Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ułatwianie hodowli organoidów mózgowych poprzez boczne oświetlenie miękkim światłem

2.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63989

⸱

6 czerwca 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Major Obstetric Diseases, The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 2Key Laboratory of Reproduction and Genetics of Guangdong Higher Education Institutes, 3School of Biotechnology and Health Sciences, Wuyi University

W tym artykule

Podsumowanie

Organoidy mózgowe dają niespotykane dotąd możliwości badania rozwoju narządów i patologii chorób ludzkich. Chociaż osiągnięto wielki sukces w zakresie systemów hodowli organoidów mózgowych, nadal istnieją trudności operacyjne w stosowaniu tej technologii. Niniejszy protokół opisuje procedurę organoidów mózgowych, która ułatwia zmianę podłoża i transfer organoidów.

Streszczenie

Obecnie technologia hodowli organoidów mózgowych jest nadal skomplikowana w obsłudze i trudna do zastosowania na dużą skalę. Konieczne jest znalezienie prostego i praktycznego rozwiązania. Dlatego w niniejszym badaniu zaproponowano bardziej wykonalny protokół organoidów mózgowych. Aby rozwiązać nieuniknione niedogodności związane ze zmianą pożywki i przenoszeniem organoidów na wczesnym etapie, obecne badania optymalizują technologię działania, stosując zasadę inżynierii. Zastosowano lampę o miękkim świetle, aby bocznie oświetlić próbki ciała zarodka (EB), umożliwiając zobaczenie EB gołym okiem dzięki wzmocnionemu efektowi odbicia rozproszonego. Wykorzystując zasadę przepływu wtórnego generowanego przez rotację, organoidy gromadzą się w kierunku środka studni, co ułatwia operację zmiany podłoża lub transferu organoidów. W porównaniu z komórką rozproszoną, ciało zarodka szybciej osadza się w pipecie. Wykorzystując to zjawisko, większość wolnych komórek i martwych fragmentów komórek można skutecznie usunąć w prosty sposób, zapobiegając uszkodzeniom EB w wyniku wirowania. Badanie to ułatwia działanie hodowli organoidów mózgowych i pomaga promować stosowanie organoidów mózgowych.

Wprowadzenie

W porównaniu do dwuwymiarowych (2D) systemów hodowli, trójwymiarowe (3D) systemy hodowlane mają kilka zalet, w tym prawdziwą replikację i efektywną reprodukcję złożonych struktur niektórych organów1. Dlatego organoidy mózgowe są jedną z ważnych metod pomocniczych w dziedzinach badań nad rozwojem i chorobą ludzkiego mózgu2, badania przesiewowe leków i terapia komórkowa.

Hodowla organoidów mózgowych metodą rotacyjnego zawieszenia sprzyja ich rozwojowi i dojrzewaniu3. Chociaż systemy hodowli organoidów mózgowych odniosły wielki sukces, nadal stoją przed krytycznymi wyzwaniami, które ograniczają ich zastosowanie. Na przykład uprawa ręczna wiąże się ze skomplikowanymi etapami manipulacji i wprowadza przeszkody w osiąganiu zastosowań na dużą skalę. Dodatkowo, na każdym etapie rozwoju w hodowli organoidów mózgowych, potrzebne są zmiany w różnych pożywkach i cytokinach4. Jednak we wczesnym stadium organoidy lub EB mają niewielkie rozmiary (około 200 μm do 300 μm) i są prawie niedostępne wizualnie bez odpowiedniej aparatury. Nieuchronnie pewna ilość cennych próbek organoidów jest wypłukiwana po zmianie podłoża. Zbadano wiele technik, aby przezwyciężyć ten problem w innych rodzajach kultur organoidowych, a niektóre przykłady obejmują zanurzanie całych chipów organoidowych w pożywce hodowlanej na 3 dni bez interwencji5; Dodawanie świeżego podłoża przez szkiełko nakrywkowe po wchłonięciu starego podłoża za pomocą papieru chłonnego5; lub zastosowanie złożonych rurociągów mikroprzepływowych do wymiany płynów6,7,8. Kolejną przeszkodą napotkaną na wczesnym etapie hodowli organoidów jest trudność w uzyskaniu bezpośrednich obserwacji gołym okiem, co może powodować słabe operacje, które prowadzą do uszkodzenia i utraty organoidów na etapach przenoszenia organoidów. Dlatego konieczne jest ustanowienie bardziej wykonalnego protokołu, który ułatwi zmianę pożywki i transfer organoidów w celu wytworzenia organoidów.

Odpowiednia zoptymalizowana operacja oparta na zasadach inżynierii jest proponowana w celu przezwyciężenia tych problemów, co znacznie i wygodniej ułatwia wiele procedur organoidowych. W naturze, gdy słońce wpada do domu przez szparę okienną, gołym okiem można zobaczyć kurz tańczący w promieniu światła. Ze względu na rozproszone odbicie światła słonecznego od kurzu, część światła załamuje się w gałce ocznej, tworząc obraz wizualny. Zainspirowani zasadą tego zjawiska9,10, w tym badaniu stworzono lampę o miękkim świetle i oświetlono EB z boku. Stwierdzono, że EB mogą być wizualnie wyraźne bez wpływu na zakres widzenia. Przepływ wtórny skierowany do środka jest generowany w cieczy przez obracanie płytki hodowlanej pod wpływem prądów wirowych11. Pierwotnie rozproszone EB gromadzą się w środku płytki. Na tej podstawie oraz zjawisko polegające na tym, że prędkość sedymentacji organoidów jest większa niż w komórkach, zaproponowano łatwą metodę operacyjną polegającą na zmianie pożywki i przenoszeniu organoidów bez wirowania. Organoidy w pożywce hodowlanej można skutecznie oddzielić od wolnych komórek i martwych fragmentów komórek poprzez tę operację przenoszenia.

Tutaj zaproponowano łatwy w obsłudze protokół do generowania organoidów mózgowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Technologia działania została zoptymalizowana poprzez zastosowanie zasady inżynierii, dzięki czemu operacje w kulturze 3D są tak proste i wykonalne, jak te w kulturze 2D. Ulepszona metoda wymiany cieczy i operacja przenoszenia organoidów są również pomocne w przypadku innych rodzajów hodowli organoidów i projektowania automatycznych maszyn do hodowli.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół został przeprowadzony zgodnie z Deklaracją Helsińską. Zatwierdzenie zostało udzielone przez Komisję Etyczną Trzeciego Szpitala Stowarzyszonego Uniwersytetu Medycznego w Kantonie (Przegląd medyczny i etyczny [2021] nr 022). Przed eksperymentem każde podłoże zostało przygotowane zgodnie z formułą Juergena A. Knoblicha 12 (Tabele uzupełniające 1-4) lub użyto dostępnego na rynku zestawu Cerebral Organoid Kit (patrz Tabela materiałów). Wartości iPS użyte w tym badaniu zostały wcześniej ustalone przez nasze laboratorium i uzyskały świadome zwolnienie. SCA3-iPSC zostały wygenerowane od 31-letniej pacjentki z ataksją rdzeniowo-móżdżkową typu 3 (SCA3), u której genotypowano 26/78 powtórzeń CAG w genie ATXN313 (rysunek uzupełniający 1A). Normalne ludzkie iPSC wymienione w poprzednim artykule zostały wybrane jako NC-iPSCs14, a gen ATXN3 został zidentyfikowany jako mający 14/14 powtórzeń CAG (rysunek uzupełniający 1B).

1. Przygotowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC)

  1. Pobrać 3 ml krwi obwodowej przez nakłucie żyły za świadomą zgodą ochotników i pacjentów.
  2. Wyizoluj jednojądrzaste komórki krwi obwodowej zgodnie z metodą Ficolla-Paque'a15.
  3. Ustal iPSC zgodnie z protokołem zestawu do przeprogramowania Sendai (patrz tabela materiałów).
    1. Hodowlę iPSC z pożywką mTeSR1 na 35-milimetrowych szalkach Petriego pokrytych Matrigelem (matryca błony podstawnej, patrz tabela materiałów). Zmieniaj podłoże codziennie. Gęstość wzrostu iPSC nie może przekraczać 75%.
    2. Trawić komórki roztworem dysocjacyjnym PSC (patrz Tabela Materiałów) i hodować je w subkulturze w stosunku 1:5 co 3-5 dni.
      UWAGA: Wirus Sendai jest tutaj używany. Musi być obsługiwany w komorze bezpieczeństwa biologicznego i należy podjąć środki samoobrony. Powinno być jasne, czy można go legalnie używać w lokalnym kraju. Podczas użytkowania należy ściśle przestrzegać lokalnych przepisów i regulacji dotyczących bezpieczeństwa biologicznego.

2. Przygotowanie do EB (dni 0-1)

  1. Usunąć pożywkę mTeSR1 z iPSC za pomocą pipety i przemyć ją 2x 1 ml 1x PBS.
  2. Usunąć PBS za pomocą pipety i dodać 300 μl roztworu do odrywania komórek (patrz tabela materiałów) w celu wytrawienia iPSC na pojedyncze komórki przez 3-4 minuty w temperaturze 37 °C.
  3. Zawiesić komórki w 2 ml pożywki do tworzenia EB (tabela uzupełniająca 1), a następnie odwirować próbkę przez 5 minut przy 300 x g (temperatura pokojowa).
  4. Wstępnie potraktuj specjalistyczną 24-dołkową płytkę roztworem do płukania zapobiegającym przywieraniu (500 μl/dołek) przez 5 minut (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Roztwór do płukania zapobiegający przywieraniu jest niezbędny do optymalnego tworzenia EB i sferoidów.
  5. Zawiesić komórki w pożywce do tworzenia EB zawierającej Y-27632 (stężenie końcowe, 10 μM, patrz tabela materiałów), o gęstości komórek 1,5 x 106 komórek/ml.
  6. Usunąć roztwór płuczący zapobiegający przywieraniu i przepłukać każdą studzienkę 2 ml pożywki do tworzenia EB.
  7. Dodaj komórki do wyspecjalizowanych 24-dołkowych płytek o gęstości 3 x 106 komórek/dołek (Rysunek 1A, po lewej).
    UWAGA: Zwykle w każdej studzience można przygotować 300 EB. Ta metoda pozwala przygotować duże ilości EB tej samej wielkości.
  8. Odwirować płytkę o sile 100 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Równomiernie rozmieść komórki w każdej komorze na dnie płytki (Rysunek 1A, po prawej).
    UWAGA: Jeśli nie ma odpowiedniej wirówki, płytkę można również umieścić bezpośrednio w inkubatorze w celu hodowli statycznej, ale czas formowania kuli EB będzie o kilka godzin późniejszy niż w przypadku normalnego wirowania.
  9. Próbki inkubować w temperaturze 37 °C i przy stężeniu 5% CO2 przez 24 godziny. Jeśli w poprzednim etapie nie zastosowano wirowania, inkubować przez 36 godzin. Utrzymuj próbkę nieruchomo i nie wyjmuj jej z inkubatora w tym okresie.

3. Przygotowanie lampy o miękkim świetle (dzień 1)

  1. Użyj przezroczystej płyty akrylowej o grubości 0,3-0,5 cm w rozmiarze papieru A5. Wklej białe podkładki z przodu i z tyłu płyty akrylowej.
    1. Zainstaluj rząd białych świateł LED na krawędzi płyty, tak aby światła mogły wchodzić od strony płyty akrylowej, a następnie wystrzeliwać równolegle (rysunek uzupełniający 2A-F, rysunek 1B).
      UWAGA: Ponieważ średnice EB we wczesnym stadium wynoszą około 200 μm do 300 μm, trudno jest je wyraźnie zaobserwować gołym okiem pod świetlówką czystych ławek. W przeciwieństwie do tego, ze względu na wzmocnienie odbicia rozproszonego, możemy wyraźnie wykryć EB za pomocą bocznie oświetlonego miękkiego światła (Rysunek 1B, C). Płytka 6-dołkowa jest zalecana do hodowli EB w kolejnych eksperymentach. Jednak, aby lepiej pokazać efekt wizualny miękkiego światła, w tym badaniu czasami używa się naczyń do robienia zdjęć i nagrywania filmów zamiast talerzy, więc proszę nie zrozum mnie źle. Lampa z podświetlanym światłem miękkim może być również używana do płytki 6-dołkowej.

4. Transfer EB i wymiana pożywki (dni 2-5)

  1. Przygotuj nową 6-dołkową płytkę o niskiej przyczepności i dodaj 2 ml pożywki do tworzenia EB do każdego dołka.
  2. Usuń EB wraz z podłożem za pomocą końcówki do pipety o szerokim otworze 1000 μl (patrz Tabela materiałów) i przenieś je na 6-dołkową płytkę o niskiej przyczepności (~100 EBs/dołek).
    UWAGA: W procesie operacyjnym przyjmuje się lampę z miękkim światłem (wspomnianą w kroku 3.), aby ułatwić obserwację EB. Wyłącz inne wewnętrzne źródła światła, aby uzyskać lepszy efekt wizualny miękkiego światła.
  3. Zastępować taką samą objętością świeżej pożywki tworzącej EB każdego dnia. Użyj przepływu wtórnego, aby zebrać EB do środka i zmienić medium.
    1. Odessać starą pożywkę, pipetując powoli do krawędzi studzienki. Nie ssij zbyt mocno; w przeciwnym razie EB zostaną usunięte razem. Następnie dodaj świeże podłoże, aby ponownie zawiesić EBs.
      UWAGA: Zasada przepływu wtórnego (Rysunek 1D). Wywołaj przepływ wirowy, obracając czaszę po orbicie kołowej. Ze względu na przepływ wirowy indukowany jest przepływ wtórny skierowany w stronę środka. EB lub organoidy zbiegają się do środka studni ze względu na wtórny przepływ generowany przez rotację, po którym można łatwo przeprowadzić zmianę podłoża lub transfer zarodka.

5. Sprawdzanie pluripotencji poprzez oznaczanie markerem pluripotencji OCT4 (dzień 4)

UWAGA: Gdy średnica EB jest większa niż 300 μm, weź kilka EB do barwienia immunofluorescencyjnego markerem OCT4, aby wykryć ich pluripotencję.

  1. Utrwalić EB w 4% paraformaldehydzie w temperaturze 4 °C przez 30 minut, a następnie przemyć w 1x PBS 3x przez 10 minut za każdym razem.
  2. Przenieś EBs do PBS o temperaturze pokojowej zawierającej 0,3% Triton X-100 i 3% BSA przez 2 godziny, a następnie myj w PBS 3x przez 10 minut za każdym razem.
    UWAGA: Po potraktowaniu Triton X-100 EB unoszą się na powierzchni cieczy i można je łatwo odessać wraz z płynem podczas czyszczenia. Zalecana jest praca pod mikroskopem stereoskopowym.
  3. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe OCT4 (patrz tabela materiałów) 1 ml 1x PBS zawierającego 1% BSA w stosunku 1:200 i dodać do EB do inkubacji w temperaturze 4 °C przez noc, a następnie przemyć PBS 3x przez 10 minut za każdym razem.
  4. Rozcieńczyć odpowiednie przeciwciało drugorzędowe (patrz tabela materiałów) 1x PBS w stosunku 1:500 i dodać 1 ml do EBs.
  5. Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, myć komórki w 1x PBS 3x przez 10 minut za każdym razem.
  6. Usunąć PBS, dodać 2 ml 1x PBS roztworu zawierającego 1 μg/ml DAPI, inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie przemyć w PBS 3x przez 10 minut za każdym razem.
  7. Przesunąć EB zawierający niewielką ilość płynu na szkiełko podstawowe, uszczelnić szkiełko nakrywkowe pokryte dostępną w handlu wazeliną (patrz Tabela materiałów) na krawędzi, a następnie obserwować i zbierać obraz pod fluorescencyjnym mikroskopem konfokalnym.
    UWAGA: Wyrażenie OCT4 reprezentuje pluripotencję EB12. Gdy ekspresja OCT4 jest mniejsza niż 90%, EB należy wyrzucić, a EB należy ponownie przygotować.

6. Indukcja neuronalna (dni 5-7)

  1. Przygotuj nową 6-dołkową płytkę o niskiej przyczepności i dodaj 3 ml pożywki do indukcji neuronalnej (tabela uzupełniająca 2) do każdej studzienki.
  2. Włącz boczne miękkie światło (wymienione w kroku 3.) i wyłącz inne źródła światła w pomieszczeniach.
  3. Przenieś EB na 6-dołkową płytkę z dodatkiem pożywki do indukcji neuronalnej (~100 EB / dołek). Dodaj jak najmniej oryginalnego podłoża do nowego dołka.
    UWAGA: Wprowadź proste umiejętności przenoszenia organoidów. Naturalnie, pod wpływem grawitacji i o stosunkowo większej gęstości niż medium, zawieszone EB będą stopniowo opadać, stosując operację pokazaną na Rysunek 1E. Dzięki temu EB można wygodnie przenosić. Ponieważ, w porównaniu z EB, wolne komórki i martwe fragmenty komórek toną wolniej, większość wolnych komórek i martwych fragmentów komórek można usunąć za pomocą tej metody sedymentacji (Rysunek 1F).
  4. Próbki inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 h.
    UWAGA: Pod mikroskopem średnica EB wynosiła około 500 μm, a krawędź była półprzezroczysta, co wskazuje, że utworzyła się warstwa neuronabłonkowa.
  5. Przejdź do następnego kroku.

7. Osadzanie w macierzy membrany podstawnej (dni 7-10)

  1. Umieść matrycę membranową w lodówce o temperaturze 4 °C na 60 minut wcześniej, aby się rozpuściła. Oblicz wcześniej ilość wymaganej matrycy. Około 100 EB osadzono w 1,5 ml matrycy membranowej.
  2. Włącz boczne miękkie światło i wyłącz źródło światła w górnej części konsoli.
  3. Utrzymuj matrycę membrany na lodzie, aby zapobiec zestaleniu.
  4. Za każdym razem przenosić niewielką ilość EB do naczynia o średnicy 60 mm zawierającego świeżą pożywkę ekspendacyjną (tabela uzupełniająca 3). Zmniejsz liczbę EB, aby ułatwić usunięcie pojedynczego EB.
  5. Następnie użyj nowej 6-dołkowej płytki o niskiej przyczepności. Za każdym razem odsysać pojedynczy EB (zawierający około 10 μl pożywki) za pomocą końcówki do pipety o szerokim otworze o pojemności 200 μl (patrz tabela materiałów), a następnie dodawać go do dna płytki 6-dołkowej, aby uzyskać kropelki. Użyj pięciu kropel na studzienkę.
    UWAGA: Kluczem jest ustawienie zakresu pistoletu do pipet na 50 μl i zassanie EB, a następnie zapoznanie się z działaniem Rysunek 1E. Gdy EB osiądzie w otworze końcówki pipety, końcówka szybko dotyka dna płytki i wypycha około 10 μl płynu, tworząc kroplę.
  6. Dodać 15 μl matrycy membranowej do każdej kropli zawierającej EB i szybko wymieszać. Osadź kulkę EB w środku kropli.
    UWAGA: EB nie wolno zasysać standardową końcówką pipety, ponieważ uszkadza EB. Zamiast tego należy użyć końcówki do pipety o szerokim otworze o pojemności 200 μl.
  7. Umieścić 6-dołkową płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 30 minut i zestalić kropelki matrycy membranowej zawierające EBs.
  8. Dodaj 3 ml pożywki rozprężającej do każdej studzienki i delikatnie wydmuchaj EB osadzone w matrycy, aby je zawiesić.
  9. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 3 dni.
    UWAGA: Jeśli zaobserwuje się pączkowanie na powierzchni EB, oznacza to, że uformował się rozszerzony nabłonek nerwowy16.

8. Dojrzewanie organoidów (dni 10-40)

  1. Delikatnie usunąć oryginalną pożywkę i dodać 3 ml pożywki do dojrzewania (tabela uzupełniająca 4) do każdej studzienki.
  2. Umieścić płytkę organoidową na wytrząsarce poziomej w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
  3. Kontynuuj obracanie kultury w poziomie. Ustaw wytrząsarkę na odpowiednią prędkość.
    UWAGA: Podczas hodowli organoidów mózgowych na płytce 6-dołkowej, względna siła odśrodkowa (RCF) wynosząca 0,11808 x g jest bardziej odpowiednia, według producenta wytrząsarki poziomej (patrz Tabela materiałów). Zgodnie z konwersją między względną siłą odśrodkową a prędkością obrotową17,18, RCF = 1,118 x 10−5 × R × obr./min2, gdzie RCF = względna siła odśrodkowa (g), rpm = obroty na minutę (r / min) i R = promień obrotu (cm), znany również jako rzut wstrząsowy. Parametry rzutu wytrząsającego różnych wytrząsarek mogą być różne. Dlatego można oszacować, że prędkość obrotowa wynosi rpm = 299 x (RCF/R)1/2.
  4. Zmieniaj świeżą pożywkę do dojrzewania co 2-3 dni.
  5. Po 20-30 dniach stopniowo hoduj organoidy mózgowe do dojrzałości.
    UWAGA: W tym okresie organoidy mogą być używane do eksperymentów i wykrywania, takich jak wykrywanie markerów neuronalnych i sekwencjonowanie transkryptomu19,20,21.

9. Zamrożone skrawki i immunofluorescencja organoidów mózgowych

  1. Utrwalić organoidy w 4% paraformaldehydzie w temperaturze 4 °C przez 16 godzin, a następnie przemyć je 3x 1x PBS przez 10 minut za każdym razem.
  2. Wyjąć PBS i zanurzyć organoidy w 30% sacharozie w temperaturze 4 °C na noc.
  3. Osadź organoidy w 10%/7,5% żelatynie/sacharozie w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, a następnie szybko przenieś je do formy do zatapiania.
  4. Dodaj suchy lód do 100% etanolu, aby przygotować zawiesinę suchego lodu/etanolu i umieść w nim próbki organoidów w celu szybkiego zamrożenia.
  5. Zamrożone próbki należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C. W razie potrzeby należy wykonać zamrożone sekcje o grubości 20 μm.
  6. Patrz kroki 5.3.-5.5. dla immunofluorescencji. Użyj przeciwciała PAX6 do znakowania wierzchołkowych komórek progenitorowych, przeciwciała TUJ1 (patrz Tabela materiałów) do oznaczania komórek neuronalnych22,23,24 oraz DAPI do barwienia jądrowego DNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym badaniu indukowano iPSC (Rycina 2B) w organoidy mózgowe (Rycina 2C). Ciałka zarodkowe (EB) hodowane we wczesnej fazie wykazywały ekspresję markera OCT4 (Rysunek 2A), co wskazywało na dobrą pluripotencję. W późniejszym etapie ciała embrioidalne (EB) przekształciły się w dojrzałe organoidy mózgu (Rycina 2D). W ramach badań iPSC pochodzące od zdrowych osób oraz pacjentów z SCA3 przekształcono ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Organoidy mózgowe otwierają nowe możliwości dla badań medycznych. Wiele użytecznych zastosowań tej technologii dopiero zaczyna być badanych28 . Badania te wykazały, że wyniki sekwencjonowania transkryptomu genetycznie chorych organoidów mózgowych i normalnych organoidów mózgowych mogą odzwierciedlać różnice między chorobą a zdrowiem. Na przykład wyniki analizy danych sekwencyjnych RNA (Figura 3B) są zgodne z wieloma zgłoszonymi badaniami dotyczącymi chorób SCA3 29,30,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Guangdong (Grant nr 2020A0505100062), Projekt Kluczowych Tematów Nauki i Technologii Miasta Guangzhou (Grant nr 201904020025), Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (Grant nr 31872800, 32070582, 82101937) oraz projekt Guangzhou City Postdoctoral Research Grant (dla Bangzhu Chen).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 μ m FilterNEST Biotechnology, Chiny331001
1000 μ L końcówka do pipet o szerokim otworzeThermo Fisher Scientific, USA9405163
200 μ L końcówka do pipet o szerokim otworzeThermo Fisher Scientific, USA9405020
2-merkaptoetanolMerck, Niemcy8057400005
4% paraformaldehyduServicebio, ChinyG1101
6-dołkowa płytka o niskiej przyczepnościNEST Biotechnology, Chiny703011Służy do hodowli zawiesinowych EB
Roztwór do odrywania komórek AaccuteSTEMCELL Technologies, Kanada07920Służy do trawienia iPSC do pojedynczych komórek.
AggreWell800 24-dołkowaSTEMCELL Technologies, Kanada34811Mikroporowata płytka hodowlana do przygotowania EBs.
Roztwór do płukania zapobiegający przywieraniuSTEMCELL Technologies, Kanada07010Roztwór do płukania do hodowli w celu zapobiegania adhezji komórek
B27-vit. SuplementThermo Fisher Scientific, USA12587010
bFGFPeprotech, USAGMP100-18B
BSABeyotime Biotechnology, ChinyWirówka ST025
Eppendorf, Niemcy5810 RMoże być stosowany do wirowania różnego rodzaju probówek wirówkowych, butelek z odczynnikami i płytek roboczych.
Szkło osłonoweSprzęt laboratoryjny Shitai, Chiny10212020C
DAPIBeyotime Biotechnology, ChinyC1002Używany do barwienia jądrowego. Po połączeniu DAPI z dwuniciowym DNA maksymalna długość fali wzbudzenia wynosiła 364 nm, a maksymalna długość fali emisji 454 nm.
DMEM-F12Thermo Fisher Scientific, USA11330032
jakości ES FBSThermo Fisher Scientific, USA10270106
Ficoll PaqueGeneral Electric Company, USA17-5442-02Izolować komórki jednojądrzaste krwi obwodowej metodą Ficoll-Paque.
ŻelatynaSangon Bioteach, ChinyA609764
Suplement GlutamaxThermo Fisher Scientific, USA35050061
Suplement GlutamaxThermo Fisher Scientific, USA17504044
Kozie przeciwciało anty-IgY kurczakaAbcam, Wielka Brytaniaab150171Koza anty-Chicken IgG. Koniugacja: Alexa Fluor 647. Np.: 652 nm, Em: 668 nm. Stosować w rozcieńczeniu 1:500.
Kozie przeciwciało wtórne anty-mysie IgGAbcam, Wielka Brytaniaab150120Kozie przeciwciało anty-mysie IgG. Koniugacja: Alexa Fluor 594. Przykład: 590 nm, Em: 617 nm. Stosować w rozcieńczeniu 1:500.
Kozie przeciwciało anty-IgG przeciw królikowiAbcam, Wielka Brytaniaab150077Kozie przeciwciało anty-królicze IgG. Koniugacja: Alexa Fluor 488. Np.: 495 nm, Em: 519 nm. Stosować w rozcieńczeniu 1:500.
HeparinMerck, NiemcyH3149
Wytrząsarka poziomaServicebio, ChinyDS-H200Względna siła odśrodkowa (RCF) 0,11808 x g jest bardziej odpowiednia, według producenta INFORS HT (Szwajcaria).
InsulinaMerck, NiemcyI9278-5ML
KOSRThermo Fisher Scientific, USA10828028
MatrigelCorning, Stany Zjednoczone354277Matrigel zestala się w środowisku w temperaturze wyższej niż 4 & stopnie; C, więc powinien być pakowany w niskiej temperaturze.
MEM-NEAAThermo Fisher Scientific, Stany Zjednoczone11140050
mTeSR1STEMCELL Technologies, Kanada85850Pożywka hodowlana iPSC
Suplement N2Thermo Fisher Scientific, Stany Zjednoczone17502048
NeurobasalThermo Fisher Scientific, Stany Zjednoczone21103049
OCT4 przeciwciało pierwszorzędoweAbcam, Wielka Brytaniaab19857Gospodarz: Królik. Rozpuścić w 500 μ L PBS. Stosować w rozcieńczeniu 1:200.
Patologiczny mrożony krajalnikLeica, NiemcyLeica CM1860
PAX6 przeciwciało pierwszorzędoweAbcam, Wielka Brytaniaab78545Gospodarz: Mysz. Stosować w rozcieńczeniu 1:100.
PBSSTEMCELL Technologies, Kanada37350
Penicylina-StreptomycynaThermo Fisher Scientific, USA15140122
roztwór dysocjacyjny PSCPekin Saibei Biotechnology, ChinyCA3001500Do trawienia i pasażu iPSC można stosować roztwór dysocjacyjny wolny od enzymów.
Zestaw do przeprogramowania SendaiThermo Fisher Scientific, USAA16518Ustanów iPSC zgodnie z protokołem zestawu do przeprogramowania Sendai.
Szkło przesuwneSprzęt laboratoryjny Shitai, Chiny188105W
Lampa z miękkim światłemNAKRĘTKANAKRĘTKAProste urządzenie wykonane samodzielnie, patrz rysunek uzupełniający 2 w celu przygotowania.
STEMdiff Mózgowy zestaw organoidowy STEMCELLTechnologies, Kanada8570zawiera: 1. Pożywkę do tworzenia EB; 2. Medium indukcyjne; 3. Podłoże rozprężne; 4. Podłoże do dojrzewania.
STEMdiff Mózgowy zestaw do dojrzewania organoidów STEMCELLTechnologies, Kanada8571Medium do dojrzewania
SacharozaSangon Bionauczanie, ChinyA502792
Triton X-100Merck, NiemcyX100
Pierwotne przeciwciało TUJ1Abcam, Wielka Brytaniaab41489Gospodarz: Kurczak. Stosować w rozcieńczeniu 1:1000.
VaselineSangon Bioteach, ChinyA510146
Y-27632STEMCELL Technologies, Kanada72302Przygotować 5 mM roztwór podstawowy w PBS, zawiesić 1 mg w 624 &mikro; L z PBS.
Weblink
Surowe dane sekwencjonowaniaArchiwum sekwencji genomu (genomika, proteomika i Bioinformatyka 2021) w National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academyof Sciences GSA-Human:HRA002430 https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/

Bibliografia

  1. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (33), (2020).
  2. Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
  3. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  4. Qian, X., et al. et al.Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  5. Hu, Y., et al. Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week. Nature Communications. 12 (1), 2581(2021).
  6. Jung, D. J., et al. A one-stop microfluidic-based lung cancer organoid culture platform for testing drug sensitivity. Lab on a Chip. 19 (17), 2854-2865 (2019).
  7. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 520-531 (2019).
  8. Gkatzis, K., Taghizadeh, S., Huh, D., Stainier, D. Use of three-dimensional organoids and lung-on-a-chip methods to study lung development, regeneration and disease. The European Respiratory Journal. 52 (5), 1800876(2018).
  9. Ye, Y., Pui, D. Detection of nanoparticles suspended in a light scattering medium. Scientific Reports. 11 (1), 20268(2021).
  10. Staven, V., Waaseth, M., Wang, S., Grønlie, I., Tho, I. Utilization of the tyndall effect for enhanced visual detection of particles in compatibility testing of intravenous fluids: Validity and reliability. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 69 (2), 270-283 (2015).
  11. Fukuma, Y., Inui, T., Imashiro, C., Kurashina, Y., Takemura, K. Homogenization of initial cell distribution by secondary flow of medium improves cell culture efficiency. PloS One. 15 (7), 0235827(2020).
  12. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  13. Ouyang, S., et al. CRISPR/Cas9-targeted deletion of polyglutamine in spinocerebellar ataxia type 3-derived induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 27 (11), 756-770 (2018).
  14. Xian, Y., et al. The safety and effectiveness of genetically corrected iPSCs derived from β-thalassaemia patients in nonmyeloablative β-thalassaemic mice. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 288(2020).
  15. Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , Chapter 7, Unit 7.1 (2001).
  16. Knight, G. T., et al. Engineering induction of singular neural rosette emergence within hPSC-derived tissues. eLife. 7, 37549(2018).
  17. Rieder, H. L., Smithwick, R. W. RPM or RCF. The American Review of Respiratory Disease. 132 (6), 1371(1985).
  18. Dole, V. P., Cotzias, G. C. A nomogram for the calculation of relative centrifugal force. Science. 113 (2941), 552-553 (1951).
  19. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
  20. Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
  21. Kathuria, A., et al. Transcriptomic landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia. JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).
  22. Paşca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nature Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  23. Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
  24. Tang, X. Y., et al. DSCAM/PAK1 pathway suppression reverses neurogenesis deficits in iPSC-derived cerebral organoids from patients with Down syndrome. The Journal of Clinical Investigation. 131 (12), 135763(2021).
  25. Costa, M., Paulson, H. L. Toward understanding Machado-Joseph disease. Progress in Neurobiology. 97 (2), 239-257 (2012).
  26. Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature Biotechnology. 28 (5), 511-515 (2010).
  27. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550(2014).
  28. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  29. Klockgether, T., et al. Age related axonal neuropathy in spinocerebellar ataxia type 3/Machado-Joseph disease (SCA3/MJD). Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 66 (2), 222-224 (1999).
  30. Khan, L. A., et al. Expanded polyglutamines impair synaptic transmission and ubiquitin-proteasome system in Caenorhabditis elegans. Journal of Neurochemistry. 98 (2), 576-587 (2006).
  31. Teixeira-Castro, A., et al. Serotonergic signalling suppresses ataxin 3 aggregation and neurotoxicity in animal models of Machado-Joseph disease. Brain: A Journal of Neurology. 138, Pt 11 3221-3237 (2015).
  32. Joers, J. M., et al. Neurochemical abnormalities in premanifest and early spinocerebellar ataxias. Annals of Neurology. 83 (4), 816-829 (2018).
  33. Sivitilli, A., Ghiasi, P., Attisano, L. Production of phenotypically uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Bio-protocol. 11 (8), 3985(2021).
  34. Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
  35. Camp, J. G., Treutlein, B. Human development: Advances in mini-brain technology. Nature. 545 (7652), 39-40 (2017).
  36. Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2021).
  37. Yoon, S. J., et al. Reliability of human cortical organoid generation. Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2019).
  38. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  39. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Tworzenie ciał embrionalnychtransfer organoidówwymiana pożywkiindukcja neuronalnamacierz błony podstawnejmarkery pluripotencjidojrzewanie organoidówprzepływ wtórny
Ułatwianie hodowli organoidów mózgowych poprzez boczne oświetlenie miękkim światłem
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.