankietu

  1. Przygotuj i wysterylizuj (w autoklawie) następujące narzędzia chirurgiczne: skalpel nr 15, parę kleszczyków o drobnych zębach i małą parę nożyczek z rękojeścią pierścieniową. Ponadto przygotuj i wysterylizuj następujące narzędzia mikrochirurgiczne: proste, drobno zakończone kleszczyki jubilerskie nr 3, kątowe kleszczyki jubilerskie, uchwyt na igły z okrągłą rękojeścią i zakrzywionymi szczękami, parę rozszerzaczy naczyń, nożyczki preparacyjne, nożyczki do przydanek, a także zaciski do naczyń z ich aplikatorem.
  2. Przygotować roztwór 100 j.m./ml soli fizjologicznej heparynizowanej, rozcieńczając 5 ml podstawowego roztworu heparyny ze 195 ml soli fizjologicznej.
  3. Wytnij i wysterylizuj mankiety poliimidowe.
    1. Wytnij 2,5 mm odcinki rurki poliimidowej pod mikroskopem preparacyjnym
      2. .
    2. Na jednym końcu każdej sekcji wykonaj 1,25 mm nacięcie wzdłuż w ściance rurki, aby uzyskać uchwyt mankietu. Wykonaj ukośne nacięcie na drugim końcu rurki, aby ułatwić wywijanie naczynia.
    3. Zanurz mankiety w 70% etanolu, a następnie dwukrotnie przepłucz je heparynizowaną solą fizjologiczną.
  4. Przygotuj samca szczura Sprague-Dawley (275-350 g) do operacji.
    1. Siedem dni przed zabiegiem należy rozpocząć podawanie podskórnej dziennej dawki cyklosporyny (10 mg kg-1) w celu uzyskania supresji immunologicznej.
    2. Przed zabiegiem należy znieczulić zwierzę za pomocą 3% inhalacji izofluranu zgodnie z instytucjonalnym SOP za pomocą komory indukcyjnej. Sprawdź głębokie znieczulenie, szczypiąc obie stopy i sprawdzając, czy nie ma odruchów.
    3. Podawać podskórnie dawkę przeciwbólową buprenorfiny (0,03 mg kg-1) i heparyny przeciwzakrzepowej (200 j.m. kg-1).
    4. Nałóż nawilżającą maść do oczu na oczy zwierzęcia, aby zapobiec odwodnieniu.
    5. Ogolić obszar chirurgiczny szczura i zdezynfekować to miejsce jodem, a następnie 70% etanolem. Przymocuj kończyny zwierzęcia do stołu za pomocą taśmy klejącej.
  5. Odsłoń i odizoluj wspólną tętnicę udową.
    1. Wykonaj ukośne nacięcie o długości 2 cm przez skórę, wzdłuż wklęsłości między nogą a brzuchem.
    2. Za pomocą kleszczy i nożyczek uwolnij skórę z leżącej pod spodem tkanki, aby uwidocznić pachwinową poduszeczkę tłuszczową.
    3. Za pomocą nożyczek i kleszczy przetnij poduszeczkę tłuszczową wokół górnego, środkowego i dolnego brzegu. Zwróć uwagę, aby nie ciąć dużych naczyń pod poduszką tłuszczową.
    4. Odbij poduszeczkę tłuszczową na boki, pozostawiając nienaruszone naczynia w nadbrzuszu. Umieść mokrą gazę na odbitej poduszce tłuszczowej, aby zapobiec wysuszeniu i zamocuj ją na miejscu. Upewnij się, że naczynia udowe wspólne są widoczne.
      UWAGA: Poduszka tłuszczowa zostanie później użyta do delikatnego ucisku na zespolenia.
    5. Odsłoń tętnicę udową od więzadła pachwinowego proksymalnie do punktu rozgałęzienia tętnicy nadbrzusza dystalnie, wyciągając ją z jej pochewki.
      UWAGA: Zwykle pod nią biegnie gałąź tętnicy udowej, potocznie nazywana gałęzią Murphy'ego. Uważaj, aby nie uszkodzić tej trudnej do zauważenia gałęzi.
    6. Podziel gałąź Murphy'ego, podwiązując ją, a następnie podwiąż tętnicę udową za pomocą dwóch ligatur w środku tętnicy oddalonych od siebie o 1 mm. Trzymaj jeden koniec szwu ligaturowego długi, aby użyć go później, aby przeciągnąć koniec naczynia przez mankiet.
  6. Przeciąć tętnicę między dwiema ligaturami za pomocą nożyczek adventitia.
    UWAGA: Podczas wykonywania tego cięcia nie powinno być żadnego krwawienia. Jeśli koniec tętnicy krwawi, zaciśnij tętnicę i ponownie nałóż ligatrę.
  7. Używając długiego końca szwu ligaturowego, włóż każdy koniec naczynia do mankietu poliimidowego, tak jak przygotowany w poprzednim kroku, tak aby uchwyty obu mankietów były skierowane od siebie.
  8. Po włożeniu nałóż zacisk jednocześnie na rączkę mankietu i naczynie, zabezpieczając mankiet na miejscu.
  9. Przygotować heparynizowany roztwór soli fizjologicznej w strzykawce wyposażonej w igłę 27 G.
  10. Pociągnij za podwiązany koniec naczynia i przytnij go blisko ligatury. Natychmiast dokładnie umyć koniec naczynia heparynizowaną solą fizjologiczną, aż w świetle nie będzie widać krwi.
    UWAGA: Upewnij się, że koniec naczynia jest dobrze umyty, ponieważ krew pozostawiona w środku utworzy skrzep, który zostanie wprowadzony do krwiobiegu po zakończeniu zabiegu. Może to prowadzić do niedrożności naczynia i utraty perfuzji do nogi.
  11. Rozszerz światło naczynia, trzymając je jedną ręką za osłonę, a drugą ręką rozszerzając jego światło za pomocą rozszerzacza naczynia.
  12. Umieść luźny szew obwodowy z polipropylenu 6-0 wokół korpusu mankietu. Zakończ naczynie za pomocą dwóch rozszerzaczy naczyń nad korpusem mankietu i zabezpiecz go na miejscu, zaciskając szew obwodowy.
    UWAGA: Jeśli podczas manipulacji przez zaciśnięte naczynie wycieknie krew, dokładnie umyj światło heparynizowaną solą fizjologiczną.
  13. Przepłucz zmodyfikowaną klapkę heparynizowaną solą fizjologiczną, a następnie włóż mankiet wyściełany naczyniem do światła rusztowania naczyniowego. Zamocuj rusztowanie na miejscu, umieszczając obwodowy szew polipropylenowy 6-0 wokół rusztowania i korpusu mankietu. Wykonaj ten krok dla obu stron rusztowania naczyniowego.
  14. Owiń filtr z membraną polistyrenową o grubości 0,2 μm wokół miejsca zespolenia, aby odizolować zmodyfikowany płat od otaczającej tkanki.
  15. Najpierw zwolnij dystalny zacisk, a następnie zwolnij proksymalny zacisk, aby przywrócić przepływ krwi przez naczynie.
  16. Aby zatamować krwawienie przez zespolenia, należy odbić poduszkę tłuszczową z powrotem nad naczyniami udowymi i delikatnie uciskać za pomocą sterylnej gazy przez 3 minuty.
  17. Zszyj poduszeczkę tłuszczową z powrotem na miejscu za pomocą polipropylenu 6-0, a następnie zszyj skórę za pomocą wchłanialnych szwów 5-0 PGA.
  18. Oczyść obszar rany solą fizjologiczną i nałóż roztwór jodu.
  19. W przypadku bólu pooperacyjnego i leczenia zwierząt należy przygotować 0,1% (v/v) tramadolu w wodzie pitnej. Ponadto należy podawać dzienną dawkę heparyny (200 IU kg-1) i cyklosporyny (10 mg kg-1).
  20. Umieść zwierzę w czystej klatce umieszczonej pod lampą grzewczą. Kontynuuj monitorowanie zwierzęcia, aż odzyska wystarczającą przytomność, aby utrzymać pozycję leżącą mostka.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje wykonanie zaprojektowanej klapy składającej się z rusztowania naczyniowego (Rysunek 1Ai) i biodrukowanej mikrokrążenia (Rysunek 1Aii), które zostały zmontowane w celu osiągnięcia mezoskalowych i mikroskalowych naczyń krwionośnych (Rysunek 1Aiii). Zgodnie z protokołem, formy BVOH rusztowania naczyniowego zostały zaprojektowane i wydrukowane w 3D (Rysunek 1B, C). Uzyskane wydrukowane struktury zostały wizualnie sprawdzone pod kątem małych pasm BVOH, które można znaleźć w pustych przestrzeniach form (Rysunek 1D). Pasemka te zwykle wskazują na nieprawidłowe ustawienia materiału lub na to, że BVOH wchłonął wilgoć. Pasma te należy usunąć, ponieważ mogą one prowadzić do niepełnego wypełnienia formy i wad strukturalnych powstałego rusztowania naczyniowego. Następnie formy zostały wypełnione roztworem PLLA:PLGA, po czym nastąpił proces liofilizacji i etapy mycia, zgodnie z opisem w protokole. Uzyskane rusztowanie naczyniowe PLLA:PLGA zostało poddane oględzinom w celu sprawdzenia integralności ścian naczynia i drożności światła (Rysunek 1E).

Zneutralizowany biotusz rhCollMA o stężeniu 10 mg/ml został przygotowany i połączony w stosunku 1:1 z roztworem PEO:LAP. Ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego tkanki tłuszczowej znakowane Zs-Green1 oraz komórki macierzyste miazgi zębowej zawieszono za pomocą biotuszu rhCollMA, a roztwór załadowano do wkładu drukującego i do drukarki. Kształty pudełek z centralnym kanałem o prostoliniowym wzorze (Rysunek 1D) zostały wydrukowane biologicznie wewnątrz żelatynowej kąpieli nośnej. Po wydrukowaniu konstrukcje zostały usieciowane, a kąpiel podporowa została rozpuszczona i umyta. Po 4 dniach hodowli konstrukty zostały zobrazowane na żywo w celu sprawdzenia samoorganizacji sieci mikronaczyniowej. Rysunek 1D pokazuje przykład wysoko rozwiniętej sieci mikronaczyniowej HAMEC-ZsGreen1 w biodrukowanym konstrukcie.

Następnie, pokryte fibronektyną rusztowanie naczyniowe zostało wstawione do centralnego kanału wydrukowanego konstruktu (Rysunek 2A). Zmontowane konstrukty hodowano przez 2 dni, podczas których komórki kurczyły żel, mocno przytwierdzając go do rusztowania naczyniowego. Następnie rusztowanie naczyniowe zostało wyłożone HAMEC wyrażającymi tdTomato, zgodnie z protokołem. Po 7 dniach hodowli konstrukty zostały utrwalone i zobrazowane. Rysunek 2B pokazuje widok z boku zmontowanych konstrukcji, gdzie komórki śródbłonka w mikrokrążeniu biodrukowanym są przedstawione na zielono, podczas gdy wyściółka śródbłonka rusztowania naczyniowego jest przedstawiona na czerwono. Zdjęcie przedstawia zieloną samoorganizację mikrokrążenia w żelu z nadrukiem biologicznym, podczas gdy rusztowanie naczyniowe jest wyłożone czerwonymi komórkami śródbłonka. Przy większym powiększeniu widać kiełki pochodzące z czerwonej wyściółki śródbłonka kiełkujące i zespalające się z biodrukowaną siecią mikronaczyniową (Ryc. 2C). Następnie konstrukty wybarwiono pod kątem aktyny α mięśni gładkich (SMA) jako markera komórek macierzystych miazgi zębowej. Po barwieniu immunologicznym konstrukty zobrazowano za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego (Rysunek 2D).

Na koniec, po 7 dniach hodowli, zmodyfikowane płaty zostały mikrochirurgicznie połączone z tętnicą udową szczura, jak opisano w protokole. Film przedstawiający reprezentatywną procedurę można obejrzeć w filmie uzupełniającym S1. Rysunek 2E pokazuje reprezentatywny obraz zakończonego zespolenia przed usunięciem zacisku, a Rysunek 2F pokazuje reprezentatywny obraz miejsca zespolenia po usunięciu zacisku i hemostazie. Przed zamknięciem rany nie powinno być widoczne krwawienie.

figure-results-1
Rysunek 1: Reprezentatywne obrazy sfabrykowanych naczyń w skali mezo- i mikro. (A) Schematyczny przegląd kroków protokołu. Powielane za zgodą16. (B) Projekt CAD dla formy protektorowej rusztowania naczyniowego. (C) Widok z boku reprezentatywnej formy ofiarnej wydrukowanej w 3D (podziałka = 0,5 mm). (D) Widok z góry formy ofiarnej (podziałka = 0,5 mm) (E) Reprezentatywne rusztowanie naczyniowe wykonane przy użyciu opisanego protokołu (podziałka = 5 mm). (F) Projekt CAD dla biodrukowanej w 3D sieci mikronaczyniowej rhCollMA. Linie siatki = 1 mm. (G) Reprezentatywny obraz wysoko rozwiniętej sieci naczyniowej z nadrukiem biologicznym, na którym zaznaczono HAMEC-ZsGreen1 na zielono. Podziałka = 200 μm. Skróty: CAD = projektowanie wspomagane komputerowo; rhCollMA = rekombinowany metakrylan kolagenu ludzkiego; HAMEC = ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego tkanki tłuszczowej; PLLA = kwas poli-L-mlekowy; PLGA = kwas polimlekowo-ko-glikolowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy złożonego płata unaczynionego. (A) Zdjęcie reprezentatywnego zespołu biodrukowanej mikrokrążenia i rusztowania naczyniowego. Podziałka = 1 mm. (B) Widok z boku reprezentatywnego płata zaprojektowanego na obrazie 4 dni po wyściełaniu śródbłonka rusztowania naczyniowego. Biodrukowana mikrokrążność jest pokazana na zielono (HAMEC-ZsGreen1), podczas gdy wyściółka śródbłonka jest pokazana na czerwono (HAMEC-tdTomato). Podziałka liniowa = 1 mm. (C) Reprezentatywny obraz zespoleń między biodrukowanym układem naczyniowym w kolorze zielonym a wyściółką śródbłonka w kolorze czerwonym. Pasek skali = 200 μm. (D) Reprezentatywny obraz barwienia immunologicznego aktyny mięśni gładkich (czerwony), jąder (niebieski) i komórek śródbłonka (zielony) po 7 dniach inkubacji. Podziałka liniowa = 0,1 mm. (E) Reprezentatywny obraz ukończonych zespoleń zaprojektowanego płata z tętnicą udową szczura przed usunięciem zacisku i (F) po zdjęciu zacisku. Skróty: HAMEC = ludzkie komórki mikronaczyniowe tkanki tłuszczowej śródbłonka; SMA = aktyna mięśni gładkich; DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dodatkowe wideo S1: Reprezentatywny zabieg mikrochirurgiczny do zespolenia rusztowania naczyniowego z tętnicą udową szczura. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inżynieria unaczynionych tkanek jest jednym z głównych wyzwań inżynierii tkankowej20. Obecne metody tworzenia zmodyfikowanej tkanki naczyniowej koncentrują się na tworzeniu samoorganizującej się mikrokrążenia 21,22,23 lub wytwarzaniu mezoskalowych rusztowań naczyniowych 24,25, a nie na odtwarzaniu systemu hierarchicznego unaczynienia, które może być ukrwione natychmiast i bezpośrednio po implantacji26. W tej pracy opisujemy protokół, który wykorzystuje dwie modalności drukowania 3D do wytworzenia hierarchicznej sieci naczyń składającej się z naczyń krwionośnych w mikroskali i mezoskali. Protokół łączy biodrukowaną w 3D, samodzielnie zmontowaną sieć mikronaczyniową z mezoskalowym rusztowaniem naczyniowym, uzyskując wszczepialny, unaczyniony płat. Ponadto w pracy przedstawiono protokół bezpośredniego zespolenia tego płata z tętnicą udową szczura.

Biodruk 3D zyskał zainteresowanie w ostatnich latach ze względu na jego wszechstronność w porównaniu z tradycyjnymi technikami inżynierii tkankowej. Chociaż protokół ten opisuje generowanie sieci mikronaczyniowej w biotuszu rhCollMA, stosowane metody można stosować z niewielkimi modyfikacjami do wielu innych biotuszów z mnóstwa badanych i nowatorskich biotuszów i kąpieli wspomagających27,28. Zdecydowaliśmy się użyć rhCollMA jako biotuszu ze względu na obfitość kolagenu typu I w ludzkim ECM, zapewniając odpowiednie środowisko do przyczepiania komórek. Ponadto jest wytwarzany rekombinacyjnie w roślinach i dalej modyfikowany grupami metakrylanowymi, co pozwala na fotopolimeryzację i tworzenie stabilnych hydrożeli 3D29,30. Fotosieciowanie osiągnięto poprzez dodanie fotoinicjatora LAP, który, jak wykazano, jest nietoksyczny i jest aktywowany przez ekspozycję na niebieskie światło 405 nm, zmniejszając możliwą fototoksyczność światła UV. Jednak stosowanie światłoczułych biotuszów wymaga użycia pożywki hodowlanej niezawierającej czerwieni fenolowej do przygotowania biotuszu i materiału podporowego. Ponadto w protokole opisano zastosowanie żelatynowego materiału nośnego, który umożliwia wytłaczanie biotuszów z zachowaniem wysokiej wierności, takich jak rhCollMA. Dlatego tak ważne jest, aby zapewnić użycie zimnego medium podczas jego przygotowania i chłodzenia stołu drukarki. Nadmierne nagrzewanie może wystąpić z powodu źródła światła używanego do sieciowania lub z powodu podwyższonych temperatur otoczenia.

Do stworzenia biodrukowanej sieci mikronaczyniowej wykorzystano tutaj biodrukowaną biodrukarkę, a obecnie dostępnych na rynku jest wiele biodrukarek, które mogą generować podobne konstrukty. Co więcej, proponowane metody można łatwo modyfikować i stosować do badania różnych geometrii, rozmiarów i wzorów wypełnień. W tej pracy wybrano prostoliniowy wzór wypełnienia, aby utworzyć połączone ze sobą pory, które można wydrukować stosunkowo szybko z dużą dokładnością.

Pęcherzyki powietrza stanowią poważne wyzwanie w biodruku ekstruzyjnym, zwłaszcza wewnątrz materiałów podporowych. Dlatego tak ważne jest, aby zminimalizować obecność i powstawanie tych pęcherzyków poprzez stosowanie pipet wyporowych do przenoszenia materiału podporowego, przygotowania zawiesiny biotuszu-komórek i ich transferu do wkładów drukarskich.

W tej pracy ludzkie komórki śródbłonka pochodzące z tkanki tłuszczowej i komórki macierzyste miazgi zębowej zostały wykorzystane jako komórki podporowe ze względu na ich stosunkowo łatwą izolację od pacjentów. Ponadto wybrano całkowite stężenie komórek 8 x 106 komórek/ml, ponieważ wykazano, że stężenie to tworzy najbardziej rozwinięte sieci naczyniowe16. Chociaż protokół ten może być stosowany do generowania mikrokrążenia przy użyciu różnych typów komórek i źródeł, a także różnych biotuszów, należy przeprowadzić kalibrację stężenia komórek, aby stworzyć najlepsze warunki do rozwoju sieci mikrokrążenia. Co więcej, komórki specyficzne tkankowo (tj. mioblasty lub osteoblasty) mogą być włączone do biotuszu w celu uzyskania specyficznych dla tkanki unaczynionych płatów.

Forma do porowatego rusztowania naczyniowego została wykonana przy użyciu drukowanego w 3D materiału rozpuszczalnego w wodzie na dostępnej na rynku drukarce 3D do wytłaczania. W ten sposób powstała opłacalna technika oparta na platformach szybkiego prototypowania, dzięki której można szybko badać i badać wiele różnych geometrii i rozmiarów rusztowań naczyniowych31. Niemniej jednak ograniczeniem tej metody jest limit rozdzielczości większości drukarek3D 32. Jednak wraz z szybko rozwijającą się branżą związaną z produkcją addytywną oczekuje się, że limity te z czasem ulegną poprawie. Stosowanie rozpuszczalników organicznych w procesie wytwarzania jest kolejnym ograniczeniem protokołu, ponieważ większość rozpuszczalników organicznych jest toksyczna dla komórek, uniemożliwiając połączenie procedury biodruku z procesem wytwarzania rusztowania naczyniowego.

Opisana metoda wysiewu światła rusztowania za pomocą aspiracji, a nie wypychania zawiesiny komórkowej, ma duży wpływ na lokalizację wysiewanych komórek. Zastosowanie podciśnienia pozwala na endotelizację wewnętrznego światła rusztowania przy jednoczesnej minimalizacji rozlewania się zawiesiny komórkowej przez perforacje na ścianie rusztowania16.

Opisana metoda "mankietowa" dla zespoleń mikrochirurgicznych może być łatwo modyfikowana i dostosowywana do różnych materiałów lub rozmiarów rusztowań naczyniowych, a także do różnych tętnic i żył w szerokiej skali modeli zwierzęcych. Adaptacje do protokołu obejmowałyby różne rozmiary rurek poliimidowych i rozmiary szwów. Metoda ta nie wymaga perforacji ściany rusztowania, co może prowadzić do powstania wad. W tej pracy przedstawiono protokół, który można rozszerzyć na wiele zastosowań. Krytyczne aspekty tego protokołu, które obejmują wytwarzanie naczyń krwionośnych w skali mezo- i mikro oraz ich montaż i implantację, reprezentują krytyczne aspekty zaprojektowanych płatów zarówno do zastosowań rekonstrukcyjnych, jak i do badań naczyniowych i innych badań inżynierii tkankowej.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten projekt otrzymał dofinansowanie od Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC) w ramach Programu Badań i Innowacji Unii Europejskiej Horyzont 2020 (umowa o grant nr 818808). rhCollMA została hojnie przekazana przez CollPlant (Rehovot, Izrael). Autorzy dziękują Urzędowi ds. Badań Przedklinicznych Technion za pomoc w opiece nad zwierzętami, a także Janette Zavin, Galii Ben David i Idanowi Redenskiemu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,4-dioksanBiosolve Chemical42405
27 G x 0,5 "igły dozujące z końcówkąDostawa CML901-27-050
3cc bursztynowy zestaw cylindrów i tłoków strzykawekNordson EFD7012085Amber używane do blokowania światła i zapobiegania przedwczesnemu sieciowaniu
5-0 AssuCryl PGA Szew absorbalnyAssut SzwyNici wchłanialne stosowane do zamykania ran skóry
6-0 nici polipropylenoweAssut Sutures9351
Zaciski AclandS& TB-1V
Nożyczki AdventitiaS& TSAS-15
Kleszczyki jubilerskie kątowe nr 3S& TJFAL-3-18
BioAssemblyBot 400 Biodrukarka 3DZaawansowane rozwiązania6-osiowa biodrukarka 3D
Surowica albuminy bydlęcej ProbuminMillipore  82-045-1
BuprenorfinavetmarketB15100
Filament BVOHVerbatim55903rozpuszczalny w wodzie filament o średnicy 1,75 mm
Zacisk do kleszczyS& TCAF-4
Komórki macierzyste miazgi zębaLonzaPT-5025
Zaciski Dietrich BulldogFine Science Tools (FST)18039-45
wodorofosforan di-sodu (Na2HPO4)Carlo Erba Odczynniki480141
Nożyczki preparacyjneS& T18039-45
DMEM, Wysoka glukoza, bez czerwieni fenolowejSartorius01-053-1A
DuratearsAlconDJ03
ECM media + zestaw pociskówSciencell#1001
Etanol 96%Grupa Gadot64-17-5
GlutaMAXGibco35050061substytut glutaminy
Koza anty-mysz Przeciwciało Cy3Jackson115-166-072
Heparyna sodowa  5,000 I.U./mLPanpharma-Ludzkie
komórki mikronaczyniowe tkanki tłuszczowejSciencell#7200
Ludzka fibronektynaSigmaF0895-5MGStężenie podstawowe 1 mg / ml
izofluranu, USP TerrellPiramal Critical CareNDC 66794-011-25
LifeSupportAdvanced Biomatrix5244żelatynowa zawiesina wspomagająca do biodruku FRESH 3D
Lithium phenyl-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinian litu (LAP)Sigma-Aldrich900889
Low-glucose DMEMBiological Industries01-050-1A
MICROMAN E M1000E, 100-1,000 µ LGilsonFD10006
Mysie przeciwciało anty-SMADakoM0851
NEAAGibco11140068
Uchwyt igłyFine Science Tools (FST)12500-12
Roztwór paraformaldehydu 4% w PBSChemCruz  SC-281692
Roztwór penicyliny-streptomycyny-nystatynyPrzemysł biologiczny03-032-1B
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)SigmaP5368-10PAK
Poli(tlenek etylenu), MW250,000 do 400,000Acros Organics178602500
Poli(kwas L-mlekowy), IV 5,0 dl/g (PLLA)Polysciencse, Inc.18582-10
Rurka poliimidowa, ID: 0.0249", OD: 0.0273"Cole-Parmer95820-05Cienkościenna rurka używana do produkcji mankietów do zespoleń mikrochirurgicznych
Drukarka 3D Prusa I3 MK2.5Prusa Researchhttp://www.prusa3d.com/popularna komercyjna drukarka 3D
Resomer  RG 503 H, poli(D,L-laktyd-ko-glikolid) (PLGA)Evonik Industries719870
rhCollMACollPlanthttps://collplant.com/hojnie dostarczony przez CollPlant (Rehovot, Izrael)
uchwyt na igły z okrągłą rękojeściąS& TB-15-8
Rękojeść skalpela - #3Fine Science Tools (FST)10003-12
małe cienkie proste nożyczkiFine Science Tools (FST)14090-09
Chlorek soduBiosolve Chemiczny19030591
Fosforan sodu dwuzasadowy (NaH2PO4)Riedel-de Haen4276
SolidworksOprogramowanie CAD Dassault Systems
Kleszcze jubilerskie proste nr 3S& TJF-3-18
Kleszcze proste ząbkowaneFine Science Tools (FST)11050-10
Ostrze skalpela chirurgicznego nr 15Swann-Morton Limited305
Triton-X 100BioLab LTD57836
TSIMAdvanced SolutionsOprogramowanie do krojenia i projektowania 3D dla BioAssembly Bot
Rozszerzacz naczyńS& TD-5a.1
Mikroskop chirurgiczny Zeiss Tivato 700Zeiss
Strzykawki

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wallace, C. G., Wei, F. -C. C. The current status, evolution and future of facial reconstruction. Chang Gung Medical Journal. 31 (5), 441-449 (2008).
  2. Atala, A., Kasper, F. K., Mikos, A. G. Engineering complex tissues. Science Translational Medicine. 4 (160), 12(2012).
  3. Duan, B. State-of-the-art review of 3D bioprinting for cardiovascular tissue engineering. Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 195-209 (2017).
  4. Kim, J. J., Hou, L., Huang, N. F. Vascularization of three-dimensional engineered tissues for regenerative medicine applications. Acta Biomaterialia. 41, 17-26 (2016).
  5. Ouyang, L., Armstrong, J. P. K., Chen, Q., Lin, Y., Stevens, M. M. Void-free 3D bioprinting for in situ endothelialization and microfluidic perfusion. Advanced Functional Materials. 30 (1), 1908349(2020).
  6. Baltazar, T., et al. Three dimensional bioprinting of a vascularized and perfusable skin graft using human keratinocytes, fibroblasts, pericytes, and endothelial cells. Tissue Engineering - Part A. 26 (5-6), 227-238 (2020).
  7. Chia, H. N., Wu, B. M. Recent advances in 3D printing of biomaterials. Journal of Biological Engineering. 9 (1), 4(2015).
  8. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
  9. Guillotin, B., et al. Laser assisted bioprinting of engineered tissue with high cell density and microscale organization. Biomaterials. 31 (28), 7250-7256 (2010).
  10. Catros, S., et al. Laser-assisted bioprinting for creating on-demand patterns of human osteoprogenitor cells and nano-hydroxyapatite. Biofabrication. 3 (2), (2011).
  11. Ronca, A., Ambrosio, L., Grijpma, D. W. Preparation of designed poly(d,l-lactide)/nanosized hydroxyapatite composite structures by stereolithography. Acta Biomaterialia. 9 (4), 5989-5996 (2013).
  12. Lan, P. X., Lee, J. W., Seol, Y. J., Cho, D. W. Development of 3D PPF/DEF scaffolds using micro-stereolithography and surface modification. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 20 (1), 271-279 (2009).
  13. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), (2015).
  14. Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
  15. Bhattacharjee, T., et al. Writing in the granular gel medium. Science Advances. 1 (8), 1500655(2015).
  16. Szklanny, A. A., et al. 3D bioprinting of engineered tissue flaps with hierarchical vessel networks (VesselNet) for direct host-to-implant perfusion. Advanced Materials. 33 (42), 2102661(2021).
  17. Schleimer, K., et al. Training a sophisticated microsurgical technique: interposition of external jugular vein graft in the common carotid artery in rats. Journal of Visualized Experiments JoVE. (69), (2012).
  18. Sucher, R., et al. Mouse hind limb transplantation: A new composite tissue allotransplantation model using nonsuture supermicrosurgery. Transplantation. 90 (12), 1374-1380 (2010).
  19. Fensterer, T. F., Miller, C. J., Perez-Abadia, G., Maldonado, C. Novel cuff design to facilitate anastomosis of small vessels during cervical heterotopic heart transplantation in rats. Comparative Medicine. 64 (4), (2014).
  20. Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
  21. Landau, S., et al. Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation. Biomaterials. 122, 72-82 (2017).
  22. Szklanny, A. A., et al. High-throughput scaffold system for studying the effect of local geometry and topology on the development and orientation of sprouting blood vessels. Advanced Functional Materials. 1901335, 1-13 (2019).
  23. Song, W., et al. Engineering transferrable microvascular meshes for subcutaneous islet transplantation. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
  24. Luo, Y., Lode, A., Gelinsky, M. Direct plotting of three-dimensional hollow fiber scaffolds based on concentrated alginate pastes for tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 2 (6), 777-783 (2013).
  25. Ying, G. L., et al. Aqueous two-phase emulsion bioink-enabled 3D bioprinting of porous hydrogels. Advanced Materials. 30 (50), 1-9 (2018).
  26. Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and angiogenesis in tissue engineering: beyond creating static networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
  27. Jang, J., Park, J. Y., Gao, G., Cho, D. W. Biomaterials-based 3D cell printing for next-generation therapeutics and diagnostics. Biomaterials. 156, 88-106 (2018).
  28. Suntornnond, R., An, J., Chua, C. K. Roles of support materials in 3D bioprinting - present and future. International Journal of Bioprinting. 3 (1), 83-86 (2017).
  29. Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. Human recombinant type I collagen produced in plants. Tissue Engineering - Part A. 19 (13-14), 1527-1533 (2013).
  30. Stein, H., et al. Production of bioactive, post-translationally modified, heterotrimeric, human recombinant type-I collagen in transgenic tobacco. Biomacromolecules. 10 (9), 2640-2645 (2009).
  31. Kaplan, B., et al. Rapid prototyping fabrication of precision polyester scaffolds for axonal guidance. Biomaterials. , 120062(2020).
  32. Karakurt, I., Lin, L. 3D printing technologies: techniques, materials, and post-processing. Current Opinion in Chemical Engineering. 28, 134-143 (2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

3D BioprintingVascularized Tissue FlapsHierarchical Vascular NetworkSacrificial Mold PrintingExtrusion BioprintingRecombinant Collagen BioinkEndothelial CellsMicrovascular NetworkScaffold FabricationSurgical Anastomosis

Powiązane artykuły