Testy na dużą skalę w kierunku SARS-CoV-2 z wykorzystaniem łączenia próbek śliny i transpozycji

Summary

Protokół ma służyć jako wzór dla uniwersytetów i innych organizacji rozważających przeprowadzenie testów na dużą skalę na obecność SARS-CoV-2 lub opracowanie planów gotowości na przyszłe epidemie wirusa.

Abstract

Identyfikacja i izolacja osób zaraźliwych wraz z kwarantanną bliskich kontaktów, ma kluczowe znaczenie dla spowolnienia rozprzestrzeniania się COVID-19. Przeprowadzanie na dużą skalę testów w ramach nadzoru lub badań przesiewowych w kierunku bezobjawowych nosicieli COVID-19 dostarcza zarówno danych na temat rozprzestrzeniania się wirusa, jak i możliwości szybkiego testowania osób w przypadku podejrzenia wystąpienia ogniska choroby. Program wczesnego wykrywania COVID-19 na Uniwersytecie Stanowym Michigan od jesieni 2020 r. wykorzystuje testy na dużą skalę w ramach nadzoru lub badań przesiewowych. Zastosowane tutaj metody wykorzystują niezawodność, dużą objętość próbki i korzyści płynące z samodzielnego pobierania śliny, w połączeniu z opłacalnym, oszczędzającym odczynniki dwuwymiarowym schematem łączenia. Proces został zaprojektowany tak, aby można go było dostosować do niedoborów w dostawach, a wiele elementów zestawów i testu można łatwo zastąpić. Opisane procesy pobierania i przetwarzania próbek SARS-CoV-2 można dostosować do testowania przyszłych patogenów wirusowych wykazujących wiarygodną ekspresję w ślinie. Dostarczając ten plan uniwersytetom lub innym organizacjom, można opracować plany gotowości na przyszłe epidemie wirusa.

Introduction

Pandemia COVID-19, wywołana przez wirusa SARS-CoV-2, spowodowała do tej pory śmierć ponad 6,2 miliona osób, a liczba ta rośnie każdego dnia¹. Złotym standardem testów na obecność SARS-CoV-2 jest ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (RT-q), ze starterami przeznaczonymi do celowania w genom wirusa, takimi jak nukleokapsyd, otoczka, kolce i geny polimerazy RNA zależnej od RNA². Na początku pandemii poważnie brakowało wystarczających zdolności do wykonywania testów w kierunku SARS-CoV-2. Wynikało to z braku zwalidowanych testów, komponentów testowych, personelu klinicznego i infrastruktury nieprzygotowanej do szybkiej rozbudowy, aby pomieścić masowe testy na poziomie pandemii. Ze względu na niedobory centra testowe często wymagały skierowania od lekarza, aby kwalifikować się do testu. Niedobory te skutkowały opóźnieniami w zatwierdzaniu testów, długimi kolejkami do niewygodnego pobierania próbek z nosogardzieli i długim czasem oczekiwania na wyniki. Dodatkowo, ze względu na te ograniczenia, wysiłki testowe nie mogły objąć przedobjawowych, łagodnych lub bezobjawowych nosicieli nieświadomie rozprzestrzeniających SARS-CoV-2. Brak łatwo dostępnych, powszechnych testów prawdopodobnie przyczynił się do niekontrolowanego rozprzestrzeniania się COVID-19.

Testy interwałowe na dużą skalę mogą być przeprowadzane zarówno jako nadzór, jak i badania przesiewowe. Oba mogą być wykorzystywane do monitorowania lokalnych wskaźników pozytywności na obszarach o dużej gęstości zaludnienia lub wysokiego ryzyka transmisji i mogą być wykorzystywane do podejmowania decyzji dotyczących zdrowia publicznego. Testy kontrolne mają na celu monitorowanie częstości występowania i rozpowszechnienia choroby w populacji i nie są wykorzystywane do indywidualnej diagnostyki³. Wyniki nadzoru są zazwyczaj pozbawione elementów pozwalających na identyfikację i nie są zwracane uczestnikom; Laboratoria przeprowadzające testy nadzorcze nie muszą być certyfikowane klinicznie ani nie są zobowiązane do stosowania testu zatwierdzonego przez FDA. Badania przesiewowe pozwalają na zwrócenie wyników poszczególnym uczestnikom, ale laboratoria przesiewowe w Stanach Zjednoczonych muszą posiadać certyfikat Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA) i spełniać wszystkie obowiązujące wymagania CLIA.

Program wczesnego wykrywania Uniwersytetu Stanowego Michigan (MSU) rozpoczął się we wrześniu 2020 roku i przetworzył ponad 350 000 próbek. Program powstał w wyniku wysiłków grupy badawczej mających na celu zaprojektowanie wysoce czułego testu SARS-CoV-2, który nie wymagał dużego zapotrzebowania na materiały testowe^4,5,6,7,8. Celem było pomoc laboratoriom klinicznym w zwiększeniu wydajności i opracowaniu elastycznych procesów w celu uwzględnienia niedoborów dostaw, a także opracowanie strategii badań przesiewowych w celu ustalenia planu powrotu do pracy dla MSU College of Human Medicine. Początkowe wysiłki koncentrowały się na alternatywnych metodach zbierania, ekstrakcji i oznaczania ilościowego SARS-CoV-2. Wysoki popyt i wynikające z niego niedobory wymazów z nosogardzieli doprowadziły do oceny próbek z przednich nozdrzy pobranych za pomocą wymazów z policzka, a niedobory odczynników doprowadziły do opracowania metody ekstrakcji próbek zaadaptowanej z wczesnych doniesień z Wuhan w Chinach⁹. Aby zwiększyć czułość wykrywania SARS-CoV-2 w próbkach z nozdrzy przednich, kropelkowy cyfrowy PCR został zastąpiony RT-qPCR^6,7. Chociaż kropelkowy cyfrowy PCR jest bardzo czuły i może dostarczyć wartości bezwzględnych przy odczycie punktu końcowego, ustalono, że jego użycie nie jest wykonalne w przypadku testów na dużą skalę ze względu na brak niezawodnego oprzyrządowania o wysokiej przepustowości dla tej technologii. Ponadto samodzielne pobieranie próbek z przednich nozdrzy w oparciu o poziomy ludzkiej RNazy P było niezwykle zmienne, co sugeruje, że nie było wystarczająco wiarygodne do masowych testów.

Alternatywą dla wymazów z nosogardzieli i przednich nozdrzy jest pobieranie śliny. Wirusy układu oddechowego, takie jak SARS-CoV, H1N1 i MERS, były historycznie wykrywane w ślinie^10,11,12,13. Zostało to następnie udowodnione w przypadku SARS-CoV-2^14,15,16,17. Bezpośrednie porównanie próbek śliny i nosogardzieli wykazało, że ślina daje wyższe miana wirusa niż wymazy z nosogardzieli w dopasowanych próbkach, a ślina jest mniej zmienna przy wielokrotnym pobieraniu próbek¹⁴. Doniesiono również, że ślina jest bardziej wrażliwa w niektórych wariantach, takich jak Omicron, w porównaniu z Delta¹⁶. Dodatkowe korzyści płynące z pobierania śliny to względna łatwość samodzielnego pobierania śliny poza miejscem bez dużych potrzeb zaopatrzeniowych, możliwość wielokrotnego ponownego testowania próbki w razie potrzeby, wyeliminowanie wymagań dotyczących personelu na miejscu przy pobieraniu próbek oraz unikanie kolejek uczestników, które mogłyby zwiększyć ryzyko transmisji wirusa. Zmontowany w laboratorium zestaw do usuwania śliny został opracowany w wyniku współpracy między twórcami testów laboratoryjnych, ekspertami w dziedzinie opakowań, uniwersyteckimi ekspertami ds. brandingu, specjalistami ds. bezpieczeństwa i zewnętrznymi partnerami produkcyjnymi, którzy wyprodukowali pudełko i system etykietowania.

Podczas gdy próbki śliny oferują wystarczającą ilość genetycznego materiału wyjściowego, a RT-qPCR zapewnia czułe, wiarygodne wyniki, koszt odczynników (starter/sondy i mieszanka główna) sprawił, że badanie na dużą skalę pojedynczych próbek stało się kosztownym przedsięwzięciem na podstawie pojedynczej próbki. Ponieważ starter/sonda i mieszanka wzorcowa są najdroższymi składnikami procesu, celem było poszukiwanie rozwiązań, które rozszerzyłyby ich zastosowanie, a tym samym obniżyły koszt na próbkę. Zaproponowano systemową optymalizację wielkości puli próbek w oparciu o częstość występowania w społeczności i czułość testu dla testów SARS-CoV-2¹⁸. Jeśli jednak pule dowolnej wielkości wskazują na obecność SARS-CoV-2, wszyscy uczestnicy w puli muszą zostać ponownie przetestowani, co skutkuje straconym czasem i zwiększonymi możliwościami rozprzestrzeniania się. Aby zaradzić tym ograniczeniom, zastosowano dwuwymiarową metodę łączenia, podobną do procesu zaproponowanego przez Zilinskasa i innych¹⁹ w celu przeprowadzenia pierwszego przejścia zgodnie z ograniczeniami testów nadzorczych. W tym procesie 96 pojedynczych próbek umieszcza się na 96-dołkowej płytce składającej się z 12 kolumn i ośmiu rzędów. Każda próbka znajduje się w puli ośmiu i puli 12 próbek na dwóch różnych płytkach reakcyjnych. Powoduje to, że każda próbka jest jednoznacznie reprezentowana w dwóch pulach. Dekonwolucja pul na podstawie współrzędnych identyfikuje potencjalnie dodatnie próbki. Próbki w pulach, w których nie wykryto SARS-CoV-2, nie przechodzą od testów kontrolnych do badań przesiewowych. Tymczasem próbki od osób, które uzyskały pozytywny wynik w procesie nadzoru, są ponownie pobierane w procesie badań przesiewowych zatwierdzonym przez CLIA. Jeśli potwierdzi się, że wynik jest pozytywny, pacjent otrzymuje wynik, jest kierowany do uniwersyteckiego gabinetu lekarskiego, inicjowane jest śledzenie kontaktów i powiadamiany jest wydział zdrowia. W sumie próbka danej osoby jest testowana w trzech oddzielnych reakcjach, zanim zostanie uznana za pozytywną, dwa razy w pulach nadzoru i raz jako pojedynczy ekran potwierdzający, co zmniejsza ryzyko fałszywie dodatniego wyniku. Łączenie próbek zużywa ~ 80% mniej odczynników niż uruchamianie próbek pojedynczo, co skutkuje kosztem ~ 12 USD za próbkę.

Poza zestawem do badania śliny, strategią poolingu i procesem rozwoju testów, zespół opracował również plan logistyczny dystrybucji zestawów, pobierania próbek i raportowania wyników. Uczestnicy programu odbierają swój zestaw, rejestrują unikalny kod alfanumeryczny na swojej probówce, produkują próbkę i wpłacają ją do jednego z wielu pojemników, w których są codziennie odbierane i transportowane do laboratorium. Laboratorium przetwarza próbki, kierownik techniczny przegląda i przesyła wyniki, a uczestnicy są powiadamiani o konieczności sprawdzenia portalu wyników. Czas realizacji tego procesu wynosi 24-48 godzin od momentu złożenia próbki. Współpraca ze strony wszystkich części instytucji miała kluczowe znaczenie dla pomyślnego wdrożenia tego hybrydowego procesu nadzoru i kontroli na dużą skalę. Poniższe procedury i opisy programu testowania i potrzebnej infrastruktury mają na celu określenie sposobu zwiększania skali testowania do celów przyszłego nadzoru i/lub badań przesiewowych.

Protocol

Badania przeprowadzone w celu optymalizacji metod dla Programu Wczesnego Wykrywania zostały zatwierdzone przez Michigan State University Institutional Review Board. Wszystkie rysunki zostały odtworzone za pomocą spreparowanych próbek i są reprezentatywne dla obserwowanych wyników u ludzi. Żadne dane, informacje ani wyniki przedstawione w manuskrypcie nie pochodzą od żadnego uczestnika Programu Wczesnego Wykrywania Uniwersytetu Stanowego Michigan.

1. Produkcja zestawów

UWAGA: Podczas montażu zestawu noś maski, rękawice, okulary ochronne i fartuchy laboratoryjne przez cały czas, aby zapobiec zanieczyszczeniu elementów zestawu.

1. Przygotowanie elementów zestawu
   1. Za pomocą markera permanentnego narysuj linię oznaczającą 1 ml na stożkowej probówce o pojemności 25 ml. Za pomocą markera permanentnego narysuj linię oznaczającą 1 ml na pipecie transferowej.
   2. Dodaj cztery kulki ceramiczne do probówki o pojemności 5 ml. Odpipetować 1 ml roztworu stabilizującego RNA do probówki z próbką i zamknąć probówkę. Przymocuj naklejkę ze sztangą składającą się z unikalnego kodu identyfikacyjnego do probówki z kodem kreskowym Data Matrix na górze i identyfikatorem powtórzonym w kodzie alfanumerycznym z boku.
      UWAGA: Koraliki ceramiczne są wolne od RNaz/DNaz i nie wymagają dalszej sterylizacji.
2. Umieść stożkową probówkę o pojemności 25 ml, probówkę z próbką o pojemności 5 ml, pipetę transferową i małą torbę na wypadek zagrożenia biologicznego w pudełku z zestawem (rysunek uzupełniający 1).
   UWAGA: Rurki stożkowe nie muszą być wolne od DNaz/RNaz. Integralność próbki jest zachowana przez roztwór stabilizujący RNA.

2. Użycie zestawu do samodzielnego pobierania próbek

1. Zgodnie z instrukcjami dołączonymi do zestawu, poproś uczestników, aby nie jedli ani nie pili na 30 minut przed dostarczeniem próbki. Poproś uczestników, aby pluli do stożkowej probówki o pojemności 25 ml, aż zbierze się 1 ml śliny (zaznaczona linia).
2. Za pomocą pipety przenieś 1 ml śliny (do zaznaczonej linii) do probówki o pojemności 5 ml zawierającej roztwór stabilizujący RNA i kulki ceramiczne. Zamknąć probówkę z próbką i potrząsać nią przez 15 sekund.
3. Poproś uczestników o zarejestrowanie kodu alfanumerycznego przypisanego do próbki na wyznaczonej stronie internetowej. Po zakończeniu poproś ich, aby umieścili probówkę z próbką w małej torbie na wypadek zagrożenia biologicznego i wrzucili do pojemnika na próbki.

3. Pobieranie próbek i przygotowanie do izolacji RNA

UWAGA: Wszystkie kroki odbywają się w komorze bezpieczeństwa biologicznego lub wiadrze wirówki z pokrywą zabezpieczającą biologicznie.

1. Zdezynfekuj i sprawdź wzrokowo próbki w celu kontroli jakości, gdy nadal znajdują się w torbie na zagrożenie biologiczne.
2. Odrzuć próbkę, jeśli (Rysunek 1): próbka ma kolor nienaturalny (np. zielony, niebieski) lub zawiera cząstki jedzenia lub krew; próbka przecieka lub brakuje w niej kulek; próbka ma nieprawidłową oczekiwaną objętość (<1,5 ml lub >3 ml); próbka nie ma dołączonego kodu kreskowego ani kodu alfanumerycznego.
   1. Jeśli próbka zostanie odrzucona, zeskanuj ją i zapisz w pliku odrzucenia z notatką, dlaczego próbka została odrzucona. Jeśli próbka zostanie odrzucona, ponieważ nie ma identyfikatorów, zarejestruj próbkę jako Brak kodu kreskowego w pliku odrzucenia.
3. Jeśli próbka nie zostanie odrzucona, rozetnij worek z zagrożeniem biologicznym nożyczkami i wyjmij probówkę z próbką. Wirować probówkę przez 15 sekund, a następnie umieścić probówkę z próbką w adapterze probówki do wirówki z odchylanym wiadrem.
4. Gdy adaptery probówek są pełne, zabezpiecz pokrywę bioizolacyjną nad wiadrem wirówki i przenieś do wirówki. Odwirować próbki o masie 4 100 x g przez 2 minuty i umieścić je z powrotem w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
   UWAGA: Wirowanie służy do osadzania gruzu i wtłaczania bardziej lepkiego materiału ze śliny na dno probówki. Eliminuje to potrzebę stosowania proteinazy K w tym procesie. Pełna seria składa się z 768 próbek (osiem 96-dołkowych płytek wypełnionych próbką po izolacji RNA).
5. Nie naruszając granulowanego materiału, przenieś probówki z próbkami do 96-szczelinowego stojaka na probówki wstępnie oznaczonego identyfikatorem serii, który zawiera numer stojaka (1-8), datę i odpowiednią grupę, z którą próbki zostaną połączone/ocenione (identyfikator oznaczający grupę, tj. grupa A to pierwsza seria dnia).
6. Gdy 96-szczelinowe stojaki na probówki są pełne lub nie pozostały żadne próbki, za pomocą ręcznego skanera kodów kreskowych zeskanuj probówki do pliku z mapą płyt (plik uzupełniający 1 dla pełnych pul; Plik uzupełniający 2 dla pul o połowie rozmiaru). W przypadku, gdy kod kreskowy nie działa, użyj kodu alfanumerycznego na probówce, aby zarejestrować próbkę.
   UWAGA: Maska jest wymagana, aby zapobiec skanowaniu sąsiednich kodów kreskowych. Maskę można wykonać, wycinając otwór w nieprzezroczystym papierze, a następnie laminując go. Kody kreskowe zeskanowane do pliku z mapą tablic pojawią się w tej samej orientacji, co w szafie z 96 gniazdami.
7. Spryskaj probówki z próbkami w stojaku 70% etanolem i osusz ręcznikiem papierowym.
   UWAGA: Wycieranie probówek zamiast wklepywania może uszkodzić kody kreskowe.
8. Oznaczyć 96-dołkową płytkę o pojemności 2 ml za pomocą identyfikatora przebiegu. Przenieść 200 μl próbki śliny z każdej probówki z próbką do odpowiedniego dołka na 96-dołkowej płytce. Jeśli próbki są zbyt lepkie, aby je przenieść, należy ponownie odwirować i odwirować. Odrzuć próbkę, jeśli problem nadal występuje.
   UWAGA: Próbki śliny mogą być żylaste i pozostawiać ślad ślimaka na płytce podczas przenoszenia, jeśli technik nie jest ostrożny. Może to prowadzić do początkowych wyników fałszywie dodatnich i większej liczby próbek, które ostatecznie będą musiały zostać ponownie uruchomione na etapie potwierdzenia (patrz punkt 6).
9. Po przeniesieniu wszystkich próbek przykryj płytkę z 96 dołkami matą silikonową i przechowuj w temperaturze pokojowej. Zapisz i przechowuj 96-gniazdowe stojaki z pozostałymi próbkami w celu potwierdzenia potencjalnie dodatnich próbek.
   UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

4. Izolacja RNA

1. Oznacz 96-dołkowy wkład izolacyjny RNA identyfikatorem przebiegu i umieść go na pustej płytce zbiorczej.
   UWAGA: W tym momencie można wyjąć płytki zawierające próbki z komory bezpieczeństwa biologicznego.
2. Usuń matę silikonową z płytki z 96 dołkami. Przenieść 400 μl buforu do ładowania wirusa do każdej studzienki płytki z 96 głębokimi dołkami.
3. Wymieszaj każdą próbkę, delikatnie pipetując w górę i w dół dwa do czterech razy i przenieś całą próbkę do odpowiedniej kolumny w 96-dołkowym wkładzie izolacyjnym RNA.
   UWAGA: Mieszanie dużych objętości spowoduje powstanie pęcherzyków, które mogą prowadzić do zanieczyszczenia sąsiednich studni, jeśli zostaną wykonane przypadkowo. Mieszanie w przemyślany sposób może obniżyć to ryzyko i chronić integralność dalszego przetwarzania.
4. Odwirować wkład izolacyjny RNA na wierzchu płytki zbiorczej o masie 4 100 x g przez 10 minut, aby załadować próbki do wkładu. Przenieś wkład izolacyjny RNA na czystą płytkę zbiorczą.
5. Dodać 500 μl buforu płuczącego do każdej studzienki wkładu izolacyjnego RNA i odwirować przy 4 100 x g przez 5 minut. Przenieść wkład izolacyjny RNA na czystą płytkę zbiorczą.
6. Dodać 500 μl buforu płuczącego do każdej studzienki wkładu izolacyjnego RNA i odwirować przy 4 100 x g przez 5 minut. Przenieść wkład izolacyjny RNA na czystą płytkę zbiorczą.
7. Dodać 500 μl 100% etanolu do każdego dołka wkładu izolacyjnego RNA i odwirować przy 4 100 x g przez 5 minut. Przenieść wkład izolacyjny RNA na czystą płytkę zbiorczą.
   UWAGA: Jeśli próbka nie przeszła całkowicie przez kolumnę w tym momencie, oznacza to, że próbka jest zbyt lepka lub małe kawałki zanieczyszczeń w próbce zatykają kolumnę. Próbkę należy całkowicie usunąć z wkładu, aby nie zanieczyścić dalszego procesu poolingu, a numer próbki należy dodać do pliku odrzucenia.
8. Odwirować wkład izolacyjny RNA na wierzchu płytki zbiorczej o masie 4 100 x g przez 5 minut w celu wysuszenia kolumn. Przenieś wkład izolacyjny RNA na czystą płytkę elucyjną oznaczoną identyfikatorem przebiegu i wierszem słów, a następnie umieść oba na czystej płytce zbiorczej.
9. Dodaj 25 μl wody molekularnej wolnej od DNaz/RNaz do każdej studzienki wkładu izolacyjnego RNA. Wirować przy 4 100 x g przez 10 minut w celu elucji RNA. Jeśli próbka nie zostanie całkowicie wymyta, należy ją ponownie odwirować przez 5 minut.
10. Przenieść płytki elucyjne na wstępnie schłodzone zimne płytki i przykryć. Natychmiast przejdź do łączenia próbek i RT-qPCR.

5. Łączenie próbek i RT-qPCR

UWAGA: Proces jest ustawiony w systemie dwupłytkowym (jak widać w Rysunek 2). Numer tabliczki elucyjnego RNA odpowiada wyprodukowanemu numerowi tabliczki kolumny i literze tabliczki wiersza (A = 1, B = 2, C = 3 itd.). Dla celów dekonwolucji, litera wiersza płyty kolumny będzie odpowiadać literze wiersza z płytki elucyjnej RNA, a numer kolumny płytki elucyjnej RNA będzie odpowiadał numerowi kolumny płytki elucyjnej RNA. Na przykład próbka na płytce RNA #6 w pozycji C4 zostanie znaleziona w pozycji F4 płytki reakcyjnej rzędu i w pozycji C6 płytki reakcyjnej kolumny.

1. Oznacz nową płytkę elucyjną identyfikatorem przebiegu i wierszem słów i umieść na wstępnie schłodzonej zimnej płytce. Przenieś 10 μl RNA z każdej studzienki na płytce elucyjnej rzędu do odpowiedniego rzędu na płytce elucyjnej kolumny, tworząc w ten sposób kopię oryginalnej płytki elucyjnej (Rysunek 2).
   UWAGA: Płytki elucyjne oznaczone kolumną zostaną połączone w kierunku kolumny, a płytki elucyjne oznaczone rzędem zostaną połączone w kierunku rzędu.
2. W przypadku płyty z pulą kolumn przenieś całą objętość z każdej studzienki przez płytę do numeru kolumny, który odpowiada numerowi tabliczki z identyfikatorem przebiegu. W przypadku płyty puli rzędów przenieś całą objętość z każdej studzienki w górę lub w dół płytki do numeru wiersza, który odpowiada numerowi tabliczki znamionowej przebiegu (1 = A, 2 = B itd.; Rysunek 2).
3. Przenieś 13 μl każdej próbki zbiorczej do odpowiedniej kolumny lub rzędu 96-dołkowej płytki reakcyjnej (Rysunek 2).
4. W tym protokole należy użyć trzech sond przeciwko genom nukleokapsydu (N), ORF1ab i kolca (S) w celu wykrycia SARS-CoV-2 oraz czwartej sondy starterowej ukierunkowanej na faga MS2 jako kontroli wewnętrznej. W próbkach zbiorczych należy wprowadzić kontrolę pozytywną faga MS2 do mieszaniny wzorcowej. W próbkach uruchamianych pojedynczo należy wprowadzić MS2 do próbki na kartridżu izolacyjnym RNA i użyć jako kontroli ekstrakcji.
   UWAGA: Mieszanka główna, sondy starterowe, barwniki fluorescencyjne i wygaszacze będą się różnić w zależności od testu. Odpowiednie proporcje i kanały fluorescencyjne powinny być określone przez każde laboratorium.
5. Przygotować kontrolę pozytywną, dodając 2 μl roztworu kontroli dodatniej i 11 μl wody molekularnej wolnej od DNazy/RNaz do studzienki kontroli pozytywnej na płytce reakcyjnej (Rysunek 2).
6. Przygotować kontrolę bez matrycy, dodając 13 μl wody molekularnej wolnej od DNaz/RNaz do studzienki kontroli ujemnej na płytce reakcyjnej.
7. Wykonać mieszankę wzorcową zgodnie z instrukcjami producenta i zwiększyć kontrolę pozytywną faga MS2. Dozować 7 μl mieszanki wzorcowej do każdego dołka z 96-dołkowych płytek reakcyjnych, które zawierają próbki lub kontrole. Ogranicz ekspozycję na światło fluorescencyjne.
8. Przykryj płytki reakcyjne folią optyczną i wiruj przez 2 minuty, aby dobrze wymieszać próbki. Odwirować płytki reakcyjne przy 650 x g przez 5 min.
9. Przenieść płytki do systemu RT-PCR i uruchomić z parametrami cyklicznymi odpowiednimi dla mieszanki wzorcowej. Dla zastosowanej tu mieszanki wzorcowej przeprowadzono następujące cykle: 25 °C przez 2 minuty, 53 °C przez 10 minut, 95 °C przez 2 minuty, 40 cykli po 95 °C przez 3 s i 60 °C przez 30 s.
10. Po uruchomieniu próbek wykonaj dekonwolucję pul, aby zidentyfikować potencjalne próbki dodatnie ręcznie (Rysunek 3) i za pomocą aplikacji R Script Shiny.
    1. Eksportuj wyniki z płyt reakcyjnych kolumn i wierszy jako pliki arkusza kalkulacyjnego. Otwórz skrypt dekonwolucji puli R Aplikacja Shiny (kod źródłowy dostępny pod adresem: https://github.com/kochman1/JoVE-MSU-COVID-EDP).
    2. Przeciągnij i upuść pliki mapy tablic rejestracyjnych, kolumn i wierszy do aplikacji i uruchom aplikację. Zapisz listę utworzoną z aplikacji.
       UWAGA: Lista utworzona z aplikacji zawiera wszystkie kody kreskowe wprowadzone do mapy tablic oraz to, czy są one prawdopodobnie dodatnie, czy ujemne na podstawie skryptu dekonwolucji puli. Próbki, które są oznaczone jako potencjalnie dodatnie, są ponownie przetwarzane indywidualnie.

6. Walidacja próbek dodatnich

1. Oznaczyć dwie probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i kolumnę ekstrakcyjną RNA dla każdej próbki, która ma być badana. Użyj jednej probówki do mikrowirówki do mieszania próbki, faga MS2 i buforu ładującego wirusa, a drugiej probówki mikrowirówki do etapu elucji RNA.
2. Dodać 5 μl RNA faga MS2 do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Przenieść 200 μl potencjalnie dodatniej próbki do probówki i dodać 400 μl buforu do ładowania wirusa do probówki, wymieszać pipetując.
3. Przenieść całą zawartość do wstępnie znakowanej kolumny do ekstrakcji RNA w czystej probówce zbiorczej. Wirować przy 10 000 x g przez 2 min. Zasysać przepływ z rurki zbiorczej.
4. Dodać 500 μl buforu płuczącego do kolumny ekstrakcyjnej RNA i odwirować przy 10 000 x g przez 2 min. Odsysać przepływ z probówki zbiorczej.
5. Dodać 500 μl buforu płuczącego do kolumny ekstrakcyjnej RNA i odwirować przy 10 000 x g przez 2 min. Odsysać przepływ z probówki zbiorczej.
6. Dodać 500 μl 100% etanolu do kolumny ekstrakcyjnej RNA i odwirować przy 10 000 x g przez 1 min. Przenieść kolumnę ekstrakcyjną RNA do czystej probówki zbiorczej i odwirować przy 10 000 x g przez 1 minutę w celu wysuszenia kolumny.
7. Przenieść kolumnę ekstrakcyjną RNA do wstępnie znakowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml w celu elucji. Dodać 25 μl wody molekularnej wolnej od DNaz/RNaz do kolumny ekstrakcyjnej RNA. Wirować przy 10 000 x g przez 2 minuty w celu zebrania RNA i przeniesienia probówki do mokrego lodu.
8. Przygotuj mieszankę wzorcową zgodnie z instrukcjami producenta. Dozować 7 μl mieszanki wzorcowej do każdego dołka 96-dołkowej płytki reakcyjnej, która będzie zawierać próbkę. Przenieś 13 μl każdego izolowanego RNA na płytkę reakcyjną.
   UWAGA: Mieszanka główna jest taka sama, jak ta, która została użyta w protokole zbiorczej próbki, ale nie zawiera kolca RNA faga MS2.
9. Przygotować kontrolę dodatnią, dodając 2 μl roztworu kontroli dodatniej i 11 μl wody molekularnej wolnej od DNaz/RNaz do studzienki kontroli pozytywnej na płytce reakcyjnej. Przygotować kontrolę bez matrycy, dodając 13 μl wody molekularnej wolnej od DNaz/RNaz do studzienki kontroli ujemnej na płytce reakcyjnej.
10. Przykryj płytki reakcyjne folią optyczną i wiruj przez 2 minuty, aby dobrze wymieszać próbki. Odwirować płytki reakcyjne przy 650 x g przez 5 min. Przenieść płytki do systemu RT-PCR i uruchomić z parametrami cyklicznymi odpowiednimi dla mieszanki wzorcowej.
    1. W przypadku podanej tutaj mieszanki wzorcowej należy stosować temperaturę 25 °C przez 2 minuty, 53 °C przez 10 minut, 95 °C przez 2 minuty, 40 cykli po 95 °C przez 3 sekundy i 60 °C przez 30 sekund.

Results

Zdecydowana większość próbek otrzymanych do tej pory przez laboratorium została zaakceptowana i przeszła wstępny etap wizualnej kontroli jakości. Konieczność odrzucenia próbki ogranicza się do powodów, które mogą negatywnie wpłynąć na przetwarzanie próbki i/lub ogólne wyniki próbki. W szczególności niewłaściwa objętość w probówce, konsystencja lub kolor nienaturalny dla śliny, brak kulek ceramicznych używanych do pomocy w homogenizacji próbki i brakujące kody kreskowe są powodami odrzucenia próbki (Ry...

Discussion

Podczas przetwarzania próbki występują czynności wymagające szczególnej uwagi. Początkowy etap kontroli jakości, który dotyczy objętości próbki, konsystencji, koloru i obecności dodanych kulek, ma kluczowe znaczenie dla ogólnego sukcesu procesu. Probówki z próbkami, które nie zawierają odpowiedniej ilości śliny, mogą dawać fałszywie ujemny wynik, ponieważ zbyt mała ilość śliny skutkowałaby niewystarczającą ilością materiału genetycznego; i odwrotnie, zbyt dużo śliny nie byłoby w prawidłowym stosunku do buforu RNA i może ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 Krok MM, bez ROX	Thermo Fisher	A28523
1,2 mlPłytki głębinowe	Fisher	AB0564
100 ml zbiorniki na odczynniki	Corning	4872
2,8 mm Koraliki ceramiczne	OMNI	19-646
25 ml stożkowe z nakrętką	VWR	76338-496
50mL V zbiorniki denne	Costar	4870
5430-Wirówka szybkoobrotowa	Eppendorf	22620601
5ml Eppendorf Tube	Fisher	14282300
8 probówek paskowych do	technologii QuantStudio life	4316567
Beta merkaptoetanol	Fisher	AC125472500
Ethanol 200 Proof, klasa biologii molekularnej	Fisher	BP28184
Microamp Endura Optical 96-dołkowa szybka, przezroczysta płytka reakcyjna z technologiami żywotności kodów kreskowych		4483485
Microamp Fast Optical 96-dołkowa płytka	Fisher	4346906
Mini mikrowirówka	Corning Medical	6770
nasadki optyczne do probówek paskowych	technologie życia	AB-1820
Folia optyczna	Thermo Fisher
Folia uszczelniająca płytkę PCR Nieoptyczna	Fisher	AB-0558
Płytka PCR półspódnicowa	Fisher	14230244
QuantStudio 3 System do PCR w czasie rzeczywistym, 96-dołkowa, 0,1 ml	Thermo Fisher	A28136
Potwierdzenie zestawu szybkiego wirusa RNA	Zymo	R1035
, 100 ml	DOT	229298
RNA Shield	Zymo	R1200-1L
Małe worki na zagrożenia biologiczne	Zestaw COVID19 Fisher	180000
Taqpath RTPCR	Thermo Fisher	A47814
Thermo Scientific Sorvall ST4R Plus	Wirówka Thermo Fisher	75009525
Pipeta transferowa	Fisher	22170404
Viral 96 Kit	Zymo	Mieszalnik wirowy R1041
	Fisher	2215414