Artykuł metodologiczny

Izolacja i identyfikacja wodnych bakterii opornych na antybiotyki oraz charakterystyka molekularna ich genów oporności na antybiotyki

9.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63934

⸱

3 marca 2023

 , 
1Antimicrobial Research (AMR) Lab, Department of Biotechnology, University of Mumbai

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół izolacji i identyfikacji bakterii opornych na antybiotyki z wody oraz molekularną charakterystykę ich genów oporności na antybiotyki (ARG). Zastosowanie technik opartych na kulturach i nieopartych na kulturach (analiza metagenomiczna) dostarcza pełnych informacji na temat całkowitej różnorodności bakterii i całkowitej puli różnych ARG obecnych w wodach słodkich z Bombaju w Indiach.

Streszczenie

Rozwój i rozprzestrzenianie się oporności na antybiotyki (AR) poprzez mikrobiotę związaną ze zbiornikami słodkowodnymi jest głównym globalnym problemem zdrowotnym. W niniejszym badaniu pobrano i przeanalizowano próbki słodkowodne pod kątem całkowitej różnorodności bakterii i genów AR (ARG) przy użyciu zarówno konwencjonalnych technik opartych na hodowlach, jak i wysokoprzepustowego, niezależnego od kultury podejścia metagenomicznego. W pracy przedstawiono systematyczny protokół oznaczania liczby bakterii hodowlanych ogółem i opornych na antybiotyki w próbkach słodkowodnych oraz oznaczania odporności fenotypowej i genotypowej w izolatach hodowlanych. Ponadto informujemy o zastosowaniu pełnej analizy metagenomicznej całkowitego metagenomicznego DNA wyekstrahowanego z próbki słodkowodnej w celu identyfikacji ogólnej różnorodności bakterii, w tym bakterii niehodowlanych, oraz identyfikacji całkowitej puli różnych ARG (rezystomów) w zbiorniku wodnym. Postępując zgodnie z tymi szczegółowymi protokołami, zaobserwowaliśmy wysokie obciążenie bakteriami opornymi na antybiotyki w zakresie 9,6 × 10 5-1,2 × 109 CFU/ml. Większość izolatów była oporna na wielokrotnie testowane antybiotyki, w tym cefotaksym, ampicylinę, lewofloksacynę, chloramfenikol, ceftriakson, gentamycynę, neomycynę, trimetoprim i cyprofloksacynę, ze wskaźnikami wielokrotnej oporności na antybiotyki (MAR) wynoszącymi ≥0,2, co wskazuje na wysoki poziom oporności izolatów. Sekwencjonowanie 16S rRNA zidentyfikowało potencjalne ludzkie patogeny, takie jak Klebsiella pneumoniae, oraz bakterie oportunistyczne, takie jak Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp. i Aeromonas spp. Charakterystyka molekularna izolatów wykazała obecność różnych ARG, takich jak blaTEM, blaCTX-M (β-laktamy), aadA, aac (6')-Ib (aminoglikozydy) i dfr1 (trimetoprimy), co również zostało potwierdzone przez całą analizę metagenomicznego DNA. W metagenomicznym DNA wykryto również wysoką częstość występowania innych ARG kodujących pompy wypływu antybiotyków - mtrA, macB, mdtA, acrD, β-laktamazy - SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, gen acetylotransferazy chloramfenikolu catB10 i gen oporności na ryfampicynę rphB. Za pomocą protokołów omówionych w tym badaniu potwierdziliśmy obecność przenoszonych przez wodę bakterii MAR o różnych cechach fenotypowych i genotypowych AR. W związku z tym analiza całego metagenomicznego DNA może być stosowana jako technika uzupełniająca konwencjonalne techniki oparte na kulturach w celu określenia ogólnego stanu AR zbiornika wodnego.

Wprowadzenie

Oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) została uznana za jeden z najbardziej palących problemów globalnych. Szybki rozwój oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe i ich ogólnoświatowe rozprzestrzenianie się są jednym z największych zagrożeń dla zdrowia ludzkiego i światowej gospodarki pod względem związanych z tym kosztów zdrowotnych1. Nadużywanie i niewłaściwe stosowanie antybiotyków doprowadziło do wzrostu AR. Uwypukliła to pandemia COVID-19, podczas której leczenie powiązanych wtórnych zakażeń w wielu przypadkach było znacznie utrudnione z powodu oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe u pacjentów dotkniętych chorobą2. Oprócz bezpośredniego stosowania/niewłaściwego stosowania antybiotyków przez ludzi, głównym problemem jest nadużywanie i niewłaściwe stosowanie antybiotyków w rolnictwie i hodowli zwierząt oraz ich niewłaściwe odprowadzanie do środowiska, w tym do zbiorników wodnych3. Pojawienie się nowych cech oporności i wielolekooporności bakterii pilnie uwypukla potrzebę lepszego zrozumienia czynników prowadzących do rozwoju AR i jego rozpowszechnienia. Wiele bakterii opornych na antybiotyki, które często przenoszą wiele genów AR (ARG) na ruchomych elementach genetycznych, takich jak plazmidy, mogą przenosić te geny oporności na nieoporne mikroorganizmy, w tym potencjalne ludzkie patogeny, prowadząc w ten sposób do pojawienia się superbakterii, których nie można leczyć nawet antybiotykami ostatniej szansy4. Te liczne bakterie oporne na antybiotyki, jeśli są obecne w ekosystemach wodnych, mogą bezpośrednio dostać się do ludzkiego jelita poprzez spożycie skażonej żywności na bazie wody, takiej jak ryby, kraby i. Wcześniejsze badania wykazały, że rozprzestrzenianie się bakterii AR w naturalnie występujących systemach wodnych może również dotrzeć do innych źródeł wody, w tym wody pitnej, a tym samym może dostać się do łańcucha pokarmowego człowieka5,6,7.

Celem niniejszego badania jest dostarczenie kompleksowego protokołu wykorzystującego kombinację technik opartych na kulturach i nieopartych na kulturach (cała analiza metagenomiczna) w celu uzyskania pełnych informacji na temat całkowitej różnorodności bakterii i całkowitej puli różnych ARG obecnych w zbiorniku wodnym w Bombaju, Indie. Tradycyjnie techniki oparte na kulturach były wykorzystywane do badania różnorodności bakterii w zbiornikach wodnych. Ponieważ mikroorganizmy nadające się do hodowli stanowią jedynie niewielki procent całkowitej mikrobioty w każdej niszy, aby lepiej zrozumieć ogólny stan różnorodności bakterii i różne cechy oporności występujące w każdej próbce, należy jednocześnie stosować różne techniki oparte na kulturach i niezależnych od hodowli. Jedną z takich solidnych i niezawodnych technik niezależnych od hodowli jest analiza całego metagenomicznego DNA. Ta wysokoprzepustowa metoda została z powodzeniem wykorzystana w różnych badaniach nad różnorodnością bakterii lub funkcjonalnymi adnotacjami różnych ARG8,9. Technika ta wykorzystuje metagenom (całkowity materiał genetyczny w próbce) jako materiał wyjściowy do różnych analiz, a zatem jest niezależna od hodowli. Protokoły w niniejszym badaniu mogą być wykorzystane do analizy całego metagenomicznego DNA w celu uzyskania informacji o całkowitej różnorodności bakterii i różnych ARG (rezystomie) w próbkach wody.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Pobieranie i przetwarzanie próbek

  1. Pobieranie próbek
    1. Pobrać odpowiednią objętość próbki wody do sterylnego pojemnika (sterylnych pojemników) na próbki, upewniając się, że nie więcej niż 3/4 pojemnika jest napełnione.
    2. Próbki należy przetransportować do laboratorium w warunkach aseptycznych tak szybko, jak to możliwe po pobraniu i natychmiast je przetworzyć.
  2. Przetwarzanie próbek
    1. Próbkę wody należy przefiltrować w aseptyki przez sterylną ściereczkę muślinową, aby usunąć wszelkie cząstki stałe.
    2. Przeprowadzić odpowiednie seryjne rozcieńczenia przefiltrowanej wody do dalszej analizy.

2. Oszacowanie całkowitego obciążenia bakteryjnego i liczby bakterii opornych na antybiotyki

  1. Oznaczanie całkowitego obciążenia bakteryjnego
    1. Zawiesić 18,12 g agaru R2A, zmodyfikowanego proszku w 1,000 ml podwójnie destylowanej wody i rozpuścić mieszaninę przez ogrzewanie. Rozpuszczoną mieszaninę należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C, 15 psi przez 20 min. Przygotować agar R2A, zmodyfikowane płytki, wlewając odpowiednią ilość autoklawowanej mieszaniny do sterylnych płytek Petriego (np. dodać około 20 ml autoklawowanej sterylnej pożywki do sterylnej płytki Petriego o średnicy 90 mm).
    2. Równomiernie rozprowadzić 100 μl odpowiednich rozcieńczeń przefiltrowanej próbki wody na zmodyfikowanej płytce R2A Agar, gdy podłoże zastygnie. Wykonaj eksperyment w dwóch egzemplarzach.
    3. Inkubować wszystkie powyższe płytki w temperaturze 35-37 °C przez 48 godzin (zmieniać temperaturę i czas inkubacji w zależności od pożywki użytej do izolacji).
    4. Wyrazić całkowite obciążenie bakteryjne w jednostkach tworzących kolonie na mililitr (CFU/ml) za pomocą równania (1):
      figure-protocol-1 (1)
  2. Oznaczanie liczby bakterii AR
    1. Wykonaj kroki 2.1.1-2.1.4. Jednak zamiast agaru R2A, zmodyfikowanych płytek, użyj R2A Agar, zmodyfikowanych płytek uzupełnionych indywidualnie pięcioma różnymi antybiotykami, a mianowicie cefotaksymem (3 μg / ml), cyprofloksacyną (0,5 μg / ml), erytromycyną (20 μg / ml), kanamycyną (15 μg / ml) i wankomycyną (3 μg / ml).
    2. Dodać antybiotyki oddzielnie do probówek zawierających 20 ml sterylnego stopionego agaru R2A, zmodyfikowanego (o temperaturze stopionego agaru R2A, zmodyfikowanego na ≤40 °C), aby osiągnąć końcowe stężenie antybiotyku, jak wspomniano w kroku 2.2.1.
    3. Zawirować w celu równomiernego wymieszania i wylać na sterylne płytki Petriego, zanim agar zastygnie. Wykonaj eksperyment w dwóch egzemplarzach.
    4. Inkubować wszystkie powyższe płytki w temperaturze 35-37 °C przez 48 godzin (w przypadku użycia innej pożywki temperatura i czas inkubacji mogą się różnić).
    5. W celu kontroli jakości i sprawdzenia skuteczności antybiotyków, należy rozprowadzić 100 μl zawiesin bakteryjnych szczepów Escherichia coli ATCC 25922 i Staphylococcus aureus ATCC 29213 na odpowiednich zawierających antybiotyk Agar R2A, zmodyfikowane płytki (upewnić się, że gęstość świeżej kultury użytej do inokulacji wynosi OD = 0,5 przy 600 nm).
    6. Określić liczbę bakterii opornych na antybiotyki w jtk/ml, jak opisano w kroku 2.1.4.
  3. Zapasy glicerolu w izolatach
    1. Wybierz morfologicznie odrębne kolonie AR.
    2. Zawiesić pojedynczą izolowaną kolonię w 2 ml sterylnego bulionu Luria-Bertani zawierającego odpowiedni antybiotyk (np. jeśli kolonia została wybrana z płytki zawierającej cefotaksym, zaszczepić kolonię z kroku 2.3.1 w sterylnym bulionie Luria-Bertani zawierającym cefotaksym w odpowiednim stężeniu).
    3. Inkubować zaszczepione probówki w temperaturze 37 °C przy 80 obr./min, aż OD600 osiągnie 0,5.
    4. Przygotować zapasy glicerolu izolatów, mieszając 750 μl zawiesiny hodowlanej z kroku 2.3.3 z 250 μl sterylnego 100% glicerolu w warunkach aseptycznych.
    5. Zapasy glicerolu należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.
      UWAGA: W celu ożywienia kultur z zapasów glicerolu, należy rozmrozić bulion glicerolu w temperaturze 4 °C. Zaszczepić pętlę tego wywaru w 2 ml sterylnego bulionu Luria-Bertani zawierającego odpowiedni antybiotyk i pozostawić do wzrostu.

3. Identyfikacja bakterii hodowlanych za pomocą sekwencjonowania genu 16S rRNA

  1. Przygotowanie matrycy DNA z izolatów do PCR
    UWAGA: Protokół opisany dla przygotowania matrycy DNA do PCR w celu izolacji surowego DNA z bakterii jest podany przez Carlson et al.10.
    1. Za pomocą sterylnej wykałaczki weź pojedynczą, izolowaną, czystą kolonię izolatu rosnącą na szalce Petriego. Zawiesić kolonię bakteryjną w 100 μl sterylnej, podwójnie destylowanej wody w sterylnej probówce do mikrowirówek i gotować przez 10 minut.
    2. Odwirować zawiesinę o stężeniu 10 000 × g przez 2 minuty w celu osadzenia szczątków i przenieść supernatant do świeżej sterylnej probówki do mikrowirówki, która ma być używana jako surowa matryca DNA.
  2. Celowana amplifikacja PCR regionu V3 genu 16S rRNA i sekwencjonowanie
    1. Przygotować 40 μl mieszaniny reakcyjnej w probówce do PCR do amplifikacji PCR, jak podano w tabeli 1.
      UWAGA: Przygotowanie DNA należy przeprowadzić na bloku lodu, minimalizując ryzyko zanieczyszczenia (podczas pracy z odczynnikami należy nosić rękawice, a powierzchnię roboczą dokładnie czyścić 70% etanolem).
    2. Umieść probówkę w bloku termicznym i uruchom odpowiedni program w termocyklerze PCR. Patrz Tabela 2, aby zapoznać się ze standaryzowanymi warunkami cyklicznymi PCR i informacjami o starterach do amplifikacji regionów V3 genów 16S rRNA.
    3. W celu rozdzielenia amplikonów i wizualizacji należy przeprowadzić elektroforezę w żelu agarozowym (AGE). Zmieszać 10 μl amplifikowanego produktu PCR i 2 μl 6x buforu ładującego żel (Tabela 3) i załadować tę mieszaninę do studzienek na 1,5% żelu agarozowym (rozpuścić 1,5 g proszku agarozy w 100 ml 1x buforu TAE [Tabela 3]) zawierającego 5 μl 10 mg/ml bromku etydyny (EtBr) do końcowego stężenia 0,5 μg/ml EtBr w 100 ml żelu agarozowego.
      UWAGA: EtBr jest silnym czynnikiem rakotwórczym. Rękawice należy nosić przez cały czas pracy z EtBr i żelami zawierającymi EtBr.
    4. Dodaj drabinkę DNA, aby oszacować rozmiar amplikonów.
    5. Przeprowadzić elektroforezę żelu w buforze zbiornika TAE pod napięciem 80-100 V.
    6. Gdy barwnik śledzący przepuści 3/4 żelu, przerwij elektroforezę i uwidocznij pasma amplikonów pod transiluminatorem UV.
    7. Użyj produktu PCR (amplikonu) do sekwencjonowania genu 16S rRNA w celu identyfikacji izolatu.
    8. Określić ilościowo amplikon, poddając go analizie spektrofotometrycznej przy użyciu równania (2).
      figure-protocol-2 (2)
    9. Aby sprawdzić czystość DNA, oblicz stosunek A260/A280.
      UWAGA: Idealnie, aby ta liczba była wyższa niż 1,5, a najlepiej między 1,8 a 2,0.
    10. Aby zidentyfikować izolaty, porównaj uzyskane sekwencje z bazami danych sekwencji za pomocą odpowiedniego narzędzia do wyszukiwania wyrównania.

4. Wykrywanie oporności na antybiotyki w izolatach za pomocą testów wrażliwości na antybiotyki

UWAGA: Ten protokół opisuje metodę badania wrażliwości na antybiotyki (AST) metodą dyfuzji krążków. Stosowano następujące krążki antybiotykowe: cefotaksym (5 μg), ampicylina (10 μg), lewofloksacyna (5 μg), chloramfenikol (30 μg), tygecyklina (15 μg), ceftriakson (30 μg), imipenem (10 μg), gentamycyna (10 μg), neomycyna (10 μg), trimetoprim (5 μg) i cyprofloksacyna (5 μg).

  1. Przygotowanie inokulum dla AspAT
    1. Aseptycznie zaszczepić pojedynczą, izolowaną, oczyszczoną kolonię AR za pomocą sterylnej pętli w 2 ml sterylnego nieselektywnego podłoża, takiego jak bulion Luria-Bertani (bez antybiotyku) i inkubować w temperaturze 37 °C przy 80 obr./min przez noc.
    2. Zawiesić, pobierając 100-150 μl kultury wyhodowanej przez noc (w przybliżeniu OD600 = 1,8-2,0) w 2 ml świeżej, nieselektywnej pożywki bulionowej Luria-Bertani i inkubować przez 2-4 godziny (aż OD600 osiągnie 0,4-0,5).
    3. Rozcieńczyć tę świeżo wyhodowaną zawiesinę kultury za pomocą sterylnego 0,85% roztworu soli fizjologicznej, tak aby gęstość kultury była równa 0,5 wzorca McFarlanda (w przybliżeniu OD600 = 0,1), co w przybliżeniu odpowiada 1-2 × 108 komórek/ml.
    4. Delikatnie wymieszaj zawiesinę bakteryjną, aby uzyskać równomierne rozprowadzenie komórek.
    5. Powyższą zawiesinę należy zużyć w ciągu 15 minut od rozcieńczenia.
  2. Zaszczepianie płytek agarowych
    1. Przygotować płytki z agarem Muellera-Hintona (MHA) do wykonania AST, mieszając 38 g MHA w 1,000 ml podwójnie destylowanej wody i rozpuścić mieszaninę przez ogrzewanie. Rozpuszczoną mieszaninę należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C, 15 psi przez 15 min.
    2. Upewnij się, że głębokość MHA w płytkach wynosi 4 mm (25 ml pożywki na płytkę).
    3. W tym samym czasie wyjmij krążki z antybiotykiem z zamrażarki i podgrzej je do temperatury pokojowej.
      UWAGA: Krążki z antybiotykiem powinny być stopniowo rozmrażane, początkowo rozmrażając je w temperaturze 4 °C, a następnie w temperaturze pokojowej, aby zmniejszyć potencjalne niebezpieczeństwo kondensacji na krążkach, co może następnie wpłynąć na strefę inhibicji (ZOI).
    4. W warunkach aseptycznych zanurzyć sterylny bawełniany wacik w inokulum przygotowanym w kroku 4.1 i usunąć nadmiar zawiesiny, aby uniknąć nadmiernego zaszczepienia płytek.
    5. Rozprowadź kulturę równomiernie na płytkach, zaczynając od góry płytki MHA i przechodząc tam iz powrotem od krawędzi do krawędzi. Obróć płytkę o 60° podczas pobierania wacika.
  3. Stosowanie krążków z antybiotykiem
    1. Za pomocą sterylizowanych płomieniowo kleszczyków aseptycznie przenieś krążki antybiotyku na zaszczepione płytki MHA i delikatnie dociśnij krążki, aby zapewnić pełny kontakt z agarem.
      UWAGA: Procedurę tę należy wykonać w ciągu 15 minut od zaszczepienia kultury na płytkach.
    2. Umieść odpowiednią liczbę krążków antybiotyku na płytce agarowej, biorąc pod uwagę organizm, zastosowany antybiotyk i rozmiar płytki, aby uniknąć nakładania się stref inhibicji.
      UWAGA: Na okrągłej płycie o średnicy 90 mm można umieścić od czterech do pięciu tarcz.
  4. Inkubacja płytek
    1. W ciągu 15 minut od nałożenia krążków z antybiotykiem odwrócić płytki i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
  5. Interpretacja wyników
    1. Zmierz średnicę ZOI w milimetrach (mm) i zinterpretuj zgodnie z wartościami punktu granicznego podanymi przez EUCAST11. Zobacz dwa przykłady podane poniżej.
      1. Granica średnicy strefy (mm) dla krążka antybiotyku cyprofloksacyny (5 μg) dla Enterobacterales wynosi S ≥ 25 i R < 22, co oznacza, że jest ona uważana za wrażliwą (S), jeśli ZOI ≥ 25 mm, natomiast jest oporna (R), jeśli ZOI < 22 mm. Jeśli średnica ZOI mieści się w przedziale od 22 do 25, izolat uważa się za pośredni (I).
      2. Punkt graniczny średnicy strefy (mm) dla krążka antybiotyku chloramfenikolowego (30 μg) dla Staphylococcus spp. wynosi S ≥ 18 i R < 18, co oznacza, że uważa się, że jest on wrażliwy, jeśli ZOI ≥ 18 mm, podczas gdy jest odporny, jeśli ZOI < 18 mm.
    2. Określ wskaźnik wielorakiej oporności na antybiotyki (MAR), znajdując stosunek liczby antybiotyków, na które izolat jest oporny, do całkowitej liczby antybiotyków, na które izolat jest narażony.
      UWAGA: Do kontroli jakości E. coli ATCC 25922 i S. Aureus ATCC 29213 są używane jako szczepy referencyjne zgodnie z protokołem jak w kroku 4.

5. Wykrywanie genów oporności na antybiotyki w izolatach metodą PCR

  1. Użyj standardowego protokołu PCR do identyfikacji ARG w izolatach. Przygotuj matrycę DNA, korzystając z protokołu podanego w kroku 3.1.
    UWAGA: Warunki cykliczne PCR zastosowane w tym badaniu wynosiły 94 °C przez 10 minut, a następnie 35 cykli po 94 °C przez 30 s, wyżarzanie przez 30 s w odpowiedniej temperaturze (zgodnie ze standaryzacją dla każdego zestawu starterów), przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 40 s i końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 5 minut. Mieszaninę reakcyjną opisano w tabeli 4. Wykaz ARG, podkładów i temperatur wyżarzania znajduje się w tabeli 5.
  2. Aby rozwiązać, zwizualizować i sprawdzić czystość amplikonów, wykonaj kroki 3.2.3-3.2.10.

6. Analiza całego metagenomicznego DNA w celu identyfikacji całkowitej różnorodności bakterii i wykrywania ARG w metagenomie

  1. Ekstrakcja całkowitego DNA (metagenomu) z próbki wody
    1. Ekstrahować metagenomiczne DNA z przefiltrowanych próbek wody.
      UWAGA: W obecnym badaniu metagenomiczne DNA (całkowite DNA) zostało wyekstrahowane z przefiltrowanych próbek wody przy użyciu referencyjnego zestawu do izolacji DNA zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów).
    2. Sprawdź jakość DNA, ładując 3 μl wyekstrahowanego metagenomicznego DNA do 0,8% żelu agarozowego i uruchom żel pod napięciem 80-110 V przez około 30 minut.
    3. Sprawdź, czy nie ma pojedynczego nienaruszonego pasma.
    4. Sprawdź stężenie DNA za pomocą fluorometru.
  2. Oznaczanie różnorodności bakteryjnej i wykrywanie ARG za pomocą sekwencjonowania całego metagenomicznego DNA
    1. Przygotowanie biblioteki i amplifikacja PCR:
      1. Przygotuj bibliotekę sekwencjonowania sparowanych końców, korzystając z przywołanego zestawu do przygotowania biblioteki DNA (patrz Tabela materiałów).
      2. Przygotuj DNA do ligacji adapterowej, pobierając 200 ng DNA i mechanicznie ścinając je na mniejsze fragmenty, a następnie wykonując ciągły etap naprawy końców, w którym do końców 3' dodaje się literę "A".
      3. W zależności od platformy użytej do sekwencjonowania, podwiązaj specyficzne adaptery do obu końców fragmentów DNA.
        UWAGA: Sekwencje kluczowe dla powiązania bibliotek z dwoma kodami kreskowymi z komórką przepływową w celu sekwencjonowania są obecne w tych adapterach. Pozwala to na amplifikację PCR fragmentów ligowanych adapterem i wiązanie standardowych starterów sekwencjonowania.
      4. Aby sprawdzić jakość i ilość, przeanalizuj amplifikowaną bibliotekę za pomocą chipa DNA o wysokiej czułości zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Generowanie i sekwencjonowanie klastrów:
      1. Załaduj wzmocnioną bibliotekę na odpowiednią platformę sekwencjonowania w celu generowania klastrów i późniejszego sekwencjonowania.
        UWAGA: Cząsteczki biblioteczne wiążą się z komplementarnymi oligonukleotydami adaptera na sparowanej komórce przepływowej. Podczas sekwencjonowania nici przednie są selektywnie rozszczepiane po resyntezie nici odwrotnej. Ta skopiowana odwrotna nić jest następnie sekwencjonowana od przeciwnego końca fragmentu.
    3. Analiza bioinformatyczna:
      1. Generuj rusztowania na podstawie wysokiej jakości danych za pomocą odpowiedniej platformy.
      2. Poddaj te rusztowania analizie bioinformatycznej w celu klasyfikacji taksonomicznej i identyfikacji ARG.
        UWAGA: Przebieg całej metagenomicznej analizy DNA w celu identyfikacji całkowitej różnorodności bakteryjnej i wykrywania ARG w metagenomie jest podany w Rysunek 1. Schemat technologiczny pełnej metodologii opisanej w manuskrypcie znajduje się w Rysunek 2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Całkowita liczba bakterii i bakterii opornych na antybiotyki (AR)
Liczenie całkowitego obciążenia bakteryjnego przeprowadzono poprzez rozprowadzenie 10−4 do 10−6 krotnych rozcieńczeń próbek wody na agarze R2A, pożywce modyfikowanej. W celu zliczenia liczby bakterii AR rozprowadzono 10−3 do 10−6-krotnych rozcieńczeń na płytkach zawierających antybiotyki (Ryc. 3). Całkowita liczba bakterii i AR została obliczona jako CFU/ml, a wszystkie ek...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pobieranie i przetwarzanie próbek odgrywa znaczącą rolę i może mieć wpływ na wyniki i interpretację badania. W związku z tym, aby wykluczyć zmienność próbek, ważne jest, aby pobierać próbki w wielu miejscach badanej części wód słodkich. Utrzymanie odpowiednich aseptycznych warunków środowiskowych podczas obchodzenia się z takimi próbkami może zapobiec zanieczyszczeniu. Ponadto, aby zapobiec zmianom w składzie bakterii, które mogą mieć wpływ na jakość i ilość wyekstrahowanych kwasów nukleinowych, warunki tranzytu powinny ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają sprzecznych interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez granty finansowe z Wydziału Nauki i Technologii - Promocja Badań Uniwersyteckich i Doskonałości Naukowej (DST-PURSE) Uniwersytetu w Bombaju. Devika Ghadigaonkar pracowała w ramach programu jako Project Fellow. Doceniamy pomoc techniczną udzieloną przez Harshali Shinde, starszego pracownika naukowego w ramach Rady Badawczej ds. Nauki i Technologii oraz Nauki i Inżynierii (DST-SERB) nr projektu: CRG/2018/003624.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100 pz Drabinka DNAHimediaMBT049-50LNDo szacowania wielkości amplikonów
2x PCR Taq mastermixHiMediaMBT061-50RDo sporządzania mieszaniny reakcyjnej PCR
37 ° C InkubatorGS-192, Gayatri ScientificNADo inkubacji bakterii
6x Bufor do ładowania żeluHiMediaML015-1MLBarwnik ładujący i śledzący, który pomaga zważyć próbkę DNA i śledzić postęp elektroforezy
Proszek agarozowyHimediaMB229-50GDo rozpuszczania amplikonów podczas elektroforezy żelu agarozowego (AGE)
Ampicylina antybiotyk krążekHiMediaSD002Do wykonywania autoklawu AST
EquitronNAWymagany do sterylizacji pożyw, płytek szklanych, probówek itp
Bioanalizator 2100Agilent TechnologiesNAAby sprawdzić jakość i ilość wzmocnionej biblioteki
Szafa Bisafety B2IMSETIMSET BSC-Klasa II Typ B2Używany do prac mikrobiologicznych, takich jak hodowla bakterii, AST itp.
Krążek z antybiotykiem cefotaksymowymHiMediaSD295E-5VLDo wykonywania AST
Cefotaksym antybiotyk w proszkuHiMediaTC352-5GDo przygotowania roztworu podstawowego antybiotyku wymaganego podczas izolacji bakterii opornych na antybiotyki
Krążek z antybiotykiem CeftriaksonHiMediaSD065Do wykonywania
wirówki AST MinispinEppendorfMinispin Plus-5453Służy do osadzania szczątków podczas przygotowywania surowego DNA
Krążek z antybiotykiem chloramfenikolowymHiMediaSD006-5x50DSDo wykonywania
krążka z antybiotykiem AST CiprofloksacynaHiMediaSD060-5x50DSDo wykonywania AST
Antybiotyk cyprofloksacynowy w proszkuHiMediaTC447-5GDo przygotowania roztworu podstawowego antybiotyku wymaganego podczas izolacji antybiotykoopornych bakterie
KolorymetrQuestNADo sprawdzania OD zawiesin hodowlanych
Kompleksowa bazabaza danych adnotacja funkcjonalna ARG; https://card.mcmaster.ca/
Inkubator z wytrząsarką chłodzącąBTL41 Allied ScientificNADo inkubacji płytek z pożywką do hodowli bakterii
Deep Freezer (-40 ° C) HaierDW40L, Haier BiomedicalsDo przechowywania zapasów glicerolu
Zestaw do przygotowania biblioteki DNANEB Next Ultra DNA Zestaw przygotowawczy do biblioteki dla IlluminaNAPrzygotowanie biblioteki sekwencjonowania sparowanych końców
EDTAHiMediaGRM1195-100GDo przygotowania żelu buforowego do elektroforezy w żelu agarozowym (AGE)
Aparatura do elektroforezyTechResource Tacaodlewaniażelu 15 cmDo przygotowania żelu agarozowego  i przeprowadzanie elektroforezy 
Elektroforeza Power pack z elektrodamiGeneiNADo uruchamiania AGE 
Krążek z antybiotykiem erytromycynyHiMediaSD222-5VLDo wykonywania AST
Antybiotyk erytromycyna w proszkuHiMediaCMS528-1GDo przygotowania roztworu podstawowego antybiotyku wymaganego podczas izolacji bakterii opornych na antybiotyki
Antybiotyk erytromycyna w proszkuHiMediaTC024-5GDo przygotowania podstawowego roztworu antybiotyku wymaganego podczas izolacji antybiotykooporności bakterie
Escherichia coli ATCC 25922       HiMedia0335X-1Stosowany jako kontrola podczas wykonywania AST
Bromek etydynyHiMediaMB071-1GCzynnik interkalujący i wizualizacja DNA po elektroforezie pod Systemem Dokumentacji Żelowej
FluorometrQubit 2.0NADo oznaczania stężenia wyekstrahowanego metagenomicznego
DNA Gel Documentation SystemBioRadSłuży do wizualizacji amplikonów PCR po elektroforezie
Krążek z antybiotykiem gentamycynyHiMediaSD170-5x50DSDo wykonywania
AST Lodowcowy kwas octowyHiMediaAS119-500MLDo przygotowania Żelu do elektroforezy w żelu agarozowym (AGE)
GlicerolHiMediaGRM1027-500MLDo wytwarzania zapasów glicerolu
Krążekz antybiotykiem ImipenemHiMediaSD073Do wykonywania bazy danych AST
KaijuNANA NA Dotaksonomicznej klasyfikacji odczytów; https://kaiju.binf.ku.dk/
Krążek z antybiotykiem kanamycynyHiMediaSD017-5x50DSDo wykonywania AST
Antybiotyk Kanamycyna w proszkuHiMediaMB105-5GDo przygotowania roztworu podstawowego antybiotyku wymaganego podczas izolacji bakterii opornych na antybiotyki
Krążek z antybiotykiem lewofloksacynyHiMediaSD216-5VLDo wykonywania AST
Bulion Luria BertaniHimediaM1245-500GDo wzbogacania kultur
McFarland StandardsHimediaR092-1NoDo porównania gęstości zawiesiny hodowli
Biologia molekularna wodaHiMediaTCL018-500MLDo wytwarzania mieszaniny
reakcyjnej PCRAgar Muellera-Hintona (MHA) HiMediaM173-500GDo wykonywania testów wrażliwości na antybiotyki (AST)
Krążek z antybiotykiem neomycynowymHiMediaSD731-5x50DSDo wykonywania
gradientowego termocykleraAST PCR EppendorfMastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz Służy do wykonywania PCR w celu amplifikacji regionu 16S rRNA i różnych genów oporności na antybiotyki
Podkłady XcelrisNAdo modyfikacji PCR 
R2A Agar, ZmodyfikowanyHiMediaM1743Do przygotowania płytek z podłożem do izolacji całkowitego i opornego na antybiotyki (AR) obciążenia bakteryjnego
Generacja rusztowańCLC Genomics Workbench 6.0NADo generowania rusztowań
Platforma SequencerIllumina (2 x 150 bp chemia)BRAK DANYCHSekwencjonowanie amplifikowanej biblioteki
Chlorek sodu HiMediaTC046-500GDo przygotowania 0,85% soli fizjologicznej do seryjnego rozcieńczania próbki wody
Zestaw do izolacji DNA glebyXcelgenNADo ekstrakcji całego metagenomicznego DNA z przefiltrowanej próbki wody 
Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213HiMedia0365PUżywany jako kontrola podczas wykonywania
klasyfikacji taksonomicznejNarzędzie informatyczne Kaiju ioinformaticsNADo klasyfikacji odczytów do różnych grup taksonomicznych od poziomu typu do rodzaju 
Kompleksowa Baza Danych Oporności na Antybiotyki (CARD)NANA Dofunkcjonalnej adnotacji ARG
Krążek z antybiotykiem TigecyklinaHiMedia SD278Do wykonywania krążka
antybiotykiem AST trimetoprimHiMediaSD039-5x50DSDo wykonywania AST
Tris baseHiMediaTC072-500GDo przygotowania żelu do biegania w żelu Elektroforeza (AGE)
Antybiotyk wankomycyna w proszkuHiMediaCMS217Do przygotowania roztworu podstawowego antybiotyku wymaganego podczas izolacji bakterii opornych na antybiotyki
Waga wagowaMettler ToledoME204 Mettler ToledoSłuży do ważenia proszków mediów, odczynników w proszku itp.
BRAK DANYCH - Nie dotyczy
. danych antybiotyków (CARD) do AST z

Bibliografia

  1. Prestinaci, F., Pezzotti, P., Pantosti, A. Antimicrobial resistance: A global multifaceted phenomenon. Pathogens and Global Health. 109 (7), 309-318 (2015).
  2. Knight, G., et al. Antimicrobial resistance and COVID-19: Intersections and implications. Elife. 10, 64139(2021).
  3. Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: Part 1: Causes and threats. Pharmacy and Therapeutics. 40 (4), 277-283 (2015).
  4. Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J. R., Rath, A. Metagenomic analysis of total microbial diversity and antibiotic resistance of culturable microorganisms in raw chicken meat and mung sprouts (Phaseolus aureus) sold in retail markets of Mumbai. India. Current Science. 113 (1), 71-79 (2017).
  5. Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J., Rath, A. Characterization of multiple antibiotic resistance of culturable microorganisms and metagenomic analysis of total microbial diversity of marine fish sold in retail shops in Mumbai, India. Environmental Science and Pollution Research. 25 (7), 6228-6239 (2018).
  6. Czekalski, N., GascónDíez, E., Bürgmann, H. Wastewater as a point source of antibiotic-resistance genes in the sediment of a freshwater lake. The ISME Journal. 8 (7), 1381-1390 (2014).
  7. Kraemer, S., Ramachandran, A., Perron, G. Antibiotic pollution in the environment: From microbial ecology to public policy. Microorganisms. 7 (6), 180(2019).
  8. Edmonds-Wilson, S., Nurinova, N., Zapka, C., Fierer, N., Wilson, M. Review of human hand microbiome research. Journal of Dermatological Science. 80 (1), 3-12 (2015).
  9. de Abreu, V., Perdigão, J., Almeida, S. Metagenomic approaches to analyze antimicrobial resistance: An overview. Frontiers in Genetics. 11, 575592(2021).
  10. Carlson, S., et al. Detection of multiresistant Salmonella typhimurium DT104 using multiplex and fluorogenic PCR. Molecular and Cellular Probes. 13 (3), 213-222 (1999).
  11. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, Version 12.0. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. , Available from: https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_12.0_Breakpoint_Tables.pdf (2022).
  12. Bharti, R., Grimm, D. Current challenges and best-practice protocols for microbiome analysis. Briefings in Bioinformatics. 22 (1), 178-193 (2019).
  13. Choo, J., Leong, L., Rogers, G. Sample storage conditions significantly influence faecal microbiome profiles. Scientific Reports. 5, 16350(2015).
  14. Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, 11th edition. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2015).
  15. Bayot, M., Bragg, B. Antimicrobial Susceptibility Testing. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2021).
  16. Joseph, A. A., Odimayo, M. S., Olokoba, L. B., Olokoba, A. B., Popoola, G. O. Multiple antibiotic resistance index of Escherichia coli isolates in a tertiary hospital in South-West Nigeria. Medical Journal of Zambia. 44 (4), 225-232 (2017).
  17. Lorenz, T. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).
  18. Rolin, J. Food and human gut as reservoirs of transferable antibiotic resistance encoding genes. Frontiers in Microbiology. 4, 173(2013).
  19. Racewicz, P., et al. Prevalence and characterisation of antimicrobial resistance genes and class 1 and 2 integrons in multiresistant Escherichia coli isolated from poultry production. Scientific Reports. 12, 6062(2022).
  20. Gebreyes, W., Thakur, S. Multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Muenchen from pigs and humans and potential interserovar transfer of antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (2), 503-511 (2005).
  21. Li, L., et al. Prevalence and characteristics of extended-spectrum β-lactamase and plasmid-mediated fluoroquinolone resistance genes in Escherichia coli isolated from chickens in Anhui Province, China. PLoS One. 9 (8), 104356(2014).
  22. Akers, K., et al. Aminoglycoside resistance and susceptibility testing errors in Acinetobacter baumannii-calcoaceticus complex. Journal Of Clinical Microbiology. 48 (4), 1132-1138 (2010).
  23. Ciesielczuk, H. Extra-intestinal pathogenic Escherichia coli in the UK: The importance in bacteraemia versus urinary tract infection, colonisation of widespread clones and specific virulence factors. , Queen Mary University of London. PhD thesis (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bakterie wodneanaliza metagenomicznego DNAtechniki hodowlanesekwencjonowanie 16S rRNAtesty wra liwo ci na antybiotykiwielolekoopornomikrobiota w d s odkichgeny beta laktamaz

Powiązane artykuły