Method Article

Połączone makroporowate rusztowania 3D z prętów mikrożelowych

DOI:

10.3791/64010

⸱

June 16th, 2022

 ,  ,  , 
1DWI - Leibniz Institute for Interactive Materials, 2Institute for Technical and Macromolecular Chemistry, RWTH Aachen University, 3Institute of Applied Medical Engineering, Department of Advanced Materials for Biomedicine, RWTH Aachen University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrożelowe pręty z komplementarnymi grupami reaktywnymi są produkowane za pomocą mikrofluidyki z możliwością łączenia się w roztworze wodnym. Anizometryczne mikrożele zacinają się i łączą w stabilne konstrukcje z większymi porami w porównaniu z systemami sferycznymi. Mikrożele modyfikowane za pomocą GRGDS-PC tworzą makroporowate konstrukcje 3D, które można wykorzystać do hodowli komórkowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwuskładnikowy system funkcjonalizowanych mikrożeli z mikrofluidyki pozwala na szybkie łączenie się w makroporowate konstrukcje 3D w roztworach wodnych bez dalszych dodatków. Ciągłe fotoinicjowane żelowanie na chipie umożliwia zmianę proporcji mikrożelu, który określa właściwości bloków budulcowych dla otrzymanych konstrukcji. Monomery metakrylanu glicydylu (GMA) lub metakrylanu 2-aminoetylu (AMA) są kopolimeryzowane w sieć mikrożeli na bazie polimerów gwiaździstych glikolu polietylenowego (PEG) w celu uzyskania funkcjonalności epoksydowej lub aminowej. Skupiający przepływ oleju jest wprowadzany do mikroprzepływowej struktury wylotowej, aby zapewnić ciągłe zbieranie funkcjonalizowanych prętów mikrożelowych. Na podstawie niedawnej publikacji, konstrukcje oparte na pałeczkach mikrożelowych skutkują większymi porami o długości kilkuset mikrometrów, a jednocześnie prowadzą do ogólnie wyższej stabilności rusztowania w porównaniu z modelem sferycznym. W ten sposób możliwe jest wytwarzanie konstrukcji o większej objętości z większą objętością przy jednoczesnym zmniejszeniu ilości wymaganego materiału. Połączone ze sobą makroporowate rusztowania można podnosić i transportować bez uszkodzeń i rozpadu. Grupy aminowe i epoksydowe niebiorące udziału w wzajemnym łączeniu pozostają aktywne i mogą być używane niezależnie do modyfikacji końcowej. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę wytwarzania pałeczek mikrożelowych w celu utworzenia makroporowatych, połączonych ze sobą rusztowań, które można wykorzystać do kolejnych eksperymentów komórkowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby badać złożone zachowania komórek współpracujących w konstrukcjach 3D, platformy rusztowań muszą wykazywać stałą wydajność w odtwarzalności, mieć odpowiednią geometrię do migracji komórek, a jednocześnie pozwalać na pewną elastyczność w zakresie zmiany parametrów w celu zbadania ich wpływu na żywą tkankę1. W ostatnich latach koncepcja makroporowatych wyżarzonych cząstek (MAP), po raz pierwszy opisana przez Segurę i wsp., przekształciła się w wydajną i wszechstronną platformę do produkcji rusztowań 3D2. Dopasowana kompozycja mikrożeli, które są budulcem końcowego rusztowania 3D, predefiniuje właściwości, takie jak sztywność konstrukcji, selektywna reaktywność chemiczna sieci żelowej i ostateczny rozmiar porów rusztowania2,3,4,5,6. Peptydy adhezyjne jako wskazówki dotyczące interakcji rusztowanie-komórka są włączane do sieci polimerowej mikrożeli, aby umożliwić przyłączanie komórek i mogą być zmieniane w celu zbadania ich specyficznego wpływu na komórki w hodowli. Rusztowania 3D są stabilizowane przez połączenie wyżarzonych mikrożeli iniekcyjnych dzięki wiązaniom kowalencyjnym lub supramolekularnym, co skutkuje solidnymi i zdefiniowanymi konstruktami do hodowli komórkowych2,3,5,7,8.

Mikrofluidyka stała się jedną z najdokładniejszych i najbardziej elastycznych metod przygotowania zdefiniowanych granulowanych hydrożeli9. Możliwość wytwarzania większych ilości wymaganych bloków budulcowych w procesie ciągłym przy zachowaniu ich monodyspersyjności chemicznej, mechanicznej i fizycznej w znacznym stopniu przyczynia się do przydatności tego procesu. Ponadto wielkością i kształtem wytwarzanych mikrożeli można manipulować różnymi metodami, takimi jak emulsje wsadowe, mikrofluidyka, litografia, natryskiwanie elektrodynamiczne lub fragmentacja mechaniczna, które określają geometrię bloków budulcowych, a tym samym strukturę 3D końcowego rusztowania1,10.

Ostatnio zgłoszono koncepcję makroporowatych rusztowań 3D składających się z funkcjonalizowanych prętów mikrożelowych, które szybko łączą się w roztworach wodnych bez dalszych dodatków11. Anizotropia pałeczek mikrożelowych skutkowała większą porowatością i rozkładem porów przy większych rozmiarach porów w porównaniu z zastosowaniem sferycznych mikrożeli w tym badaniu11. W ten sposób mniejsza ilość materiału tworzy większe pory o różnych geometriach porów, przy jednoczesnym zachowaniu stabilności rusztowania 3D. System składa się z dwóch rodzajów pałeczek mikrożelowych z komplementarnymi pierwszorzędowymi grupami funkcyjnymi aminowymi i epoksydowymi, które są zużywane w reakcji łączenia w kontakcie ze sobą. Grupy funkcyjne, które nie uczestniczą w procesie wzajemnego wiązania, pozostają aktywne i mogą być wykorzystywane do selektywnej modyfikacji końcowej za pomocą peptydów adhezyjnych komórek lub innych czynników bioaktywnych. Komórki fibroblastów przyczepiają się, rozprzestrzeniają i namnażają po wyhodowaniu w rusztowaniach 3D, najpierw rosnąc na powierzchni mikrożelu i wypełniając większość makroporów po 5 dniach. Wstępne badanie z wykorzystaniem wspólnej hodowli ludzkich fibroblastów i ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) wykazało obiecujące wyniki w zakresie tworzenia struktur przypominających naczynia w połączonych rusztowaniach 3D11.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wymagany materiał i preparaty do mikrofluidyki

  1. Do opisanej procedury mikroprzepływowej należy użyć szklanych strzykawek o pojemności 1 ml i 5 ml oraz pompek strzykawkowych. Tworzenie się kropel na chipie obserwuje się za pomocą odwróconego mikroskopu wyposażonego w szybką kamerę.
  2. Stwórz projekt chipa mikroprzepływowego (Rysunek 1B) za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo i utwórz szablon główny, jak już podano12.
  3. Osiągnij kontrolowane naświetlanie promieniowaniem UV za pomocą samodzielnie skonstruowanej diody UV-LED (λ = 365 nm, średnica plamki ~4,7 mm) zapewniającej napromieniowanie o mocy 957 mW/cm2 przez szkło osłonowe o grubości 0,13 mm.
    UWAGA: Należy wziąć pod uwagę możliwe miejscowe wytwarzanie ciepła przez diodę UV-LED podczas napromieniowania. W takim przypadku należy zapewnić wystarczające chłodzenie przez zewnętrzny przepływ powietrza.

2. Produkcja urządzeń mikroprzepływowych

UWAGA: Produkcja urządzeń mikroprzepływowych opiera się na poprzedniej publikacji13.

  1. Przygotować 20 g mieszaniny polidimetylosiloksanu (PDMS) i utwardzacza w proporcji 10:1 (masowo). Mieszać energicznie przez 3 min.
  2. Wymieszaj 60 mg oleju czerwonego O z 2,0 g toluenu. Do mieszaniny PDMS dodać 50 μl czerwieni olejowej O w roztworze toluenu. Mieszaj, aż uzyskasz jednorodny rozkład kolorów, aby zmniejszyć niepożądane rozpraszanie światła i utrzymać ostrość wielkości plamki podczas żelowania na chipie.
  3. Usunąć pęcherzyki, umieszczając mieszaninę w eksykatorze wyposażonym w pompę próżniową.
  4. Wlać mieszaninę PDMS do matrycy głównej na wysokość 5-5,5 mm i ponownie odgazować.
  5. Pozostaw PDMS do utwardzenia przez 18 godzin w temperaturze pokojowej, aby uniknąć degradacji barwnika diazowego.
  6. Wyciąć strukturę PDMS i przebić otwory wlotowe i wylotowe w konstrukcji za pomocą narzędzia do pobierania próbek rdzenia liniowego (średnica wewnętrzna 0,77 mm, średnica zewnętrzna 1,07 mm).
  7. Umyj PDMS i szkło nakrywkowe izopropanolem i wodą dejonizowaną wielokrotnie 5 razy, a następnie usuń płyn za pomocą strumienia sprężonego powietrza lub azotu po każdym etapie mycia.
  8. Suche szkło i PDMS należy traktować razem w piecu plazmowym pod ciśnieniem 0,2 mbar, z przepływem tlenu 20 ml/min przez 60 s przy 100 W, a następnie połączyć bezpośrednio, aby związać szkło i PDMS razem, tworząc urządzenie mikroprzepływowe.
    UWAGA: Unikaj zginania struktury PDMS podczas procesu wiązania, aby zminimalizować deformację struktury kanału.
  9. Aby kanały chipa mikroprzepływowego były hydrofobowe, umieść urządzenie wraz z 50 μl trichloro-(1H,1 H,2 H,2 H-perfluoroktylo)-silanu w eksykatorze pod próżnią przez noc (zamknij połączenie z pompą po zmniejszeniu prężności pary). Opłucz zewnętrzną część urządzenia hydrofluoroeterem.
    UWAGA: Wykonaj te czynności w dygestoriach i unikaj kontaktu z perfluorosilanem. Użyć szklanego eksykatora próżniowego uszczelnionego smarem. Dokładnie wyczyść eksykator przed użyciem do innych celów.

3. Przygotowanie roztworu dla mikrofluidyki

  1. W przypadku ciągłej fazy olejowej należy wymieszać olej parafinowy i heksadekan (1:1 v/v) i dodać 8% (w/w) niejonowego środka powierzchniowo czynnego. Napełnij jedną szklaną strzykawkę o pojemności 1 ml (pierwszy olej, Rysunek 1) i jedną 5 ml (drugi olej, Rysunek 1).
  2. Przygotować roztwory prepolimerów do fazy dyspersyjnej w fiolkach z brązowego szkła, aby zapobiec rozkładowi fotoinicjatora i niezamierzonemu żelowaniu.
    1. Roztwór prepolimeru aminowego zawierający GRGDS-PC
      1. W przypadku roztworu o objętości 300 μl odważyć 33,3 mg akrylanu glikolu gwiaździstego (sPEG-AC) i 3,03 mg fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinianu litu (LAP).
      2. Rozpuścić 18,74 mg chlorowodorku metakrylanu 2-aminoetylu (AMA) w 1,5 ml wody dejonizowanej i przepuścić roztwór przez filtr strzykawkowy (wielkość porów 0,20 μm).
        UWAGA: AMA jest higroskopijny i należy go wyrzucić, gdy tylko ciała stałe zbrylą się w pojemniku do przechowywania.
      3. Przygotować sterylne porcje 36 mM GRGDS-PC w wodzie i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
      4. Użyć 291,7 μl roztworu AMA do rozpuszczenia sPEG-AC i LAP oraz dodać 8,3 μl roztworu GRGDS-PC. Roztwór należy pobrać szklaną strzykawką o pojemności 1 ml i chronić przed światłem za pomocą folii aluminiowej.
    2. Roztwór prepolimeru epoksydowego
      1. W przypadku roztworu o objętości 300 μl odważyć 33,3 mg akrylanu glikolu polietylenowego (sPEG-AC), 3,03 mg LAP i rozpuścić w 300 μl wody dejonizowanej. Dodać 2,4 mg metakrylanu glicydylu (GMA).
        UWAGA: Energiczne potrząsanie przyspiesza rozpuszczanie GMA. Roztwór należy pobrać szklaną strzykawką o pojemności 1 ml i chronić przed światłem za pomocą folii aluminiowej.

4. Produkcja i oczyszczanie mikrożelowych prętów funkcjonalizowanych aminami i żywicą epoksydową

figure-protocol-1
Rysunek 1: Układ zespołu żelowania mikroprzepływowego na chipie. (A) Widok z przodu i pod kątem układu komponentów podczas mikrofluidyki. (B) Mikroprzepływowa konstrukcja chipa stosowana do żelowania prętów mikrożelowych na chipie. (1) Rura PE do pierwszego wlotu oleju. (2) Osłonięta światłem rura PE do wlotu fazy dyspersyjnej. (3) Rurka PE do drugiego wlotu oleju. (4) Rurka PE od wylotu do pojemnika na produkt. (5) Lampa UV i lokalizacja naświetlania na prostym kanale 80 μm w pobliżu wylotu. (6) Pozycja obiektywu/obserwacji mikroskopu. (7) Kolorowy komponent PDMS urządzenia mikroprzepływowego. (8) Szkło nakrywkowe połączone z PDMS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Włóż igły do probówek PE i usuń gaz ze strzykawki i probówki.
  2. Włóż rurkę PE do wylotu w celu zebrania produktu.
  3. Umieść wszystkie szklane strzykawki w pompach strzykawkowych i włóż każdy koniec rurki do odpowiedniego wlotu (Rysunek 1).
    UWAGA: Chroń rurkę prepolimerową przed światłem za pomocą folii aluminiowej lub czarnej rurki, aby uniknąć niezamierzonego żelowania.
  4. Ustaw mikroskop na przekroju poprzecznym olej-woda.
  5. Uruchom pierwszą pompę strzykawkową oleju (natężenie przepływu = 100-200 μl/h), aby najpierw napełnić kanał olejem, aby zapobiec zwilżeniu kanału przez fazę dyspersyjną.
  6. Zmniejszyć pierwsze natężenie przepływu oleju do 30 μL/h i uruchomić pompę strzykawkową prepolimerową (natężenie przepływu = 100-200 μL/h) do momentu, gdy w przekroju będzie można zaobserwować rozproszoną fazę wodną.
  7. Ustaw natężenie przepływu prepolimeru na 30 μl/h i skoncentruj mikroskop na wylocie.
  8. Uruchomić drugą pompę strzykawki olejowej (przepływ 300 μl/h) i poczekać, aż reżim przepływu się ustabilizuje.
  9. Umieść rurkę wylotową w pojemniku zbiorczym.
    UWAGA: Umieść koniec rurki w górnej części pojemnika, aby uniknąć wzrostu ciśnienia spowodowanego gromadzeniem się produktu w czasie.
  10. Ustaw system naświetlania UV tak, aby natężenie promieniowania mieściło się w zakresie 900-1000 mW/cm2 (użyte natężenie promieniowania = 957 mW/cm2), a punkt naświetlania znajdował się w prostej części kanału przed wylotem (Rysunek 1B).
    UWAGA: Upewnij się, że nie napromieniowujesz w pobliżu przekroju oleju i wody, aby uniknąć zatkania kanału. Aby uzyskać dodatkową ochronę, zakryj struktury kanałów przed punktem napromieniowania na górze urządzenia.
  11. Przed naświetlaniem UV należy wyregulować natężenia przepływu prepolimeru i pierwszego oleju, aby osiągnąć pożądany współczynnik kształtu w zakresie od 3,0 do 4,5, oraz ustawić czas naświetlania fazy rozproszonej na ~2,3 s, w zależności od wielkości plamki napromieniania.
  12. Rozpocząć naświetlanie promieniami UV i, jeśli to konieczne, ponownie wyregulować natężenie przepływu zgodnie z poprzednim podrozdziałem.
    UWAGA: Na początku obserwuj produkcję i monitoruj stabilny przepływ na wylocie i jednorodność prętów mikrożelowych. Drugi przepływ oleju można regulować, aby zoptymalizować transport produktu w obrębie wylotu.
  13. Zmień pojemnik zbiorczy i zanotuj czas rozpoczęcia odbioru produktu i natężenie przepływu.
    UWAGA: Chroń produkt przed kurzem. Należy przerwać zbieranie, zanim w strzykawce zacznie brakować roztworu.
  14. Aby zakończyć zbieranie, wyjmij pojemnik na zbiórkę, zwracając uwagę na godzinę. Zatrzymać napromienianie i wszystkie pompy strzykawkowe.
  15. Następnie umyj produkt 5x za pomocą n-heksanu, izopropanolu i wody dejonizowanej. Usunąć supernatant po sedymentacji pręcików.
    UWAGA: Po każdym dodaniu roztworu należy dokładnie zdyspergować produkt i odczekać 10 minut przed wymianą rozpuszczalnika, biorąc pod uwagę dyfuzję molekularną. Zastępuj izopropanol stopniowo wodą, aby zapobiec unoszeniu się prętów na powierzchnię cieczy. Wiele dodatkowych etapów mycia wodą zmniejsza pozostałe ślady izopropanolu.

5. Formacja rusztowania makroporowatego

  1. Określić liczbę pałeczek mikrożelowych na objętość dyspersji dla próbek funkcjonalizowanych żywicą epoksydową i aminami.
  2. Dostosuj liczbę próbek funkcjonalizowanych żywicami epoksydowymi i aminami przez rozcieńczenie lub stężenie do podobnej wartości w zakresie 1 000-5 000 pręcików/100 μl.
    UWAGA: Użyj wirówki o sile ~ 2,000 x g przez 5-10 s, aby przyspieszyć sedymentację pałeczek mikrożelowych. Jeśli liczba prętów na objętość dyspersji jest niska, łączenie prętów może skutkować mniejszymi skupiskami prętów zamiast jednej stabilnej konstrukcji. Jeśli liczba prętów na objętość dyspersji jest wysoka, jakość mieszania tych dwóch składników będzie zagrożona.
  3. Przenieś dyspersję pierwszego składnika (~1,200 pręcików) do stożkowej przezroczystej fiolki o pojemności 1,5 ml lub 2 ml.
  4. Drugi składnik należy dodawać w sposób kontrolowany w trybie ciągłym (pipeta o pojemności 100 μl). Po dodaniu wymieszaj zawartość bezpośrednio za pomocą pipety, aby pobrać płyn i dodaj go ponownie. Połączona struktura tworzy się w ciągu kilku sekund podczas mieszania.
    UWAGA: Jeśli zamiast jednej spójnej struktury tworzy się wiele klastrów, ponownie sprawdź liczbę pałeczek mikrożelu na objętość lub zapewnij bardziej kontrolowane mieszanie dwóch składników.

6. Klej komórkowy po modyfikacji

  1. Obliczyć teoretyczną liczbę grup epoksydowych w połączonej strukturze na podstawie natężenia przepływu rozproszonej fazy polimerowej, liczby mikrożeli zebranych w określonym czasie oraz współczynnika rozcieńczenia dyspersji mikrożelu używanej do tworzenia rusztowań.
    UWAGA: Przybliżyć teoretyczną liczbę grup epoksydowych na rusztowanie za pomocą następującego równania.
    figure-protocol-2
    figure-protocol-3
    nth: Teoretyczna ilość substancji
    cGMA: stężenie GMA w roztworze prepolimeru
    Q: Natężenie przepływu roztworu prepolimeru
  2. Dodaj roztwór GRGDS-PC do połączonej struktury, aby zmodyfikować wszystkie pozostałe grupy epoksydowe za pomocą peptydu adhezyjnego komórki zawierającego wolną aminę i tiol (n [teoretyczne grupy epoksydowe] / n [GRGDS-PC] = 1). Pozostaw na noc w temperaturze pokojowej.
  3. Usunąć nieprzereagowane cząsteczki, przemywając wodą dejonizowaną i usuwając supernatant.

7. Sterylizacja i transfer do pożywki do hodowli komórkowych

  1. Zmniejsz poziom wody, aby po prostu zanurzyć połączone rusztowanie.
  2. Otworzyć fiolkę i naświetlić światłem UV λ = 250-300 nm. Zamknąć fiolkę i przenieść fiolkę na czystą ławkę. Umyć 1x sterylną wodą.
  3. Zastąp wodę w fiolce pożywką do hodowli komórkowych i pozwól na równowagę przez 5 minut. Powtórz to z żywymi pożywkami do hodowli komórkowych 2x.
  4. Przenieść makroporowate rusztowanie na płytkę studzienki do hodowli komórkowej na potrzeby eksperymentu, wylewając lub używając szpatułki.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Rysunek 2: Makroporowata struktura rusztowania usieciowanego. (A) Rzut 3D stosu Z z mikroskopii konfokalnej 500 μm połączonego makroporowatego rusztowania. Podziałka odpowiada 500 μm. (B) Połączone rusztowanie składające się z ~ 10 000 prętów mikrożelowych na szkle nakrywkowym wyjętym bezpośrednio z wody. Podziałka skali re...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z krytycznych etapów tego protokołu jest jakość metakrylanu 2-aminoetylu (AMA) stosowanego jako komonomer do pierwszorzędowej funkcjonalizacji amin. AMA powinien być drobnoziarnistym i najlepiej bezbarwnym proszkiem dostarczanym w gazoszczelnym pojemniku z brązowego szkła. Należy unikać stosowania zielonkawego i grudkowatego materiału, ponieważ znacznie upośledza on reakcję żelowania i negatywnie wpływa na powtarzalność wyników. W przypadku słabego żelowania i niestabilnych pałeczek mikrożelowych można rozważyć zm...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy zapewniają, że nie dochodzi do konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyrażamy naszą wdzięczność współautorom naszej poprzedniej pracy, na której opiera się ta metodologia, Céline Bastard, Luis P. B. Guerzoni, Yonca Kittel, Rostislav Vinokur, Nikolai Born i Tamás Haraszti. Z wdzięcznością dziękujemy za dofinansowanie z Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) w ramach projektu B5 i C3 SFB 985 "Funkcjonalne mikrożele i systemy mikrożelowe". Przyjmujemy do wiadomości dofinansowanie przez Senacką Komisję ds. Konkurencji im. Leibniza (SAW) w ramach programu Professorinnenprogramm (SAW-2017-PB62: BioMat). Serdecznie dziękujemy za dofinansowanie ze strony Komisji Europejskiej (EUSMI, 731019). Prace te zostały częściowo wykonane w Centrum Technologii Polimerów Chemicznych (CPT), które było wspierane przez UE i kraj związkowy Nadrenia Północna-Westfalia (grant EFRE 30 00 883 02).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ABIL EM 90Evonik144243-53-8niejonowy środek powierzchniowo czynny
Chlorowodorek metakrylanu 2-aminoetyluTCI ChemicalsA3413>98.0%(T)(HPLC)
8-ramienny PEG-akrylan 20 kDaBiochempeg Scientific Inc.A88009-20K≥ 95 %
AutoCAD 2019Oprogramowaniedo komputerowego wspomagania projektowania (CAD)
Filtr strzykawkowy CHROMAFIL MV A-20/25CHROMAFILCarl Roth GmbH+Co.KGXH49.1wielkość porów 0,20 i mikro; m; Mieszane estry celulozy (MV)
Szkło nakrywkoweMarienfeld-Superiortyp nr 1
Szwajcarskie narzędzie do pobierania próbek rdzenia linii EMS 0,75 mmMikroskopia elektronowa Sciences Średnicawewnętrzna 0,77 mm, średnica zewnętrzna 1,07 mm
Etanol absolutVWR Chemicals
FL3-U3-13Y3M Seria 150 FPSSystemy
FLIRIzomer fluoresceinaminy ISigma-Aldrich201626
Izotiocyjanian fluoresceinyThermo Fisher Scientific46424
25G x 5/8' ’ Igły 0,50 x 16 mmBD Microlance 3
Metakrylan glicydyluSigma-Aldrich779342≥ 97,0% (GC)
GRGDS-PCCPC ScientificFIBN-015A
Hamilton 1000 Series Strzykawki gazoszczelneThermo Fisher Scientific10772361/10500052PFTE Luer-Lock
HexaneSigma-Aldrich1,04,367
Fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosforynian lituSigma-Aldrich900889≥ 95 %
Motic AE2000 mikroskop trójokularowyTed Pella, Inc.22443-12
Novec 7100Sigma-AldrichSHH0002
Oil Red OSigma-AldrichO9755
ParafinaVWR Chemicals24679320
Pavone Nanoindenter PlatformOptics11Life
Sól fizjologiczna buforowana fosforanemThermo Fisher ScientificAM9624
Polietylen Rurki 0,38 i razy; 1,09 mmkropliID 0,38 mm OD 1,09 mm
2-PropanolSigma-Aldrich190764odczynnik ACS, ≥ 99,5%
Białkowe rurki LoBind30108132Eppendorf
11 Programowalna pompa strzykawkowa Pico Plus EliteAparat
RPMI 1640 średniGibco11530586
Zestaw elastomerów silikonowych SYLGARD 184Dow SYLGARD634165S
Trichloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroktylo)-silanSigma-Aldrich448931
UVC LED sterylizacjaUVLED Optical Technology Co., Ltd.9S SZH8-S2
Autodesk; modelowanie konstrukcji mikroprzepływowych klasy medycznej Pompa Harvarda

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
  2. Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
  3. Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1800160(2018).
  4. Truong, N. F., et al. Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer. Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2019).
  5. Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
  6. de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071(2019).
  7. Hsu, R. -S., et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520(2019).
  8. Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254(2017).
  9. Chen, Z., et al. Advanced microfluidic devices for fabricating multi-structural hydrogel microsphere. Exploration. 1 (3), 20210036(2021).
  10. Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194(2022).
  11. Rommel, D., et al. Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture. Advanced Science. 9 (10), 2103554(2022).
  12. Guerzoni, L. P. B., et al. Cell encapsulation in soft, anisometric poly(ethylene) glycol microgels using a novel radical-free microfluidic system. Small. 15 (20), 1900692(2019).
  13. Krüger, A. J. D., et al. Compartmentalized jet polymerization as a high-resolution process to continuously produce anisometric microgel rods with adjustable size and stiffness. Advanced Materials. 31 (49), 1903668(2019).
  14. Darling, N. J., et al. Click by click microporous annealed particle (MAP) scaffolds. Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391(2020).
  15. Lutzweiler, G., Ndreu Halili,, Engin Vrana, N. The overview of porous, bioactive scaffolds as instructive biomaterials for tissue regeneration and their clinical translation. Pharmaceutics. 12 (7), 602(2020).
  16. Dang, H. P., et al. 3D printed dual macro-, microscale porous network as a tissue engineering scaffold with drug delivering function. Biofabrication. 11 (3), 035014(2019).
  17. Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Macroporous ScaffoldsMicrogel Rods3D Scaffold FabricationMicrofluidic GelationPhotoinitiated GelationPolyethylene GlycolScaffold Pore SizeAmine FunctionalizationEpoxy FunctionalizationConfocal Microscopy

Related Articles