Artykuł metodologiczny

Izolacja i identyfikacja wodnych bakterii opornych na antybiotyki oraz charakterystyka molekularna ich genów oporności na antybiotyki

9.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63934

⸱

3 marca 2023

 , 
1Antimicrobial Research (AMR) Lab, Department of Biotechnology, University of Mumbai

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół izolacji i identyfikacji bakterii opornych na antybiotyki z wody oraz molekularną charakterystykę ich genów oporności na antybiotyki (ARG). Zastosowanie technik opartych na kulturach i nieopartych na kulturach (analiza metagenomiczna) dostarcza pełnych informacji na temat całkowitej różnorodności bakterii i całkowitej puli różnych ARG obecnych w wodach słodkich z Bombaju w Indiach.

Streszczenie

Rozwój i rozprzestrzenianie się oporności na antybiotyki (AR) poprzez mikrobiotę związaną ze zbiornikami słodkowodnymi jest głównym globalnym problemem zdrowotnym. W niniejszym badaniu pobrano i przeanalizowano próbki słodkowodne pod kątem całkowitej różnorodności bakterii i genów AR (ARG) przy użyciu zarówno konwencjonalnych technik opartych na hodowlach, jak i wysokoprzepustowego, niezależnego od kultury podejścia metagenomicznego. W pracy przedstawiono systematyczny protokół oznaczania liczby bakterii hodowlanych ogółem i opornych na antybiotyki w próbkach słodkowodnych oraz oznaczania odporności fenotypowej i genotypowej w izolatach hodowlanych. Ponadto informujemy o zastosowaniu pełnej analizy metagenomicznej całkowitego metagenomicznego DNA wyekstrahowanego z próbki słodkowodnej w celu identyfikacji ogólnej różnorodności bakterii, w tym bakterii niehodowlanych, oraz identyfikacji całkowitej puli różnych ARG (rezystomów) w zbiorniku wodnym. Postępując zgodnie z tymi szczegółowymi protokołami, zaobserwowaliśmy wysokie obciążenie bakteriami opornymi na antybiotyki w zakresie 9,6 × 10 5-1,2 × 109 CFU/ml. Większość izolatów była oporna na wielokrotnie testowane antybiotyki, w tym cefotaksym, ampicylinę, lewofloksacynę, chloramfenikol, ceftriakson, gentamycynę, neomycynę, trimetoprim i cyprofloksacynę, ze wskaźnikami wielokrotnej oporności na antybiotyki (MAR) wynoszącymi ≥0,2, co wskazuje na wysoki poziom oporności izolatów. Sekwencjonowanie 16S rRNA zidentyfikowało potencjalne ludzkie patogeny, takie jak Klebsiella pneumoniae, oraz bakterie oportunistyczne, takie jak Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp. i Aeromonas spp. Charakterystyka molekularna izolatów wykazała obecność różnych ARG, takich jak blaTEM, blaCTX-M (β-laktamy), aadA, aac (6')-Ib (aminoglikozydy) i dfr1 (trimetoprimy), co również zostało potwierdzone przez całą analizę metagenomicznego DNA. W metagenomicznym DNA wykryto również wysoką częstość występowania innych ARG kodujących pompy wypływu antybiotyków - mtrA, macB, mdtA, acrD, β-laktamazy - SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, gen acetylotransferazy chloramfenikolu catB10 i gen oporności na ryfampicynę rphB. Za pomocą protokołów omówionych w tym badaniu potwierdziliśmy obecność przenoszonych przez wodę bakterii MAR o różnych cechach fenotypowych i genotypowych AR. W związku z tym analiza całego metagenomicznego DNA może być stosowana jako technika uzupełniająca konwencjonalne techniki oparte na kulturach w celu określenia ogólnego stanu AR zbiornika wodnego.

Wprowadzenie

Oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) została uznana za jeden z najbardziej palących problemów globalnych. Szybki rozwój oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe i ich ogólnoświatowe rozprzestrzenianie się są jednym z największych zagrożeń dla zdrowia ludzkiego i światowej gospodarki pod względem związanych z tym kosztów zdrowotnych1. Nadużywanie i niewłaściwe stosowanie antybiotyków doprowadziło do wzrostu AR. Uwypukliła to pandemia COVID-19, podczas której leczenie powiązanych wtórnych zakażeń w wielu przypadkach było znacznie utrudnione z powodu oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe u pacjentów dotkniętych chorobą2. Oprócz bezpośredniego stosowania/niewłaściwego stosowania antybiotyków przez ludzi, głównym problemem jest nadużywanie i niewłaściwe stosowanie antybiotyków w rolnictwie i hodowli zwierząt oraz ich niewłaściwe odprowadzanie do środowiska, w tym do zbiorników wodnych3. Pojawienie się nowych cech oporności i wielolekooporności bakterii pilnie uwypukla potrzebę lepszego zrozumienia czynników prowadzących do rozwoju AR i jego rozpowszechnienia. Wiele bakterii opornych na antybiotyki, które często przenoszą wiele genów AR (ARG) na ruchomych elementach genetycznych, takich jak plazmidy, mogą przenosić te geny oporności na nieoporne mikroorganizmy, w tym potencjalne ludzkie patogeny, prowadząc w ten sposób do pojawienia się superbakterii, których nie można leczyć nawet antybiotykami ostatniej szansy4. Te liczne bakterie oporne na antybiotyki, jeśli są obecne w ekosystemach wodnych, mogą bezpośrednio dostać się do ludzkiego jelita poprzez spożycie skażonej żywności na bazie wody, takiej jak ryby, kraby i. Wcześniejsze badania wykazały, że rozprzestrzenianie się bakterii AR w naturalnie występujących systemach wodnych może również dotrzeć do innych źródeł wody, w tym wody pitnej, a tym samym może dostać się do łańcucha pokarmowego człowieka5,6,7.

Celem niniejszego badania jest dostarczenie kompleksowego protokołu wykorzystującego kombinację technik opartych na kulturach i nieopartych na kulturach (cała analiza metagenomiczna) w celu uzyskania pełnych informacji na temat całkowitej różnorodności bakterii i całkowitej puli różnych ARG obecnych w zbiorniku wodnym w Bombaju, Indie. Tradycyjnie techniki oparte na kulturach były wykorzystywane do badania różnorodności bakterii w zbiornikach wodnych. Ponieważ mikroorganizmy nadające się do hodowli stanowią jedynie niewielki procent całkowitej mikrobioty w każdej niszy, aby lepiej zrozumieć ogólny stan różnorodności bakterii i różne cechy oporności występujące w każdej próbce, należy jednocześnie stosować różne techniki oparte na kulturach i niezależnych od hodowli. Jedną z takich solidnych i niezawodnych technik niezależnych od hodowli jest analiza całego metagenomicznego DNA. Ta wysokoprzepustowa metoda została z powodzeniem wykorzystana w różnych badaniach nad różnorodnością bakterii lub funkcjonalnymi adnotacjami różnych ARG8,9. Technika ta wykorzystuje metagenom (całkowity materiał genetyczny w próbce) jako materiał wyjściowy do różnych analiz, a zatem jest niezależna od hodowli. Protokoły w niniejszym badaniu mogą być wykorzystane do analizy całego metagenomicznego DNA w celu uzyskania informacji o całkowitej różnorodności bakterii i różnych ARG (rezystomie) w próbkach wody.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Pobieranie i przetwarzanie próbek

  1. Pobieranie próbek
    1. Pobrać odpowiednią objętość próbki wody do sterylnych pojemników, upewniając się, że nie są one wypełnione bardziej niż w 3/4.
    2. Przetransportować próbki do laboratorium w warunkach aseptycznych tak szybko, jak to możliwe po pobraniu, i niezwłocznie przystąpić do ich przetwarzania.
  2. Przetwarzanie próbek
    1. Przesączyć próbkę wody w warunkach aseptycznych przez sterylną gazę w celu usunięcia wszelkich cząstek stałych.
    2. Wyonać odpowiednie rozcieńczenia seryjne przefiltrowanej wody do dalszych analiz.

2. Oznaczenie całkowitej liczby bakterii oraz liczby bakterii opornych na antybiotyki

  1. Oznaczanie całkowitej liczby bakterii
    1. Zawiesić 18,12 g proszku R2A Agar, Modified w 1 0 mL wody dwukrotnie destylowanej i rozpuścić mieszaninę poprzez podgrzewanie. Sterylizować rozpuszczoną mieszaninę w autoklawie przy 121 °C i ciśnieniu 15 psi przez 20 min. Przygotować płytki z agarem R2A Agar, Modified, wlewając odpowiednią ilość wysterylizowanej mieszaniny do sterylnych płytek Petriego (np. dodać około 20 mL sterylnego medium do płytki Petriego o średnicy 90 mm).
    2. Po zestaleniu się medium równomiernie rozprowadzić 10 µL odpowiednich rozcieńczeń przefiltrowanej próbki wody na płytce z agarem R2A Agar, Modified. Doświadczenie wykonać w dubletach.
    3. Inkubować wszystkie powyższe płytki w temperaturze 35-37 °C przez 48 h (temperaturę i czas inkubacji dostosować do rodzaju użytego medium izolacyjnego).
    4. Całkowitą liczbę bakterii wyrazić w jednostkach tworzących kolonie na mililitr (CFU/mL), stosując równanie (1):
      figure-protocol-1   (1)
  2. Oznaczanie liczby bakterii opornych na antybiotyki (AR)
    1. Postępować zgodnie z krokami 2.1.1-2.1.4. Jednak zamiast płytek R2A Agar, Modified, użyć płytek R2A Agar, Modified uzupełnionych oddzielnie pięcioma różnymi antybiotykami: cefotaksymem (3 µg/mL), cyprofloksacyną (0,5 µg/mL), erytromycyną (20 µg/mL), kanamyciną (15 µg/mL) i wankomycyną (3 µg/mL).
    2. Dodawać antybiotyki oddzielnie do probótek zawierających 20 mL sterylnego, stopionego agaru R2A Agar, Modified (temperatura stopionego agaru R2A Agar, Modified ≤40 °C), aby uzyskać końcowe stężenie antybiotyku określone w kroku 2.2.1.
    3. Wymieszać przez delikatne potrząsanie w celu ujednolicenia i wlać na sterylne płytki Petriego przed zastygnięciem agaru. Doświadczenie wykonać w dubletach.
    4. Inkubować wszystkie powyższe płytki w temperaturze 35-37 °C przez 48 h (w przypadku użycia innego medium temperatura i czas inkubacji mogą być inne).
    5. W celu kontroli jakości i sprawdzenia skuteczności antybiotyków, rozprowadzić 10 µL zawiesin bakteryjnych szczepów Escherichia coli ATCC 25922 i Staphylococcus aureus ATCC 29213 na odpowiednich płytkach R2A Agar, Modified zawierających antybiotyki (należy upewnić się, że gęstość świeżej kultury użytej do inokulacji wynosi OD = 0,5 przy 60 nm).
    6. Oznaczyć liczbę bakterii opornych na antybiotyki w CFU/mL zgodnie z opisem w kroku 2.1.4.
  3. Zamrażarki glicerynowe izolatów
    1. Wybrać morfologicznie odmienne kolonie AR.
    2. Zawiesić pojedynczą wyizolowaną kolonię w 2 mL sterylnej pożywki Luria-Bertani zawierającej odpowiedni antybiotyk (np. jeśli kolonia została wybrana z płytki zawierającej cefotaksym, zaszczepić kolonię z kroku 2.3.1 do sterylnej pożywki Luria-Bertani zawierającej cefotaksym w odpowiednim stężeniu).
    3. Inkubować zaszczepione probótki w temperaturze 37 °C przy 80 rpm, aż OD60 osiągnie wartość 0,5.
    4. Przygotować zamrażarki glicerynowe izolatów, mieszając 750 µL zawiesiny kultury z kroku 2.3.3 z 250 µL sterylnego 10% glicerolu w warunkach aseptycznych.
    5. Przechowywać zamrażarki glicerynowe w temperaturze −80 °C do czasu dalszych analiz.
      UWAGA: W celu rewitalizacji kultur z zamrażarek glicerynowych, rozmrozić je w temperaturze 4 °C. Przenieść pętlą ilość materiału z tej zamrażarki do 2 mL sterylnej pożywki Luria-Bertani zawierającej odpowiedni antybiotyk i inkubować do namnożenia.

3. Identyfikacja bakterii zdolnych do hodowli za pomocą sekwencjonowania genu 16S rRNA

  1. Przygotowanie matrycy DNA z izolatów do PCR
    UWAGA: Protokół opisywany w celu przygotowania matrycy DNA do PCR dla izolacji surowego DNA z bakterii został przedstawiony przez Carlson et al.10.
    1. Używając sterylnej wykałaczką, pobrać pojedynczą, odizolowaną, czystą kolonię izolatu rosnącą na szalce Petriego. Zawiesić kolonię bakteryjną w 100 µL sterylnej wody podwójnie destylowanej w sterylnej probówce do mikrocentryfugi i gotować przez 10 min.
    2. Wirować zawiesinę przy 10,0 × g przez 2 min w celu osadzenia pozostałości, a następnie przenieść naddatek do nowej sterylnej probówki do mikrocentryfugi do wykorzystania jako surowa matryca DNA.
  2. Celowana amplifikacja PCR regionu V3 genu 16S rRNA i sekwencjonowanie
    1. Przygotować 40 µL mieszaniny reakcyjnej w probówce PCR do amplifikacji PCR, zgodnie z Tabelą 1.
      UWAGA: Przygotowanie DNA powinno być przeprowadzane na bloku lodowym przy minimalizacji ryzyka kontaminacji (należy używać rękawiczek podczas pracy z odczynnikami i dokładnie oczyścić powierzchnię roboczą 70% etanolem).
    2. Umieścić probówkę w bloku termicznym i uruchomić odpowiedni program w termocyklerze PCR. Standardowe warunki cykli PCR oraz informacje o starterach dla amplifikacji regionów V3 genów 16S rRNA znajdują się w Tabeli 2.
    3. W celu rozdzielenia amplikonów i ich wizualizacji przeprowadzić elektroforezę w żelu agarozowym (AGE). Wymieszać 10 µL amplifikowanego produktu PCR i 2 µL 6x buforu do ładowania żelu (Tabela 3), a następnie nanieść tę mieszaninę do studzienek w 1,5% żelu agarozowym (rozpuścić 1,5 g proszku agarozy w 10 mL 1x buforu TAE [Tabela 3]) zawierającego 5 µL bromku etydyny (EtBr) o stężeniu 10 mg/mL, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 µg/mL EtBr w 10 mL żelu agarozowego.
      OSTRZEŻENIE: EtBr jest silnym kancerogenem. Podczas pracy z EtBr i żelami zawierającymi EtBr należy przez cały czas używać rękawiczek.
    4. Dodać drabinę DNA w celu oszacowania wielkości amplikonów.
    5. Przeprowadzić elektroforezę żelu w buforze TAE przy 80-10 V.
    6. Gdy barwnik śledzący przejdzie 3/4 żelu, przerwać elektroforezę i wizualizować prążki amplikonów pod transiluminatorem UV.
    7. Wykorzystać produkt PCR (amplikon) do sekwencjonowania genu 16S rRNA w celu identyfikacji izolatu.
    8. Oznaczyć ilość amplikonu, poddając go analizie spektrofotometrycznej zgodnie z równaniem (2).
      figure-protocol-2   (2)
    9. Aby sprawdzić czystość DNA, obliczyć stosunek A260/A280.
      UWAGA: Idealnie wartość ta powinna być powyżej 1,5, a najlepiej mieścić się w zakresie od 1,8 do 2,0.
    10. W celu identyfikacji izolatów porównać uzyskane sekwencje z bazami danych sekwencji, używając odpowiedniego narzędzia do wyszukiwania dopasowań.

4. Wykrywanie oporności na antybiotyki w izolatach za pomocą testów podatności na antybiotyki

UWAGA: Niniejszy protokół opisuje metodę badania wrażliwości na antybiotyki (AST) za pomocą dyfuzji krążkowej. Wykorzystano następujące krążki z antybiotykami: cefotaksym (5 µg), ampicylina (10 µg), lewofloksacyna (5 µg), chloramfenikol (30 µg), tygecyklina (15 µg), ceftriakson (30 µg), imipenem (10 µg), gentamycyna (10 µg), neomycyna (10 µg), trimetoprym (5 µg) oraz cyprofloksacyna (5 µg).

  1. Przygotowanie inokulum do AST
    1. Aseptycznie zaszczepić pojedynczą, izolowaną, oczyszczoną kolonię AR za pomocą sterylnej pętli do 2 mL sterylnego medium nieselektywnego, np. bulionu Luria-Bertani (bez antybiotyków), i inkubować w temperaturze 37 °C przy 80 rpm przez noc.
    2. Resuspendować, przenosząc 10-150 µL kultury wyhodowanej przez noc (w przybliżeniu OD60 = 1,8-2,0) do 2 mL świeżego nieselektywnego medium bulionu Luria-Bertani i inkubować przez 2-4 h (aż do osiągnięcia OD60 0,4-0,5).
    3. Rozcieńczyć tę świeżo wyhodowaną zawiesinę kultury za pomocą sterylnego 0,85% roztworu soli fizjologicznej tak, aby gęstość kultury odpowiadała standardowi 0,5 McFarland (w przybliżeniu OD60 = 0,1), co odpowiada mniej więcej 1-2 × 108 komórek/mL.
    4. Delikatnie wymieszać zawiesinę bakteryjną dla równomiernego rozłożenia komórek.
    5. Użyć powyższej zawiesiny w ciągu 15 min od rozcieńczenia.
  2. Zaszczepianie szalek agarowych
    1. Przygotować szalki z agarem Mueller-Hinton (MHA) do wykonania AST, mieszając 38 g MHA w 1 0 mL wody podwójnie destylowanej i rozpuszczając mieszaninę poprzez podgrzewanie. Autoklawować rozpuszczoną mieszaninę w temperaturze 121 °C, ciśnieniu 15 psi przez 15 min.
    2. Upewnić się, że głębokość MHA w szalkach wynosi 4 mm (25 mL medium na szalkę).
    3. Jednocześnie wyjąć krążki z antybiotykiem z zamrażarki i doprowadzić je do temperatury pokojowej.
      UWAGA: Krążki z antybiotykiem powinny być rozmrażane stopniowo, najpierw w temperaturze 4 °C, a następnie w temperaturze pokojowej, aby zminimalizować ryzyko kondensacji pary wodnej na krążkach, co mogłoby wpłynąć na strefę zahamowania wzrostu (ZOI).
    4. W warunkach aseptycznych zanurzyć sterylny tampon w inokulum przygotowanym w kroku 4.1, a następnie usunąć nadmiar zawiesiny, aby uniknąć nadmiernego zaszczepienia szalek.
    5. Równomiernie rozprowadzić kulturę na szalkach, zaczynając od góry szalki MHA i przesuwając tampon w przód i w tył od krawędzi do krawędzi. Obracać szalkę o 60° podczas nakładania.
  3. Nakładanie krążków z antybiotykiem
    1. Za pomocą wysterylizowanej w płomieniu pęsety aseptycznie przenieść krążki z antybiotykiem na zaszczepione szalki MHA i delikatnie docisnąć krążki, aby zapewnić pełny kontakt z agarem.
      UWAGA: Procedurę tę należy przeprowadzić w ciągu 15 min od zaszczepienia kultury na szalkach.
    2. Umieścić odpowiednią liczbę krążków z antybiotykiem na szalce agarowej, biorąc pod uwagę organizm, użyty antybiotyk i rozmiar szalki, aby uniknąć nakładania się stref zahamowania wzrostu.
      UWAGA: Na okrągłej szalce o średnicy 90 mm można zmieścić od czterech do pięciu krążków.
  4. Inkubacja szalek
    1. W ciągu 15 min od nałożenia krążków z antybiotykiem odwrócić szalki i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
  5. Interpretacja wyników
    1. Zmierzyć średnicę ZOI w milimetrach (mm) i zinterpretować zgodnie z wartościami granicznymi podanymi przez EUCAST1. Zobacz dwa poniższe przykłady.
      1. Wartość graniczna średnicy strefy (mm) dla krążka z cyprofloksacyną (5 µg) dla Enterobacterales to S ≥ 25 i R < 2, co oznacza, że izolat jest uznawany za wrażliwy (S), jeśli ZOI ≥ 25 mm, natomiast za oporny (R), jeśli ZOI < 2 mm. Jeśli średnica ZOI mieści się w przedziale od 2 do 25, izolat uznaje się za pośredni (I).
      2. Wartość graniczna średnicy strefy (mm) dla krążka z chloramfenikolem (30 µg) dla Staphylococcus spp. to S ≥ 18 i R < 18, co oznacza, że izolat uznaje się za wrażliwy, jeśli ZOI ≥ 18 mm, a za oporny, jeśli ZOI < 18 mm.
    2. Wyznaczyć indeks wielooporności na antybiotyki (MAR), obliczając stosunek liczby antybiotyków, na które izolat jest oporny, do całkowitej liczby antybiotyków, na które izolat był narażony.
      ​UWAGA: Do kontroli jakości wykorzystuje się szczepy referencyjne E. coli ATCC 2592 oraz S. aureus ATCC 29213 zgodnie z protokołem opisanym w kroku 4.

5. Detekcja genów oporności na antybiotyki w izolatach z wykorzystaniem techniki PCR

  1. Zastosuj standardowy protokół PCR w celu identyfikacji genów oporności na antybiotyki (ARGs) w izolatach. Przygotuj matrycę DNA zgodnie z protokołem opisanym w kroku 3.1.
    UWAGA: Warunki cykli PCR zastosowane w niniejszym badaniu obejmowały 94 °C przez 10 min, a następnie 35 cykli: 94 °C przez 30 s, przyłączanie w odpowiedniej temperaturze (zgodnie ze standaryzacją dla każdego zestawu starterów) przez 30 s, elongację w 72 °C przez 40 s oraz końcową elongację w 72 °C przez 5 min. Skład mieszaniny reakcyjnej opisano w Tabeli 4. Lista genów ARGs, starterów i temperatur przyłączania znajduje się w Tabeli 5.
  2. Aby rozdzielić, zwizualizować i sprawdzić czystość amplikonów, postępuj zgodnie z krokami 3.2.3-3.2.10.

6. Analiza całkowitego metagenomicznego DNA w celu identyfikacji całkowitej różnorodności bakteryjnej oraz wykrycia genów oporności (ARGs) w metagenomie

  1. Ekstrakcja całkowitego DNA (metagenomu) z próbki wody
    1. Wyizoluj metagenomiczne DNA z przefiltrowanych próbek wody.
      UWAGA: W niniejszym badaniu metagenomiczne DNA (całkowite DNA) wyekstrahowano z przefiltrowanych próbek wody przy użyciu wskazanego zestawu do izolacji DNA zgodnie z protokołem producenta (patrz w Tabela materiałów).
    2. Sprawdź jakość DNA poprzez naniesienie 3 µL wyekstrahowanego metagenomicznego DNA na żel agarozowy o stężeniu 0,8% i prowadzić elektroforezę przy napięciu 80–10 V przez około 30 min.
    3. Sprawdzić obecność pojedynczego, nieprzerwanego prążka.
    4. Zmierz stężenie DNA za pomocą fluorometru.
  2. Oznaczanie różnorodności bakteryjnej i wykrywanie genów oporności na antybiotyki (ARG) przy użyciu sekwencjonowania całego metagenomicznego DNA
    1. Przygotowanie biblioteki i amplifikacja PCR:
      1. Przygotuj bibliotekę do sekwencjonowania par końcowych, korzystając z odniesionego zestawu do przygotowania biblioteki DNA (patrz) Tabela materiałów).
      2. Przygotuj DNA do ligacji adapterów, pobierając 20 ng DNA i poddając je mechanicznemu ścinaniu w celu uzyskania mniejszych fragmentów, a następnie wykonując bezpośrednio następujący krok naprawy końców, w którym "A" jest dodawane do końców 3'.
      3. W zależności od platformy wykorzystywanej do sekwencjonowania, należy przyłączyć specyficzne adaptery do obu końców fragmentów DNA.
        UWAGA: W adapterach tych znajdują się sekwencje kluczowe dla wiązania bibliotek z podwójnym kodem kreskowym do celi przepływowej w celu sekwencjonowania. Umożliwia to amplifikację PCR fragmentów zligowanych z adapterami oraz wiązanie standardowych starterów do sekwencjonowania.
      4. W celu sprawdzenia jakości i ilości, należy przeanalizować amplifikowaną bibliotekę za pomocą chipa do DNA o wysokiej czułości, zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Generowanie klastrów i sekwencjonowanie:
      1. Załaduj amplifikowaną bibliotekę na odpowiednią platformę sekwencjonowania w celu generowania klastrów i następującego po tym sekwencjonowania.
        UWAGA: Cząsteczki biblioteki wiążą się z komplementarnymi oligonukleotydami adapterowymi na przepływowej komórce do sekwencjonowania typu paired-end. Podczas sekwencjonowania nici forward są selektywnie odcinane po resyntezie nici reverse. Ta skopiowana nić reverse jest następnie sekwencjonowana od przeciwległego końca fragmentu.
    3. Analiza bioinformatyczna:
      1. Wygeneruj rusztowania z danych wysokiej jakości, korzystając z odpowiedniej platformy.
      2. Poddać te skafoldy analizie bioinformatycznej w celu klasyfikacji taksonomicznej i identyfikacji genów oporności na antybiotyki (ARG).
        UWAGA: Schemat całego procesu analizy metagenomicznego DNA w celu identyfikacji całkowitej różnorodności bakteryjnej oraz wykrycia genów oporności (ARG) w metagenomie przedstawiono w Rysunek 1Schemat kompletnej metodologii opisanej w manuskrypcie przedstawiono w Rycina 2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Całkowita liczba bakterii oraz liczba bakterii opornych na antybiotyki (AR)
Oznaczanie całkowitej liczby bakterii przeprowadzono poprzez wysiewanie rozcieńczeń próbek wody od 10−4 do 10−6 na zmodyfikowane podłoże R2A Agar. W celu oznaczania liczby bakterii AR, rozcieńczenia od 10−3 do 10−6 wysiewano na płytki z podłożem zawierającym antybiotyki (Rycina 3). Całkowitą liczbę bakterii oraz liczbę bakterii AR obliczono jako CFU/m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pobieranie i przetwarzanie próbek odgrywa znaczącą rolę i może mieć wpływ na wyniki i interpretację badania. W związku z tym, aby wykluczyć zmienność próbek, ważne jest, aby pobierać próbki w wielu miejscach badanej części wód słodkich. Utrzymanie odpowiednich aseptycznych warunków środowiskowych podczas obchodzenia się z takimi próbkami może zapobiec zanieczyszczeniu. Ponadto, aby zapobiec zmianom w składzie bakterii, które mogą mieć wpływ na jakość i ilość wyekstrahowanych kwasów nukleinowych, warunki tranzytu powinny ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają sprzecznych interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez granty finansowe z Wydziału Nauki i Technologii - Promocja Badań Uniwersyteckich i Doskonałości Naukowej (DST-PURSE) Uniwersytetu w Bombaju. Devika Ghadigaonkar pracowała w ramach programu jako Project Fellow. Doceniamy pomoc techniczną udzieloną przez Harshali Shinde, starszego pracownika naukowego w ramach Rady Badawczej ds. Nauki i Technologii oraz Nauki i Inżynierii (DST-SERB) nr projektu: CRG/2018/003624.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100 pz Drabinka DNAHimediaMBT049-50LNDo szacowania wielkości amplikonów
2x PCR Taq mastermixHiMediaMBT061-50RDo sporządzania mieszaniny reakcyjnej PCR
37 ° C InkubatorGS-192, Gayatri ScientificNADo inkubacji bakterii
6x Bufor do ładowania żeluHiMediaML015-1MLBarwnik ładujący i śledzący, który pomaga zważyć próbkę DNA i śledzić postęp elektroforezy
Proszek agarozowyHimediaMB229-50GDo rozpuszczania amplikonów podczas elektroforezy żelu agarozowego (AGE)
Ampicylina antybiotyk krążekHiMediaSD002Do wykonywania autoklawu AST
EquitronNAWymagany do sterylizacji pożyw, płytek szklanych, probówek itp
Bioanalizator 2100Agilent TechnologiesNAAby sprawdzić jakość i ilość wzmocnionej biblioteki
Szafa Bisafety B2IMSETIMSET BSC-Klasa II Typ B2Używany do prac mikrobiologicznych, takich jak hodowla bakterii, AST itp.
Krążek z antybiotykiem cefotaksymowymHiMediaSD295E-5VLDo wykonywania AST
Cefotaksym antybiotyk w proszkuHiMediaTC352-5GDo przygotowania roztworu podstawowego antybiotyku wymaganego podczas izolacji bakterii opornych na antybiotyki
Krążek z antybiotykiem CeftriaksonHiMediaSD065Do wykonywania
wirówki AST MinispinEppendorfMinispin Plus-5453Służy do osadzania szczątków podczas przygotowywania surowego DNA
Krążek z antybiotykiem chloramfenikolowymHiMediaSD006-5x50DSDo wykonywania
krążka z antybiotykiem AST CiprofloksacynaHiMediaSD060-5x50DSDo wykonywania AST
Antybiotyk cyprofloksacynowy w proszkuHiMediaTC447-5GDo przygotowania roztworu podstawowego antybiotyku wymaganego podczas izolacji antybiotykoopornych bakterie
KolorymetrQuestNADo sprawdzania OD zawiesin hodowlanych
Kompleksowa bazabaza danych adnotacja funkcjonalna ARG; https://card.mcmaster.ca/
Inkubator z wytrząsarką chłodzącąBTL41 Allied ScientificNADo inkubacji płytek z pożywką do hodowli bakterii
Deep Freezer (-40 ° C) HaierDW40L, Haier BiomedicalsDo przechowywania zapasów glicerolu
Zestaw do przygotowania biblioteki DNANEB Next Ultra DNA Zestaw przygotowawczy do biblioteki dla IlluminaNAPrzygotowanie biblioteki sekwencjonowania sparowanych końców
EDTAHiMediaGRM1195-100GDo przygotowania żelu buforowego do elektroforezy w żelu agarozowym (AGE)
Aparatura do elektroforezyTechResource Tacaodlewaniażelu 15 cmDo przygotowania żelu agarozowego  i przeprowadzanie elektroforezy 
Elektroforeza Power pack z elektrodamiGeneiNADo uruchamiania AGE 
Krążek z antybiotykiem erytromycynyHiMediaSD222-5VLDo wykonywania AST
Antybiotyk erytromycyna w proszkuHiMediaCMS528-1GDo przygotowania roztworu podstawowego antybiotyku wymaganego podczas izolacji bakterii opornych na antybiotyki
Antybiotyk erytromycyna w proszkuHiMediaTC024-5GDo przygotowania podstawowego roztworu antybiotyku wymaganego podczas izolacji antybiotykooporności bakterie
Escherichia coli ATCC 25922       HiMedia0335X-1Stosowany jako kontrola podczas wykonywania AST
Bromek etydynyHiMediaMB071-1GCzynnik interkalujący i wizualizacja DNA po elektroforezie pod Systemem Dokumentacji Żelowej
FluorometrQubit 2.0NADo oznaczania stężenia wyekstrahowanego metagenomicznego
DNA Gel Documentation SystemBioRadSłuży do wizualizacji amplikonów PCR po elektroforezie
Krążek z antybiotykiem gentamycynyHiMediaSD170-5x50DSDo wykonywania
AST Lodowcowy kwas octowyHiMediaAS119-500MLDo przygotowania Żelu do elektroforezy w żelu agarozowym (AGE)
GlicerolHiMediaGRM1027-500MLDo wytwarzania zapasów glicerolu
Krążekz antybiotykiem ImipenemHiMediaSD073Do wykonywania bazy danych AST
KaijuNANA NA Dotaksonomicznej klasyfikacji odczytów; https://kaiju.binf.ku.dk/
Krążek z antybiotykiem kanamycynyHiMediaSD017-5x50DSDo wykonywania AST
Antybiotyk Kanamycyna w proszkuHiMediaMB105-5GDo przygotowania roztworu podstawowego antybiotyku wymaganego podczas izolacji bakterii opornych na antybiotyki
Krążek z antybiotykiem lewofloksacynyHiMediaSD216-5VLDo wykonywania AST
Bulion Luria BertaniHimediaM1245-500GDo wzbogacania kultur
McFarland StandardsHimediaR092-1NoDo porównania gęstości zawiesiny hodowli
Biologia molekularna wodaHiMediaTCL018-500MLDo wytwarzania mieszaniny
reakcyjnej PCRAgar Muellera-Hintona (MHA) HiMediaM173-500GDo wykonywania testów wrażliwości na antybiotyki (AST)
Krążek z antybiotykiem neomycynowymHiMediaSD731-5x50DSDo wykonywania
gradientowego termocykleraAST PCR EppendorfMastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz Służy do wykonywania PCR w celu amplifikacji regionu 16S rRNA i różnych genów oporności na antybiotyki
Podkłady XcelrisNAdo modyfikacji PCR 
R2A Agar, ZmodyfikowanyHiMediaM1743Do przygotowania płytek z podłożem do izolacji całkowitego i opornego na antybiotyki (AR) obciążenia bakteryjnego
Generacja rusztowańCLC Genomics Workbench 6.0NADo generowania rusztowań
Platforma SequencerIllumina (2 x 150 bp chemia)BRAK DANYCHSekwencjonowanie amplifikowanej biblioteki
Chlorek sodu HiMediaTC046-500GDo przygotowania 0,85% soli fizjologicznej do seryjnego rozcieńczania próbki wody
Zestaw do izolacji DNA glebyXcelgenNADo ekstrakcji całego metagenomicznego DNA z przefiltrowanej próbki wody 
Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213HiMedia0365PUżywany jako kontrola podczas wykonywania
klasyfikacji taksonomicznejNarzędzie informatyczne Kaiju ioinformaticsNADo klasyfikacji odczytów do różnych grup taksonomicznych od poziomu typu do rodzaju 
Kompleksowa Baza Danych Oporności na Antybiotyki (CARD)NANA Dofunkcjonalnej adnotacji ARG
Krążek z antybiotykiem TigecyklinaHiMedia SD278Do wykonywania krążka
antybiotykiem AST trimetoprimHiMediaSD039-5x50DSDo wykonywania AST
Tris baseHiMediaTC072-500GDo przygotowania żelu do biegania w żelu Elektroforeza (AGE)
Antybiotyk wankomycyna w proszkuHiMediaCMS217Do przygotowania roztworu podstawowego antybiotyku wymaganego podczas izolacji bakterii opornych na antybiotyki
Waga wagowaMettler ToledoME204 Mettler ToledoSłuży do ważenia proszków mediów, odczynników w proszku itp.
BRAK DANYCH - Nie dotyczy
. danych antybiotyków (CARD) do AST z

Bibliografia

  1. Prestinaci, F., Pezzotti, P., Pantosti, A. Antimicrobial resistance: A global multifaceted phenomenon. Pathogens and Global Health. 109 (7), 309-318 (2015).
  2. Knight, G., et al. Antimicrobial resistance and COVID-19: Intersections and implications. Elife. 10, 64139(2021).
  3. Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: Part 1: Causes and threats. Pharmacy and Therapeutics. 40 (4), 277-283 (2015).
  4. Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J. R., Rath, A. Metagenomic analysis of total microbial diversity and antibiotic resistance of culturable microorganisms in raw chicken meat and mung sprouts (Phaseolus aureus) sold in retail markets of Mumbai. India. Current Science. 113 (1), 71-79 (2017).
  5. Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J., Rath, A. Characterization of multiple antibiotic resistance of culturable microorganisms and metagenomic analysis of total microbial diversity of marine fish sold in retail shops in Mumbai, India. Environmental Science and Pollution Research. 25 (7), 6228-6239 (2018).
  6. Czekalski, N., GascónDíez, E., Bürgmann, H. Wastewater as a point source of antibiotic-resistance genes in the sediment of a freshwater lake. The ISME Journal. 8 (7), 1381-1390 (2014).
  7. Kraemer, S., Ramachandran, A., Perron, G. Antibiotic pollution in the environment: From microbial ecology to public policy. Microorganisms. 7 (6), 180(2019).
  8. Edmonds-Wilson, S., Nurinova, N., Zapka, C., Fierer, N., Wilson, M. Review of human hand microbiome research. Journal of Dermatological Science. 80 (1), 3-12 (2015).
  9. de Abreu, V., Perdigão, J., Almeida, S. Metagenomic approaches to analyze antimicrobial resistance: An overview. Frontiers in Genetics. 11, 575592(2021).
  10. Carlson, S., et al. Detection of multiresistant Salmonella typhimurium DT104 using multiplex and fluorogenic PCR. Molecular and Cellular Probes. 13 (3), 213-222 (1999).
  11. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, Version 12.0. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. , Available from: https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_12.0_Breakpoint_Tables.pdf (2022).
  12. Bharti, R., Grimm, D. Current challenges and best-practice protocols for microbiome analysis. Briefings in Bioinformatics. 22 (1), 178-193 (2019).
  13. Choo, J., Leong, L., Rogers, G. Sample storage conditions significantly influence faecal microbiome profiles. Scientific Reports. 5, 16350(2015).
  14. Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, 11th edition. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2015).
  15. Bayot, M., Bragg, B. Antimicrobial Susceptibility Testing. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2021).
  16. Joseph, A. A., Odimayo, M. S., Olokoba, L. B., Olokoba, A. B., Popoola, G. O. Multiple antibiotic resistance index of Escherichia coli isolates in a tertiary hospital in South-West Nigeria. Medical Journal of Zambia. 44 (4), 225-232 (2017).
  17. Lorenz, T. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).
  18. Rolin, J. Food and human gut as reservoirs of transferable antibiotic resistance encoding genes. Frontiers in Microbiology. 4, 173(2013).
  19. Racewicz, P., et al. Prevalence and characterisation of antimicrobial resistance genes and class 1 and 2 integrons in multiresistant Escherichia coli isolated from poultry production. Scientific Reports. 12, 6062(2022).
  20. Gebreyes, W., Thakur, S. Multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Muenchen from pigs and humans and potential interserovar transfer of antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (2), 503-511 (2005).
  21. Li, L., et al. Prevalence and characteristics of extended-spectrum β-lactamase and plasmid-mediated fluoroquinolone resistance genes in Escherichia coli isolated from chickens in Anhui Province, China. PLoS One. 9 (8), 104356(2014).
  22. Akers, K., et al. Aminoglycoside resistance and susceptibility testing errors in Acinetobacter baumannii-calcoaceticus complex. Journal Of Clinical Microbiology. 48 (4), 1132-1138 (2010).
  23. Ciesielczuk, H. Extra-intestinal pathogenic Escherichia coli in the UK: The importance in bacteraemia versus urinary tract infection, colonisation of widespread clones and specific virulence factors. , Queen Mary University of London. PhD thesis (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bakterie wodneanaliza metagenomicznego DNAtechniki hodowlanesekwencjonowanie 16S rRNAtesty wra liwo ci na antybiotykiwielolekoopornomikrobiota w d s odkichgeny beta laktamaz

Powiązane artykuły